KR20150140831A

KR20150140831A - 페녹시에틸 디히드로-1h-이소퀴놀린 화합물

Info

Publication number: KR20150140831A
Application number: KR1020157032468A
Authority: KR
Inventors: 제레미 슐렌버그 요크
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2015-12-16
Also published as: CN105209438B; AU2014265762A1; EP2997015B1; EA201591915A1; PL2997015T3; EP2997015A1; KR101798315B1; TWI636046B; TW201534588A; EA027306B1; CA2908400C; JP2016519140A; CN105209438A; BR112015026967A8; PT2997015T; HUE033574T2; ES2626976T3; US20160052889A1; BR112015026967B1; MX2015015841A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
<화학식 I>

상기 식에서, R은 H 또는 F이다.

Description

페녹시에틸 디히드로-1H-이소퀴놀린 화합물 {PHENOXYETHYL DIHYDRO-1H-ISOQUINOLINE COMPOUNDS}

본 발명은 신규 페녹시에틸 디히드로-1H-이소퀴놀린 화합물, 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물, 상기 화합물을 사용하여 생리학적 장애를 치료하는 방법, 및 상기 화합물의 합성에 유용한 중간체 및 공정에 관한 것이다.

본 발명은 골관절염과 류마티스 관절염을 포함하고 이들 병태와 연관된 통증을 추가로 포함하는 관절염과 같은 염증성 병태의 치료 분야에 속한다. 관절염은 미국에서만도 수백만명의 사람이 걸리며 장애의 주요 원인이다. 또한, 관절염은 반려 동물에서 장애의 중요한 원인으로서 인식되고 있다. 치료는 종종 NSAID (비스테로이드성 항염증 약물) 또는 COX-2 억제제를 포함하며, 이들은 환자에서 뜻밖의 심혈관 및/또는 위장 부작용을 일으킬 수 있다. 그에 따라, 특정 환자는 NSAID 또는 COX-2 억제제를 사용하는 것으로부터 배제될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 현행 치료의 부작용이 없는 골관절염 및 류마티스 관절염의 대체 치료에 대한 필요성이 존재한다.

4가지 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂) 수용체 하위유형이 다음과 같이 확인되었다: EP1, EP2, EP3 및 EP4. EP4는 류마티스 관절염 및 골관절염의 설치류 모델에서 관절 염증성 통증에 관여하는 1차 수용체인 것으로 개시되었다. 그러므로, 선택적 EP4 길항제는 관절염성 통증을 포함한 관절염의 치료에 유용할 수 있다. 또한, EP4 길항작용은 프로스타노이드, 예컨대 PGI₂ 및TxA₂의 생합성을 방해하지 않으므로, 선택적 EP4 길항제는 NSAID 및 COX-2 억제제로 관찰되는 잠재적인 심혈관 부작용을 가지고 있지 않을 수 있는 것으로 시사되었다.

WO 2013/004290에서는 EP4 수용체 길항제로서의 시클릭 아민 유도체를 개시하고 있다. US 2005/0250818에서는 진통제 활성을 지닌 EP4 수용체 선택적 길항제인 특정 오르토 치환된 아릴 및 헤테로아릴 아미드 화합물을 개시하고 있다. 또한, WO 2011/102149에서는 IL-23 매개 질환의 치료에 유용한 선택적 EP4 길항제인 특정 화합물을 개시하고 있다.

본 발명은 EP1, EP2 및 EP3에 비해 EP4의 선택적 억제제인 특정 신규 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 전통적인 NSAID와 비교하여 감소된 심혈관 또는 위장 부작용에 대한 가능성을 지닌 특정 신규 화합물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서, R은 H 또는 F이다.

본 발명은 관절염의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 관절염을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 골관절염의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 골관절염을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 또한, 본 발명은 류마티스 관절염의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 관절염과 연관된 통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 관절염과 연관된 통증을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 골관절염 또는 류마티스 관절염과 연관된 통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 골관절염 또는 류마티스 관절염과 연관된 통증을 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

또한, 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 특히 골관절염의 치료를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 류마티스 관절염의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 본 발명은 골관절염 또는 류마티스 관절염과 연관된 통증의 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 또한 제공한다. 또한, 본 발명은 골관절염 치료용 의약의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 본 발명은 류마티스 관절염 치료용 의약의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 본 발명은 골관절염 또는 류마티스 관절염과 연관된 통증 치료용 의약의 제조를 위한, 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 또한 제공한다.

본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 특정한 실시양태에서, 조성물은 1종 이상의 다른 치료제를 추가로 포함한다. 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 관절염을 치료하기 위한 제약 조성물을 또한 제공한다. 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 합성을 위한 신규 중간체 및 공정을 또한 포괄한다.

본원에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료하기 위한"은 기존 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도의 억제, 둔화, 정지 또는 역전을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "환자"는 인간, 반려 동물, 예컨대 고양이 또는 개, 또는 가축, 예컨대 말, 소 또는 돼지를 포함하는 포유동물을 지칭한다. 인간 및 반려 동물이 바람직한 환자이다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은 환자에게 단회 또는 다회 용량 투여시 진단 또는 치료 단계에 있는 환자에서 목적하는 효과를 제공하는 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다.

