KR20150146217A - 시로미 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항당뇨 조성물 - Google Patents
시로미 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항당뇨 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 시로미 추출물(Empetrum nigrum var. japonicum) 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항당뇨 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 시로미 추출물 또는 이의 분획물은 알파-글루코시다제 및 알파-아밀라제의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 항균 효과가 우수하여 항균 또는 항당뇨 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 시로미 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항당뇨용 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
당뇨병(Diabetes mellitus)은 탄수화물, 지방, 단백질 대사에서 절대적인 혹은 상대적인 인슐린 결핍으로 인한 대사장애로 특징지어지는 복합 질환이며(Balaji et al., 2013; Kazeem et al., 2013), 많은 당뇨병 환자들은 신장병, 망막증, 신경변증, 심장혈관계 질환을 포함하는 심각한 합병증을 가진다(Jeong et al., 2013).
당뇨병 치료에 있어서 가장 중요한 목표는 혈당치를 가능한 정상치에 가깝게 조절하는 것인데, 공복혈당과 함께 식후 혈당조절이 당뇨병 증세의 개선과 합병증의 예방 및 치료에 있어서 중요하며, 치료 방법으로 약물요법, 식이요법 및 운동요법이 있다.
현재 제1형 및 제2형 당뇨병 환자에게 사용되는 경구혈당강하제로서 알파-글리코시다제(α-glucosidase) 억제제, 설포닐우레아(sulfonylurea) 제제 및 비구아니드(biguanide) 제제가 있으며, 이중 알파-글리코시다제 억제제는 섭취한 식이 중의 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 식후 혈당 및 혈중 인슐린의 상승을 감소시킴으로써 당뇨병의 치료효과를 나타낸다. 알파-글리코시다제 억제제는 고인슐린혈증이나 저혈당을 유발하지 않고, 인슐린 분비를 촉진시키며 글루카곤 분비를 억제하는 글루카곤-유사-펩티드-1(glucagon-like peptide-1)의 소장에서의 분비를 촉진하는 장점을 가지고 있다(Mooradian, A.D., Thurman, J.E., Drugs, 57, pp19-29, 1999; Baron, A.D., Diabetes Research and Clinical Practice, 40, pp54-55, 1998).
현재 임상에서 사용하고 있는 알파-글루코시다제 억제제로는 아카보스(acarbose), 보길리보스(voglibose) 및 미글리톨(miglitol) 등이 있으나, 알파-글리코시다제 억제제를 장기 복용한 경우 일부 환자에 있어서 복부 팽만감, 구토, 설사 등 부작용을 나타낼 수 있어, 그 사용이 제한될 수 있다(Hanefeld, M., Journal of Diabetes and its Complications, 12, pp228-237, 1998).
한편, 식물에 존재하는 폴리페놀 화합물(Polyphenolic compounds)은 단백질과 결합하여 탄수화물 가수분해 효소인 알파-아밀라제(α-amylase)와 알파-글루코시다제(α-glucosidase)를 저해한다고 알려져 왔다(Mai et al., 2007). 따라서, 최근 기존의 항당뇨 약의 대안을 제공하기 위해서 알파-아밀라제 및 알파-글루코시다제를 저해하는 물질을 식물로부터 분리하는 연구가 수행되어 왔다(Wang et al., 2013; Xiao et al., 2013).
천연 항생물질은 천연 자원이나 미생물 자원으로부터 선택하여, 생화학적, 생리학적 차이를 극대화함으로써, 바이러스, 세균, 효모, 곰팡이 등을 선택적으로 제어하는 것으로, 인체에는 무해하거나 또는 독성을 최소화한 항균제를 의미한다. 천연 항생물질 중에서도 특히 식물 유래의 항균물질은 특히 새로운 치료 약물의 개발 원천으로 이용되어 왔다. 이는 식물이 야생에서 감염성 질병으로부터 안전성을 유지하기 위한 방어 기전으로서, 가장 효율적인 방법으로 항균물질을 만들어 내기 때문이다.
