KR20150130614A

KR20150130614A - Peptides Having Growth Factor Activity and Uses Thereof

Info

Publication number: KR20150130614A
Application number: KR1020140057188A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 정현아
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2015-11-24
Also published as: WO2015174600A1

Abstract

A peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, according to the present invention, shows growth factor activity. A peptide of the present invention has excellent stability and skin penetration. Therefore, a composition comprising the peptide of the present invention shows excellent efficacy for treating, preventing or alleviating a disease or a state which requires or should inhibit growth factor activity. The excellent activity and stability of the peptide of the present invention can be advantageously applied to medicines, quasi-drugs and cosmetics.

Description

Peptide Having Growth Factor Activity and Uses Thereof [

본 발명은 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드 및 이를 포함하는 과각화증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물, 그리고 골 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a peptide showing growth factor activity, a pharmaceutical composition for treating or preventing hyperkeratosis comprising the peptide, and a composition for promoting bone differentiation.

피부조직은 표피와 진피 그리고 피하(hypodermis)로 이루어져 있다. 피부의 성질을 결정짓는 부분은 표피로서 표피는 외부로부터 직접적이고 잦은 손상을 받으므로 표피의 수선과 재생은 매우 중요하다. 사람의 표피는 2 주일에 한번씩 교체되므로 표피를 조성하는 피부 줄기세포의 증식능력은 엄청나다고 할 수 있다. 또한, 피부의 만능줄기세포가 모낭의 지질샘 바로 밑 벌지(bulge) 부위에 위치한다는 보고도 많이 언급이 되고 있는데, 이 벌지 줄기세포는 표피 줄기세포, 모근줄기세포(hair matrix stem cells), 지질샘 줄기세포(sebaceous glands stem cells)를 만드는 근간이 되는 줄기세포이다. 대부분의 표피 줄기세포는 3-6번을 증식하고 나면 분화의 길을 밟는다. 반면에 벌지 줄기세포는 증식은 다른 세 줄기세포보다 느리지만 사람이 사는 동안 무한정 증식하면서 표피줄기세포, 모근줄기세포, 지질샘 줄기세포를 만드는 동시에 그 자신의 줄기세포 성격을 유지할 수 있는 것으로 보인다.Skin tissue consists of epidermis, dermis and hypodermis. Skin repair and regeneration are very important because the epidermis is directly and frequently damaged from outside by the skin which determines the nature of the skin. Since the human epidermis is replaced every two weeks, the ability of the skin stem cells to form the epidermis is tremendous. It has also been reported that the pluripotent stem cells of the skin are located in the bulge region beneath the lipid gland of the hair follicle. These bulge stem cells include epidermal stem cells, hair matrix stem cells, It is a stem cell that is the basis for making sebaceous glands stem cells. Most epidermal stem cells multiply 3-6 times, and then they step on the path of differentiation. On the other hand, bulb stem cells proliferate more slowly than other three stem cells, but they seem to be able to maintain their own stem cell characteristics while making epidermal stem cells, hair follicle stem cells, and lipid gland stem cells while proliferating indefinitely during human life.

표피는 체내와 체외 사이의 물리화학적 장벽의 제조자로서의 기능 외에, 활성 면역 장벽으로서의 기능도 한다. 케라티노사이트(keratinocyte)는 면역계 및 염증계 세포와 교통하며 상호작용하는 다수의 사이토킨 및 기타 염증 매개체에 반응하는 것은 물론 이들을 생산할 수 있는 능력을 가지는데, 이는 미생물 감염에 대한 숙주 방어 및 상처 치료에서 큰 중요성을 가진다. 또한, 케라티노사이트는 건선 및 좌창과 같은 많은 염증 피부병에서 활발한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.In addition to functioning as a manufacturer of physicochemical barriers between the body and the body, the epidermis also functions as an active immune barrier. Keratinocytes have the ability to produce and to respond to a number of cytokines and other inflammatory mediators that interact with and interact with the immune system and inflammatory cells, including host defense against microbial infections and wound healing It has great importance. In addition, keratinocytes are known to play an active role in many inflammatory skin diseases such as psoriasis and acne.

