KR20150145282A

KR20150145282A - C1／r―s 형질전환 벼 유래의 신규 플라보노이드들

Info

Publication number: KR20150145282A
Application number: KR1020140074002A
Authority: KR
Inventors: 백남인; 조진경; 류하나; 송나영; 김대옥; 남태규
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2015-12-30
Also published as: KR101645032B1

Abstract

본 발명은 형질전환 벼 유래의 신규 플라보노이드 화합물에 대한 것이다.

Description

C1／R―S 형질전환 벼 유래의 신규 플라보노이드들{NOVEL FLAVONOIDS FROM C1/R-S TRANSGENIC RICE}

본 발명은 C1/R-S 형질전환 벼 유래의 신규 플라보노이드들에 대한 것이다.

플라보노이드들은 자연에서 흔하며, 식물 세포의 시토졸(cytosol) 내 말로닐-코에이(malonyl-CoA)로 축합에 의하여 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 유도체들로부터 합성된다(Fatland, B. L.; Ke, J.; Anderson, M. D.; Mentzen, W. I.; Cui, L. W.; Allred, C. C.; Johnston, J. L.; Nikolau, B. J.; Wurtele, E. S. Molecular characterization of a heteromeric ATP-citrate lyase that generates cytosolic acetyl-coenzyme A in Arabidopsis. Plant Physiol. 2002, 130, 740-756). 찰콘(chalcone), 플라바논(flavanone), 디하이드로플라보놀(dihyroflavonol), 안토시아닌(anthocyanin), 플라본(flavone), 플라보놀(flavonol), 이소플라보노이드(isoflavonoid), 및 카테킨(catechin)을 포함하는 다양한 구조 형태들이 있다. 이것들은 과일들, 채소들, 너트들, 씨앗들 및 줄기들에서 발견되며, 인간 식이의 흔한 구성성분을 대표한다. 플라바놀(flavanol)은 빨간 포도 및 레드와인에서 발견되며, 플라바논(flavanone)은 시트러스 식품들에 존재하고, 플라보논(flavone)은 녹색 잎 스파이스들에 풍부하고, 이소플라본(isoflavone)은 콩 식품들에서 발견되고 안토시아니딘(anthocyanidin)은 베리들에서 발견되고, 그리고 플라보놀(flavonol)은 거의 모든 식품들에서 발견된다(Beecher, G. R. Overview of dietary flavonoids: nomenclature, occurrence and intake. J. Nutr. 2003, 133, 32485-32545). 플라보노이드는 넓은 범위로 건강에 유익한 영향을 미친다. 그것들은 항바이러스, 항알레르기, 항혈소판, 항염증, 항암 및 항산화 활성들을 보이는 것으로 보고되었다. 퀘르세틴(플라보놀)(quercetin (flavonol)), 아피게닌(플라본(apigenin (flavone)) 및 나린게닌(플라바논(naringenin (flavanone))의 가장 잘 알려진 유익한 효과들은 그것들의 항산화 활성들이다.

C1/R-S 형질전환 벼(C1/R-S 벼)는 Oryza sativa spp. japonica cv. Hwa-Young (HY)(Shin, Y. M.; Park, H. J.; Yim, S. D.; Baek, N. I.; Lee, C. H.; An, G.; Woo, Y. M. Transgenic rice lines expressing maize C1 and R-S regulatory genes produce various flavonoids in the endosperm. Plant Biotechnol. J. 2006, 4, 303-315) 유래의 새로운 품종의 벼이다. 이 품종은 종피(coat) 또는 호분(aleurone) 층뿐 아니라, 씨앗 내, 특히 벼 배젖(endosperm) 조직에서 높은 플라보노이드 함량을 갖는데, 이는 배젖-특이적 프로모터가 옥수수(maize) C1 및 R-S의 발현을 조절하는데 사용되었기 때문이다. 배젖은 씨앗의 배아(embryo)를 둘러싼 영양조직이며, 우리가 먹는 벼 곡물(즉, 쌀)의 대부분을 구성한다.

C1/R-S 벼 씨앗들 내 총 플라보노이드 함량은 비형질전환 벼 품종 Hwa-Young(이하, “HY”라 한다) 내 그것보다 14배 더 높다고 알려져 있다(Yi, G.; Baek, N. I.; Park, D. S.; Park, S. K.; Manigbas, N. L.; Cho, J. G.; Ahn, J. G.; Woo, Y. M. Characterization of a hybrid population from a cross between a black waxy rice cultivar and transgenic rice with high levels of flavonoids in the endosperm. Philipp. J. Crop Sci. 2009, 34, 68-77.). 더군다나, HY과 비교할 때 C1/R-S 벼의 액체 크로마토그래피-질량 분석기-질량 분석기(liquid chromatography-mass spectrometry-mass spectrometry)(LC-MS/MS)를 통하여 많은 플라보노이드들이 확인되었다. 본 발명자들은 C1/R-S 형질전환 벼를 연구하던 중 상기 C1/R-S 벼로부터 신규 플라보노이드를 분리하고 이를 조사하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 C1/R-S 형질전환 벼 유래의 신규 플라보노이드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 C1/R-S 형질전환 벼 유래의 신규 플라보노이드를 제공한다.

본 발명의 신규 플라보노이드들은 항산화 활성을 갖는다.

도 1은 벼 추출물 유래 플라보노이드들의 HPLC 프로파일들이다. (A) 형질전환 벼 품종, 즉 Oryza sativa spp. japonica cv. Hwa-Young, C1/R-S 형질전환 벼 유래의 플라보노이드들의 HPLC 프로파일. (B) C1/R-S 벼/HY 교배종 유래의 플라보노이드들의 HPLC 프로파일. (C) Hwa-Young (HY) 유래의 플라보노이드들 및 화합물 1 내지 5, 화합물 7 및 8의 HPLC 프로파일. HPLC 분석은 용매 A (0.1% 포름산) 및 B (MeOH/acetonitrile = 1:1)로 기울기 용리(gradient elution)로 C18 칼럼 (Agilent, Eclipse Plus C18, 1.8 μm, 100 × 2.1 mm)에서 수행하였다. B의 농도는 0-30분에 5-30%, 30-40 분에 30-100%, 40-54 분에 100-100%, 54-55 분에 100-2%였다. 유속은 0.2 mL/분이었고, 주입(injection) 부피는 2 μL이었으며, 광다이오드 어레이 디텍터는 280 nm에서 사용하였다.

본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염에 대한 것이다.

<화학식 1>

<화학식 2>

이 때, R4 및 R5는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 포함하는 식품 조성물에 대한 것이다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 포함하는 화장료 조성물에 대한 것이다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 포함하는 사료 조성물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

벼를 추출하는 단계;및

상기 벼 추출물로부터 하기 화학식 1 또는 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 분리하는 단계를 포함하는,

항산화 물질의 제조 방법에 대한 것이다.

<화학식 1>

이 때, R1 내지 R3는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

<화학식 2>

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

화학식 1의 화합물

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 및 그 허용 가능한 염에 대한 것이다. 또한 본 발명은, 하기 화학식 1의 화합물 및 그 허용 가능한 염을 포함하는 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물에 대한 것이다.

<화학식 1>

이 때, R1 내지 R3는 각각 H, 알킬, 글루코피라노실(glucopyranosyl), 글루코퓨라노실(glucofuranosyl) 및 셀로비오실(cellobiosyl)로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

바람직하게는, 상기 알킬은 탄소 수 5 이하의 알킬로, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 등이나 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는 상기 알킬은 가지달린 알킬 또는 가지없는 알킬이다.