따라서 최근에는 당뇨병 뿐만 아니라 당뇨병으로 인한 합병증을 치료하기 위한 치료제로서 인체 부작용이 적고 치료 효과가 높은 약제를 천연재료로부터 얻으려는 연구들이 지속되고 있는데, 이러한 연구 결과, 대한민국공개특허 제2008-0078963호에는 인삼 추출물 및 화살나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 내용이 개시되어 있고, 대한민국공개특허 제2008-0085358호에는 측백 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물에 대한 내용이 개시되어 있으며, 대한민국등록특허 제824,365호에는 오죽 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물에 대한 내용이 개시되어 있다.
이처럼, 많은 천연재료로부터 당뇨병 및 당뇨성 합병증을 치료하기 위한 새로운 약제들이 개발되고 있으나 종래 개발된 약제의 경우 치료 효과가 미비하거나 또는 인체 부작용들을 유발하는 문제점들이 있어 궁극적으로 당뇨병 및 당뇨성 합병증의 치료제로서는 부적합한 단점이 있다.
따라서 인체에 부작용이 없으면서도 당뇨병 및 당뇨성 합병증을 치료하는 효과가 우수한 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum)는 상록관목식물로서, 시로미과(Empetraceae)에 속하며, 북유럽, 시베리아, 아시아, 북미 등에 광범위하게 자란다(Eshbaugh, W. Phil. Soc. 1968). 상기 시로미는 북반구의 북부 고산지역과 남아메리카의 고산 지역에 약 3속 7종, 우리나라에는 1속 1종이 분포하며(Lee, Yong No, 2006), 한반도에는 시로미가 백두산, 관모봉, 두류산, 북수백산등의 북부지역과 제주도 한라산 정상부근 해발 1,700m 이상의 고원지에 주로 분포한다(Kong and Watts, Kluwer Academic Publishers, 1993). 한라산에 분포하는 시로미는 지구상 분포의 남방한계선으로 식물 지리학적 가치가 매우 높으며 한라산에서도 비교적 넓은 분포지역을 가져 환경변화에 따른 식생패턴의 변화를 예측하기에 적합한 극지고산 식물의 대표적인 수종으로 볼 수 있다(Kong, W. S., J. of the Korean Giographical Society, 37(4), 2002). 시로미는 고산지대 정상 가까운 곳에 나는 상록 관목으로 키는 10~20cm이다. 약용 및 관상용으로 이용되고, 민간에서는 나무 전체를 방광염, 임질, 소화, 구토, 정혈, 신장염등에 약으로서 사용되기도 하고(Kim, T. J., Korean Resources Plants II, 1996), 콜라겐 합성 촉진작용, 보습효과, 피부미백효과 등의 효과가 있음이 알려져 있으나, 항당뇨 효과와 관련하여는 아직 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 당뇨병을 예방 및 치료하고, 항균 효과를 나타낼 수 있는 천연 식물에 대하여 장기간 연구를 계속해오던 중, 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum)의 지상부(잎과 줄기)와 열매 추출물 및 이의 분획물이 우수한 항균 활성과 항당뇨 활성을 가지고 있어, 항균제 또는 항당뇨제로서 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 시로미 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 시로미 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시로미 추출물은 메탄올을 이용하여 추출한 메탄올 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시로미 분획물은 상기 시로미 메탄올 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 이용하여 분획한 분획물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피 투여제, 또는 좌제의 형태일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료의 형태일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 그람-양성균에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 시로미 추출물 또는 이의 분획물은 알파-글루코시다제 및 알파-아밀라제의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 항균 효과가 우수하여 항균용 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 또는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.
본 발명자들은 항균 또는 항당뇨 개선를 위한 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중 시로미에 주목하였는데, 시로미는 북반구, 특히 핀란드에서 흔히 발견되는 black crowberry로 알려져 있고, 과일 주스의 형태로 소비된다.
