KR20150142306A

KR20150142306A - CD44v3 도메인 3 및 도메인 6 특이적 단일클론 항체 및 그 용도

Info

Publication number: KR20150142306A
Application number: KR1020140070873A
Authority: KR
Inventors: 이석묵; 정미현; 김택근; 박창식; 이우란; 고남경
Original assignee: (재) 스크립스코리아항체연구원
Priority date: 2014-06-11
Filing date: 2014-06-11
Publication date: 2015-12-22
Also published as: KR102215384B1

Abstract

본 발명은 CD44 변이체 3(이하 ‘CD44v3’라 한다)의 도메인 3 및 도메인 6 특이적 단일클론 항체 및 그 용도에 관한 것으로, 특히 상기 CD44v3의 도메인 3 및/또는 도메인 6에 특이적인 항체 및 이를 이용한 암 진단 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CD44D3 및/또는 CD44D6 특이적 항체 및 이를 포함하는 키트를 이용할 경우, 매우 효율적으로 CD44v3를 검출할 수 있어, 암을 조기에 진단할 수 있는 효과가 있다.

Description

CD44v3 도메인 3 및 도메인 6 특이적 단일클론 항체 및 그 용도 {CD44v3 domain 3 and domain 6 specific monoclonal antibodies and Use Therof}

본 발명은 CD44 변이체 3(이하 ‘CD44v3’라 한다)의 도메인 3 및 도메인 6 특이적 단일클론 항체 및 그 용도에 관한 것으로, 특히 상기 CD44v3의 도메인 3 및/또는 도메인 6에 특이적인 항체 및 이를 이용한 암 진단 방법 및 이를 위한 키트에 관한 것이다.

전 세계적으로 사망의 두 번째 주요 요인으로 알려져 있는 암은 사망자의 13%를 차지하며, 이 중 70%의 환자가 저소득 및 중간소득 국가에서 발생하는 것으로 알려져 있다(Itzhak, Z. et al ., India Transworld Research Network, 423p, 2010). 지속적인 암 치료 방법의 발전에도 불구하고, 아직은 암의 조기 발견이 생존기간을 늘리는 최선의 방법으로 알려져 있다. 이에 따라 암 발생 및 암 전이와 밀접하게 관련된 바이오 마커의 발굴에 지대한 관심이 이어지고 있으며, 이러한 바이오 마커는 암의 조기 진단을 가능케 하며 더 나은 임상 결과를 가져올 수 있다. 하지만, 아직은 암을 정확하게 조기 진단할 수 있는 암 마커의 개발은 미미한 실정이다.

CD44는 1형 막횡단 당단백질(type I transmembrane glycoprotein)로 세포외(extracellular), 막횡단(transmembrane) 및 세포내(cytosolic) 부위로 구성되어 있다. CD44의 발현양상은 복잡하며, 상이적인 스플라이싱(alternative splicing) 및 번역 후 수식(post-translational modification), 특히 세포외 부위에서의 번역 후 수식으로 인해 다양한 CD44 변이체를 형성하게 된다.

CD44는 다기능적인 세포 접착분자(cell adhesion molecule)로 세포 성장, 생존, 세포이동 및 혈관형성에 주요 역할을 담당하며(Marhaba, R. et al ., J Mol Histol ., 35(3):211-31, 2004), 조절되지 않은(Dysregulated) CD44의 발현은 여러 종류의 암의 진단 또는 예후 표지자로 알려져 있다(Jothy, S., Clin Exp Metastasis, 20(3):195-201, 2003; Stauder, R. et al ., Blood, 85(10):2885-99, 1995; Wielenga, V.J. et al ., Adv Cancer Res ., 77:169-87, 2000; Kainz, C. et al ., Eur J Cancer, 31A(10):1706-9, 1995; Hsieh, H.F. et al ., Mol Pathol, 52(1):25-8, 1999; Gotte, M. et al ., Cancer Res ., 66(21):10233-7, 2006; Bennett, K.L. et al ., J Cell Biol ., 128(4):687-98, 1995).

특히, 최근 연구결과에 의하면 CD44 변이체 3(CD44v3)과 종양 진행간에 연관성이 있는 것으로 알려져 있다. CD44v3는 CD44의 변이체(isoform)의 하나로, 엑손 v3 내지 v10을 포함하는데, 각각의 엑손은 본 발명에서 도메인(domain)으로 칭하며, 이에 따라 CD44v3는 도메인 D3 내지 D10을 포함한다(도 1A 참조).

CD44v3는 다양한 성장인자 및 케모카인(chemokines)을 고정(immobilize)하는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 성장인자 및 케모카인에는 헤파린 결합 상피성장인자 유사 성장인자(heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor), 기본 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor: HGF), RANTES(Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) 및 MIP-1 beta(Macrophage inflammatory protein-1 beta) 등이 포함된다(Bennett, K.L. et al., J Cell Biol ., 128(4):687-98, 1995; Jones, M. et al ., J Biol Chem, 2000. 275(11):7964-74; Tanaka, Y., et al ., Nature, 361(6407):79-82, 1993; Sherman, L.S. et al., J Cell Biol, 150(5):1071-84, 2000). 또한, HGF 수용체인 c-Met를 활성화시키는 데는 CD44v3의 발현이 필요하다고 알려져 있다(Van der Voort, R. et al ., J Biol Chem, 274(10):6499-506, 1999; Orian-Rousseau, V. et al ., Genes Dev ., 16(23):3074-86, 2002).

난소 암세포에서 CD44v3는 Ras 및 Rac1를 활성화시키는 종양유전자(oncogene)인 Her2/Neu 단백질에 결합하여 종양세포의 증식과 세포골격을 개편하는 역할을 보조한다(Bourguignon, L.Y. et al ., J Biol Chem ., 272(44):27913-8, 1997; Bourguignon, L.Y. et al ., J Biol Chem ., 276(10):7327-36, 2001; Bourguignon, L.Y. et al ., J Biol Chem ., 276(52):48679-92, 2001). 또한, 생체 내(in vivo) CD44v3의 발현은 내피세포에서 종양 유도 혈관형성(tumor-induced angiogenesis)에 있어 중요한 역할을 한다(Forster-Horvath, C. et al ., Microvasc Res., 68(2):110-8. 2004).

또한, 최근 두경부암 및 결장암을 포함하는 여러 암 종류의 진단 또는 예후 마커로서 CD44v3의 중요성이 보고된 바 있다(Reategui, E.P., et al ., Cancer Biol Ther, 5(9):1163-8, 2006; Kuniyasu, H. et al ., Clin Cancer Res ., 7(12):4067-72).

이렇게 CD44v3가 암과의 연관성 및 마커로서의 활용가능성이 알려져 있어, CD44v3을 효율적으로 검출할 필요성이 있었음에도 불구하고, 지금까지 대부분의 연구는 정상 또는 종양 조직의 CD44v3의 발현량을 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용하여 분석하거나, 총 혈청 CD44 발현을 표준 CD44 변이체인 CD44s에 대한 항체를 사용하여 수행된 정도에 불과하였다(Ni, H.M. et al ., J Lab Clin Med, 139(1):59-65, 2002; Yokota, A., et al ., Hematol Oncol ., 17(4):161-8, 1999; Shah, N., et al ., Leuk Lymphoma, 53(1):50-6, 2012).