상기 글루코피라노실은 알파-D-글루코피라노실 또는 베타-D-글루코피라노실이고, 바람직하게는 베타-D-글루코피라노실이다.

상기 글루코퓨라노실은 알파-D-글루코퓨라노실 또는 베타-D-글루코퓨라노실이고, 바람직하게는 베타-D-글루코퓨라노실이다.

상기 R1 내지 R3는 각각 H, 알킬, 글루코피라노실(glucopyranosyl), 글루코퓨라노실(glucofuranosyl) 및 셀로비오실(cellobiosyl)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는 상기 R1 내지 R3는 각각 H 및 글루코피라노실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다. 더욱 바람직하게는 상기 R1 및 R2 중 적어도 어느 하나는 글루코피라노실이다.

화학식 2의 화합물

본 발명은 하기 화학식 2의 화합물 및 그 허용 가능한 염에 대한 것이다. 또한 본 발명은, 하기 화학식 2의 화합물 및 그 허용 가능한 염을 포함하는 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물에 대한 것이다.

<화학식 2>

이 때, R4 및 R5는 각각 H, 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

상기 R4 및 R5는 각각 H, 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는 상기 R4 및 R5는 각각 H, 글루코피라노실, 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다. 더욱 바람직하게는 상기 R4는 셀로비오실이거나, 또는 상기 R4 및 R5는 모두 글루코피라노실이다.

화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 특성

본 발명의 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염은 천연물 유래이거나 또는 합성된 화합물 등이다. 바람직하게는 상기 화합물 또는 염은 벼 유래이며, 바람직하게는 형질전환 벼 유래이고, 더욱 바람직하게는 C1/R-S 형질전환 벼 유래이다.

본 발명의 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염은 항산화 물질이며, 바람직하게는 ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능을 갖는 플라보노이드 화합물이다. 구체적으로 본 발명의 신규 플라보노이드 화합물들은 200 내지 1,000 mg VCE/g의 ABTS 라디칼 소거능을 갖고, 또한 5 내지 100 mg VCE/g의 DPPH 라디칼 소거능을 갖는다.

식품 조성물

본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 포함하는 식품 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 첨가하는 것도 포함된다.

본 발명의 식품 조성물은, 본 발명의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 그 허용가능한 염은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량%에 대하여 0.1 내지 70 중량%, 바람직하게는 2 내지 50 중량%로 첨가될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

화장료 조성물

본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 포함하는 화장료 조성물에 대한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은, 당업계의 통상적으로 제조되는 어떠한 제형에도 제조될 수 있으며 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 제형으로 제조될 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 효과적인 경피 흡수를 위하여 피부 침투 촉진제를 포함할 수 있다. 상기 피부 침투 촉진제는 당 업계에서 화장료 조성물에 사용하는 일반적인 피부 침투 촉진제면 되고, 특별히 제한되는 것은 아니다. 예컨대 본 발명의 피부 침투 촉진제는 디메틸 설폭사이드, oleic acid 등 지방산/에스테르 화합물, 리모넨(limonene) 등이 될 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물을 이용 시에는 충격파, 이온삼투요법, 전기침공법, 미세침요법 등 물리적 방법을 병용하여 경피 흡수를 촉진할 수도 있다.

사료 조성물

본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 포함하는 사료 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 사료 조성물은 통상적인 사료와 함께 배식할 수 있으며, 본 발명의 사료 조성물을 통상적인 사료 조성물에 첨가하여 기능성 사료 조성물을 제조하여 이용할 수도 있다. 또한 본 발명의 사료 조성물은 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염 외 기능성 성분을 추가로 포함할 수도 있다. 상기 통상적인 사료 조성물과 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염이 혼합된 기능성 사료 조성물의 제조 시, 본 발명의 화합물 또는 그 허용가능한 염은 총 사료 조성물에 대하여 0.01 내지 30.00 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 20.00 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 사료 조성물의 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염의 유효용량은 상기 식품 조성물의 유효 용량에 준해서 사용할 수 있으나, 지속적인 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 필요에 따라 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 가축 또는 가금을 대상으로 한다. 상기 가축 또는 가금은 소, 돼지, 닭, 말, 양, 당나귀, 노새, 멧돼지, 토끼, 메추라기, 집오리, 장닭, 투계용 닭, 비둘기, 칠면조, 개, 고양이, 원숭이, 햄스터, 생쥐, 래트, 구관조, 앵무새, 잉꼬, 카나리아 등이나 이들에 제한되는 것은 아니며 가정 내에서 사육 가능한 인간 이외의 포유 동물 또는 조류이면 본 발명의 사료 조성물의 대상이라 할 것이다.

항산화 물질의 제조 방법

본 발명은 벼를 추출하는 단계; 및 상기 벼 추출물로부터 상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용 가능한 염을 분리하는 단계를 포함하는 항산화 물질의 제조 방법에 대한 것이다.

상기 벼 추출 단계는 벼를 초임계 이산화 탄소 또는 유기 용매로 추출하는 것이며, 바람직하게는 탄소 수 3 이하의 저가 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 물로 추출하고, 더욱 바람직하게는 상기 저가 알코올은 메탄올, 에탄올 또는 프로판올이다. 바람직하게는 상기 벼를 유기 용매를 이용하여 추출한 후 상기 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물 등으로 분획하고, 상기 분획물로부터 화학식 1 또는 2의 화합물을 분리한다. 예컨대, 본 발명의 항산화 물질 제조 방법은 벼를 메탄올, 에탄올 등으로 추출한 후 상기 추출물을 에틸아세테이트, 물, 부탄올 등으로 분획하여 화학식 1 또는 2의 화합물을 분리하여 수행할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<재료 및 방법들>

재료

C1/R-S 벼 곡물들은 2008년 5월 포항대학교로부터 제공받아서 사용하였다. 그 외 도구들 및 화합물들은 Yi, G.; Baek, N. I.; Park, D. S.; Park, S. K.; Manigbas, N. L.; Cho, J. G.; Ahn, J. G.; Woo, Y. M. Characterization of a hybrid population from a cross between a black waxy rice cultivar and transgenic rice with high levels of flavonoids in the endosperm. Philipp. J. Crop Sci. 2009, 34, 68-77, Cho, J. G.; Lee, D. Y.; Lee, J. Y.; Lee, D. G.; Lee, Y. H.; Kim, S. Y.; Kim, S. H.; Baek, N. I. Acyclic diterpenoids from the leaves of Capsicum annuum. J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 2009, 52, 128-132, 및 Wu, Q.; Cho, J. G.; Lee, D. S.; Lee, D. Y.; Song, N. Y.; Kim, Y. C.; Lee, K. T.; Chung, H. G.; Choi, M. S.; Jeong, T. S.; Ahn, E. M.; Kim, G. S.; Baek, N. I. Carbohydrate derivatives from the roots of Brassica rapa ssp. campestris and their effects on ROS production and glutamate-induced cell death in HT-22 cells. Carbohydr. Res. 2013, 372, 9-14에 기초하여 준비하였다.