시로미(Empetrum nigrum var. japonicum)는 상록관목식물로서 시로미과(Empetraceae)에 속하며 북유럽, 시베리아, 아시아, 북미 등에 광범위하게 자란다.(Eshbaugh, W. Phil. Soc. 1968) 북반구의 북부 고산지역과 남아메리카의 고산 지역에 약 3속 7종, 우리나라에는 1속 1종이 분포하며(Lee, Yong No, 2006), 한반도에는 시로미가 백두산, 관모봉, 두류산, 북수백산등의 북부지역과 제주도 한라산 정상부근 해발 1,700m 이상의 고원지에 주로 분포한다.(Kong and Watts, Kluwer Academic Publishers, 1993) 한라산에 분포하는 시로미는 지구상 분포의 남방한계선으로 식물 지리학적 가치가 매우 높으며 한라산에서도 비교적 넓은 분포지역을 가져 환경변화에 따른 식생패턴의 변화를 예측하기에 적합한 극지고산 식물의 대표적인 수종으로 볼 수 있다.(Kong, W. S., J. of the Korean Giographical Society, 37(4), 2002) 시로미는 고산지대 정상 가까운 곳에 나는 상록 관목으로 키는 10~20cm이다. 약용 및 관산용으로 이용되고 민간에서는 나무 전체를 방광염, 임질, 소화, 구토, 정혈, 신장염등에 약으로서 사용되기도 한다.(Kim, T. J., Korean Resources Plants II, 1996)
한편, 시로미 추출물에 대해서는 콜라겐 합성 촉진작용, 보습효과, 피부미백효과, 염증억제 효과 등이 알려져 있으나, 항균 또는 항당뇨와 관련된 효과는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 시로미의 지상부(잎과 줄기)와 열매를 메탄올을 이용하여 메탄올 조추출물을 수득하였고, 상기의 메탄올 조추출물을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획하여 메탄올 조추출물 및 분획물을 수득했다. 상기의 수득물이 항균 효과가 있는지, 그리고 당뇨병의 치료 및 예방에 유효한지를 조사하였다.
구체적으로, 본 발명의 시로미 추출물 또는 이의 분획물의 항당뇨 활성을 알아보고자 알파-글루코시다제 저해 능력을 pNPG를 이용하여 측정한 결과, 메탄올 조추출물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물에서 IC50이 0.5~5.4 ㎍/㎖를 나타냄으로써 유의적인 항당뇨 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 특히, 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 IC50이 0.5~0.6 ㎍/㎖를 나타냄으로써 우수한 항당뇨 활성을 가짐을 알 수 있었다(표 5 및 표 6 참조).
또한, 녹말 가수분해 분석을 통하여 시로미 추출물 또는 분획물의 알파-아밀라제 저해 활성을 측정한 결과, 200 g의 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에 의해 알파-아밀라제에 의한 녹말의 분해가 저해됨을 확인하였다(표 7 참조).
나아가, 본 발명의 시로미 추출물 또는 이의 분획물의 항균 활성을 측정한 결과, 그람-양성균에 대해 우수한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다(표 8 참조).
그러므로 본 발명자들은 하기 본 발명의 실시예에서 입증된 실험 결과를 토대로 본 발명의 시로미 추출물 또는 이의 분획물이 당뇨병을 치료하기 위한 약학적 용도 및 항균제의 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
한편, 본 발명에 따른 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum)는 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 '추출물'은 적절한 용매를 이용하여 시로미로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 시로미의 열수 추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.
시로미로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 시로미 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 시로미 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.