각질층은 피부의 가장 분화된 구조를 가지며, 표피 분화 과정의 최종 산물, 즉 피부의 최외 부분을 차지하는 중층 편평상피이다. 대부분의 표피 세포들은 다양한 분화 상태의 케라티노사이트(keratinocytes)로 구성되며, 표피의 연결 조직인 진피와 접촉해 있는 기저막 상에 존재하는 기저 세포는 분할능을 가지는 유일한 케라티노사이트이다. 기저 세포의 분획은 연속적으로 기저막을 출발하여 분화 과정을 거쳐 결국에는 세포가 각질층의 건축 저해물이 되도록 한다. 인접 세포들의 중간 필라멘트는 증가된 수의 교소체에 의해 기능 단위체에 결합된다. 각질층의 가장 극적인 변화는 최외각 생 세포층인 과립층으로부터 생육불능 각질층으로의 전이 과정(keratination) 중에 발생한다. 공유 결합된 단백질은 매우 저항성을 가지는 세포 외피를 형성하는 원형결막의 내면에 밀접하게 침전된다. 또한 케라티노사이트-특이적인 세포 소기관에서 생성되는 지질-풍부 물질은 세포의 공간으로 배출되고, 각질층 세포를 에워싸고 있는 지질 라멜라를 형성함으로써 친수성 물질에 대한 투과성 장벽을 구성한다. 최종적으로 꽉 채워져 있는 세포케라틴 필라멘트를 제외한 모든 세포내 구조들은 사라진다.The stratum corneum has the most differentiated structure of the skin and is the final product of the epidermal differentiation process, the middle layer squamous epithelium, which occupies the outermost part of the skin. Most epidermal cells are composed of keratinocytes in various differentiated states. Basal cells present on the basement membrane in contact with the dermal connective tissue are the only keratinocytes with splitting ability. The basal cell fraction starts from the basement membrane continuously and undergoes differentiation process, eventually allowing the cell to become a building degradation of the stratum corneum. Intermediate filaments of adjacent cells are bound to functional units by an increased number of crosslinkers. The most dramatic change in the stratum corneum occurs during keratination from the outermost biomass layer, the granule layer, to the non-growing stratum corneum. Covalently bound proteins precipitate intimately on the inner surface of the circular conjunctiva, which forms a highly resistant cell envelope. In addition, the lipid-rich material produced in keratinocyte-specific organelles is released into the cell space and forms a permeable barrier to the hydrophilic material by forming a lipid lamella surrounding the stratum corneum cell. All intracellular structures except the finally filled keratin filaments disappear.

피부에서의 많은 병리적 조건 하에서 케라틴화 과정에 장애가 발생한다. 건선은 전형적인 만성 염증을 나타낼 뿐 아니라 전형적인 낙설을 초래하는 미성숙 각질층의 과다생산을 보인다. 또한, 어린선(ichthyosis)은 피부의 각질층이 잘 안 떨어져나가서 두터워지는 병으로 유전성 피부질환의 일종으로, 낙설률이 감소된다. 어린선보다 경중이기는 하지만, “건조 피부(건피증)” 또한 단일 세포나 세포들의 소집단과 같은 정상적인 조건 하에서가 아니라, 대규모의 육안 관찰가능한 인설(scales)로서 각질층으로부터 코르네오사이트(corneocyte)가 박리되는 특징이 있다. 좌창의 경우에는 여드름 및 전색(plugging)의 생성을 초래하는 피지선관에 케라틴화 장애가 발생한다. 상술한 케라틴화 장애는 다양한 인자들이 관여한다. 예를 들어, 생육성 표피층과 각질화된 표피층 사이에서 전환이 일어나는 동안 발생하는 세포케라틴 필라멘트를 제외한 모든 세포내 구조들의 소멸에 단백질분해가 관여한다는 것을 고려해 볼 때, 단백질 가수분해 효소가 중요하다. 즉, 단백질분해는 결국에는 낙설을 초래하는 과정 중 각질층에서의 세포내 응집성 구조 분해에서 중요한 역할을 한다.Under many pathological conditions in the skin, the keratinization process is disturbed. Psoriasis not only exhibits typical chronic inflammation, but also shows overproduction of immature stratum corneum, which results in a typical decline. In addition, ichthyosis is a type of hereditary skin disease, which is a thickened layer of the stratum corneum of the skin. As opposed to the younger ones, "dry skin" (dry skin) is also a large, macroscopic scales, not under normal conditions such as a single cell or a small subset of cells, but a corneocyte from the stratum corneum Feature. In the case of acne, keratinizing disorders occur in sebaceous tubules, which lead to the production of acne and plugging. The above-mentioned keratinizing disorders are involved in various factors. For example, protein hydrolytic enzymes are important, considering that protein degradation is involved in the extinction of all intracellular structures except the cellular keratin filaments that occur during the transition between the biomimetic epidermal layer and the keratinized epidermal layer. In other words, proteolysis plays an important role in intracellular cohesive structure degradation in the stratum corneum during the process of eventually bringing down.

따라서, 상기 질환에서 표피층의 케라틴화의 조절이 매우 중요하며, 본 발명의 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드가 이에 효과적으로 적용될 수 있다.Therefore, it is very important to control the keratinization of the epidermal layer in the disease, and peptides exhibiting the growth factor activity of the present invention can be effectively applied thereto.