HPLC 를 이용한 플라보노이드들의 정량 분석

본 발명의 플라보노이드들을 70% 메탄올 3.5 mL에 분말 500 mg으로부터 추출하였다. 상기 플라보노이드들을 HPLC를 이용하여 정량분석하는 공정은 2분간 활발한 볼텍싱, 30분간 초음파 처리(sonication) 및 실온에서 3시간 동안 배양을 수반하였다. 혼합물이 20 분 간 180 rpm에서 원심분리된 후, 0.9 mL의 상등액이 수득되었다. 지질(lipids)을 제거하기 위하여 n-헥산(hexane) 0.9 mL로 분배(partitioning)한 후, 남은 액을 취하여 0.45 μm 시린지(syringe) 필터를 통하여 여과하였다. High-performance liquid chromatography (HPLC) (Agilent 6410B, RRLC system, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 분석이 C18 칼럼(Agilent, Eclipse Plus C18, 1.8 μm, 100 × 2.1 mm)에서 기울기 용리(gradient elution)로 용매들 A(solvents A)(0.1% 포름산(formic acid)) 및 B (메탄올/아세토니트릴(acetonitrile) = 1:1)로 수행되었다. B의 농도는 0-30 분에 5-30%, 30-40 분에 30-100%, 40-54 분에 100-100%, 그리고 54-55 분에 100-2%였다. 유속(flow rate)는 0.2 mL/분이고, 주입(injection) 부피는 2 μL이고, 그리고 광다이오드(photodiode) 어레이 디텍터(detector)는 280 nm에서 사용되었다.

자유 라시칼 소거 활성 측정

2,2′-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)는 van den Berg 등(van den Berg R.; Haenen, G. R. M. M.; van den Berg, H.; Bast, A. Applicability of an improved Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay for evaluation of antioxidant capacity measurements of mixtures. Food Chem. 1999, 66, 511-517)의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 소거 활성은 Brand-Williams 등(Brand-Williams, W.; Cuvelier, M. E.; Berset, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm.-Wiss. Technol.1995, 28, 25-30)의 방법을 변형한 방법으로 측정하였다.

<실험예 1> C1/R-S 벼 낱알들의 추출 및 플라보노이드들의 분리

백미의 C1/R-S 벼 낱알들의 건조 분말(1.6 kg)을 실온에서 12시간 동안 80% 메탄올 (5 L × 4)로 추출하였다. 상기 추출물을 여과지를 통하여 여과하였고, 로터리 진공 증발기(rotary vacuum evaporator)에서 농축하여 갈색을 띤 잔사(residue)를 얻었다(52 g). 잔사는 물 500 mL에서 현탁되고 EtOAc (500 mL × 3) 및 n-부탄올 (400 mL × 2)로 차례로 분배되어, EtOAc (C1RSRE, 5 g), n-부탄올 (C1RSRB, 9 g), 및 물 (38 g)의 농축된 추출물들을 순차로 얻었다.

EtOAc 획분 (C1RSRE, 5 g)을 플래쉬 실리카 겔(flash silica gel (SiO2)) 칼럼 크로마토그래피(Biotage SNAP Cartridge 100 g, Biotage, Uppsala, Sweden)로 분획하고, n-헥산(hexane)/EtOAc (8:1, 3 L → 5:1, 2 L) 및 CHCl3/MeOH (15:1 → 7:1, each 1.5 L)로 용리시켜, 14개 획분들을 얻었다(C1RSRE-1 내지 C1RSRE-14). TLC 시험을 통하여 확인된 플라보노이드가 풍부한 획분들인 C1RSRE-10, -13, 및 -14가 플라보노이드들의 추가적인 분리를 위하여 선택되었다. C1RSRE-10 [751 mg, elution volume/total volume (Ve/Vt ) 0.67-0.72]을 ODS 칼럼 크로마토그래피 (3.5 cm × 4.5 cm)에 가하고, 아세톤/물(2:1, 2.0 L → 4:1, 1.0 L)로 용리시켜 17개 획분들을 얻었다(C1RSRE-10-1 내지 C1RSRE-10-17). C1RSRE-10-1 (118 mg, Ve/Vt 0.00-0.03)를 옥타데실(octadecyl) SiO2 (ODS) 칼럼 크로마토그래피 (3.0 × 4.0 cm)에 가하고, 메탄올/물(5:7, 1.0 L)로 용리시켜, 20개 획분들을 얻었으며(C1RSRE-10-1-1 내지 C1RSRE-10-1-20), 결국 화합물 1[C1RSRE-10-1-4, 28.4 mg, Ve/Vt 0.11-0.16, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.60, 메탄올/물 = 2:1]을 얻었다. C1RSRE-13 (368 mg, Ve/Vt 0.83-0.93)은 ODS 칼럼 크로마토그래피 (3.5 cm × 4.5 cm)로 분리되었으며(separate), 메탄올/물(2:5, 2.0 L → 2:3, 0.5 L)로 용리되었으며, 15개 획분들을 얻었고(C1RSRE-13-1 내지 C1RSRE-13-15), 결국 화합물 2[C1RSRE-13-2, 37.5 mg, Ve/ Vt 0.02-0.11, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.60, MeOH/H2O = 1:1] 및 화합물 3[C1RSRE-13-7, 32 mg, Ve/Vt 0.27-0.48, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.55, MeOH/H2O = 1:1]을 얻었다. C1RSRE-13-15 (100 mg, Ve/Vt 0.93-1.00)는 ODS 크로마토그래피(3.0cm × 3.0 cm)에 의하여 분리되었으며 아세톤/물(2:3, 1.0 L)로 용리시켰고, 6개의 획분들(C1RSRE-13-15-1 내지 C1RSRE-13-15-6) 및 분리된 화합물 4 [C1RSRE-13-15-2, 12 mg, Ve/Vt 0.16-0.37, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.59, 아세톤/물 = 3:2]를 얻었다. C1RSRE-14 획분 (218mg, Ve/Vt 0.93-1.00)을 ODS 칼럼 크로마토그래피 (3.0 cm × 4.0 cm)에 가했으며, 아세톤/물(1:2, 1.2 L)로 용리시키고, 10개의 획분들(C1RSRE-14-1 내지 C1RSRE-14-10)을 얻었으며, 결국 화합물 5[C1RSRE-14-6, 5 mg, Ve/Vt 0.49-0.54, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.31, 아세톤/물 = 2:3]를 얻었다.

농축된 n-부탄올 획분(C1RSRB, 9 g)을 SiO2 칼럼 크로마토그래피(8.0 cm × 13.0 cm)에 가하였으며, CHCl3/메탄올/물 (8:3:1, 16 L → 5:3:1, 6 L)의 구배(gradient)로 용리시켜, 10개의 획분들(C1RSRB-1 내지 C1RSRB-10)을 얻었다. n-부탄올 획분으로부터 얻은 획분들 중, 플라보노이드-풍부한 획분들 C1RSRB-4, -7, 및 -8이 플라보노이드들의 추가적인 분리에 사용되었다.

C1RSRB-4 획분(1.26 g, Ve/Vt 0.13-0.20)을 ODS 칼럼 크로마토그래피 (4.5 cm × 4.5 cm)에 가하였으며, 메탄올/물(2:5, 1L → 1:1, 0.5 L)로 용리시켰으며, 8개의 획분들(C1RSRB-4-1 내지 C1RSRB-4-8)을 생산하였다. 획분 C1RSRB-4-1 (204 mg, Ve/Vt 0.00-0.14)을 ODS 칼럼 크로마토그래피(3.3 cm × 3.0 cm)에 가하였으며, 메탄올/물(1:4, 0.8 L → 1:3, 0.6 L)로 용리시켜, 13개의 획분들(C1RSRB-4-1-1 내지 C1RSRB-4-1-13)을 얻고, 결국 화합물 6 [C1RSRB-4-1-7, 7.9 mg, Ve/Vt 0.59-0.65, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.56, MeOH/H2O = 1:1]을 얻었다. 획분 C1RSRB-7 (1.7 g, Ve/Vt 0.42-0.67)를 ODS 칼럼 크로마토그래피(4.5 cm × 5.0 cm)에 가하고, 아세톤/물(2:5, 1 L → 1:1, 0.5 L)로 용리시켜, 11개 획분들(C1RSRB-7-1 내지 C1RSRB-7-11)을 얻고, 결국 화합물 7 [C1RSRB-7-5, 10 mg, Ve/Vt 0.21-0.27, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.55, MeOH/H2O = 2:1]을 얻었다.