유효량은 공지 기술의 사용에 의해 및 유사한 상황 하에서 수득된 결과를 관찰함으로써 통상의 기술자로서의 담당 진단의에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 환자에 대한 유효량을 결정함에 있어서, 포유동물의 종; 그의 크기, 연령 및 일반적 건강; 관여된 특정 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 정도 또는 연루 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여된 특정한 화합물; 투여 방식; 투여된 제제의 생체이용률 특성; 선택된 용량 요법; 병용 의약의 사용; 및 기타 관련 상황을 포함한 (이에 제한되지 않음) 다수의 인자가 담당 진단의에 의해 고려된다.

본 발명의 화합물은 폭넓은 투여량 범위에 걸쳐서 일반적으로 효과적이다. 예를 들어, 1일당 투여량은 보통 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중의 범위 안에 있다. 일부 경우에서는 전술한 범위의 하한치 미만의 투여량 수준이 훨씬 충분할 수 있으며, 반면에 다른 경우에서는 훨씬 더 많은 용량이 허용가능한 부작용 하에 사용될 수 있고, 따라서 상기 투여량 범위는 어떤 식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 화합물을 생체이용가능하게 하는 임의의 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 가장 바람직하게는, 그러한 조성물은 경구 투여용이다. 그러한 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 주지이다. (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)] 참조).

본 발명의 화합물은 본 발명의 치료 방법에 특히 유용하지만, 특정 기, 치환기 및 배위가 바람직하다. 하기 단락은 그러한 바람직한 기, 치환기 및 배위를 기재한다. 이들 바람직한 사항은 본 발명의 치료 방법 및 새로운 화합물 양쪽 모두에 적용가능한 것으로 이해될 것이다.

하기 화학식 Ia의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 바람직하다.

<화학식 Ia>

또한, 하기 화학식 Ib의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이 바람직하다.

<화학식 Ib>

특히 바람직한 화합물은 하기 화학식으로 표시되는 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-페녹시에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조산 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.

4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-페녹시에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조산이 가장 바람직하다.

명확을 기하기 위해 하기 반응식에서 특정 입체화학적 중심은 특정하지 않은 채로 놔두고 특정 치환기는 제거시켰으며, 어떤 식으로도 반응식의 교시내용을 제한하고자 의도되지 않는다. 또한, 개별 이성질체, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 통상의 기술자에 의해 화학식 I 화합물의 합성시에 임의의 편리한 시점에서 선택적 결정화 기술 또는 키랄 크로마토그래피와 같은 방법에 의해 분리 또는 분할될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [J. Jacques, et al., "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 및 E.L. Eliel and S.H. Wilen, "Stereochemistry of Organic Compounds", Wiley-Interscience, 1994] 참조). 대안적으로, 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이 적합하고 용이하게 이용가능한 키랄 출발 물질이 또한 이용될 수 있다. 추가로, 하기 반응식에 기재된 중간체는 질소 보호기를 함유한다. 보호 및 탈보호 조건은 통상의 기술자에게 주지이며 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007] 참조).

본원에 사용된 "kPag"는 킬로파스칼 게이지를 지칭하고; "Pg"는 적합한 보호기를 지칭하고; "DMEM"은 둘베코 변형 이글 배지를 지칭하고; "Boc"는 tert-부톡시 카르보닐 보호기를 지칭하고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 지칭하고; "THF"는 테트라히드로푸란을 지칭하고; "EtOAc"는 에틸 아세테이트를 지칭하고; "Et₂O"는 디에틸 에테르를 지칭하고; "TBME"는 tert-부틸 메틸 에테르를 지칭하고; "BOP"는 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "PGE₂"는 프로스타글란딘 E₂를 지칭하고; "FBS"는 소 태아 혈청을 지칭하고; "IBMX"는 (3-이소부틸-1-메틸크산틴)을 지칭하고; "MES"는 (2-(N-모폴리노)에탄술폰산)을 지칭하고; "HEPES"는 (2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산)을 지칭하고; "HTRF"는 균질 시간-분해 형광 기술을 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하고; "HBSS"는 행크 균형 염 용액을 지칭하고; "EC₈₀"은 작용제에 대해 가능한 최대 효능의 80%를 산출하는 그 작용제의 농도를 지칭하고; "IC₅₀"은 작용제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 산출하는 그 작용제의 농도를 지칭한다.

본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 관련 기술분야에 알려져 있는 다수의 절차에 의해 제조될 수 있으며, 그 중 일부가 하기 반응식, 제조 및 실시예에서 예시되어 있다. 기재된 경로의 각각에 대한 구체적 합성 단계를 상이한 방식으로 또는 상이한 반응식으로부터의 단계와 함께 조합시켜 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조할 수 있다. 하기 반응식에서의 각 단계의 생성물은 추출, 증발, 침전, 크로마토그래피, 여과, 연화처리 및 결정화를 비롯한 통상의 방법에 의해 회수될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 통상의 기술자에게 용이하게 이용가능하다. 모든 치환기는 달리 특정되지 않는 한 이전에 정의된 바와 같다. 이들 반응식, 제조 및 실시예는 어떤 식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해된다.