통상적으로, 성장인자류는 병리학적 상태에 대한 효능이 매우 뛰어난 반면에 자연형의 성장인자를 얻기 위하여 재 접힘이라는 추가 공정과 시간이 요구되고, 또한 정제과정에서 대장균 유래의 오염원을 제거하기 위한 복잡한 정제 과정을 필요로 하게 되며, 안정성 및 높은 분자량으로 인한 피부 조직으로의 낮은 침투 가능성 등이 비싼 가격과 맞물려 활용도를 떨어뜨리고 있는 실정이다. 상기 성장인자의 발현의 문제점을 해결하기 위하여 일부 성장인자들의 일부분만을 고체상합성의 방법을 이용하여 생산하여 유사기능을 얻고자 하는 시도들이 보고되었다(미국 등록특허 제5,473,054호, WO 03/048192, 미국 등록특허 제7,105,481호).
Generally, growth factors are highly effective against pathological conditions, while additional processes and time are required for refolding in order to obtain a natural type growth factor. In addition, complicated processes for eliminating sources of Escherichia coli And the stability and the low penetration into the skin tissues due to the high molecular weight are interfering with the expensive price and the utilization is being reduced. In order to solve the problem of the expression of the growth factor, attempts have been made to produce only a part of some growth factors using a solid phase synthesis method to obtain similar functions (U.S. Patent No. 5,473,054, WO 03/048192, US No. 7,105,481).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 천연 성장인자보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 각질세포 증식 억제 및 사멸 촉진, Bax 및 p-p53 단백질 발현 촉진, 골 분화 촉진, 등)이 우수한 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.As a result of efforts to develop a substance having superior activity, skin permeability and stability than natural growth factors, the present inventors have found that many peptide candidates have physiological activities such as inhibition of keratinocyte proliferation and death, promotion of Bax and p-p53 protein expression, Promotion of differentiation, etc.), the present invention has been completed.

따라서, 본 발명의 목적은 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a peptide exhibiting growth factor activity.

본 발명의 다른 목적은 과각화증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hyperkeratosis.

본 발명의 또 다른 목적은 골 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a composition for promoting bone differentiation.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a peptide exhibiting growth factor activity comprising the amino acid sequence of the first sequence of Sequence Listing.

본 발명자들은 천연 성장인자보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 상술한 특성을 나타내는 우수한 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 합성하였다.The present inventors have made efforts to develop a substance having higher activity, skin permeability and stability than natural growth factors, and as a result, peptides showing excellent growth factor activity exhibiting the above characteristics have been synthesized.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.The peptides of the present invention comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Specifically, the peptide of the present invention is essentially composed of the amino acid sequence of the first sequence of the sequence listing.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열의 펩타이드는 각질세포의 증식을 억제하고 사멸(apoptosis)을 촉진시키는 활성을 나타낸다.According to some embodiments of the present invention, the peptide of Sequence Listing 1 sequence exhibits an activity of inhibiting the proliferation of keratinocytes and promoting apoptosis.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열의 펩타이드는 각질세포 및 골 분화를 촉진시키는 활성을 가진다.According to some embodiments of the present invention, the peptide of Sequence Listing 1 sequence has keratinocyte and activity of promoting bone differentiation.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.As used herein, the term " peptide " refers to a linear molecule formed by peptide bonds and amino acid residues joined together. The peptides of the present invention can be synthesized by chemical synthesis methods known in the art, especially solid-phase synthesis techniques (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd ed., Pierce Chem. Co .: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis technology (US Patent No. 5,516,891).

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 높은 열 안정성을 갖는다(참고: 도 8).The peptides of the present invention have high thermal stability as such (see Fig. 8).

본 발명의 펩타이드는 매우 저렴하게 대량 합성이 가능하고 고온 등에서 물리화학적인 안정하기 때문에, 생리활성의 저하를 최대한으로 방지할 수 있으며 체내 외에서의 잔존 기간을 증가시킴으로 좀 더 향상된 치료 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 의약품, 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.The peptide of the present invention can be mass-synthesized at a very low cost and is physically and chemically stable at high temperatures, so that it is possible to prevent a decrease in physiological activity to a maximum extent and to have a more improved therapeutic effect by increasing the residence time in the body. Accordingly, the peptide of the present invention can be advantageously applied to products requiring long-term storage such as pharmaceuticals, quasi-drugs and cosmetics.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.According to some embodiments of the present invention, the N- or C-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group and a polyethylene glycol (PEG) A protecting group selected from the group consisting of R < 1 >

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 “안정성”은 “인 비보”안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.
The above-mentioned modification of the amino acid serves to greatly improve the stability of the peptide of the present invention. As used herein, the term " stability " means not only " in-bibo " stability, but also storage stability (eg, room temperature storage stability). The above-mentioned protecting group functions to protect the peptide of the present invention against attack of a protein cleaving enzyme in vivo.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 과각화증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hyperkeratosis comprising, as an active ingredient, a peptide consisting of the amino acid sequence of Sequence Listing 1 described above.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention contains the peptide of the first sequence of the present invention as an active ingredient, the description thereof is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 건선 및 아토피성 피부염 같은 과도한 각질세포층의 증식을 억제할 뿐 아니라 각질세포의 분화를 효과적으로 촉진하기 때문에 과각화증의 치료 또는 예방에 매우 유효하다.As demonstrated in the following examples, the peptides of the first sequence listing of the present invention not only inhibit the proliferation of excessive keratinocyte layers such as psoriasis and atopic dermatitis, but also effectively treat the differentiation of keratinocytes, It is very effective for prevention.