획분 C1RSRB-8 (1.4 g, Ve/Vt 0.67-0.78)를 플래쉬 ODS 칼럼 크로마토그래피(Biotage SNAP Cartridge KP-C18-HS 30 g, Biotage)에 가하고, 아세톤/물(1:5, 0.9 L → 2:3, 0.5L)로 용리하여, 14개 획분들(C1RSRB-8-1 to C1RSRB-8-14)을 얻었다. 획분 C1RSRB-8-5 (80 mg, Ve/Vt 0.32-0.39)을 세파덱스(Sephadex) LH-20 칼럼 크로마토그래피 (3.0 cm × 40.0 cm, acetone 33%, 0.8 L → 100%, 0.5 L)에 가하였고, 7개의 획분들(C1RSRB-8-5-1 내지 C1RSRB-8-5-7)을 얻고, 결국 화합물 8 [C1RSRB-8-5-3, 7.5 mg, Ve/Vt 0.50-0.54, TLC (RP-18 F254s) Rf 0.67, acetone/H2O = 2:3]을 얻었다.

<실험예 2> 분리된 화합물들의 확인

3′-O- 메틸탁시폴린 ( methyltaxifolin ) (화합물 1)

노란색 무정형 분말(메탄올); mp 200-205 ℃; [α]D 25 +10.5°(c 3.6, MeOH); EI/MS m/z 318 [M]+, 289, 261, 166, 165, 164, 153, 137, 124, 95, 77, 69, 55; IR (CaF2, ν, cm^-1) 3420, 1007, 849, 816; 1H 및 13C NMR 데이터는 타문헌들과 일치한다(Wang, X.; Zhou, H.; Zeng, S. Identification and assay of 3′-Omethyltaxifolin by UPLC-MS in rat plasma. J. Chromatogr., B 2012, 911, 34-42, Alberto Marco, J.; Sanz-Cervera, J. F.; Yuste, A.; Carmen Oriola, C. Sesquiterpene lactones and dihydroflavonols from Andryala and Urospermum species. Phytochemistry 1994, 36, 725-729).

3′-O- 메틸탁시폴린 ( Methyltaxifolin )-7-O-β-D- 글루코피라노사이드 (glucopyranoside) (화합물 2)

노란색 무정형 분말(메탄올); [α]D26 -41.7°(c 0.8, MeOH); 음성 HRFAB/MS m/z 479.1189 [M^-H]^-(calcd for C22H23O12, 479.1190); IR (CaF2, ν, cm^-1) 3391, 2924, 1645, 1578, 1519, 1455, 1278, 1171, 1075, 1027; 1H NMR (400 MHz, CD3OD, δH) 7.08 (1H, br s, H-2′), 6.93 (1H, br d, J = 8.0 Hz, H-6′), 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.17 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.15 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 4.96 (1H, d, J = 12.0 Hz, H-2), 4.94 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1″), 4.58 (1H, d, J = 12.0 Hz, H-3), 3.84 (3H, s, 3′-OCH3), 3.82 (1H, dd, J = 12.0, 1.6 Hz, H-6″a), 3.65 (1H, dd, J = 12.0, 5.2 Hz, H-6″b), 3.44-3.28 (4H, H-2″, -3″, -4″, -5″); 13C NMR (100 MHz, CD3OD, δC) 199.1 (C-4), 166.9 (C-7), 164.4 (C-5), 163.9 (C-9), 148.6 (C-3′), 148.1 (C-4′), 129.4 (C-1′), 122.1 (C-6′), 115.8 (C-5′), 112.2 (C-2′), 103.3 (C-10), 101.1 (C-1″), 98.2 (C-8), 96.9 (C-6), 85.2 (C-2), 78.1 (C-3″), 77.6 (C-5″), 74.5 (C-2″), 73.6 (C-3), 70.9 (C-4″), 62.1 (C-6″), 56.4 (3′-OCH3).

3′-O- 메틸탁시폴린 ( Methyltaxifolin )-4′-O-β-D- 글루코피라노사이드 (glucopyranoside) (화합물 3)

밝은 노란색 분말 (CHCl3/메탄올); [α]D 27-35.7° (c 0.39, CHCl3/MeOH); 음성 HRFAB/MS m/z 479.1189 [M-H]- (calcd for C22H23O12, 479.1190); IR (CaF2, ν, cm^-1) 3390, 1644, 1595, 1514, 1464, 1265, 1166, 1074; 1H NMR (400 MHz, C5D5N, δH) 7.63 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5′), 7.46 (1H, br s, H-2′), 7.34 (1H, br d, J = 8.4 Hz, H-6′), 6.51 (1H, br s, H-6), 6.39 (1H, br s, H-8), 5.71 (1H, d, J = 6.8 Hz, H-1″), 5.43 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-2), 5.01 (1H, d, J = 11.6 Hz, H-3), 4.51 (1H, br d, J = 11.6 Hz, H-6″a), 4.44-4.06 (5H, H-2″, -3″, -4″, -5″, -6″b), 3.66 (3H, s, 3′-OCH3); 13C NMR (100 MHz, C5D5N, δC) 198.3 (C-4), 168.6 (C-7), 164.9 (C-5), 163.6 (C-9), 149.9 (C-3′), 148.3 (C-4′), 131.9 (C-1′), 121.6 (C-6′), 115.6 (C-5′), 112.6 (C-2′), 101.9 (C-1″), 101.6 (C-10), 97.5 (C-6), 96.2 (C-8), 84.6 (C-2), 78.8 (C-3″), 78.5 (C-5″), 74.8 (C-2″), 73.1 (C-3), 71.1 (C-4″), 62.2 (C-6″), 55.9 (3′-OCH3).

브라시신 ( Brassicin ) (화합물 4)

노란색 결정들(crystals)(메탄올); mp 214-216 °C; [α]D 26.7-39.3° (c 0.2, MeOH); EI/MS m/z 478 [M]+; IR (CaF2, ν, cm^-1) 3367, 1649, 1595, 1514, 1498, 1285, 1206, 1170, 1073, 1027; 1H 및 13C NMR 데이터는 다른 논문과 일치하였다(El-Ghazooly, M. G.; El-Lakany, A. M.; Abou-Shoer, M. I.; Aly, A. H. Chemical constituents of Helichrysum conglobatum growing in Egypt. Nat. Prod. Sci. 2003, 9, 213-219.)