반응식 1

반응식 1, 단계 A에서, 보호된 3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카복실산 (여기서 Pg는 적합한 질소 보호기, 예컨대 tert-부톡시 카르보닐 보호기 (BOC)임)을 표준 조건 하에서 메틸 4-(1-아미노에틸)벤조에이트와 커플링시켜 구조 (1)의 보호된 이소퀴놀린 아미드를 제공한다. 예를 들어, 보호된 3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카복실산을 적합한 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄에 용해시키고, 약 0℃로 냉각시키고, 약 1.1 당량의 적합한 유기 염기, 예컨대 트리에틸아민으로 처리한다. 이어서 약 1.1 당량의 이소부틸 클로로포메이트를 교반하면서 적가한다. 혼합물을 약 20분 동안 0℃에서 교반하고, 뒤이어 약 1.1 당량의 메틸 4-(1-아미노에틸)벤조에이트를 첨가한다. 반응 혼합물을 이어서 약 1시간 동안 실온에서 교반한다. 보호된 이소퀴놀린 아미드 (1)를 이어서 관련 기술분야 주지의 방법, 예컨대 추출 기술을 사용하여 단리한다. 예를 들어, 물을 혼합물에 첨가하고, 층을 분리하고, 유기상을 수성 중황산칼륨, 뒤이어 수성 중탄산나트륨으로 세척한다. 유기상을 이어서 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 보호된 이소퀴놀린 아미드 (1)를 제공한다.

반응식 2

반응식 2, 단계 A에서, 보호된 이소퀴놀린 아미드 (1)를 관련 기술분야 주지의 조건 하에서 탈보호시켜 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)를 제공한다. 예를 들어, 약 10 당량의 아세틸 클로라이드를 약 0℃에서 적합한 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트에 용해된 약 11 당량의 에탄올에 적가한다. 혼합물을 약 30분 동안 교반하고, 실온으로 가온하고, 이어서 에틸 아세테이트 중 약 1 당량의 보호된 이소퀴놀린 아미드 (1)의 용액을 교반하면서 반응 혼합물에 첨가한다. 반응 혼합물을 이어서 약 40℃에서 약 12시간 동안 교반한다. 이어서 실온으로 냉각시키고, 탈보호된 이소퀴놀린을 관련 기술분야 주지의 기술을 사용하여 단리한다. 예를 들어, 고체를 여과에 의해 수집하고, 감압 하에 건조시킨다. 물을 고체에 첨가하고, 뒤이어 혼합물의 pH가 약 10에 도달할 때까지 32% 수성 암모니아를 첨가한다. 고체를 다시 여과에 의해 수집하고, 약 45℃에서 감압 하에 건조시켜 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)를 제공한다.

대안적으로, 반응식 2, 단계 A에서, 보호된 이소퀴놀린 아미드 (1)를 관련 기술분야 주지의 조건 하에서 탈보호시켜 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)의 HCl 염을 제공할 수 있다. 예를 들어, 보호된 이소퀴놀린 아미드 (1)를 1,4-디옥산 중 염화수소의 4M 용액에 용해시킨다. 반응을 약 12시간 동안 실온에서 교반한다. 이어서 반응 혼합물을 감압 하에 농축시킴으로써 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)의 HCl 염을 단리한다.

반응식 2, 단계 B에서, 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)를 적합하게 치환된 페녹시 화합물과 커플링시켜 페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 제공한다. 예를 들어, 실리카 겔을 적합한 유기 용매, 예컨대 디클로로메탄과 약 22℃에서 합하고, 물 중 약 2 당량의 과아이오딘산나트륨의 용액을 교반 실리카 겔 혼합물에 적가한다. 혼합물을 약 30분 동안 교반하고, 약 1.5 당량의 3-페녹시-1,2-프로판디올을 첨가한다. 혼합물을 약 또 다른 30분 동안 교반하고, 이어서 여과하여 고체를 제거하고, 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘 위에서 건조시킨다. 유기층을 다시 여과하고, 약 1 당량의 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)를 첨가하고, 뒤이어 약 2 당량의 적합한 환원제, 예컨대 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 조금씩 첨가한다. 반응 혼합물을 이어서 약 1시간 동안 교반하고, 뒤이어 과량의 물을 첨가한다. 수성층의 pH가 약 10에 도달할 때까지 32% 암모니아의 수용액을 혼합물에 첨가한다.

페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 이어서 관련 기술분야 주지의 기술에 의해 단리하고 정제한다. 예를 들어, 반응 혼합물의 층을 분리하고, 유기층을 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시킨다. 조 오일을 적합한 유기 용매, 예컨대 TBME에 용해시키고, 물을 첨가하고, 뒤이어 1M 수성 HCl을 첨가한다. 생성된 슬러리를 약 30분 동안 교반하고, 이어서 감압 하에 농축시켜 유기 용매를 제거한다. 침전물을 이어서 여과에 의해 수집하고, 물과 TBME의 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 수성층의 pH가 약 10에 도달할 때까지 32% 수성 암모니아로 처리하고, 층을 분리하고, 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시킨다. 생성된 조 물질을 적합한 용리제, 예컨대 에틸 아세테이트/헥산으로 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 정제된 페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 제공한다.