본 명세서에서 언급되고 있는 용어 “과각화증(hyperkerotosis)”은 거칠고 단단한 케라틴을 다량 포함하는 피부의 바깥층(outer layer)이 비대해지는 증상을 가지는 질환, 질병 또는 상태를 의미한다. 케라틴화는 정상적으로는, 국소적인 마찰, 압력 또는 자극으로부터 피부를 보호하거나 또는 만성 염증, 감염, 자외선, 등으로부터 피부를 보호하기 위한 과정이다. 하지만, 조절되지 않은 케라틴화는 심각한 질병으로 발전할 수 있다. 예를 들어, 과각화증은 건선, 어린선(ichthyosis), 좌창, 만성 습진, 아토피성 피부염, 피부건조증, 각질증식 및 모공성 각화증, 광선 각화증, 지루각화증, 상처 치유, 자가면역 천포창, 다리어병(darier’s disease), 티눈(corns), 사마귀(warts), 검버섯 및 편평태선을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, the term " hyperkerotosis " refers to a disease, disorder or condition in which the outer layer of the skin, which contains a large amount of rough and hard keratin, is enlarged. Keratinization is normally a process for protecting the skin from localized friction, pressure or irritation or for protecting the skin from chronic inflammation, infection, ultraviolet rays, and the like. However, unconditioned keratinization can develop into a serious disease. For example, hyperkeratosis may be caused by psoriasis, ichthyosis, acne, chronic eczema, atopic dermatitis, dry skin, hyperkeratosis and poreal keratosis, actinic keratosis, bruch keratosis, wound healing, autoimmune pemphigus, disease, corns, warts, dandruff, and flatulence.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.According to some embodiments of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention described above; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term " pharmaceutically effective amount " means an amount sufficient to achieve efficacy or activity of the peptides described above.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutically acceptable carriers to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention are those conventionally used in the present invention and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not. The pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally. In the case of parenteral administration, the pharmaceutical composition can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, local administration, .

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 어떤 투여량은 1일 당 0.0001-200 ㎍이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . On the other hand, a certain dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-200 占 퐂 / day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets, capsules or gels (e.g., hydrogels), and may additionally contain dispersing or stabilizing agents .

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 성장인자-관련 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.According to some embodiments of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a cosmetically effective amount of the growth factor-related peptide of the present invention described above; And (b) an cosmetically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물이 피부(표피) 케라틴화의 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term " a cosmetically effective amount " means an amount sufficient for the compositions of the present invention described above to achieve an improving effect of skin (epidermal) keratinization.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any form conventionally produced in the art and may be in the form of a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant- , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it can be manufactured in the form of a soft lotion, a nutritional lotion, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, a spray or a powder.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, an animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as the carrier component .

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. Especially, in the case of a spray, a mixture of chlorofluorohydrocarbons, propane / Propane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or an emulsion, a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a suspension, a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is an interfacial active agent-containing cleansing, the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives, or ethoxylated glycerol fatty acid esters.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
The ingredients contained in the cosmetic composition of the present invention include ingredients commonly used in cosmetic compositions, in addition to the peptide and carrier component as the active ingredient, and include conventional ingredients such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, May include adjuvants.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 분화 촉진용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for promoting bone differentiation comprising, as an active ingredient, a peptide consisting of the amino acid sequence of Sequence Listing 1 described above.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention comprises the peptide of the present invention described above as an active ingredient, its description is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 골모세포주의 분화를 촉진시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 골 분화를 효과적으로 촉진시킬 수 있다.As demonstrated in the examples below, the peptides of the first sequence listing of the present invention promote the differentiation of osteoblasts. Therefore, the composition of the present invention can effectively promote bone differentiation.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 조골세포 분화 마커들인 OPG, OPN, OCN, ALP 및 BSP 유전자 발현을 증가시킨다.According to some embodiments of the present invention, the composition of the present invention increases osteoblast differentiation markers OPG, OPN, OCN, ALP and BSP gene expression.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 골 질환을 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.According to some embodiments of the present invention, the composition of the present invention can be used to improve or treat bone diseases.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 개선 또는 치료될 수 있는 골 질환은 골다공증, 소년기 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증, 골 괴사증, 구루병, 골수염, 치조골 소실, 뼈의 파젯병(Paget’s disease), 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증, 전이성(metastatic) 골 질환, 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환, 암에 의한 골 소실, 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환 및 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
According to some embodiments of the invention, the bone disease that may be ameliorated or treated by the composition of the present invention is selected from the group consisting of osteoporosis, boyhood osteoporosis, osteogenesis imperfecta, osteomiasis, osteonecrosis, rickets, osteomyelitis, alveolar bone loss, Paget's disease, hypercalcemia, primary hyperparathyroidism, metastatic bone disease, bone marrow, bone loss in rheumatoid arthritis, metastatic bone disease, bone loss due to cancer, fibrous bone dysplasia, And loss of bone mass with age.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(i) 본 발명의 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 성장인자 활성을 나타낸다. (i) The peptide consisting of the amino acid sequence of the first sequence of the Sequence Listing of the present invention exhibits growth factor activity.