이소람네틴 ( Isorhamnetin )-4′-O-β-D- 글루코피라노사이드 ( glucopyranoside ) (화합물 5)

노란색 분말 (메탄올); [α]D 26.8-31.9°(c 0.06, 메탄올); 양성 FAB/MS m/z 479 [M + H]+; IR (CaF2, ν, cm^-1) 3450, 1654, 1560; 1H 및 13C NMR 데이터는 다른 논문과 일치하였다(Park, Y. K; Lee, C. Y. Identification of isorhamnetin 4′-glucoside in onion. J. Agric. Food Chem. 1996, 911, 34-42., Al-Oqail, M. M.; Al-Rehaily, A. J.; Hassan, W. H. B.; Ibrahim, T.A.; Ahmad, M. S.; Ebada, S. S.; Proksch, P. New flavonol glycosides from Barbeya oleoides Schweinfurth. Food Chem. 2012, 132, 2081-2088)

3′-O- 메틸탁시폴린 ( Methyltaxifolin )-5-O-β-D- 글루코피라노사이드 (glucopyranoside) (화합물 6)

노란색 무정형 분말(메탄올); [α]D 26.9-31.1°(c 0.34, 메탄올); 음성 FAB/MS m/z 479 [M-H]-; IR (CaF2, ν, cm^-1) 3367, 2924, 1654, 1609, 1519, 1450, 1372, 1278, 1073, 1029; 1H 및 13C NMR 데이터는 다른 논문과 일치하였다(Liu, X.; Ma, T.; Wang, M.; Chen, B.; Wang, H. The scavenging effect of phenolic compounds from Celastrus angulatus maximum on hydroxyl free radicals. Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa 1999, 11, 11-14)

브라시신 ( Brassicin )-4″-O-β-D- 글루코피라노사이드 ( glucopyranoside ) (화합물 7)

노란색 무정형 분말(메탄올); [α]D 26.7-87.8°(c 0.54, CHCl3/MeOH); 음성 HRFAB/MS m/z 639.1566 [M-H]- (calcd for C28H31O17, 639.1561); IR (CaF2, ν, cm^-1) 3334, 1704, 1649, 1616, 1596, 1500, 1356, 1318, 1285, 1207, 1166, 1071, 1027; 1H NMR (400 MHz, CD3OD, δH) 7.81 (1H, br s, H-2′), 7.68 (1H, br d, J = 8.0 Hz, H-6′), 6.88 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.69 (1H, br s, H-6), 6.41 (1H, br s, H-8), 5.08 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1″), 4.45 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1”’), 3.89 (3H, s, 3′-OCH3), 3.98-3.24 (12H, H-2″, -3″, -4″, -5″, -6″, -2”’, -3”’, -4”’, -5”’, -6”’); 13C NMR (100 MHz, CD3OD, δC) 177.5 (C-4), 164.3 (C-5), 162.1 (C-7), 157.6 (C-9), 150.0 (C-4′), 148.5 (C-2), 148.4 (C-3′), 136.0 (C-3), 123.9 (C-1′), 122.9 (C-6′), 116.3 (C-5′), 112.6 (C-2′), 106.2 (C-10), 104.6 (C-1”’), 101.3 (C-1″), 100.1 (C-6), 95.8 (C-8), 80.2 (C-4″), 78.1 (C-5”’), 77.9 (C-3”’), 76.8 (C-5″), 76.2 (C-3″), 74.9 (C-2”’), 74.5 (C-2″), 71.4 (C-4”’), 62.5 (C-6”’), 61.6 (C-6″), 56.7 (3′-OCH3).

브라시신 ( Brassicin )-4′-O-β-D- 글루코피라노사이드 ( glucopyranoside ) (화합물 8)

노란색 무정형 분말(메탄올); [α]D 26.5-69.7°(c 0.09, MeOH); negative HRFAB/MS m/z 639.1566 [M-H]- (calcd for C28H31O17, 639.1561); IR (CaF2, ν, cm^-1) 3327, 1647, 1595, 1502, 1356, 1069; 1H NMR (400 MHz, C5D5N, δH) 8.52 (1H, br s, H-2′), 8.35 (1H, br d, J = 8.8 Hz, H-6′), 7.96 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5′), 7.42 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.12 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6.10 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1″), 6.08 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1”’), 4.86-4.47 (12H, H-2″, -3″, -4″, -5″, -6″, -2”’, -3”’, -4”’, -5”’, -6”’), 4.17 (3H, s, 3′-OCH3); 13C NMR (100 MHz, C5D5N, δC) 177.8 (C-4), 163.7 (C-7), 162.1 (C-9), 156.6 (C-5), 150.1 (C-3′), 149.2 (C-4′), 147.1 (C-2), 135.3 (C-3), 125.8 (C-1′), 121.9 (C-6′), 115.5 (C-5′), 112.6 (C-2′), 106.0 (C-10), 101.8 (C-1″), 101.7 (C-1”’), 99.7 (C-6), 95.1 (C-8), 79.3, 79.1 (C-5″, -5”’), 78.6 (C-3″, -3”’), 74.8 (C-2″,-2”’), 71.2 (C-4″, -4”’), 62.3 (C-6″, -6”’), 56.0 (3′-OCH3).

<실험예 3> 플라보노이드들의 구조 확인

C1/R-S 벼의 메탄올 추출물들을 에틸아세테이트(EtOAc), n-부탄올 및 물을 이용하여 분획하였다. TLC 실험으로 수성(aqueous) 획분이 주로 글루코스 및 수크로스와 같은 당들로 이루어졌다는 것이 확인되었기 때문에, 유기상이 활성 메타볼라이트들의 추가적인 분리를 위하여 사용되었다. 에틸아세테이트 및 n-부탄올 획분으로부터, 4개의 신규 플라보노이드들(화합물 2, 3, 7, 및 8) 및 4개의 공지의 플라보노이드들(화합물 1, 4, 5, 및 6)이 반복된 SiO2, ODS, and Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피들을 통하여 분리되었다. 공지의 화합물들인 디하이드로플라보놀들(dihydroflavonols)(화합물 1 및 6) 및 플라보놀들(flavonols) (화합물 4 및 5)는 분광데이터들, 즉, NMR, MS, IR, 및 특이적 회전값(rotation value)을 기초로 하여, 각각 (+)-3′-O-메틸탁시폴린(methyltaxifolin), 3′-O-메틸탁시폴린(methyltaxifolin)-5-O-β-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside), 브라시신(brassicin), 및 이소람네틴(isorhamnetin)-4′-O-β-D-글루코피라노사이드(glucopyranoside)로 확인되었고, 문헌들에 기재된 이들의 데이터와의 비교에 의하여 확정되었다(Wang, X.; Zhou, H.; Zeng, S. Identification and assay of 3′-Omethyltaxifolin by UPLC-MS in rat plasma. J. Chromatogr., B 2012, 911, 34-42, Alberto Marco, J.; Sanz-Cervera, J. F.; Yuste, A.; Carmen Oriola, C. Sesquiterpene lactones and dihydroflavonols from Andryala and Urospermum species. Phytochemistry 1994, 36, 725-729, El-Ghazooly, M. G.; El-Lakany, A. M.; Abou-Shoer, M. I.; Aly, A. H. Chemical constituents of Helichrysum conglobatum growing in Egypt. Nat. Prod. Sci. 2003, 9, 213-219, Park, Y. K; Lee, C. Y. Identification of isorhamnetin 4′-glucoside in onion. J. Agric. Food Chem. 1996, 911, 34-42, Al-Oqail, M. M.; Al-Rehaily, A. J.; Hassan, W. H. B.; Ibrahim, T. A.; Ahmad, M. S.; Ebada, S. S.; Proksch, P. New flavonol glycosides from Barbeya oleoides Schweinfurth. Food Chem. 2012, 132, 2081-2088, Liu, X.; Ma, T.; Wang, M.; Chen, B.; Wang, H. The scavenging effect of phenolic compounds from Celastrus angulatus maximum on hydroxyl free radicals. Tianran Chanwu Yanjiu Yu Kaifa 1999, 11, 11-14).