지금까지 사용되어온 방법은 많은 시간이 소요되거나, 높은 특이도(specificity) 및 민감도(sensitivity)를 나타내지 못하는 단점이 있었으며, 이에 따라 높은 특이도 및 민감도를 유지하면서 간편하게 CD44v3을 검출할 수 있는 방법에 대한 필요성이 절실한 상황이다.

본 발명의 목적은 암환자의 CD44v3을 높은 특이도(specificity) 및 민감도(sensitivity)를 유지하면서 효율적으로 검출할 수 있는 방법 및 이를 위한 키트를 제공하는 것이다.

또한, 상기 CD44v3의 검출을 통해 암을 조기에 정확하게 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 CD44v3 특이적 항체, 구체적으로는 CD44v3의 도메인 3(이하‘CD44D3’이라 한다)에 특이적인 항체 및/또는 CD44v3의 도메인 6(이하 ‘CD44D6’이라 한다)에 특이적인 항체를 이용하여 CD44v3를 효율적으로 검출할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

이에 따라 본 발명의 첫번째 목적은 CD44D3 특이적 항체 및 CD44D6 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 CD44D3 특이적 항체 및 CD44D6 특이적 항체, 또는 그러한 항체의 단편은 CD44D3 또는 CD44D6에 특이성을 가지는 것이면 어떠한 것이라도 제한 없이 사용가능하며, 쥐나 토끼 등의 동물 유래 항체, 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 또는 완전 인간 항체(fully human antibody)일 수 있다.

본 발명에 있어서, CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 단편은 적어도 CD44D3 또는 CD44D6에 대한 결합 기능을 보유하고 있는 항체의 일부분을 의미하며, 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab’)₂단편, Fd, scFv, 이황화 결합(intramolecular disulfide bond)된 Fv, 도메인 항체, 미니바디, 스캡(single chain antibody, scAb), 항체 불변영역의 유도체들, 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 CD44D3 특이적 항체 또는 그 단편은 바람직하게는

서열번호 1 또는 서열번호 4의 CDRH1, 서열번호 2 또는 서열번호 5의 CDRH2 및 서열번호 3 또는 서열번호 6의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과,

서열번호 13 또는 서열번호 16의 CDRL1, 서열번호 14 또는 서열번호 17의 CDRL2 및 서열번호 15 또는 서열번호 18의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 CD44D3 특이적 항체 또는 그 단편은 서열번호 25 또는 서열번호 26의 중쇄 가변영역과 서열번호 29 또는 서열번호 30의 경쇄 가변영역을 포함한다.

가장 바람직하게는 본 발명에 따른 CD44D3 특이적 항체 또는 그 단편은 다음과 같은 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함한다.

i) 서열번호 1의 CDRH1, 서열번호 2의 CDRH2 및 서열번호 3의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 13의 CDRL1, 서열번호 14의 CDRL2 및 서열번호 15의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;

ii) 서열번호 4의 CDRH1, 서열번호 5의 CDRH2 및 서열번호 6의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 16의 CDRL1, 서열번호 17의 CDRL2 및 서열번호 18의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;

iii) 서열번호 25의 중쇄 가변영역과 서열번호 29의 경쇄 가변영역; 또는

iv) 서열번호 26의 중쇄 가변영역과 서열번호 30의 경쇄 가변영역.

또한, 본 발명에 따른 CD44D6 특이적 항체 또는 그 단편은 바람직하게는 서열번호 7 또는 서열번호 10의 CDRH1, 서열번호 8 또는 서열번호 11의 CDRH2 및 서열번호 9 또는 서열번호 12의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과

서열번호 19 또는 서열번호 22의 CDRL1, 서열번호 20 또는 서열번호 23의 CDRL2 및 서열번호 21 또는 서열번호 24의 CDRL3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함한다.

더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 CD44D6 특이적 항체 또는 그 단편은 서열번호 27 또는 서열번호 28의 중쇄 가변영역과 서열번호 31 또는 서열번호 32의 경쇄 가변영역을 포함한다.

가장 바람직하게는 본 발명에 따른 CD44D6 특이적 항체 또는 그 단편은 다음과 같은 중쇄 및 경쇄 가변영역을 포함한다.

i) 서열번호 7의 CDRH1, 서열번호 8의 CDRH2 및 서열번호 9의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 19의 CDRL1, 서열번호 20의 CDRL2 및 서열번호 21의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;

ii) 서열번호 10의 CDRH1, 서열번호 11의 CDRH2 및 서열번호 12의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 22의 CDRL1, 서열번호 23의 CDRL2 및 서열번호 24의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;

iii) 서열번호 27의 중쇄 가변영역과 서열번호 31의 경쇄 가변영역; 또는

iv) 서열번호 28의 중쇄 가변영역과 서열번호 32의 경쇄 가변영역.

본 발명에 있어, CDRH1은 중쇄 가변영역의 CDR1, CDRH2는 중쇄 가변영역의 CDR2, CDRH3은 중쇄 가변영역의 CDR3을 각각 의미하며, CDRL1은 경쇄 가변영역의 CDR1, CDRL2는 경쇄 가변영역의 CDR2, CDRL3은 경쇄 가변영역의 CDR3을 각각 의미한다.

또한 본 발명의 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다. 그러한 예로서 가변영역에서의 아미노산의 보존적 치환(conservative substitution)을 들 수 있다. 보존적 치환은 원래의 아미노산 서열과 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하는데, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘은 염기 곁사슬을 가지고 있어 유사한 특성을 가지고, 아스파라틱산과 글루타믹산은 산 곁사슬을 가진다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 또한, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판은 비전하 극성 곁사슬을 가진다는 점에서 특성이 유사하며, 알라닌, 발린, 루신, 트레오닌, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌은 비극성 곁사슬을 가지고 있다는 점에서, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 방향족 곁사슬을 가지고 있다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 따라서, 상기와 같이 유사한 특성을 가지는 그룹 내에서의 아미노산 치환이 일어나더라도 별다른 특성 변화를 보이지 않을 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이므로, 본 발명에 따른 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 보존적 치환에 의한 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명에 따른 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체에는 지정 돌연변이(direct mutation), 친화도 성숙(affinity maturation), 파아지 디스플레이(phage display) 또는 사슬 셔플링(chain shuffling) 등의 방법에 의해 친화도 및 특이성이 개선된 항체도 포함된다. 친화도 및 특이성은 CDR를 돌연변이 시키고, 목적하는 특징을 갖는 항원 결합 위치에 대해 스크리닝 함으로써 변형 또는 개선 될 수 있다(Yang et al ., J. Mol . Bio ., 254: 392,1995). CDR는 다양한 방식으로 돌연변이 될 수 있는데, 예를 들어 한 가지 방법으로, 동일한 항원 결합 위치의 집단에서 20개의 모든 아미노산이 특정 위치에서 발견되도록 개발 잔기 또는 잔기의 조합을 랜덤화시킬 수 있으며, 또한 돌연변이를 일으키는 오류 유발(error prone) PCR 방법에 의해 CDR 잔기의 범위에 걸쳐 돌연변이를 유발시킬 수도 있다(Hawkins et al ., J. Mol . Bio ., 226: 889, 1992). 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 가변성 부위(variable region) 유전자를 함유하는 파아지 디스플레이 벡터(phagemid)는 E. coli의 돌연변이 균주에서 번식된다(Low et al ., J. Mol . Biol ., 250:359, 1996). 이러한 돌연변이 유발 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이다.