따라서 본 발명에 있어서 시로미 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 시로미 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제제 형태는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피 투여제, 좌제 등의 형태일 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액제로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 시로미 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 μg/ml 내지 500 μg/ml의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 시로미 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 시로미 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 시로미 추출물 또는 분획물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 항균용 또는 당뇨병의 예방 및 개선을 위한 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 항균용 또는 당뇨병의 예방 및 개선을 위한 목적으로 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 '건강기능식품'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 시로미 추출물 또는 분획물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명의 유효성분인 시로미 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 시로미 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 시로미 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 시로미 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1-2>
시로미
추출물의 제조
실시예
1:
시로미
지상부(잎, 줄기) 추출물의 제조
상온에서 건조한 시로미 지상부는 분쇄 후 분말로 만들었고, 분말을 메탄올을 이용하여 상온에서 24시간 동안 침출하여 추출했다. 상기의 침출액을 여과한 후 감압회전농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용하여 농축했다. 상기의 농축액은 물, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 분획하였다. 각각의 추출액 및 분획물은 감압농축기를 이용하여 농축하였다. 상기의 농축된 메탄올 조추출물 및 분획물을 메탄올과 H2O로 1mg/ml 농도로 다시 용해하였으며, 이는 -20℃에서 분석 전까지 저장하였다.
실시예
2:
시로미
열매 추출물의 제조
상온에서 건조한 시로미 열매를 분쇄 후 분말로 만들었고, 분말은 메탄올을 이용하여 상온에서 24시간 동안 침출하여 추출한 후, 초음파 세척기(Power sonic 520, Hwashin co., Korea)로 55℃에서 초음파처리 하였다. 상기의 침출액을 여과한 후 감압하에서 농축하였고, 이를 동결건조 하여 조추출물을 얻었다. 상기의 조추출물을 물, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 분획하였고, 각각의 분획물은 감압농축기를 이용하여 농축하였다. 상기의 농축된 메탄올 조추출물 및 분획물을 메탄올과 H2O로 재용해하여 분석에 사용하였다.
본 실시예 1 및 2에서 사용한 시로미 지상부 및 열매는 한라산(제주, 대한민국)에서 채집 후 동정하였다.
<
실험예
1>
시로미
추출물 또는
분획물의
총 페놀 함량 분석
1-1.
시로미
지상부 추출물 또는
분획물의
총 페놀 함량 분석
페놀 총 함량 분석은 Folin-Ciocalteu 분석(Hyun et al., 2014)을 이용하여 측정하였다. 실시예 1에서 제조된 시로미 지상부의 각각의 메탄올 조추출물 및 분획물을 50μl의 2N Folin-Ciocalteu 시약과 혼합하여 상온에 5분간 반응시킨 후, 0.3ml 20% 탄산나트륨을 첨가했다. 상기의 혼합물은 흡광도 725nm에서 측정되었으며, 각 샘플의 총 페놀 함량은 몰식자산(갈산 당량)(mg GAE/g extract)으로 나타냈다.
분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 상기 표 1의 값은 각각의 샘플을 세번 반복해서 측정하여 평균값이다.
추출물 또는 분획물 | 총 페놀 함량 (mg GAE/g) |
메탄올 조추출물 | 1170±4 |
헥산 분획물 | 111±10 |
에틸아세테이트 분획물 | 817±25 |
부탄올 분획물 | 950±76 |
물 분획물 | 160±8 |
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 시로미 지상부 추출물에 대한 총 페놀 함량은 메탄올 조추출물(1170±4 mg GAE/g), 에틸아세테이트 분획물(817±25 mg GAE/g), 부탄올 분획물(950±76 mg GAE/g)을 보였으며, 헥산 분획물, 물 분획물은 다른 분획물에 비해 낮은 함량을 보였다.
상기 시로미 지상부 추출물 또는 분획물의 총 페놀 함량과 생리활성과의 상관관계를 피어슨 상관계수를 적용하여 살펴보고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
|
상관관계 R2 |
TPC(총 페놀함량) | |
자유 라디칼 제거 활성 | 0.921*** |
환원력 | 0.868*** |
총 산화방지제 수용력 | 0.786*** |
항당뇨 활성 | -0.635** |
NO 생성 | -0.268 |
**는 p<0.01에서 유의적임을 나타낸다. ***는 p<0.001에서 유의적임을 나타낸다. |
표 2에 나타낸 바와 같이, 항산화효과는 페놀산과 양의 상관관계가 있음을 나타내었으나, 항당뇨 효과와는 역의 상관관계를 보이는 결과를 나타냈다.