화합물 2는 노란색 무정형 분말로서 수득되었으며, IR 스펙트럼에서 하이드록실(hydroxyl)기 (3391 cm_-1) 및 방향족 이중 결합 (1645, 1455 cm^-1) 때문에 흡수 밴드를 보였다. 고해상도 음성(high-resolution negative) FABMS(calcd for C22H23O12, 479.1190)의 m/z 479.1189에서 분자(pseudomolecular) 이온 피크 [M- H]-로부터 분자식은 C22H24O12로 확인되었다. 1H NMR 스펙트럼에서, δH 7.08 (1H, br s), 6.93 (1H, br d, J = 8.0 Hz), 및 6.80 (1H, d, J = 8.0 Hz)에서 관찰된 3개의 올레핀 메틴(methine) 프로톤들은 전형적인 1,2,4-삼치환된(trisubstituted) 벤젠 고리이며, δH 6.17 (1H, d, J = 2.0 Hz) 및 6.15 (1H, d, J = 2.0 Hz)에서 관찰된 2 개의 올레핀 메틴 프로톤들은 A 고리에서 메타 커플링된(meta coupling) 양성자들 때문이었다. 디하이드로플라보놀(dihydroflavonol)의 H-2 및 H-3에 기인하여, δH 4.96 및 4.58 (각각 1H, d, J = 12.0 Hz)에서 두 개의 산소화된(oxygenated) 메틴(methine) 프로톤들이 관찰되었으며, 결합 상수(coupling constant)는 두 개의 프로톤들이 트랜스 컨피규레이션(trans configuration)에 있다는 것을 가리켰다. 당 모이어티(moiety)에서 기인하는 하나의 아노머(anomer) 프로톤(δH 4.94, 1H, d, J = 7.6 Hz), 4 개의 산소화된 메틴 프로톤들(δH 3.44-3.28), 및 하나의 산소화된 메틸렌 프로톤(δH 3.82, 1H, dd, J = 12.0, 1.6 Hz, H-6″a; 3.65, 1H, dd, J = 12.0, 5.2 Hz, H-6″b)이 관찰되었고, 하나의 메톡시 프로톤(δH 3.84, 3H, s, 3'- OCH3)이 또한 관찰되었다. 프로톤 NMR로부터 화합물 2가 하나의 메톡시 및 하나의 헥소스(hexose)를 갖는 5,7,3′,4′-테트라하이드록시 디하이드로플라보놀(5,7,3′,4′-tetrahydroxy dihydroflavonol)이었다는 결론을 내렸다. 13C NMR 스펙트럼에서, 하나의 메톡시(δC 56.4)를 포함하는 22개 탄소들 및 하나의 헥소스가 관찰되었다. 각각의 탄소의 다중도(multiplicity)는 distortionless enhancement by a polarization transfer (DEPT) 실험을 이용하여 결정되었다. δC 199.1 (C-4)에서 하나의 케톤 탄소; δC 166.9 (C-7), 164.4 (C-5), 163.9 (C-9), 148.6 (C-3′), 및 148.1 (C-4′)에서 5개의 산소화된 올레핀 4차 탄소들; δC 129.4 (C-1′) 및 103.3 (C-10)에서 두 개의 올레핀 4차 탄소들; δC 122.1 (C-6′), 115.8 (C-5′), 112.2 (C-2′), 98.2 (C-8), 및 96.9 (C-6) 에서 5개의 올레핀 메틴 탄소들; 그리고 δC 85.2 (C-2) and 73.6 (C-3)에서 2 개의 산소화된 메틴 탄소들이 관찰되었다. 당은 당 모이어티의 탄소들의 화학적 이동(shifts)로부터 β-D-글루코피라노스(glucopyranose)로 확인되었으며; δC 101.1 (C-1″)에서 헤미아세탈 탄소; δC 78.1 (C-3″), 77.6 (C-5″), 74.5 (C-2″), 및 70.9 (C-4″)에서 4개의 산소화된 메틴 탄소들; 및 δC 62.1 (C-6″)에서 산소화된 메틸렌 탄소가 관찰되었다. 아노머 프로톤(7.6 Hz)의 결합 상수로 상기 아노머 하이드록실기의 베타 결합을 확인하였다. δH 3.84에서 메톡시 프로톤은 HMBC 스펙트럼의 δC 148.6 (C-3′)에서 산소화된 올레핀 4차 탄소와 관련성이 있고, 이로서 메톡시기의 위치가 확인되었다. 글루코피라노실(glucopyranosyl) 단위(unit) 및 아글리콘(aglycon)의 C-7 하이드록시 간의 연결은 HMBC 스펙트럼의 δH 4.94 (H-1″)에서의 아노머 프로톤 및 δC 166.9 (C-7)에서의 산소화된 올레핀 4차 탄소 간에 관찰된 크로스-피크에 의하여 확인되었다. 광학 회전은 [α]D 25 +10.5° (c 3.6, 메탄올)로 확인되었다. 그러므로, 화합물 2는 신규 디하이드로플라보놀 글리코사이드(dihydroflavonol glycoside)인 3′-O-methyltaxifolin-7-O-β-D-glucopyranoside였다.

화합물 3은 밝은 노란색 분말로서 수득되었으며, IR 스펙트럼에서 하이드록실(hydroxyl) 기 (3390 cm^-1) 및 방향족 이중 결합들 (1644, 1464 cm^-1) 때문에 흡수 밴드들을 보였다. 상기 화합물은 당(sugar) 위치는 예외이지만 MS 및 NMR 데이터에서 화학식 2와 매우 유사했다. 글루코피라노실(glucopyranosyl) 단위 및 아글리콘의 C-4′ 하이드록시 간의 연결은 HMBC 스펙트럼에서 δH 5.71 (H-1″)에서의 아노머 프로톤 및 δC 148.3 (C-4′)에서의 산소화된 올레핀 4차 탄소 사이에서 관찰된 크로스-피크에 의하여 확인되었다. 분자식은 high-resolution negative FAB/MS (calcd for C22H23O12, 479.1190)에서 m/z 479.1189에서 분자 이온 피크[M-H]-로부터 C22H24O12로 결정되었다. 따라서, 화합물 3은 신규 디하이드로플라보놀 글리코사이드인 3’-O-methyltaxifolin-4′-O-β-D-glucopyranoside로 확인되었다.

화합물 7은 노란색 무정형 분말로 수득되었으며, IR 스펙특럼에서 하이드록실 (3334 cm^-1), 콘쥬게이트된 케톤 (1704 cm^-1), 및 방향족 이중 결합 (1596 cm^-1)기들 때문에 흡수 밴드들을 보였다. high-resolution negative FAB/MS (calcd for C28H31O17, 639.1561)에서 m/z 639.1566에서 분자 이온 피크 [M -H]-로부터 분자식은 C28H32O17로 결정되었다. 1H NMR 스펙트럼에서, 1,2,4-삼치환된 벤젠 고리 때문에 δH 7.81 (1H, br s, H-2′), 7.68 (1H, br d, J = 8.0 Hz, H-6′), and 6.88 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′)에서 3개의 올레핀 메틴 프로톤들, 및 1,2,3,5-사치환된(tetrasubstituted) 벤젠 고리 때문에 δ H 6.69 (1H, br s, H-6) and 6.41 (1H, br s, H-8)에서 2개의 올레핀 메틴 프로톤들이 관찰되었다. 추가적으로 δH 3.89 (3H, s)에서 하나의 메톡시 프로톤 또한 관찰되었다. 이러한 데이터는 화합물 7이 5,7,3′,4′-테트라하이드록시플라보놀(tetrahydroxyflavonol) 모이어티를 갖는다는 것을 제안한다. 추가로, 2 개의 아노머 프로톤들이 5.08 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1″) 및 4.45 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1”’)에서 나타났고, 2개의 헥소스 모이어티들의 산소화된 메틴들 및 메틸렌 프로톤들이 δH 3.98-3.24 (12H)에서 나타났다.