또 다른 양태로서, 본 발명에서는 본 발명에 따른 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체 또는 그 단편의 가변영역 및 그러한 가변영역에 포함된 각 CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포, 그리고 상기 재조합 벡터 또는 숙주세포를 이용하여 본 발명에 따른 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 특히 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 제조하는 것이 바람직한데, 구체적으로 본 발명에 따른 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체를 코딩하는 가변영역을 각각 따로, 또는 하나의 숙주세포에서 동시에 발현시켜서 제조하는 것이 바람직하다. 또한 리더 서열(leader sequence)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 따른 항체의 N-말단에 위치하도록 하여 항체의 생산에 이용될 수 있다. 또한, 생산된 항체의 분리 정제 및 분석을 용이하게 하기 위하여 태그(tag)가 부착될 수 있는데, 대표적인 태그는 his-태그이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, 본 발명에서, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다

본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이것으로 제한되지는 않는다.

상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.

본 발명에 따른 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스, 베큘로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다.

세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 특히, 대장균에서의 발현을 위해서는 안트라닐레이트 합성효소(TrpE) 및 카르복시 말단의 폴리링커를 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 다른 발현 벡터 시스템은 베타-갈락토시다제(pEX); 람다 PL 말토스 결합 단백질(pMAL); 및 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(pGST)에 기초한다(Gene 67:31, 1988; Peptide Research 3:167, 1990).

효모에서 발현시키는 것이 요망되는 경우에, 효모에서 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 Yrp7에 존재하는 trpl 유전자이다(Stinchcomb et al ., Nature, 282:39, 1979; Kingsman et al, Gene, 7:141, 1979). Trpl 유전자는 트립토판 내에서 성장하는 능력이 결핍된 효모의 뮤턴트 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다(Jones, Genetics, 85:12, 1977). 따라서 효모 숙주 세포 게놈 내에 trpl 손상의 존재는 트립토판의 부재 하에 성장에 의한 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게 leu2-결함 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 함유하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2℃ 플라스미드 및 그의 유도체이며, 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.

본 발명에서의 발현벡터에는 발현되는 DNA 서열 또는 단편에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 클로닝되는 DNA 서열의 발현을 제어 또는 조절하기 위해 벡터에 삽입된다. 유용한 발현조절 서열의 예는 lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc-시스템, 파아지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 부위, fd 코트 단백질의 조절부위, 효모의 당분해(glycolytic) 프로모터, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제의 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모알파 교배 인자의 프로모터 및 폴리오마, 아데노바이러스, 레트로바이러스 및 시미안 바이러스에서 유래한 프로모터, 예를 들어 SV40의 초기 및 후기의 프로모터, 및 원핵 또는 진핵세포 및 이들의 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 서열 및 이들의 조합물이 포함될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성한다. 상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장세포(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 CHO 세포이다.

본 발명에서 숙주세포로의 "형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 CD44D3 및/또는 CD44D6 특이적 항체를 이용한 CD44v3의 검출방법 및 이를 위한 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 CD44v3의 검출을 위해서는 통상적인 어떠한 방법이라도 제한 없이 사용 가능하며, 특히 항체는 항원-항체 결합반응을 통해 시료의 CD44v3 단백질 농도를 측정하는 것이 바람직하다.

이러한 방법의 비제한적인 예로는 상기 항원-항체 결합반응은 효소 면역흡착 분석법(Enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay: RIA), 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석법(Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법(Immuno-fluorence Assay, IFA), 면역발광 측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography) 등이 있으며, 특히 샌드위치 ELISA 방법이 가장 바람직하다.

구체적으로, 본 발명에 따른 샌드위치 ELISA 방법을 위해서 고형 지지체에 포획용 항체로서 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체를 고정시키고, 탐지용 항체로서 표지물질이 결합되어 있는 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체를 이용하는 형태가 바람직하다.