대안적으로, 반응식 2, 단계 B에서, 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)의 HCl 염을 적합하게 치환된 페녹시 화합물과 커플링시켜 페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 제공할 수 있다. 예를 들어, 약 1.5 당량의 2-페녹시아세트알데히드, 예컨대 2-(4-플루오로페녹시)아세트알데히드를 적합한 유기 용매, 예컨대 1,2-디클로로에탄 중 약 1 당량의 탈보호된 이소퀴놀린 아미드 (2)의 HCl 염과 합한다. 이 혼합물에 약 1.4 당량의 적합한 환원제, 예컨대 소듐 트리아세톡시보로히드라이드를 첨가하고, 반응 혼합물을 약 12시간 동안 실온에서 교반한다. 포화 수성 중탄산나트륨을 이어서 반응 혼합물에 첨가하고, 페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 관련 기술분야 주지의 기술에 의해 단리하고 정제한다. 예를 들어, 반응 혼합물을 적합한 유기 용매, 예컨대 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 추출물을 합하고, 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, 황산마그네슘 위에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시킨다. 조 물질을 이어서 적합한 용리제, 예컨대 에틸 아세테이트/헥산으로 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 정제된 페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 제공한다.

반응식 3

반응식 3, 단계 A에서, 페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 관련 기술분야 주지의 조건 하에서 가수분해시켜 화학식 I의 화합물을 제공한다. 예를 들어, 페녹시에틸 이소퀴놀린 (3)을 적합한 유기 용매, 예컨대 THF 또는 메탄올/THF 혼합물에 용해시키고, 이어서 약 2 내지 4 당량의 적합한 수성 염기, 예컨대 수성 수산화나트륨으로 처리한다. 반응을 이어서 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도에서 약 12시간 동안 교반한다. 화학식 I의 화합물을 이어서 관련 기술분야 주지의 조건 하에서 단리하고 정제한다. 예를 들어, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 유기 용매를 제거한다. 물을 첨가하고, 수성층을 적합한 유기 용매, 예컨대 TBME로 세척한다. 수성층을 이어서 약 5℃로 냉각시키고, 적합한 수성 산, 예컨대 염산으로 교반하면서 pH가 약 2에 도달할 때까지 처리한다. 반응을 이어서 실온으로 가온하고, 고체를 여과에 의해 수집한다. 고체를 이어서 물에 첨가하고, 약 1시간 동안 약 80℃로 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 여과에 의해 수집하고, 약 45℃에서 약 12시간 동안 감압 하에 건조시킨다. 건조된 고체를 이어서 적합한 유기 용매, 예컨대 이소프로필 아세테이트에 첨가하고, 약 5시간 동안 교반한다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 감압 하에 건조시켜 화학식 I의 정제된 화합물을 제공한다.

제약상 허용되는 염 및 그를 제조하는 일반적인 방법론은 관련 기술분야에 주지이다. 예를 들어, 문헌 [Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al. "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities," Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); 및 Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977)] 참조. 합성 분야에서의 통상의 기술자라면 본 발명의 화합물을 통상의 기술자에게 주지인 기술과 조건을 사용하여 제약상 허용되는 염으로 전환시키고 그러한 제약상 허용되는 염으로서 단리시킬 수 있음을 인식할 것이다.

제조 및 실시예

하기 제조 및 실시예는 본 발명을 추가로 예시한다. 달리 언급이 없는 한, 본원에 예시된 화합물은 엑셀리스 드로우(Accelrys Draw) (IUPAC명)를 사용하여 명명되고 넘버링된다.

제조 1

tert-부틸 (3R)-3-[[(1S)-1-(4-메톡시카르보닐페닐)에틸]카르바모일]-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-2-카복실레이트의 합성

반응식 1, 단계 A: (3R)-2-tert-부톡시카르보닐-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카복실산 (40.0 g, 141.4 mmol)과 디클로로메탄 (784 mL)의 0℃ 혼합물에 트리에틸아민 (21.7 mL, 155.5 mmol)을 첨가하였다. 이어서 이소부틸 클로로포메이트 (20.3 mL, 155.5 mmol)를 적가 방식으로 첨가하였다. 첨가의 종료 후에, 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 메틸 (S)-4-(1-아미노에틸)벤조에이트 (27.9 g, 155.5 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물 (400 mL)을 첨가하고, 층을 분리하고, 유기층을 1M 수성 KHSO₄ (500 mL), 뒤이어 포화 수성 NaHCO₃ (500 mL)으로 세척하였다. 유기상을 MgSO₄ 위에서 건조시키고, 여과하여 고체를 제거하고, 여과물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 백색 고체 (60 g, 97% 수율)로서 제공하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 339 ([M + H - Boc]⁺), 383 ([M + H - t-Bu]⁺), 439 ([M + H]⁺).

제조 2

메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트의 합성

반응식 2, 단계 A: 에틸 아세테이트 (214 mL)와 에탄올 (87.6 mL, 1.51 mol)의 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 이어서 아세틸 클로라이드 (97.4 mL, 1.37 mol)를 적가 방식으로 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하면서 그것을 30분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 (480 mL) 중 tert-부틸 (3R)-3-[[(1S)-1-(4-메톡시카르보닐페닐)에틸]카르바모일]-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-2-카복실레이트 (60 g, 137 mmol)의 용액을 첨가하고, 이어서 생성된 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이어서 생성된 침전물을 여과에 의해 단리하고, 감압 하에 건조시켰다. 물 (300 mL)을 고체에 첨가하고, 이어서 32% 암모니아 수용액을 혼합물의 pH가 10에 도달할 때까지 첨가하였다. 현탁된 고체를 여과에 의해 단리하고, 이어서 그들을 진공 오븐 중 45℃에서 밤새 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (44 g, 95% 수율)로서 제공하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 339 ([M + H]⁺), 677 ([2M + H]⁺), 699 ([2M + Na]⁺).