13C NMR 스펙트럼은 28개 탄소들을 보였다. 아글리콘 탄소들에 대하여, δC 177.5 (C-4)에서 하나의 콘쥬게이트된 케톤; δC 164.3 (C-5), 162.1 (C-7), 157.6 (C-9), 150.0 (C-4′), 148.5 (C-2), 148.4 (C-3′), 및 136.0 (C-3)에서 7개의 산소화된 올레핀 4차 탄소들; δC 123.9 (C-1′) 및 106.2 (C-10)에서 2개의 올레핀 4차 탄소들; δC 122.9 (C-6′), 116.3 (C-5′), 112.6 (C-2′), 100.1 (C-6), 및 95.8 (C-8)에서 5개의 올레핀 메탄 탄소들; 및 δC 56.7 (3′-OCH3)에서 1개의 메톡시 탄소가 관찰되었다. δH 3.89에서 메톡시 프로톤은 HMBC 스펙트럼에서 δC 148.4 (C-3′)에서 산소화된 올레핀 4차 탄소와 상관성이 있는데, 이는 메톡시 기의 위치를 확인해준다. β-셀로바이오실(cellobiosyl) 모이어티의 존재는 δC 104.6 (C-1”’) 및 101.3 (C-1″)에서의 2개의 헤미아세탈들과 같은 2 개의 헥소스 탄소들; δC 80.2 (C-4″), 78.1 (C-5”’), 77.9 (C-3”’), 76.8 (C-5″), 76.2 (C-3″), 74.9 (C-2”’), 74.5 (C-2″), 및 71.4 (C-4”’)에서의 8개의 산소화된 메틴들; 및 δC 62.5 (C-6”’) 및 61.6 (C- 6″)에서의 2 개의 산소화된 메틸렌들; 그리고 2 개의 아노머 프로톤들의 결합 상수와 함께(δH 5.08, 1H, d, J = 7.6 Hz, H-1″; 4.45, 1H, d, J = 7.6 Hz, H-1'''), 화학적 이동(shifts)에 의하여 제안되었다. 아글리콘의 글루코피라노실 단위(C-1″) 및 C-7 하이드록시 사이의 연결은 HMBC 스펙트럼에서 δH 5.08 (H-1″)에서의 아노머 프로톤 및 δC 162.1 (C-7)에서의 산소화된 올레핀 4차 탄소간에 관찰된 크로스-피크에 의하여 확인되었다. 그러므로 화합물 7은 신규 플라보놀 글리코사이드인 isorhamnetin-7-O-β-D-cellobioside (brassicin-4″-O-β-D-glucopyranoside)로 확인되었다.

화합물 8은 노란색 무정형 분말로 수득되었으며, IR 스펙트럼에서 하이드록실(3327 cm^-1) 및 방향족 이중 결합 (1595 cm^-1) 때문에 흡수 밴드를 보였다. high-resolution negative FAB/MS (calcd for C28H31O17, 639.1561)에서 m/z 639.1566에서 분자 이온 피크 [M-H]-로부터 분자식은 C28H32O17로 확인되었다. 화합물 8은 2개의 글루코실 모이어티의 위치를 제외하면, MS, 1H NMR, 및 13C NMR의 분광 데이터에서 화합물 7과 매우 유사하였다. 화합물 8은 δH 6.10 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1″) 및 6.08 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1”’)에서 2개의 아노머 프로톤들 및 δC 101.8 (C-1″) 및 101.7 (C-1”’)에서 2개의 아노머 탄소들을 보였다. 게다가, 13C NMR 화학적 이동들(shifts) 및 J = 7.2 Hz 및 J = 7.2 Hz 인 2개의 아노머 프로톤들의 결합 상수로부터, 둘 다 β-D-글루코피라노스이다. 2개의 글루코피라노실 단위들과 아글리콘의 C-7 및 C-4′ 하이드록시 기들간의 연결은 각각 HMBC 스펙트럼에서 δH 6.10 (H-1″)에서의 아노머 프로톤 및 δC 163.7 (C-7) 에서의 산소화된 올레핀 4차 탄소 사이 및 δH 6.08 (H-1”’)에서의 아노머 프로톤 및 δC 149.2 (C-4′)에서의 산소화된 올레핀 4차 탄소 사이에서 관찰된 크로스 피크들에 의하여 확인되었다. 따라서, 화합물 8은 신규한 플라보놀 글리코사이드인 brassicin-4′-O-β-D-glucopyranoside으로 확인되었다.

<화학식 1>

<화학식 2>

(+)-3′-O-메틸탁시폴린((+)-3′-O-methyltaxifolin) (화합물 1)

3′-O-메틸탁시폴린-7-O-β-D-글루코피라노사이드(3′-O-methyltaxifolin-7-O-β-D-glucopyranoside) (화합물 2)

3′-O-메틸탁시폴린-4′-O-β-D-글루코피라노사이드(3′-O-methyltaxifolin-4′-O-β-D-glucopyranoside) (화합물 3)

브라시신(brassicin) (화합물 4)

이소람네틴-4′-O-β-D-글루코피라노사이드(isorhamnetin-4′-O-β-D-glucopyranoside) (화합물 5)

3′-O-메틸탁시폴린-5-O-β-D-글루코피라노사이드(3′-O-methyltaxifolin-5-O-β-D-glucopyranoside)(화합물 6)

이소람네틴-7-O-β-D-셀로비오사이드(브라시신-4″-O-β-D-글루코피라노사이드(isorhamnetin-7-O-β-D-cellobioside (brassicin-4″-O-β-D-glucopyranoside)) (화학식 7)

브라시신-4′-O-β-D-글루코피라노사이드(brassicin-4′-O-β-D-glucopyranoside)(화학식 8).

<실험예 4> 플라보노이드들의 HPLC 분석

C1/R-S 벼, C1/R-S 벼/HY 교배종, 및 HY 내 플라보노이드 함량 및 조성이 HPLC 실험을 이용하여 결정되었다. 도 1은 크로마토그램 상 7개의 플라보노이드 표준들(화합물 1 내지 5, 7, 및 8)의 분리를 보여 준다. 주된 플라보노이드들(화합물 2, 3, 및 8)이 측정되었다(calibrate). C1/R-S 벼, C1/R-S 벼/HY 교배종, 및 HY 중에서, 2차 메타볼라이트들의 프로파일에서 가장 중요한 피크들은 C1/R-S 벼에서 검출되었으며, 모든 7개 플라보노이드들이 확인되었다. 표 1은 주요 플라보노이드들(화합물 2, 3, 및 8)의 정량화를 보여준다. C1/R-S 벼는 C1/R-S 벼/HY 교배종(hybrid)보다 더 높은 플라보노이드 함량을 가지나, 플라보노이드들 중 어느 것도 정상 품종 HY에서는 검출되지 않았다. 특히, 화합물 8은 C1/R-S 벼/HY 교배종 (372.9 μg/g)에 비교할 때, C1/R-S 벼 (654.8 μg/g)에서 가장 함량이 높았다.

Oryza sativa spp.japonica cv. Hwa-Young의 형질전환 벼인 C1/R-S 형질전환 벼(C1/R-S 벼), Hwa-Young (HY), 및 C1/R-S 벼/HY 교배종의 추출물 내 주요 플라보노이드들(화합물 2, 3, 8)의 정량 분석.

^ay = area units,

x = 표준 용액의 농도(ppm),

^bnd = 검출되지 않음(not detected).