본 발명에의 “포획용 항체”는 고형지지체에 고정되어 시료 내에 포함되어 있는 CD44v3를 포획하는 항체를 의미하며, “탐지용 항체”는 포획용 항체에 의해 포획된 항체를 표지 물질에 의해 검출가능하도록 하는 항체를 의미한다. 포획용 항체와 탐지용 항체는 서로 상이한 것이 바람직하며, 예를 들어 포획용 항체가 CD44D3 특이적 항체인 경우 탐지용 항체는 CD44D6 특이적 항체가 사용될 수 있고, 반대로 포획용 항체가 CD44D6 특이적 항체인 경우 탐지용 항체는 CD44D3 특이적 항체가 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “시료”는 암 의심 환자로부터 유래한 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 세포간액, 타액, 뇌척수액 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 포획용 항체는 고형 지지체에 공유결합 또는 물리적 흡착으로 고정될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 탐지용 항체에 포함되는 표지 물질은 통상적인 모든 것이 사용될 수 있는데, 비제한적인 예로서는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloidal gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 CD44D3 및/또는 CD44D6 특이적 항체를 이용한 샌드위치 ELISA 방법을 통해 CD44v3를 검출하는 방법은 고형 지지체에 고정된 포획용 항체에 시료 내의 CD44v3를 결합시키는 단계, 포획용 항체에 결합된 CD44v3에 탐지용 항체를 결합시키는 단계 및 탐지용 항체에 결합된 표지물질을 이용하여 CD44v3를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CD44v3를 검출하는 단계는 CD44v3-Fc, CD44v3ΔD3-Fc, CD44v3ΔD6-Fc, CD44D3-Fc, CD44D6-Fc 및 IgG1으로 구성된 군에서 선택되는 표준항원(standard antigen)을 대조군으로 사용하여 시료와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 CD44v3-Fc는 CD44v3에 Fc가 융합된 것을 의미하며, CD44D3-Fc 및 CD44D6-Fc 역시 마찬가지로 CD44D3 또는 CD44D6에 Fc가 융합된 것을 의미한다. 또한, CD44v3ΔD3 및 CD44v3ΔD6는 CD44v3에서 각각 D3(domain 3) 및 D6(domain 6)가 결실된 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 CD44v3를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 CD44v3 검출용 키트에는 고형 지지체에 고정된 포획용 항체, 표지물질이 결합된 탐지용 항체, 세척액을 포함할 수 있으며, 추가적으로 표지물질과 발색 반응을 유도할 수 있는 발색기질 용액 또는 효소반응 정지 용액을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 CD44D3 및/또는 CD44D6 특이적 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 CD44v3 검출을 통한 암의 진단 방법 및 이를 위한 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 대장암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선 암, 고환암, 외음부 암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 흑색종, 기관지암, 비인두암, 후두암, 이자암, 뇌암, 골암, 골육종, 피부암, 식도암, 담도암, 두경부암, 경추암, 요관암, 신경세포아종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 CD44D3 및/또는 CD44D6 특이적 항체 및 이를 포함하는 키트를 이용할 경우, 매우 효율적으로 CD44v3를 검출할 수 있어, 암을 조기에 진단할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 WT CD44v3, 도메인 결실 돌연변이 및 개별적 도메인의 발현 및 정제를 나타낸 것으로,
(A)는 WT(wild-type) CD44v3, 도메인 결실 돌연변이 및 도메인 함유하는 Fc 융합 단백질을 도식화한 것이고(EC(extracellular), TM(transmembrane), CP(cytosolic domain)),
(B)는 HEK293F 세포에서 상기 도메인들을 발현시킨 후 단백질 A 세파로스 친화성 레진(protein A sepharose affinity resin)에서 정제한 것이며 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색(Coomassie staining)으로 측정한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 scFvs의 단리를 나타낸 것으로, 인간형 합성 scFv 항체 라이브러리(human synthetic scFV antibody library)는 Fc 바인더에 대해서 전처리로 세정되었고 재조합 CD44D3-Fc 또는 CD44D6-Fc를 사용하여 바이오페닝(biopanning)으로 스크리닝되었으며, CD44D3(A) 또는 CD44D6(B)에 특이적인 24 scFv 파아지 클론을 무작위로 선별하여 상층액을 파아지 ELISA로 분석한 것으로, CD44D3 또는 CD44D6 특이적 ScFv 클론의 반응도(reactivity)를 450nm에서의 흡광도로 측정한 것을 나타낸 것이다. scFV 클론이 CD44D3-Fc(검은 막대) 또는 CD44D6-Fc(어두운 회색 막대)에 반응하고, Fc(흰색 막대)에 대해서는 반응하지 않은 것을 화살표로 나타내었으며, BSA(흰색 대각선 막대)는 배경 콘트롤로 사용된 것을 나타낸 것이다.
도 3은 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 특성을 나타낸 것으로,
(A)는 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 발현 및 정제 후, IgG의 순도를 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 측정한 것을 나타낸 것이며,
(B)는 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 CD44D3 및 CD44D6에 대한 반응도를 CD44D3-Fc(검은 막대), CD44D6-Fc(어두운 회색 막대), Fc(흰색 막대)로 코팅된 ELISA를 사용하여 측정한 것을 나타낸 것이고,
(C)는 CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체 클론1(C1)의 반응도를 CD44v3-Fc(검은 막대), CD44v3ΔD3-Fc(어두운 회색 막대), CD44v3ΔD6-Fc(밝은 회색 막대) 및 Fc(흰색 막대)로 코팅된 ELISA를 사용하여 측정한 것을 나타낸 것이다. BSA(흰색 대각선)은 배경 컨트롤로 사용되었다.
표시된 값은 한 개 내지 두 개의 독립적인 실험 중에서 3개씩(triplicate) 측정을 한 후 평균±SD를 나타낸 것이다.
도 4는 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 IgG 친화도 측정을 나타낸 것으로 항체 및 항원의 K_D 값은 label-free Octet 시스템을 사용하여 측정한 것으로, (A)는 NHS-활성화된 바이오센서에 CD33v3-Fc를 고정한 후 다양한 CD44D3 특이적 항체 농도를 평가한 것을 나타낸 것으로, K_D는 커브 피팅(curve fitting)으로부터 유래하였다. 또한, (B)는 상기와 동일한 방법으로 CD44D6 특이적 항체 및 CD44v3-Fc간의 상호작용을 평가하여 2개의 독립적인 실험의 대표 곡선을 나타낸 것으로, K_D는 평형분리상수(equilibrium dissociation constant)로 K_OFF/K_ON의 계산된 값을 나타낸 것이다. K_ON은 결합률 상수(association rate constant)이고 K_OFF는 해리률 상수(dissociation rate constant)이다.
도 5는 CD44v3 샌드위치 ELISA의 특성을 나타낸 것으로 샌드위치 ELISA 시스템의 특성을 도식화한 것이다
도 6은 CD44v3 샌드위치 ELISA의 특성을 나타낸 것으로, (A)는 코팅 항체 농도의 효과를 나타낸 것이고, (B)는 탐지용 항체의 적정을 8개의 서로 다른 항체 희석물(Ab dilutions)을 사용하여 평가된 것을 나타낸 것이며, (C)는 CD44v3 교정 곡선(calibration curve)으로 5ug/ml 코팅 항체 및 1ug/ml 탐지 항체 희석으로 측정한 것을 나타낸 것이다. 표시된 값은 6개의 독립적인 실험에서 2개씩 측정한 값을 평균±SD로 나타낸 것이다.

CD44v3의 도메인 3 및 도메인 6를 바이오마커로서 조기암 진단에 사용하고자 암 의심 환자로부터 CD44v3를 검출할 수 있는 항체를 제작하고자 하였다.

본 발명의 일 실시예에서 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체를 단리하였다. 구체적으로, 상기 CD44v3 도메인의 DNA를 함유하는 백터를 HEK293F 동물세포에 형질감염시켜 Fc를 함유하는 '도메인-Fc 융합 단백질'을 제조한 다음 단백질 A 세파로스 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 이후, 상기 CD44v3 도메인 융합 단백질을 이용하여 인간형 합성 scFv 라이브러리부터 각각 CD44D3 또는 CD44D6 도메인을 인식하는 2가지 scFv 클론(Clones: C1, C2)을 단리할 수 있었다. 상기 C1 및 C2클론의 DNA 서열을 분석한 결과, 각기 다른 CDR(complementarity determining region)를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 완전한 항체(IgG)로 전환(conversion)시키기 위해서 상기 scFv 클론의 CD44D3 또는 CD44D6를 특이적으로 인식하는 아미노산의 DNA 염기서열을 불변영역이 포함된 백터에 삽입한 다음 상기와 같은 융합 다백질의 제조방법으로 동물세포에 형질감염시키고 정제하여 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체를 분리할 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 분리된 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 CD44v3에 대한 결합 친화성을 label-free Octet 시스템으로 측정한 결과, CD44v3-Fc에 대한 상호작용 K_D는 CD44D3 특이적 항체의 경우 1.069 nM, CD44D6 특이적 항체의 경우 1.467nM인 것으로 나타났다.