제조 3

메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-페녹시에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트의 합성

반응식 2, 단계 B: 22℃에서의 실리카 겔 (200 g, 3.33 mol)과 디클로로메탄 (1100 mL)의 교반 혼합물에 물 (352 mL) 중 과아이오딘산나트륨 (56.2 g, 260 mmol)의 용액을 적가 방식으로 첨가하였다. 첨가의 종료 후에, 혼합물을 추가 30분 동안 교반하고, 이어서 3-페녹실-1,2-프로판디올 (34.5 g, 195 mmol)을 첨가하였으며, 그에 따라 약간의 발열이 일어난다. 혼합물을 추가 30분 동안 교반하고, 이어서 여과하여 고체를 제거하고, 수성층을 폐기하고, 유기층을 MgSO₄ 위에서 건조시키고, 여과하여 고체를 제거하고, 여과물을 메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트 (44 g, 130 mmol)로 처리하였다. 이어서, 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (57.4 g, 260 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 첨가 완료시, 혼합물을 추가 1시간 동안 교반하고, 이어서 물 (200 mL)을 첨가하였다. 수성층의 pH가 10에 도달할 때까지 32% 암모니아 수용액을 첨가하였다. 층을 분리하고, 유기층을 MgSO₄ 위에서 건조시키고, 여과하여 고체를 제거하고, 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 생성된 조 오일을 TBME (300 mL)에 용해시키고, 이어서 물 (250 mL)과 1M 수성 염산 (200 mL)을 첨가하였다. 생성된 슬러리를 30분 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켜 TBME를 제거하고, 생성된 백색 침전물을 여과에 의해 단리하였다. 이 침전물을 물 (400 mL)과 TBME (400 mL)의 교반 혼합물에 붓고, 32% 암모니아 수용액을 수성층의 pH가 10에 도달할 때까지 첨가하였다. 수성층을 제거하고, 유기층을 포화 염화나트륨 수용액 (200 mL)으로 세척하였다. 유기층을 단리하고, MgSO₄ 위에서 건조시키고, 여과하여 고체를 제거하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 조 물질을 30%에서 70%의 EtOAc/헥산 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피에 적용하였다. 생성물을 함유하는 분획을 통합하고, 그들을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 백색 고체 (44 g, 74% 수율)로서 제공하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 459 ([M + H]⁺).

제조 4

메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트 히드로클로라이드의 합성

반응식 2, 단계 A: tert-부틸 (3R)-3-[[(1S)-1-(4-메톡시카르보닐페닐)에틸]카르바모일]-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-2-카복실레이트 (5.5 g, 12.5 mmol)를 1,4-디옥산 중 염화수소 (30 mL, 120 mmol)의 4M 용액에 용해시켰다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고, 이어서 혼합물을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 백색 고체 (4.70 g, 100% 수율)로서 제공하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 339 ([M + H]⁺), 677 ([2M + H]⁺), 699 ([2M + Na]⁺).

제조 5

메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-플루오로페녹시)에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트의 합성

반응식 2, 단계 B: 1,2-디클로로에탄 (10.7 mL) 중 메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트 히드로클로라이드 (800 mg, 2.13 mmol)와 2-(4-플루오로페녹시)아세트알데히드 (493 mg, 3.2 mmol)의 혼합물에 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (633 mg, 2.99 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 포화 수성 NaHCO₃ (25 mL)을 첨가하고, 수성층을 에틸 아세테이트 (2 x 25 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 수성 NaCl (25 mL)로 세척하고, 유기상을 MgSO₄ 위에서 건조시키고, 여과하고, 여과물을 감압 하에 농축시켰다. 생성된 조 물질을 0%에서 60%의 EtOAc/헥산 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래쉬 크로마토그래피에 적용하였다. 생성물을 함유하는 분획을 통합하고, 그들을 감압 하에 농축시켜 표제 화합물을 무색 발포체 (550 mg, 54% 수율)로서 제공하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 477 ([M + H]⁺).

실시예 1

4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-페녹시에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조산의 합성

반응식 3, 단계 A: 메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-페녹시에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트 (41.5 g, 90.5 mmol), THF (291 mL) 및 2M 수성 수산화나트륨 (181 mL, 360 mmol)의 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하였다. 감압 하에 농축시켜 THF를 제거하였다. 물 (200 mL)을 첨가하고, 이어서 수성층을 TBME (2 x 200 mL)로 세척하였다. 수성층을 5℃로 냉각시키고, 진한 수성 염산을 교반하면서 pH가 2에 도달할 때까지 (pH 페이퍼 분석으로 평가함) 첨가하였다. 교반하면서, 혼합물을 30분에 걸쳐서 실온으로 가온하고, 이어서 고체를 여과에 의해 단리하였다. 고체를 물 (500 mL)에 첨가하고, 1시간 동안 80℃로 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 단리하고, 고체를 진공 오븐 중 45℃에서 밤새 건조시켰다. 고체를 이소프로필 아세테이트 (300 mL)에 첨가하고, 5시간 동안 격렬하게 교반하였다. 고체를 여과에 의해 단리하고, 고체를 감압 하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고체 (26 g, 60% 수율)로서 제공하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 445 ([M + H]⁺).