(ⅱ) 본 발명의 펩타이드는 안정성이 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다.(Ii) The peptide of the present invention is very stable and has excellent skin permeability.

(ⅲ) 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, 성장인자의 활성이 요구되거나 억제되어야 하는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.(Iii) Thus, compositions comprising the peptides of the invention exhibit very good efficacy in treating, preventing or ameliorating diseases or conditions in which the activity of growth factors is required or inhibited.

(ⅳ) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.
(Iv) The excellent activity and stability of the peptide of the present invention described above can be very advantageously applied to medicines, quasi-drugs and cosmetics.

도 1은 본 발명의 펩타이드에 의한 각질세포의 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 펩타이드에 의한 각질세포의 사멸 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 프로-아팝토틱 단백질(pro-apoptotic protein)인 Bax 및 p-p53 단백질에 대한 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드에 의한 각질세포의 분화 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 5는 ALP(alkaline phosphatase) 염색을 통해 본 발명의 펩타이드에 의한 골 분화 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 6은 알리자딘 레드 S 염색을 통해 본 발명의 펩타이드에 의한 골 분화 촉진 효과를 보여주는 그래프 결과이다.
도 7은 RT-PCR을 통해 본 발명의 펩타이드에 의한 골 분화 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 8은 본 발명에서 기술한 펩타이드의 열 안정성을 보여주는 결과이다.1 is a graph showing the inhibitory effect of the peptides of the present invention on proliferation of keratinocytes.
FIGS. 2A and 2B show the effect of promoting the killing of keratinocytes by the peptide of the present invention.
Figures 3a and 3b are Western blotting results for the pro-apoptotic proteins Bax and p-p53 proteins, respectively.
4 is a graph showing the effect of promoting the differentiation of keratinocytes by the peptide of the present invention.
FIG. 5 shows the effect of stimulating bone differentiation by the peptide of the present invention through ALP (alkaline phosphatase) staining.
FIG. 6 is a graph showing the effect of promoting bone differentiation by the peptide of the present invention through Alizadin Red S staining.
FIG. 7 shows the effect of promoting bone differentiation by the peptide of the present invention through RT-PCR.
Fig. 8 shows the results showing the thermal stability of the peptides described in the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

합성예 1: Arg-Arg-Leu-Ile-Asp-Arg-Thr-Asn-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-Met(서열목록 제1서열)의 합성Synthesis Example 1 Synthesis of Arg-Arg-Leu-Ile-Asp-Arg-Thr-Asn-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-Met (Sequence Listing 1)

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Met-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Met-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Val(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Val-Met-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(pbf) 및 Fmoc-Arg(pbf) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH₂-Arg-Arg-Leu-Ile-Asp-Arg-Thr-Asn-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-Met-COOH 펩타이드 1을 0.77g 합성하였다(수율: 88.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1720(이론값 : 1719.0)를 얻을 수 있었다.700 mg of chlorotrityl chloride resin (CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) was placed in a reaction vessel, and 10 ml of methylene chloride (MC) was added thereto, followed by stirring for 3 minutes. The solution was removed, and 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added thereto. After stirring for 3 minutes, the solvent was removed again. To the reactor, 10 ml of dichloromethane solution was added, and 200 mmole of Fmoc-Met-OH (Bachem, Swiss) and 400 mmole of diisopropylethylamine (DIEA) were added and stirred to react well with stirring for 1 hour. After the reaction, methanol and DIEA (2: 1) were dissolved in DCM (dichloromethane), reacted for 10 minutes, and washed with excess DCM / DMF (1: 1). The solution was removed, and 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added thereto. After stirring for 3 minutes, the solvent was removed again. 10 ml of the deprotection solution (20% Piperidine / DMF) was added to the reaction vessel, stirred for 10 minutes at room temperature, and then the solution was removed. The same amount of the deprotection solution was added and the reaction was maintained for 10 minutes. Then, the solution was removed, and the Met-CTL resin (Resin) was prepared by washing with DMF twice, MC once, and DMF once for 3 minutes each. To the new reactor, 10 ml of DMF solution was added, 200 mmole of Fmoc-Val (Bachem, Swiss), 200 mmole of HoBt and 200 mmole of Bop were added and stirred well to dissolve. The reactor was charged with 400 mmole DIEA in two portions and stirred for at least 5 minutes until all the solids dissolved. The dissolved amino acid mixture solution was placed in a reaction vessel containing the deprotected resin and allowed to react for 1 hour at room temperature with stirring. The reaction solution was removed, and the mixture was stirred with DMF solution three times for 5 minutes and then removed. A small amount of the reaction resin was taken and the degree of reaction was checked using a Kaiser test (Nihydrin Test). The reaction was carried out in the same manner as described above twice to obtain a Val-Met-CTL resin. After thoroughly washing with DMF and MC and once again performing a Kaiser test, the following amino acid adhesion experiment was performed as described above. Fmoc-Asn (trt), Fmoc-Asn (trt), Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Arg (pbf), Fmoc-Asn (tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg (pbf) and Fmoc-Arg (pbf). The Fmoc-protecting group was reacted twice with the deprotecting solution for 10 minutes, followed by washing well. Acetic anhydride, DIEA, and HoBt were added and acetylation was carried out for one hour. The peptidyl resin prepared was washed three times with DMF, MC and methanol. The nitrogen air was slowly flowed and dried, and then vacuumed under P ₂ O ₅ 30 ml of an aqueous solution (81.5% of trifluoroacetic acid, 5% of distilled water, 5% of thioanisole, 5% of phenol, 2.5% of EDT and 1% of TIS) And the reaction was allowed to continue for 2 hours at room temperature. The resin was filtered and the resin was washed with a small amount of TFA solution and then combined with the mother liquor. The precipitate was distilled using 50 ml of cold ether to induce precipitation, and the precipitate was collected by centrifugation and washed with 2 more cold ether. The mother liquor was removed and sufficiently dried under nitrogen to synthesize 0.77 g of pre-purified NH ₂ -Arg-Arg-Leu-Ile-Asp-Arg-Thr-Asn-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-Met-COOH peptide 1 (Yield: 88.9%). Molecular weight of 1720 (theoretical value: 1719.0) was obtained by measurement using a molecular weight analyzer.