본 발명의 다른 실시예에서는 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)용 96-웰 플레이트에 5mg/ml CD44D3 특이적 항체를 포획용 항체로 고정시킨 다음, 순차적으로 시료(양성대조군: CD44v3-Fc 항원) 및 1mg/ml의 HRP가 결합된 CD44D6 특이적 항체를 탐지용 항체로 첨가한 후 TMB 발색기질용액을 넣고 1N H₂SO₄로 효소반응을 중지시킨 다음 450nm에서 흡광도를 측정하는 과정으로 이루어진 암의 유무를 CD44v3 검출로 진단할 수 있는 키트를 제조하였다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 키트를 사용하여 CD44v3 특이적 샌드위치 ELISA의 최적화하기 위해서 적합한 포획 및 탐지를 위한 최적의 항체 농도를 측정한 결과, CD44D3 특이적 포획용 항체의 경우 5μg/ml이었고 CD44D6 특이적 탐지용 항체(HRP 접합체)의 경우 1μg/ml인 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 키트의 CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체들은 8.902ng/ml의 검출 한계 및 0∼62.5ng/ml의 선형 동적 범위(linear dynamic range)를 가지는 것으로 나타나 나노몰 친화성(nanomolar affinity)을 가지는 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 샌드위치 ELISA에서 CD44D3 특이적 포획용 항체 및 CD44D6 특이적 탐지용 항체를 사용할 경우, 인트라- 및 인터-어쎄이 리커버리(Intra- and inter-assays)는 20ng/ml CD44v3-Fc(양성 대조군)에 대해서 각각 94.86% 및 95.39%로 나타났으며, 인트라- 및 인터-어쎄이 CV(coefficient of variation)는 20ng/ml CD44v3-Fc에 대해서 각각 2.439% 및 5.037%로 나타났다. 상기 결과로 최적화된 CD44v3 검출용 샌드위치 ELISA는 암 진단용 키트로서 임상적으로 유용할 것으로 나타났다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: WT CD44v3, 개별적 CD44v3 도메인 및 도메인 결실 돌연변이의 발현 및 정제

본 발명에서 사용된 단백질 발현용 HEK293F(Human embryonic Kidney 293F)는 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 프리스타일^TM293 엑스프레션 배지(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃/8%CO₂ 인큐베이터(humidified Multitron incubation shaker(Infors HT, Bottmingen, Switzerland))에서 배양하였다.

또한, 본 발명에서 CD44 변이체인 WT(Wild-type) CD44v3, 도메인 결실 돌연변이(domain deletion mutant) 및 도메인을 클로닝하기 위해서, 표 1(CD44v3 도메인 증폭에 사용된 프라이머 서열)에서 나타난 바와 같이, (1) CD44v3(아미노산 21번∼606번)용 프라이머; (2) CD44D3(CD44v3 아미노산 243번∼284번)용 프라이머; (3) CD44D6(CD44v3 아미노산 359번∼401번)용 프라이머를 사용하였으며, (4) CD44v3deltaD3 또는 CD44v3deltaD6 도메인 결실 돌연변이의 제작을 위해서 2세트의 프라이머를 사용하여 오버렙 엑스텐션(overlap extension) PCR를 수행하여 CD44v3의 도메인들을 증폭시켰다.

상기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭된 CD44v3의 도메인을 SfiI(New England BioLab,Inc., Ipswich, MA, USA)로 처리한 후 힌지(hinge) 및 인간화 IgG1의 CH₂-CH₃도메인을 코딩하는 pCEP4 포유류 엑스프레션 벡터(Invitrogen)의 3'부위에 삽입하였다. CD44v3의 도메인이 라이케이션된 상기 벡터를 대장균(Escherichia coli ) JM109에 형질전환하였고, 형질전환된 JM109로부터 CD44v3의 도메인 DNA 서열을 함유하는 벡터(플라스미드)를 플라스미드 맥시 키트(Plasmid Maxi Kit; Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다(Sambrook, J. et al ., Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd ed., 2001).

증폭 대상	방향	프라이머 서열
CD44v3 아미노산 잔기 21번-606번	forward	5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCCAGATCGATTTGAATATAACC-3'
CD44v3 아미노산 잔기 21번-606번	reverse	5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCTTCTGGAATTTGGGGTGTCC-3'
CD44D3(CD44v3 아미노산 잔기 243번-284번)	forward	5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCACGTCTTCAAATACCATCTC-3'
CD44D3(CD44v3 아미노산 잔기 243번-284번)	reverse	5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCAATGGTGCTGGAGATAAAATC-3'
CD44D6(CD44v3 아미노산 잔기 359번-401번)	forward	5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCCAGGCAACTCCTAGTAGTAC-3'
CD44D6(CD44v3 아미노산 잔기 359번-401번)	reverse	5'-TCGCGGCCGGCC TGGCCTGCAGCTGTCCCTGTTGTC G-3'
CD44v3ΔD3	forward	5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCCAGATCGATTTGAATATAACC-3', 5'-CAGAATCCCTGCTACCAGTTCAACCACACCACGGGC-3'
CD44v3ΔD3	reverse	5'-GCCCGTGGTGTGGTTGAACTGGTAGCAGGGATTCTG-3', 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCTTCTGGAATTTGGGGTGTCC-3'
CD44v3ΔD6	forward	5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCCAGATCGATTTGAATATAACC-3', 5'-CACATTCTACAAGCACAATCGCCTCAGCTCATACCAGCC-3'
CD44v3ΔD6	reverse	5'-GGCTGGTATGAGCTGAGGCGATTGTGCTTGTAGAATGTG-3', 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCTTCTGGAATTTGGGGTGTCC-3'

상기 얻어진 CD44v3의 도메인을 함유하는 벡터 0.75mg DNA를 1.5mg PEI(polyethylenimine; Polysciences,Inc., Warrington,PA, USA)를 이용하여 HEK293F 세포(3 x 10⁸cells)에 형질감염(transfection)시켰다. 7 일후, 상기 형질감염된 세포의 배양액(culture supernatant)을 수득하여 단백질 A 세파로스 친화성 크로마토그래피(protein A sepharose affinity chromatography; RepliGen, Waltham, MA, USA)를 이용하여 CD44v3의 도메인 단백질을 정제하였다(Shukla, A.A. et al ., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci ., 848(1):28-39, 2007).

상기 정제된 CD44v3의 도메인 단백질은 나노드롭 분광광도계(Nano Drop spectrophotometer; NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA)를 이용하여 정량하였다. 또한, 정제된 CD44v3의 도메인 단백질은 PBS(phosphate-buffered saline)에서 투석시켰고 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 쿠마시(Coomassie brilliant blue: CBB)염색으로 분석하였다. 상기 단백질 A 세파로스 친화성 크로마토그래피로부터 풀(pool)된 CD44v3의 도메인 단백질 분획층(fractions)은 분주하여 -80℃에 보관하였다.

실험결과, 재조합 컨스트럭트(recombinant construct) 벡터에 WT CD44v3(CD44v3의 D3 내지 D10 포함), CD44v3 도메인 3 결실 돌연변이(CD44v3ΔD3), 도메인 6 결실 돌연변이(CD44v3ΔD6), CD44v3 도메인 3(CD44D3) 또는 CD44v3 도메인 6(CD44D6)이 삽입된 것으로 확인되었다. 또한, 상기 CD44v3 도메인을 함유하는 백터를 HEK293F 세포에 형질감염시켜 Fc를 함유하는 '도메인-Fc 융합 단백질'을 제조한 다음 각각의 단백질을 단백질 A 세파로스 친화성 크로마토그래피로 정제한 후 SDS-PAGE 단백질 전기영동 및 쿠마시 염색(Coomassie staining)을 수행한 결과 상기 CD44v3의 각 도메인-Fc 융합 단백질은 90% 순도를 가지는 것으로 확인되었다(도 1B).