실시예 2

4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-플루오로페녹시)에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조산 히드로클로라이드의 합성

반응식 3, 단계 A: 메틸 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-플루오로페녹시)에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조에이트 (550 mg, 1.15 mmol)를 메탄올 (10 mL)과 테트라히드로푸란 (10 mL)의 혼합물에 용해시켰다. 수산화나트륨 (0.462 mL, 2.31 mmol)의 5N 수용액을 첨가하고, 이어서 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 감압 하에 농축시켜 백색 고체를 제공하였다. 1,4-디옥산 중 염화수소 (10 mL, 40 mmol)의 4M 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 현탁된 고체를 여과에 의해 제거하고, 고체를 THF (5 mL)로 세정하였다. 합한 여과물을 감압 하에 농축시켜 백색 고체를 제공하였다. 그 물질을 고온의 디에틸 에테르 (10 mL)에서 연화처리하고, 여과하여 표제 화합물을 백색 고체 (535 mg, 93% 수율)로서 제공하였다. 질량 스펙트럼 (m/z): 463 ([M + H]⁺), 485 ([M + Na]⁺).

인간 EP1, EP2, EP3 및 EP4에의 시험관내 결합

인간 EP1 (진뱅크(Genbank) 수탁번호 AY275470) 또는 EP4 (진뱅크 수탁번호 AY429109) 수용체를 안정적으로 발현하는 재조합 HEK293 세포로부터 hEP1 및 hEP4 막을 준비하였다. EP2 (진뱅크 수탁번호 AY275471) 또는 EP3 (이소형 VI: 진뱅크 수탁번호 AY429108) 수용체 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킨 HEK293 세포로부터 hEP2 및 hEP3 막을 준비하였다. 동결 세포 펠릿을 테플론(Teflon)/글래스 균질화기를 사용하여 균질화 완충제에서 균질화하였다. 막 단백질을 분취하고, -80℃에서 저장하기에 앞서 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시켰다. 균질화 완충제 (예를 들어 문헌 [Mauback, K.A., British Journal of Pharmacology, 156: 316-327 (2009)] 참조)는 10 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 250 mM 수크로스, 1 mM EDTA, 0.3 mM 인도메타신 및 이에 더하여 로슈 몰레큘라 바이오케미칼즈(Roche Molecular Biochemicals) (카탈로그 번호 1 697 498)로부터 입수한 컴플리트(Complete)^TM + EDTA를 함유하였다.

각 수용체에의 [³H]-PGE₂ 결합에 대한 K_d 값을 포화 결합 연구 또는 상동 경쟁에 의해 결정하였다. 화합물을 3배 희석 시리즈를 사용하여 96-웰 포맷으로 시험하여 10-포인트 곡선을 생성하였다. 희석된 화합물을 20 μg/웰 EP1, 10 μg/웰 EP2, 1 μg/웰 EP3 또는 10 내지 20 μg/웰 EP4 막과 90분 동안 25℃에서 0.3 내지 0.5 nM [³H]-PGE₂ (퍼킨엘머(PerkinElmer), 118 내지 180 Ci/mmol)의 존재 하에서 인큐베이션하였다. 결합 반응을 200 μL MES 완충제 (10 mM MES pH 6.0 + KOH, 10 mM MgCl₂ 및1 mM EDTA)에서 0.5 mL 폴리스티렌 96-웰 딥-웰 플레이트를 사용하여 수행하였다. 2 μM PGE₂의 존재 및 부재 하에서의 결합을 비교함으로써 비-특이적 결합을 계산하였다. 막을 여과에 의해 수거하고 (톰텍(TomTek) 수거기), 차가운 완충제 (10mM MES pH 6.0 + KOH, 10 mM MgCl₂)로 4회 세척하고, 60℃ 오븐에서 건조시키고, 방사능을 탑카운트(TopCount)^® 검출기를 사용하여 분당 카운트 (CPM)로서 정량화하였다. 퍼센트 특이적 결합을 임의의 억제제 부재 하에서의 결합의 퍼센트로서 계산하고, 2 μM PGE₂의 존재 하에서의 비-특이적 결합에 대해 보정하였다. 데이터를 다음에 나타낸 바와 같은 4-파라미터 비-선형 로지스틱 방정식 (ABase Equation 205)을 사용하여 분석하였다: y = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))) (여기서, y = % 특이적 억제, A = 곡선의 하단; B = 곡선의 상단; C = 상대적 IC₅₀ = 상단에서 하단까지의 데이터의 범위에 기초하여 50% 억제를 초래하는 농도; D = 힐 기울기(Hill Slope) = 곡선의 기울기). IC₅₀ 값으로부터의 K_i 전환 (K_i = IC₅₀/(1 + [L]/K_d) (여기서, [L]은 리간드 농도임).

<표 1>

인간 EP1, EP2, EP3 및 EP4에의 실시예 1 및 2의 시험관내 결합

화합물을 본질적으로 상기 기재된 바와 같은 절차에 따라 시험하였다. 표 1에서의 데이터는 실시예 1 및 실시예 2의 화합물이 서브-나노몰 농도에서 hEP4에 결합함을 입증한다. 표 1에서의 데이터는 실시예 1 및 실시예 2의 화합물이 hEP1, hEP2 및 hEP3에 보다는 hEP4에 더 강하게 결합함을 또한 입증하며, 이는 hEP4 수용체에 대한 선택성을 표시한다.