펩타이드Peptides 아미노산 서열Amino acid sequence 분석값(질량분석기)Analytical value (mass spectrometer) 분석치Analytical value 이론치Theoretical value 서열 1SEQ ID NO: 1 RRLIDRTNANFLVMRRLIDRTNANFLVM 17201720 1719.01719.0

시험예 1: 합성 펩타이드에 의한 각질세포의 증식 억제 효과Test Example 1: Inhibitory effect of synthetic peptides on proliferation of keratinocytes

합성예 1에서 합성된 펩타이드에 대한 성장인자의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res. 48:4266(1988))을 참조하여 HaCaT 각질세포주(한국세포주은행)에서 SRB(Sulforhodamine B) 비색법을 이용하여 합성 펩타이드에 의한 세포 성장 억제 효과를 측정하였다.HaCaT keratinocyte strains (Korean strain) were prepared by the method of Rizzino et al. ( Cancer Res. 48: 4266 (1988)) to analyze the similar effect and inhibitory effect of growth factors on the peptides synthesized in Synthesis Example 1 The cell growth inhibition effect of synthetic peptides was measured using SRB (Sulforhodamine B) colorimetric method.

HaCaT 각질세포주를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco, 미국)에서 배양하였다. 배양된 세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 DMEM 배양액에 재현탁한 후, 48-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 5 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 표준을 잡기 위한 공 시료와 인 합성 펩타이드를 물에 멸균상태로 녹인 뒤 농도 별(0.1-50 μg/ml)로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 50 μl MTT 시약(Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue, 5 mg/ml; SIGMA, 미국)을 처리하고 4시간 동안 37℃에서 추가적으로 배양시켜 생성된 포르마잔(formazan)을 300 μl DMSO로 녹여 540 nm에서 분광광도계(spectrophotometer; Molecular devices, 미국)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(참고: 도 1).HaCaT keratinocyte cell lines were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS) using a 250 ml tissue culture flask. The cultured cell line was detached from the bottom of the culture container with 0.25% trypsin solution, and centrifuged to collect cell precipitate. The cells were resuspended in DMEM culture medium, and then plated in a 48-well tissue culture plate at 5 × 10 ³ cells per well. The cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours. After 24 hours, a blank sample and phosphorylated peptide were dissolved in sterilized water and incubated for 72 hours under the same conditions as above (0.1-50 μg / ml). After the culture was completed, 50 μl of MTT reagent (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue, 5 mg / ml; SIGMA, USA) was treated and incubated for additional 4 hours at 37 ° C. The formazan was dissolved in 300 μl DMSO Absorbance was measured using a spectrophotometer (Molecular devices, USA) (see Fig. 1).

도 1은 본 발명의 펩타이드 처리 후의 각질세포의 성장에 대한 효과를 보여주는 결과이다.
Fig. 1 shows the effect of the present invention on the growth of keratinocytes after the peptide treatment.

시험예 2: 합성 펩타이드에 의한 각질세포의 사멸 촉진 효과Test Example 2: Promotion of killing of keratinocytes by synthetic peptides

합성예 1에 따라 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 각질세포 사멸 촉진 효과를 확인하기 위해, 각질세포에 대한 펩타이드의 세포 사멸 효과를 조사하였다.In order to confirm the keratinocyte killing effect of the peptides of the first sequence of Sequence Listing prepared in Synthesis Example 1, the killing effect of the peptides on the keratinocytes was examined.