실시예 2: CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 단쇄 가변영역 단편(scFvs)의 단리(isolation)

인간형 합성 scFv 단편 라이브러리(human synthetic single chain variable fragment library)는 재증폭하여 사용하였으며(Barbas, C.F. et al., Phage display: a laboratory manual, 2001), 상기 scFv 라이브러리에 대한 프리-클리어링(pre-clearing)을 수행하였다. 즉, Fc 바인더스(binders)를 프리-클리어(pre-clear)하기 위해서, 인간화 IgG(immunoglobulin-G; Green Cross Corp, Yong-si, Korea)를 단백질 A 세파로스에 고정시킨 후 항체-단백질 A 복합체를 라이브러리와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 상기 복합체를 원심분리한 후 상층액을 수득하였다(2회 반복). 최종 수득한 상층액은 파아지(Phage) ELISA로 분석하여 클리어링(정화)의 정도를 측정하였다.

파아지 디스플레이를 이용한 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 scFvs의 선별과정은 면역시험관(Immunotubes; Immuno™tube maxisorp, Nunc, Rochester, NY, USA)을 사용하여 5회 바이오패닝(biopanning)을 수행하거나 자석 비드(Dynabeads M-270 epoxy, Invitrogen)에 코팅된 4mg 재조합 인간화 CD44D3-Fc 또는 CD44D6-Fc를 사용하여 클론을 선별하는 과정으로 이루어졌다(Barbas, C.F. et al ., Phage display : a laboratory manual, 2001; Vestweber, D., Eur J Immunol., 33(5):1361-4, 2003). 24개의 파아지 클론을 아웃풋 플레이트 콜로니로부터 무작위하게 선택한 후 파아지 효소 면역어쎄이(phage enzyme immunoassay)를 사용하여 CD44D3 또는 CD44D6에 대한 반응도를 검증하였다(Ki, M.K. et al., Oncogene, 2013. 32(48):5449-57). 최종적으로 선별된 scFv 클론의 DNA 염기서열을 분석한 결과 2개의 scFv 클론은 서로 다른 CDR(complementarity determining region) 서열을 가지는 것으로 확인되었다(표 2: CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역 아미노산 서열).

실험결과, 인간형 합성 scFv 라이브러리를 프리-클리어링하여 Fc 바인더를 제거한 후 파아지 ELISA로 측정한 결과 Fc 바인더인 약 90% scFv가 제거된 것으로 확인되었다. 라이브러리는 CD44 도메인 융합 단백질(CD44D3-Fc 또는 CD44D6-Fc)로 코팅된 면역시험관(immunotube) 및 자석 구슬로 바이오페닝(biopanning)하여 CD44 도메인에 특이적인 클론을 단리하였다(도 2A 및 2B).

상기 단리된 클론 중에서 24개의 파아지 클론(phage clones)을 무작위로 선택하여 헬퍼 파아지 감염으로 구출(rescue)하고 CD44D3 또는 CD44D6에 대한 반응도를 파아지 효소 면역분석(phage enzyme immunoassay)으로 검증하였다. 상기 클론의 DNA 염기서열을 분석한 결과 선택된 2가지 scFv 클론(Clones: C1, C2)은 각각 CD44D3 또는 CD44D6를 인식하였고, 각기 다른 CDR(complementarity determining region)를 가지는 것으로 확인되었다(표 2 참조).

실시예 3: CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체의 발현 및 정제

CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체를 제조하기 위해서 실시예 2에서 선별된 scFv 클론(Clones: C1, C2)의 중쇄 가변영역(Variable Heavy Chain: V_H) 유전자, 또는, 경쇄 가변영역(Variable Light Chain: V_L) 유전자를 표적으로 하는 프라이머(표 3: CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체 제조를 위해 사용된 프라이머 서열)를 사용하여, V_H 사슬의 5' 및 3' 말단에 각각 EcoRI 및 ApaI 제한효소 분할부위가 포함되도록 하였고, V_L 사슬은 5' HindIII 및 3' BsiWI이 포함되도록 PCR을 수행하였다.

상기 방법에 의해 수득된 CD44D3 또는 CD44D6를 특이적으로 인식하는 아미노산의 DNA 염기서열을 함유하는 PCR 단편을 적절한 제한효소(New England BioLabs, Inc.)로 분할한 후 바이시스트로닉(bicistronic) 포유동물 엑스프레션 벡터 pCDNA3.1(Invitrogen)의 인간 IgG1의 힌지 및 CH₂-CH₃ 도메인을 가지는 V_H 클로닝 부위에 삽입하였다(Sambrook, J. et al ., Molecular cloning : a laboratory manual. 3rd ed., 2001). 상기 바이시스트로닉 벡터로부터 유래하는 CD44D3 또는 CD44D6 특이적 항체는 상기 CD44v3 도메인 융합 단백질과 동일한 방법으로 발현시켰고 정제하였다(Kim, H.Y. et al ., PLoS One, 6(5):e19867, 2011).

명칭	방향	프라이머 서열
중쇄 가변영역	forward	5'-CGGGAATTCGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCTCTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3'
중쇄 가변영역	reverse	5'-GGCGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCAGTGCCCTTGGCCCC-3'
경쇄 가변영역	forward	5'-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAAGGACCAGTCTGTGCTGACTCAGCC-3'
경쇄 가변영역	reverse	5'-GGCCGTACGTAGGACCGTCAGCTTGGTGCCTCCGCCTAAGACATAACCACC-3'

실험결과, HEK293F 세포에서 CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체(IgG 클론으로 전환된 ScFv 클론)를 발현 및 정제 후 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색한 결과 모든 IgG 클론은 90% 순도를 가지는 것으로 나타났다(도 3A). ELISA 결과에 의하면 정제된 CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체는 각각 CD44D3-Fc 및 CD44D6-Fc에 결합하나 Fc에는 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 또한, 클론 1(C1)은 클론 2(C2)보다 해당 도메인에 대해서 높은 친화도를 나타내는 것으로 확인되었다(도 3B).

실시예 4: CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체의 동정

ELISA를 준비하기 위해서, 실시예 1에서 제조된 재조합 단백질인 CD44v3-Fc, CD44v3ΔD3-Fc, CD44v3ΔD6-Fc, CD44D3-Fc, CD44D6-Fc 또는 IgG1 Fc 단편(0.1mg 단백질/100ml PBS)을 96-웰 플레이트 상에서 37℃에서 하룻밤 코팅시켰다. 상기 재조합 단백질로 코팅된 플레이트는 세척액 PBST(0.05%(v/v) Tween 20)로 3회 세척 후 3% BSA-PBST(3%(w/v) bovine serum albumin, PBST)로 37℃에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 처리한 다음, 0.1g CD44D3 또는 CD44D6 특이적 IgGs를 100ml BSA-PBST에 희석하여 첨가한 후 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 상기 처리된 플레이트는 PBST로 3회 세척 후 HRP(Horseradish peroxidase)로 접합된 항-인간화 람다(lambda) 경쇄 항체(1:1000 희석; Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA)가 첨가된 BSA-TBST로 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 상기 처리된 플레이트는 PBST로 3회 세척 후 100μl TMB 발색기질용액(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 각 웰에 분주한 후, 450nm에서의 흡광도(Optical density)를 플레이트 측정기(microtiter plate reader; VICTOR™ X4, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 측정하였다.