1-2.
시로미
열매 추출물 또는
분획물의
총 페놀 함량 분석
상기 1-1의 방법과 동일한 방법으로 실시예 2에서 제조된 시로미 열매 추출물 또는 분획물에 대하여 총 페놀 함량을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다.
추출물 또는 분획물 | 총 페놀 함량 (mg GAE/g) |
메탄올 조추출물 | 697±8 |
헥산 분획물 | 70±2 |
에틸아세테이트 분획물 | 579±22 |
부탄올 분획물 | 1110±57 |
물 분획물 | 308±6 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 2의 시로미 열매 추출물에 대한 총 페놀 함량은 메탄올 조추출물 (697±8 mg GAE/g), 에틸아세테이트 분획물(579±22 mg GAE/g), 부탄올 분획물(1110±57 mg GAE/g)을 보였으며, 헥산분획물, 물분획물은 다른 분획물에 비해 낮은 함량을 보였다.
또한, 상기 시로미 열매 추출물 또는 분획물의 총 페놀 함량과 생리활성과의 상관관계를 피어슨 상관계수를 적용하여 살펴보고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
|
상관관계 R2 |
총 페놀 함량 | |
자유 라디칼 제거 활성 | 0.889*** |
환원력 | 0.868*** |
총 산화방지제 수용력 | 0.657** |
항당뇨 활성 | -0.639** |
**는 p<0.01에서 유의적임을 나타낸다. ***는 p<0.001에서 유의적임을 나타낸다. |
표 4에 나타낸 바와 같이 항산화효과는 페놀산과 양의 상관관계가 있음을 나타내었으나, 항당뇨 효과와는 역의 상관관계를 보이는 결과를 나타냈다.
<
실험예
2>
시로미
추출물의
항당뇨
효과 실험
당뇨병(Diabetes mellitus)은 탄수화물, 지방, 단백질 대사에서 절대적인 혹은 상대적인 인슐린 결핍으로 인한 대사장애로 특징지어지는 복합 질환이며(Balaji et al., 2013; Kazeem et al., 2013), 많은 당뇨병 환자들은 신장병, 망막증, 신경변증, 심장혈관계 질환을 포함하는 심각한 합병증을 가진다(Jeong et al., 2013). 식물에 존재하는 폴리페놀 화합물(Polyphenolic compounds)은 단백질과 결합하여 탄수화물 가수분해 효소인 알파-아밀라제와 알파-글루코시다제를 저해한다고 알려져왔다(Mai et al., 2007). 따라서, 최근에 항당뇨 약의 대안을 제공하기 위해, 몇몇의 알파-아밀라제와 알파-글루코시다제 저해제가 약용식물로부터 분리되어져 왔다(Wang et al., 2013; Xiao et al., 2013).
이에, 시로미의 항당뇨 효과를 확인하기 위해, 메탄올 조추출물 또는 이의 분획물의 알파-글루코시다제 저해 능력을 pNPG를 이용하여 측정하였고, 알파-아밀라제의 저해 능력을 녹말가수분해 분석을 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 알파-글리코시다제 저해 능력은 50μL α-glucosidase(0.5 U/ml), 50μL 0.2M 인산버퍼(pH6.8)와 50μL의 시로미 추출물을 혼합하여 총 150μL의 시료를 제조하여 37 ℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 3mM pNPG(p-nitrophenyl glucopyranoside) 용액과 시료를 첨가하여 37 ℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 정지(stop) 용액(0.1M 750μl sodium carbonate)을 사용하여 중지시켰다. 흡광도는 405 nm에서 측정한 후 흡광도가 50%이상 감소할 때 나타나는 시료의 농도(IC50)로 표시하였다.