시험관내 인간 EP4 기능적 길항제 활성

인간 EP4 수용체를 안정적으로 발현하는 재조합 HEK293 세포에서 검정을 수행하였다. 세포주를 10% 소 태아 혈청 (FBS), 1 mM 피루브산나트륨, 10 mM HEPES, 500 μg/mL 제네티신 및 2 mM L-글루타민으로 보충한 고 글루코스 및 피리독신 히드로클로라이드를 함유한 DMEM (인비트로젠(Invitrogen))에서 배양함으로써 유지시켰다. 전면생장 배양물을 5% CO₂를 함유하는 분위기 중 37℃에서 성장시켰다. 세포를 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 수거하고, 동결 배지 (FBS + 6% DMSO)에 10⁷개세포/mL로 현탁시키고, 분취물을 액체 질소에 저장하였다. 검정 직전에, 세포를 DMEM에서 해동시키고, 원심분리하고, cAMP 완충제에 재현탁시켰다.

EP4 길항제에 의한 PGE₂-자극 cAMP 생산의 억제는 HTRF (시스바이오(Cisbio) 카탈로그 번호 62AM4PEB)를 사용하여 측정하였다. 4000개 세포에 상당하는 분취물을, EC₈₀을 산출하도록 미리 결정된 농도의 PGE₂ (0.188 nM PGE₂, 시그마(Sigma), 카탈로그 번호 P5640-10mg) 및 EP4 길항제를 함유하는 50 μL cAMP 검정 완충제와 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. cAMP 검정 완충제는 500 mL HBSS, 0.1% BSA, 20 mM HEPES 및 200 μM IBMX (시그마 I5879)를 함유하였다. CJ-042794는 양성 대조군으로서 역할을 하였다 (WO 2005/021508, 실시예 68, 4-{(1S)-1-[({5-클로로-2-[(4-플루오로페닐)옥시]페닐}카르보닐)아미노]에틸}벤조산; 또한 문헌 [Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226-232 (2008)] 참조). cAMP 수준을 측정하기 위해, 용해 완충제 중 cAMP-d2 접합체 및 항-cAMP-크립테이트 접합체를 처리된 세포와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. HTRF 신호를 엔비전(EnVision)^® 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머)를 사용하여 검출하여 665 nm에서의 형광 대 620 nm에서의 형광의 비를 계산하였다. 각각의 실험에 대해 생성된 cAMP 표준 곡선을 사용하여 미가공 데이터를 cAMP 양 (pmol/웰)으로 전환시켰다. 데이터를 다음에 나타낸 바와 같은 4-파라미터 비-선형 로지스틱 방정식 (ABase Equation 205)을 사용하여 분석하였다: y = (A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))) (여기서, y = % 특이적 억제, A = 곡선의 하단, B = 곡선의 상단, C = 상대적 IC₅₀ = 상단에서 하단까지의 데이터의 범위에 기초하여 50% 억제를 초래하는 농도, D = 힐 기울기 = 곡선의 기울기).

화합물을 본질적으로 상기 기재된 바와 같은 절차에 따라 시험하였다. 인간 EP4에서 측정하여 실시예 1의 화합물은 0.752±0.538 nM의 IC₅₀ (n=12)을 가지고, 실시예 2의 화합물은 0.450±0.256 nM의 IC₅₀ (n=4)을 가졌다. 이는 실시예 1 및 실시예 2의 화합물이 시험관내에서 인간 EP4의 길항제임을 입증한다.

시험관내 래트 EP4 기능적 길항제 활성

래트 EP4 cDNA (진뱅크 수탁번호 NM_03276)를 pcDNA 3.1 벡터 내로 클로닝하고, 후속하여 수용체 발현을 위해 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 래트 EP4 안정한 클론을 대규모화하고, 이어서 장래 화합물 스크리닝을 위해 세포 은행으로서 동결시켰다. rEP4 세포에서 EP4 길항제 화합물을 시험하기 위해, 동결 세포를 해동시키고, 이어서 세포를 cAMP 검정 완충제에 재현탁시켰다. cAMP 완충제는 20 mM HEPES (하이클론(Hyclone), SH30237), 0.1% BSA (깁코(Gibco), 15260) 및 125 μM IBMX (시그마, I5879)로 보충한 페놀 레드가 들어있지 않은 HBSS (하이클론, SH30268)에 의해 제조하였다 (예를 들어, 문헌 [Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226-232 (2008)] 참조). 세포를 96-웰 절반 면적 편평-바닥 폴리스티렌 블랙 플레이트 (코스타(Costar) 3694)에 플레이팅하였다. 화합물을 DMSO로 연속 희석하여 10-포인트 농도 반응 곡선을 얻었다. 이어서 희석된 화합물을 PGE₂ (케이만(Cayman) 14010, EC₈₀을 산출하도록 미리 결정된 농도)를 함유하는 cAMP 검정 완충제 내로 1/100의 DMSO/완충제의 비로 첨가하였다. 세포를 PGE₂ (EC₈₀ 농도)의 존재 하에 30분 동안 실온에서 화합물로 처리하였다. 세포로부터 생성된 cAMP 수준을 cAMP HTRF 검정 키트 (시스바이오 62AM4PEC)에 의해 정량화하였다. 플레이트를 엔비전 플레이트 판독기 상에서 HTRF 최적화 프로토콜 (퍼킨엘머)을 사용하여 판독하였다. 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) (v. 4) 비-선형 회귀, S자형 용량 반응 곡선 피팅을 사용하여 IC₅₀을 계산하였다.