그 결과, CD44v3-Fc, CD44v3ΔD3-Fc, CD44v3ΔD6-Fc 및 Fc를 96-웰 플레이트에 코팅한 후 ELISA로 반응도를 측정하면 CD44D3 및 CD44D6 특이적 항체는 도메인 특이적인 양상을 나타내는 것으로 확인되었다(도 3C).

실시예 5: 항체-항원간의 상호작용 실시간 측정

항체-항원간의 상호작용을 실시간으로 측정하기 위해서, BLI(Biolayer interferometry) 어쎄이를 OctetRED96 시스템(ForteBio, MenloPark, CA, USA)을 사용하여 측정하였다. CD44v3-Fc(5μg/ml)는 아민 반응성 바이오센서(Amine Reactive(AR2G) biosensor(ForteBio))에 아민 커플링(amine coupling)으로 고정시켰다. CD44D3 또는 CD44D6 특이적 IgGs는 순차적으로 2배수로 1 x kinetics 완충용액(ForteBio)에 희석(10nM∼1.25nM)한 후 200μl씩 96-웰 플레이트에 분주하였다. 모든 상호작용의 분석은 30℃, 1 x kinetics 완충용액에서, 1,000rpm으로 교반(agitation)하는 가운데 이뤄졌다. 결합도 및 해리도 상수(Association and dissociation rate constants)는 1:1 바인딩 모델 피팅(binding model fitting)으로 ForteBio Octet Data Analysis software Version 7.1을 사용하여 얻을 수 있었다.

그 결과, label-free Octet 시스템으로 측정한 CD44v3에 대한 결합 친화성의 CD44v3-Fc 상호작용 K_D는 CD44D3 특이적 IgG의 경우 1.069nM, CD44D6 특이적 항체의 경우 1.467nM인 것으로 나타났다.

실시예 6: CD44v3 특이적 샌드위치 ELISA를 통한 CD44v3의 검출

CD44D6 특이적 항체-HRP(horseradish peroxidase) 접합체(conjugate)를 형성하기 위해서 peroxidase labeling kit-NH₂ 키트(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)를 사용하여 정제된 CD44D6 특이적 항체에 HRP를 접합시켰다. 간략히 설명하면, 200mg CD44D6 특이적 항체가 첨가된 100μl 세척 완충용액을 필터레이션 시험관(filtration tube)에 첨가한 후 8,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 추가 세척 후 NH₂-reactive peroxidase가 첨가된 10ml 반응 완충용액(reaction buffer)을 필터레이션 시험관에 첨가하여 37℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 상기 필터레이션 시험관을 순차적으로 완충용액으로 세척한 다음, 200μl 저장용액으로 CD44D6 특이적 항체-HRP 접합체를 수득하였다.

샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)의 경우, 96-웰 플레이트를 5mg/ml의 CD44D3 특이적 포획용 항체가 첨가된 PBS로 웰 당 100μl씩 분주하고 37℃에서 하룻밤 코팅하였다. 상기 플레이트의 각 웰은 PBST로 3회 세척 후 블로킹 완충용액으로 37℃에서 1시간 동안 처리한 다음 CD44v3-Fc가 첨가된 블로킹 완충용액으로 37℃에서 2시간 인큐베인션하였다. 상기 플레이트의 각 웰은 PBST로 2회 세척 후 1mg/ml CD44D6 IgG-HRP 탐지용 항체가 첨가된 블로킹 완충용액으로 인큐베이션하였고, PBST로 3회 세척 후, 100μl TMB 발색기질용액(BD Biosciences)을 각 웰에 첨가하였다. 그 다음, 100μl 1N H₂SO₄(효소반응 정지용액)를 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시킨 다음 450nm에서의 흡광도(Optical density)를 플레이트 측정기(VICTOR™X4, PerkinElmer)로 측정하였다.

샌드위치 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 표적 단백질(CD44v3)의 적합한 포획 및 탐지를 위해서는 포획용 항체 및 탐지용 항체 희석률을 최적화하는 게 중요하며, 검출감도 및 작업범위(working range)를 결정하는 핵심적 요소가 된다(도 5). 따라서, 플레이트 상에서 최적화된 CD44v3 효소 면역어쎄이(immunoassay)를 결정하기 위해서 CD44v3에 대한 가장 높은 반응도를 나타내도록 최적화된 포획용 항체 및 탐지용 항체 농도를 결정하였다. 그 결과, 표준 분석을 하는데 최적의 농도는 CD44D3 특이적 IgG 포획용 항체의 경우 5μg/ml이었고 CD44D6 특이적 탐지용 항체(HRP 접합체)의 경우 1μg/ml인 것으로 확인되었다(도 6A 및 6B).

재조합 CD44v3-Fc를 사용한 결과 선형 동적 범위(linear dynamic range)는 0∼62.5ng/ml인 것으로 나타났으며, 보정 곡선(calibration curve)의 재현성은 6개의 독립적인 결과로부터 확인할 수 있었다(도 6C). CD44v3-Fc 검출 한계는 8.902ng/ml인 것으로 나타났다. 다음으로, 최적화된 샌드위치 ELISA의 인트라- 및 인터-어쎄이 리커버리(intra- and inter-assay recovery) 및 편차계수(coefficients of variation: CV)를 분석하였으며, 인트라-어쎄이 리커버리(intra-assay recovery)는 1회분으로 6개의 개별적인 CD44v3-Fc를 측정하였으나, 인터-어쎄이 리커버리(inter-assay recovery)는 독립적인 6회분 간의 농도를 측정하였다. 그 결과, 인트라- 및 인터-어쎄이 리커버리는 20ng/ml CD44v3-Fc에 대해서 각각 94.86% 및 95.39%로 나타났으며, 인트라- 및 인터-어쎄이 CV는 20ng/ml CD44v3-Fc에 대해서 각각 2.439% 및 5.037%로 나타났다(표 4: CD44v3의 샌드위치 ELISA 결과). 상기 결과들을 종합하면 최적화된 CD44v3 검출용 샌드위치 ELISA를 암 진단용 키트로 사용할 경우 임상적으로 매우 유용할 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Scripps Korea Antibody Institute LEE, Sukmook <120> CD44v3 domain 3- and domain 6-specific monoclonal antibodies and Use Therof <130> P14-B154 <160> 32 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain3_Variable heavy chain CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain3_Variable heavy chain CDR2 <400> 2 Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain3_Variable heavy chain CDR3 <400> 3 Arg Pro Thr Ala Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain3_Variable heavy chain CDR1 <400> 4 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain3_Variable heavy chain CDR2 <400> 5 Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain3_Variable heavy chain CDR3 <400> 6 Ala Arg Val Gln Cys Ser Gly Thr Arg Cys Tyr Ser Ala Asn Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain6_Variable heavy chain CDR1 <400> 7 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain6_Variable heavy chain CDR2 <400> 8 Gly Ile Ser Pro Asn Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain6_Variable heavy chain CDR3 <400> 9 His Ser Arg Phe Pro Leu Gln Pro Ala Leu Tyr Tyr Ala Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain6_Variable heavy chain CDR1 <400> 10 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain6_Variable heavy chain CDR2 <400> 11 Trp Ile Tyr His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain6_Variable heavy chain CDR3 <400> 12 Asp Gly Thr Pro Asn Pro Lys His Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain3_Variable light chain CDR1 <400> 13 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain3_Variable light chain CDR2 <400> 14 Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain3_Variable light chain CDR3 <400> 15 Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain3_Variable light chain CDR1 <400> 16 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain3_Variable light chain CDR2 <400> 17 Ser Asn Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain3_Variable light chain CDR3 <400> 18 Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Asn Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain6_Variable light chain CDR1 <400> 19 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp Val Asn 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain6_Variable light chain CDR2 <400> 20 Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> c1_Human CD44-Domain6_Variable light chain CDR3 <400> 21 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain6_Variable light chain CDR1 <400> 22 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asn Val Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain6_Variable light chain CDR2 <400> 23 Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser 1 5 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> c2_Human CD44-Domain6_Variable light chain CDR3 <400> 24 Ala Ala Trp Asp Ala Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 25 <211> 116 <212> PRT <213> Human CD44D3 IgG(C1)_Variable heavy chain <400> 25 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Pro Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 127 <212> PRT <213> Human CD44D3 IgG(C2)_Variable heavy chain <400> 26 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Arg Val Gln Cys Ser Gly Thr Arg Cys Tyr Ser Ala Asn 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 27 <211> 127 <212> PRT <213> Human CD44D6 IgG(C1)_Variable heavy chain <400> 27 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Pro Asn Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ser Arg Phe Pro Leu Gln Pro Ala Leu Tyr Tyr Ala Asp 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 28 <211> 121 <212> PRT <213> Human CD44D6 IgG(C2)_Variable heavy chain <400> 28 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Tyr His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Thr Pro Asn Pro Lys His Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 111 <212> PRT <213> Human CD44D3 IgG(C1)_Variable light chain <400> 29 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 30 <211> 111 <212> PRT <213> Human CD44D3 IgG(C2)_Variable light chain <400> 30 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 31 <211> 111 <212> PRT <213> Human CD44D6 IgG(C1)_Variable light chain <400> 31 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 32 <211> 111 <212> PRT <213> Human CD44D6 IgG(C2)_Variable light chain <400> 32 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asn Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110