본 발명의 실시예 1의 시로미 지상부 추출물 또는 분획물에 대한 알파-글리코시다제 저해 능력을 표 5에, 실시예 2의 시로미 열매 추출물 또는 분획물에 대한 알파-글리코시다제 저해 능력을 표 6에 각각 나타내었다.
추출물 또는 분획물 | 알파-글리코시다제 저해 능력 IC50 (ug/ml) |
메탄올 조추출물 | 5.4±0.3 |
헥산 분획물 | >100 |
에틸아세테이트 분획물 | 0.6±0 |
부탄올 분획물 | 4.3±0.6 |
물 분획물 | >100 |
추출물 또는 분획물 | 알파-글리코시다제 저해 능력 IC50 (ug/ml) |
메탄올 조추출물 | 3.3±0.1 |
헥산 분획물 | >100 |
에틸아세테이트 분획물 | 0.5±0 |
부탄올 분획물 | 3.2±0.2 |
물 분획물 | 3.7±0 |
표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1의 시로미 지상부 추출물 또는 분획물에 대하여 메탄올 조추출물(IC50; 5.4±0.3 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC50; 0.6±0 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC50; 4.3±0.6 ㎍/㎖)에서 알파-글리코시다제 저해 효과를 나타내었으며, 특히 에틸아세테이트 분획물에서 매우 높은 알파-글리코시다제 저해 효과를 나타내었다. 반면에 헥산 분획물 및 물 분획물(IC50; >100㎍/㎖)은 다른 분획물에 비해 낮은 저해효과를 보였다.
또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 2의 시로미 열매 추출물 또는 분획물에 대하여, 메탄올 조추출물(IC50; 3.3±0.1 ㎍/㎖), 에틸아세테이트 분획물(IC50; 0.5±0 ㎍/㎖), 부탄올 분획물(IC50; 3.2±0.2 ㎍/㎖), 물 분획물(IC50; 3.7±0 ㎍/㎖)에서 알파-글리코시다제 저해 효과를 나타내었으며, 특히 에틸아세테이트 분획물에서 매우 높은 알파-글리코시다제 저해 효과를 나타내었다. 반면에 헥산 분획물(IC50; >100㎍/㎖)은 다른 분획물에 비해 낮은 저해효과를 보였다.
또한, 알파-아밀라제 분석을 위해, Kim et al. (2011)에 따라 녹말가수분해 분석을 수행했다. 구체적으로, 본 발명의 실시예 2의 시로미 열매 추출물 또는 분획물과 돼지 췌장의 알파-아밀라제의 혼합물 10 μl를 필터 페이퍼 디스크(filter paper disks)(Sterile Whatman No.1, 8 mm)를 통해 여과시킨 후 한천 배지에 배치하여 37-72시간 동안 반응시킨 후, 요오드 용액 (3% KI 내의 5 mM I2)으로 염색하여 알파-아밀라제 활성을 분석하였다. 저해 활성은 웰을 둘러싼 지역의 가수분해 지역의 직경에 근거하여 측정되었다. 결과를 표 7에 나타내었다.
추출물 또는 분획물 | 알파-아밀라제 활성 (mm) | |
100 ug/디스크 | 200 ug/디스크 | |
메탄올 조추출물 | 14 | 9 |
헥산 분획물 | 10 | 10 |
에틸아세테이트 분획물 | 9 | 0 |
부탄올 분획물 | 15 | 5 |
물 분획물 | 15 | 12 |
표 7에 나타낸 바와 같이, 알파-아밀라제에 의한 녹말의 분해는 200 g의 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에 의해 저해됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 시로미 지상부 및 열매 추출물의 메탄올, 에틸아세테이트, 부탄올 분획물의 항당뇨 효과를 확인하였으며, 특히 에틸아세테이트 분획물의 높은 알파-글리코시다제 저해 능력을 통해 시로미 추출물이 탄수화물 섭취 후의 식후 혈당을 줄여주는 잠재력이 있음을 확인하였다.