화합물을 본질적으로 상기 기재된 바와 같은 절차에 따라 시험하였다. 래트 EP4에서 측정하여 실시예 1의 화합물은 2.0 nM의 IC₅₀ (n=1)을 가지고, 실시예 2의 화합물은 6.7 nM의 IC₅₀ (n=1)을 가졌다. 이는 실시예 1 및 실시예 2의 화합물이 시험관내에서 래트 EP4의 길항제임을 입증한다.

인간 전혈에서의 시험관내 길항제 활성

대식세포/단핵구로부터의 LPS-유도 TNFα 생산에 미치는 PGE₂의 억제 효과는 EP4 수용체에 의해 매개되는 것으로 생각된다 (문헌 [Murase, A., et al., Life Sciences, 82:226-232 (2008)] 참조). 인간 전혈에서 LPS-유도 TNFα 생산에 미치는 PGE₂의 억제 효과를 역전시킬 실시예 1의 화합물의 능력은 기능적 활성의 지표이다.

혈액을 정상 지원자 기증자로부터 소듐 헤파린 바큐테이너 튜브 내로 수집하였다. 기증자는 기증 전 48시간 내에서는 NSAID 또는 셀레콕시브를 또는 기증 전 2주 내에서는 글루코코르티코이드를 복용하지 않았다. 모든 튜브/기증자를 50 mL 팔콘(Falcon) 원추형 원심분리 튜브 내로 모으고, 98 μL/웰을 96-웰 조직배양 플레이트 (팔콘 3072) 내로 분배하였다. 화합물을 DMSO 내로 최종 100 X가 되도록 희석하고, 1 μL/웰을 삼중으로 혈액에 첨가하여 7-포인트 농도 반응 곡선을 얻었다. 혈액을 화합물로 37℃에서 5% CO₂ 가습 분위기 중에서 30분 동안 사전처리하고, 그 후 1 mM PGE₂ (케이만 14010) 함유 및 비함유 둘 다의 0.2 mg/mL 소 혈청 알부민 (BSA)/PBS 중 리포폴리사카라이드 (LPS) (시그마 0111:B4)의 1 mg/mL의 용액 1 μL/웰을 첨가하여 10 nM PGE₂ 함유 및 비함유 둘 다의 10 μg/mL 최종 LPS 농도를 수득하였다. 플레이트를 5% CO₂가습 분위기 중 37℃에서 20 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1800 x g로 10분 동안 22℃에서 에펜도르프 5810R 원심분리기에서 원심분리하였다. 혈장을 세포층으로부터 제거하여 v자형 바닥 폴리프로필렌 플레이트로 이송하였다. 이뮤론(Immulon) 4 HBX 플레이트 (써모(Thermo) 3855) 및 3,3',5,5'-테트라메틸비페닐-4,4'-디아민 기질 (KPL 50-76-03)을 사용하여 상업적으로 입수가능한 효소 면역검정 (알앤디 시스템즈(R&D Systems) DY210)에 의해 2 μL 혈장 중 TNFα 수준을 정량화하였다. 소프트맥스프로(SOFTmaxPRO) (v. 4.3.1) 소프트웨어를 사용하여 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스 버사맥스(Molecular Devices Versamax)) 상 A₄₅₀-A₆₅₀에서 플레이트를 판독하였다. 그래프패드 프리즘 (v. 4) 비-선형 회귀를 사용하여 S자형 용량 반응 곡선 피팅으로 IC₅₀을 계산하였다. 결과는 기하 평균±표준 편차로 나타내었으며; n = 독립 결정의 수이다.

화합물을 본질적으로 상기 기재된 바와 같은 절차에 따라 시험하였다. 인간 EP4에서 측정하여 실시예 1의 화합물은 39±21 nM의 IC₅₀ (n=8)을 가지고, 실시예 2의 화합물은 61±55 nM의 IC₅₀ (n=5)을 가졌다. 이는 실시예 1 및 실시예 2의 화합물이 인간 혈액 TNFα 유도 검정에서 EP4 길항제임을 입증한다.

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.

상기 식에서, R은 H 또는 F이다.
제1항에 있어서,

인 화합물 또는 염.
제1항 또는 제2항에 있어서,

인 화합물 또는 염.
제3항에 있어서, 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-페녹시에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조산:

인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제4항에 있어서, 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-페녹시에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조산:

인 화합물.
제3항에 있어서, 4-[(1S)-1-[[(3R)-2-(2-(4-플루오로페녹시)에틸)-3,4-디히드로-1H-이소퀴놀린-3-카르보닐]아미노]에틸]벤조산:

인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
골관절염의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 골관절염을 치료하는 방법.
류마티스 관절염의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 류마티스 관절염을 치료하는 방법.
골관절염 또는 류마티스 관절염과 연관된 통증의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 골관절염 또는 류마티스 관절염과 연관된 통증을 치료하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 골관절염의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 류마티스 관절염의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 골관절염 또는 류마티스 관절염과 연관된 통증의 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.