Claims

다음 서열을 포함하는 CD44v3 특이적 항체:
i) 서열번호 1의 CDRH1, 서열번호 2의 CDRH2 및 서열번호 3의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 13의 CDRL1, 서열번호 14의 CDRL2 및 서열번호 15의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
ii) 서열번호 4의 CDRH1, 서열번호 5의 CDRH2 및 서열번호 6의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 16의 CDRL1, 서열번호 17의 CDRL2 및 서열번호 18의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
iii) 서열번호 7의 CDRH1, 서열번호 8의 CDRH2 및 서열번호 9의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 19의 CDRL1, 서열번호 20의 CDRL2 및 서열번호 21의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
iv) 서열번호 10의 CDRH1, 서열번호 11의 CDRH2 및 서열번호 12의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 22의 CDRL1, 서열번호 23의 CDRL2 및 서열번호 24의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
v) 서열번호 25의 중쇄 가변영역과 서열번호 29의 경쇄 가변영역;
vi) 서열번호 26의 중쇄 가변영역과 서열번호 30의 경쇄 가변영역;
vii) 서열번호 27의 중쇄 가변영역과 서열번호 31의 경쇄 가변영역; 또는
viii) 서열번호 28의 중쇄 가변영역과 서열번호 32의 경쇄 가변영역.
제1항에 따른 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
제3항의 벡터가 도입된 세포.
다음 (a) 및 (b)를 포함하는 CD44v3 검출용 키트:
(a) i) 서열번호 1의 CDRH1, 서열번호 2의 CDRH2 및 서열번호 3의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 13의 CDRL1, 서열번호 14의 CDRL2 및 서열번호 15의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
ii) 서열번호 4의 CDRH1, 서열번호 5의 CDRH2 및 서열번호 6의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 16의 CDRL1, 서열번호 17의 CDRL2 및 서열번호 18의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
iii) 서열번호 25의 중쇄 가변영역과 서열번호 29의 경쇄 가변영역; 및
iv) 서열번호 26의 중쇄 가변영역과 서열번호 30의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체에서 선택된 하나 이상의 항체,
(b) i) 서열번호 7의 CDRH1, 서열번호 8의 CDRH2 및 서열번호 9의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 19의 CDRL1, 서열번호 20의 CDRL2 및 서열번호 21의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
ii) 서열번호 10의 CDRH1, 서열번호 11의 CDRH2 및 서열번호 12의 CDRH3를 포함하는 중쇄 가변영역과 서열번호 22의 CDRL1, 서열번호 23의 CDRL2 및 서열번호 24의 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역;
iii) 서열번호 27의 중쇄 가변영역과 서열번호 31의 경쇄 가변영역; 및
iv) 서열번호 28의 중쇄 가변영역과 서열번호 32의 경쇄 가변영역에서 선택된 하나 이상의 항체.
제5항에 있어서, (a)의 항체 및 (b)의 항체 중 어느 하나는 고정 지지체에 고정되어 CD44v3를 포획하는 포획용 항체이며, 다른 하나는 포획용 항체에 결합된 CD44v3를 검출하기 위한 표지물질이 결합된 탐지용 항체인 것을 특징으로 하는 CD44v3 검출용 키트.
제6항에 있어서, 상기 포획용 항체는 고형 지지체에 공유결합 또는 물리적 흡착으로 고정되어 있는 특징으로 하는 CD44v3 검출용 키트.
제6항에 있어서, 상기 탐지용 항체는 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloidal gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군에서 선택되는 표지물질이 결합된 것을 특징으로 하는 CD44v3 검출용 키트.
제6항에 있어서, 추가적으로 표지물질과 발색 반응을 유도할 수 있는 발색기질 용액 또는 효소반응 정지 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 CD44v3 검출용 키트.
제6항에 따른 키트를 이용한 CD44v3의 검출방법.
제10항에 있어서, 효소 면역흡착 분석법(Enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(Radioimmunoassay: RIA), 샌드위치 면역 측정법(Sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블럿, 면역 점 블럿 분석법(Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법(Immuno-fluorence Assay, IFA), 면역발광 측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography)을 이용하는 것을 특징으로 하는 CD44v3의 검출방법.
제10항에 있어서,
(a) 포획용 항체에 시료 내의 항원을 결합시키는 단계;
(b) 상기 포획용 항체에 결합된 시료 내의 항원에 탐지용 항체를 결합시키는 단계; 및
(c) 상기 포획용 항체 및 탐지용 항체에 결합된 시료의 항원-항체 결합반응으로 CD44v3의 유무를 확인하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 CD44v3의 검출방법.
제12항에 있어서, 상기 시료는 암 의심 환자로부터 유래한 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 세포간액, 타액, 뇌척수액 및 소변으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CD44v3의 검출방법.
제13항에 있어서, 상기 암은 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 대장암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선 암, 고환암, 외음부 암, 갑상선암, 부갑상선암, 위암, 흑색종, 기관지암, 비인두암, 후두암, 이자암, 뇌암, 골암, 골육종, 피부암, 식도암, 담도암, 두경부암, 경추암, 요관암, 신경세포아종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CD44v3 검출방법.