우선, HaCaT 각질세포주를 조직 배양용 플라스크(SPL, Korea)를 이용하여 0.03 mM CaCl₂ 및 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 DMEM(Dulbecco’s modied Eagle's medium, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 세포주를 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 DMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 60-mm 조직 배양용 디쉬(SPL, Korea)에 1.5 X 10⁵ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 1% FBS를 포함하는 배지로 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료, 양성대조군(2.8 mM CaCl₂를 포함하는 고농도 칼슘 DMEM 배지 처리군) 및 본 발명의 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 1-50 μg/ml의 농도로 5일 동안 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 아넥신 V-PI 염색 키트(Annexin V-PI staining kit; BD pharmigen)을 이용하여 세포를 염색시킨 후, 유세포 측정기인 FACS(BD pharmigen)를 이용하여 FL1 및 FL2 강도를 측정하였다(참고: 도 2a). 세포 사멸 중인 아넥신 V-양성 세포의 수를 카운팅하고 초기 아팝토틱 세포의 비율을 측정하였다(참고: 도 2b). 세포 사멸 효과를 추가 확인하기 위해 위의 실험과 동일한 조건으로 처리한 세포를 얻어 프로-아팝토틱 단백질(pro-apoptotic protein)인 Bax 및 p-p53 단백질의 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다(참고: 도 3a 및 도 3b).First, HaCaT keratinocyte cell line was cultured in DMEM (Dulbecco's modied Eagle's medium, Gibco, USA) containing 0.03 mM CaCl ₂ and 10% fetal bovine serum (Sigma) using a tissue culture flask (SPL, ). The cultured cell line was detached from the bottom of the culture dish with 1% trypsin solution, and centrifuged to collect cell precipitate. The cells were suspended in DMEM culture medium, and the cells were plated in a 60-mm tissue culture dish (SPL, Korea) at 1.5 × 10 ⁵ cells and cultured at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours. After 24 hours, the medium was exchanged with a medium containing 1% FBS, and a blank sample for the standardization, a positive control group (high-calcium DMEM medium containing 2.8 mM CaCl ₂ ) and the peptide of the present invention were sterilized in 10% distilled water And incubated at the concentration of 1-50 μg / ml for 5 days under the same conditions as above. After the cultivation was completed, the culture supernatant was removed, and the cultured cell lines were removed from the bottom of the culture dish with 1% trypsin solution, and centrifuged to collect cell precipitates. Cells were stained using Annexin V-PI staining kit (BD pharmigen), and FL1 and FL2 intensities were measured using a flow cytometer FACS (BD pharmigen) ). The number of annexin V-positive cells under apoptosis was counted and the percentage of early apoptotic cells was determined (see Figure 2b). To further confirm the apoptotic effect, cells treated under the same conditions as the above experiment were obtained and the amount of pro-apoptotic proteins Bax and p-p53 expressed was confirmed by Western blotting : Figs. 3A and 3B).

시험예 1 및 시험예 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 각질세포의 성장을 억제하고 크게 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.
As can be seen in Test Example 1 and Test Example 2, it can be seen that the peptide of the first sequence of the present invention suppresses and greatly promotes the growth of keratinocytes.

시험예 3: 합성 펩타이드에 의한 각질세포 분화 촉진 효과Test Example 3: Promotion of keratinocyte differentiation by synthetic peptide

합성예 1에 따라 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 각질세포 분화 촉진 효과를 확인하기 위해, 각질세포에 대한 펩타이드의 세포 분화 촉진 효과를 조사하였다.In order to confirm the effect of promoting keratinocyte differentiation of the peptide of Sequence Listing 1 sequence prepared according to Synthesis Example 1, the effect of promoting the differentiation of peptides on keratinocytes was examined.

시험예 2(아넥신 V-PI 염색)와 동일한 조건으로 HaCaT 각질세포주를 배양 및 씨딩(seeding)하고 본 발명의 펩타이드를 처리하였다. 이후, 세포에 용해 완충액(0.4% SDS, 100mM NaCl, 1% Tritonx-100, 50mM Tris(pH 7.4), 1mM EDTA - Sigma)을 처리하고얼음에서 1시간 동안 반응시키고 원심분리(15,000 rpm, 20분)한다. 상등액의 단백질만을 수득하여 Bio-Red 단백질 정량 키트(bio-red protein assay kit I: 500-0001)를 이용하여 단백질 값을 정량하고 SDS-PAGE에 30 ㎍의 총 단백질을 로딩한 후 PVDF 막(Amersham)으로 옮겼다. 타겟 단백질인, 인볼루크린에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하여 서열목록 제1서열 펩타이드의 효과를 관찰하였다.HaCaT keratinocyte was cultured and seeded under the same conditions as Test Example 2 (Annexin V-PI staining) to treat the peptide of the present invention. The cells were then treated with lysis buffer (0.4% SDS, 100 mM NaCl, 1% Tritonx-100, 50 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA-Sigma), reacted for 1 hour on ice and centrifuged )do. Protein values were quantified using a Bio-Red protein assay kit (I) (500-0001), and 30 μg of total protein was loaded on SDS-PAGE. Then, a PVDF membrane (Amersham ). Western blotting was performed using an antibody against inulinucrine, a target protein (Santa Cruz Biotechnology, USA), to observe the effect of Sequence Listing first sequence peptide.