<실험예 5> 플라보노이드들의 라디칼 소거 활성

비타민 C에 의하여 야기된 흡수 환원(absorbance reduction)의 양에 대한 비타민 C의 농도에 관련된 비타민 C 표준 곡선들이 ABTS 분석 및 DPPH 분석을 이용하여 수득되었다. 벼 곡물들의 라디칼-소거 용량들은 표 2와 같다. 가장 높은 항산화 용량이 C1/RS 벼 [각각, ABTS 분석의 경우, 59.2 ± 0.8 mg of 비타민 C equiv/g of variety (mg VCE/g); 그리고 DPPH 분석의 경우, 18.9 ± 2.1 mg VCE/g]에 의하여 나타났고, 반면, HY × C1/R-S 벼 교배종 및 HY 품종은 C1/R-S 벼 [각각 ABTS 분석의 경우, 30.0 ± 1.3 mg (HY × C1/R-S 벼 교배종) 및 13.0 ± 0.3 mg (HY) VCE/g; DPPH 분석의 경우, 10.5 ± 0.3 mg (HY × C1/R-S 벼 교배종) 및 5.9 ± 0.6 mg (HY) VCE/g]보다 더 낮은 용량을 보였다.

게다가, C1/R-S 벼 곡물들로부터 분리된 모든 플라보노이드들(화합물 1-8)의 DPPH 및 ABTS 라디칼들의 소거능이 결정되었다(표 2). ABTS 자유 라디칼 소거 분석에서, 화합물 1 및 4는 비타민 C보다 약간 더 높은 활성을 보였고(1, 1263.6 ± 18.5 mg VCE/g; 4, 1088.7 ± 25.1 mg VCE/g), 그리고 화합물 2는 약간 더 낮은 활성을 보였다(833.3 ± 36.5 mg VCE/g). 게다가 화합물 3, 5, 및 6은 또한 중요한 활성을 보였다(3, 598.8 ± 0.4 mg VCE/g; 5, 607.5 ± 28.4 mg VCE/g; 6, 517.9 ± 9.9 mg VCE/g). 가장 낮은 활성은 화합물 7 및 8에서 검출되었다(7, 256.8 ± 1.8 mg VCE/g; 8, 250.9 ± 15.9 mg VCE/g).

DPPH 라디칼 소거 분석에서, 화합물 4는 가장 높은 활성을 보였고(297.4 ± 10.5 mg VCE/g), 화합물 1은 두 번째로 높은 활성을 가졌다(93.1 ± 2.1 mg VCE/g). 화합물 2, 6, 7, 및 8은 유사한 활성들을 보였다(2, 78.6 ± 1.6 mg VCE/g; 6, 56.4 ± 3.2 mg VCE/g; 7, 75.0 ± 5.5 mg VCE/g; 8, 49.5 ± 1.1 mg VCE/g). 가장 낮은 활성들은 화합물 3 및 5에서 검출되었다(3, 11.5 ± 1.1 mg VCE/g; 5, 16.5 ± 1.8 mg VCE/g). 이러한 결과들은 분명한 구조-활성 관계를 보여준다.

DPPH 및 ABTS 라디칼들에 대한 디하이드로플라보놀들인 화합물 1, 2, 3 및 6의 소거능의 비교에 의하여, 아글리콘인 화합물 1은 그것의 모노글루코사이드들(monoglucosides)인 화합물 2, 3, 및 6보다 더 높은 활성을 보였다. 게다가 플라보놀 모노글루코사이드들인 화합물 4 및 5의 ABTS 소거능은 플라보놀 디글루코사이드들(diglucosides)인 화합물 7 및 8의 그것보다 3-4배 더 높았다.

플라보놀 글루코사이드인 화합물 4 및 7의 DPPH 소거능은 화합물 5 및 8의 그것보다 더 높았는데, 이는 후자의 2개 화합물의 4′-하이드록시기들이 차단(blocked)되었기 때문이다. 플라보놀인 화합물 4는 디하이드로플라보놀인 화합물 2보다 더 높은 활성을 보였는데, 이는 C2 및 C3의 이중 결합 때문이다. 그러므로 C 고리에서 C2 및 C3의 이중 결합, B 고리의 C-4’에서의 유리(free) 하이드록실기, 및 부착된 당들의 수들이 라디칼 소거 활성을 보여주는 핵심 요인이라는 것이 명확하였다.

C1/R-S 벼는, 정상 품종 HY 및 C1/R-S 벼/HY 교배종에 비하여, 매우 높은 플라보노이드 함량 및 DPPH 및 ABTS에 대한 라디칼 소거능을 가졌다. 4개의 신규 플라보노이드들이, 4개의 공지의 것과 함께, C1/R-S의 곡물로부터 분리되었으며, 그것들의 화학 구조가 광범위하게 연구되었다. 대부분의 플라보노이드들은 구조의 다양성에 따라 다양한 라디칼 소거능들을 보였다.

^a: 각각의 화합물 1g에 대응하는 라디칼 소거능을 갖는 비타민 C의 중량(mg)

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염:

<화학식 1>

이 때, R1 내지 R3는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

<화학식 2>

이 때, R4 및 R5는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.
제 1항에 있어서,
상기 R1 내지 R3는 각각 H 및 글루코피라노실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용가능한 염.
제 1항에 있어서,
상기 R1 및 R2 중 적어도 어느 하나는 글루코피라노실인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용가능한 염.
제 1항에 있어서,
상기 글루코피라노실은 베타-D-글루코피라노실인 것을 특징을 하는 화합물 또는 그 허용가능한 염.
제 1항에 있어서,
상기 R4 및 R5는 각각 H, 글루코피라노실, 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용가능한 염.
제 1항에 있어서,
상기 R4는 셀로비오실인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용가능한 염.
제 1항에 있어서,
상기 R4 및 R5는 모두 글루코피라노실인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용가능한 염.
제 1항에 있어서,
벼 유래인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용가능한 염.
제 8항에 있어서,
형질전환 벼 유래인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용 가능한 염.
제 1항에 있어서,
ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능을 갖는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그 허용 가능한 염.
하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 포함하는 식품 조성물:

<화학식 1>

이 때, R1 내지 R3는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

<화학식 2>

이 때, R4 및 R5는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.
제 11항에 있어서,
상기 R1 내지 R3는 각각 H 및 글루코피라노실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 R1 및 R2 중 적어도 어느 하나는 글루코피라노실인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 R4 및 R5는 각각 H, 글루코피라노실, 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 화합물 또는 그 허용가능한 염은 벼 유래인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 포함하는 화장료 조성물:

<화학식 1>

이 때, R1 내지 R3는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

<화학식 2>

이 때, R4 및 R5는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.
하기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 포함하는 사료 조성물:

<화학식 1>

이 때, R1 내지 R3는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

<화학식 2>

이 때, R4 및 R5는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.
벼를 추출하는 단계;및
상기 벼 추출물로부터 하기 화학식 1 또는 2의 화합물 또는 그 허용가능한 염을 분리하는 단계를 포함하는,
항산화 물질의 제조 방법.

<화학식 1>

이 때, R1 내지 R3는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.

<화학식 2>

이 때, R4 및 R5는 각각 H, 탄소 수 1 내지 5의 알킬, 글루코피라노실, 글루코퓨라노실 및 셀로비오실로 구성되는 군으부터 독립적으로 선택된다.
제 18항에 있어서,
탄소 수 3 이하의 알코올 또는 물로 벼를 추출하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 18항에 있어서,
상기 항산화 물질은 ABTS 라디칼 소거능 및 DPPH 라디칼 소거능을 갖는 플라보노이드인 것을 특징으로 하는 제조 방법.