<실험예 3> 시로미 추출물의 항균 효과 실험
항균 활성의 분석을 위해 5종의 그람-양성균; 바실루스 아트로페우스(Bacillus atrophaeus, KACC 14742), 코쿠리아 리조필라(Kocuria rhizophila, KACC 14744), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus, KACC 14819), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, KACC 14822), 바실루스 섭틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. Spizizenii, KACC 14741)와 4종의 그람-음성균; 클랩시엘라 프네우모니아(Klebsiella pneumonia, KACC 14816), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae, KACC11958), 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카(Salmonella enterica subsp. enterica, KACC 10769), 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, KACC 10186)을 사용하여 실험하였다.
모든 균은 한국농업미생물자원센터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 획득하였다. 항균 활성은 (Hyun et al., 2014b)에 기술한 것에 따라 임계 희석법(critical dilution method)을 이용하여 분석하였다. 시로미 열매 메탄올 조추출물 및 분획물의 항균력은 시험관내 5개 그람-양성균과 4개의 그람-음성군에 대하여 측정되었고, 결과는 최소 저해 농도(minimal inhibitory concentration; MIC)로 나타냈다. 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
|
MIC (ug/ml) | ||||||||
B.a. | K.r. | M.l. | St.e. | B.s. | K.p. | E.c. | S.e. | P.a. | |
메탄올 조추출물 | 500 | 250 | 250 | 500 | 250 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
헥산 분획물 |
>1000 | 1000 | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 |
에틸아세테이트 분획물 | 125 | 125 | 63 | 125 | 1000 | 1000 | 1000 | 250 | 500 |
부탄올 분획물 | 500 | 250 | 500 | 500 | 500 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
물 분획물 |
>1000 | >1000 | 500 | 1000 | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 | >1000 |
B.a.: 바실루스 아트로페우스(Bacillus atrophaeus, KACC 14742), K.r.: 코쿠리아 리조필라(Kocuria rhizophila, KACC 14744), M.l.: 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus, KACC 14819), St.e.: 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis, KACC 14822), B.s.: 바실루스 섭틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp . Spizizenii, KACC 14741), K.p.: 클랩시엘라 프네우모니아(Klebsiella pneumonia, KACC 14816), E.c.: 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae, KACC11958), S.e.: 살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카(Salmonella enterica subsp . enterica, KACC 10769), 및 P.a.: 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, KACC 10186) |
표 8에 나타낸 바와 같이, 분획물 중에, 에틸아세테이트 분획물은 바실루스 아트로페우스 (MIC = 125 μg/ml), 코쿠리아 리조필라 (MIC = 125 μg/ml), 마이크로코커스 루테우스 (MIC = 63 μg/ml) 및 스타필로코커스 에피더미디스 (MIC = 125 μg/ml)에 대하여 좋은 항균효과를 냈다. 메탄올 조추출물은 다른 분획물과 비교하여 바실루스 섭틸리스 아종 스피지제니 (MIC = 250 μg/ml)에 대하여 유의적인 항균력을 보인 반면에, 헥산 분획물과 물 분획물은 시험에 이용된 모든 박테리아(균)에 대해 저항하는 것으로 나타났다. 이로부터 시로미 열매 추출물은 그람-음성균보다 그람-양성균에 대해 우수한 항균 활성을 나타냄을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (7)
- 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 시로미(Empetrum nigrum var. japonicum) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 시로미 추출물은 메탄올을 이용하여 추출한 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 분획물은 메탄올을 이용하여 추출한 메탄올 조추출물인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 분획물은 시로미 메탄올 조추출물을 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물을 이용하여 분획한 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제, 주사제, 경피 투여제, 또는 좌제의 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 조성물은 그람-양성균에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
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Journal of Agricultural and Food Chemistry. Vol.56(12), pp.4457-4462* * |
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