인볼루크린(involucrin)에 대한 웨스턴 블랏팅 결과, 4일 동안의 펩타이드 처리 결과, 10 μg/ml의 펩타이드 처리군에서 양성대조군(high Ca²⁺ 처리된 배지)보다 더 높은 인볼루크린 발현양을 확인할 수 있었다(참고: 도 4).
Western blotting for involucrin resulted in a 4-day peptide treatment resulted in a higher amount of bolucrin expression than the positive control (high Ca ²⁺ treated medium) in the 10 μg / ml peptide treated group (See FIG. 4).

시험예 4 : 제조된 펩타이드의 열 안정성Test Example 4: Thermal stability of the prepared peptide

합성예 1에서 합성된 서열목록 제1서열의 펩타이드와 NIBSC(UK)에서 구입한 표준품 PDGF-C를 0.1 mg/ml의 농도의 인산완충용액으로 제조하였다. 준비된 용액을 1 ml씩 유리 바이알에 넣은 후 37℃에서 정치하였다. 37℃에 정치된 용액을 0, 5, 10, 20, 30, 50 그리고 70일째에 샘플링하여 날자별로 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용해 정량을 하였다(참고: 도 8).
The peptide of the first sequence sequence synthesized in Synthesis Example 1 and the standard product PDGF-C purchased from NIBSC (UK) were prepared with a phosphate buffer solution at a concentration of 0.1 mg / ml. The prepared solution was put into a glass vial at 1 ml each and allowed to stand at 37 캜. The solution at 37 ° C was sampled at 0, 5, 10, 20, 30, 50, and 70 days, and the denatured peptide or protein was removed by centrifugal separation every day. The supernatant was taken and quantified by HPLC (Note: 8).

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조Example 1: Preparation of Nano Peptides

상기 합성예 1에서 얻은 펩타이드 50 mg을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다.
50 mg of the peptide obtained in Synthesis Example 1 was precisely weighed and sufficiently dissolved with 500 ml of distilled water. The mixture solution was mixed with 5 g of lecithin, 0.3 ml of sodium oleate, 50 ml of ethanol and a little oil, and the mixture was adjusted to a total volume of 1 L with distilled water. Then, the microfluidizer The nanosomes of about 100 nm in size were prepared by emulsification using high pressure. The final concentration of the prepared nanosomes was about 50 ppm, either singly or in combination, for cosmetic use.

제형예 1: 유연화장수Formulation Example 1: Softening Age

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.The softening water containing the peptide nanosome prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to the general method of producing lotion.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0010.001 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 6.06.0 글리세린glycerin 4.04.0 PEG 1500PEG 1500 1.01.0 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 1.01.0 폴리솔베이트 20Polysorbate 20 0.50.5 에탄올ethanol 8.08.0 방부제, 색소Preservative, pigment 적량Suitable amount 벤조페논-9Benzophenone-9 0.050.05 향incense 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예 2: 영양크림Formulation Example 2: Nourishing cream

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.The nutritional cream comprising the peptide nanosome prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to the general nutrition cream preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0010.001 메도우폼오일Meadow Foam Oil 3.03.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 1.51.5 스테아린산Stearic acid 1.51.5 글리세릴스테아레이트Glyceryl stearate 1.51.5 유동 파라핀Liquid paraffin 10.010.0 밀납Wax 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate 60 0.60.6 솔비탄 세스퀴올레이트Sorbitan sesquioleate 2.52.5 스쿠알란Squalane 3.03.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 3.03.0 글리세린glycerin 5.05.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.50.5 토코페릴아세테이트 Tocopheryl acetate 0.5 0.5 방부제, 색소Preservative, pigment 적량Suitable amount 향incense 적량Suitable amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예 3: 영양화장수Formulation Example 3: Nutritional lotion

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.A nutritional lotion comprising the peptide nanosome prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to the general method of producing lotion.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0020.002 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 4.04.0 글리세린glycerin 4.04.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 0.80.8 글리세릴스테아레이트Glyceryl stearate 1.01.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.130.13 토코페릴아세테이트Tocopheryl acetate 0.30.3 유동파라핀Liquid paraffin 5.05.0 스쿠알란Squalane 3.03.0 마카다미아너트오일Macadamia nut oil 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate 60 1.51.5 솔비탄세스퀴올레이트Sorbitan sesquioleate 0.50.5 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 1.01.0 방부제,색소Preservative, pigment 적량Suitable amount 향incense 적량Suitable amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예 4: 에센스Formulation Example 4: Essence

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.An essence comprising the peptide nanosome prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to a general essence production method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0050.005 글리세린glycerin 10.010.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 5.05.0 PEG 1500PEG 1500 2.02.0 알란토인Allantoin 0.10.1 DL-판테놀DL-Panthenol 0.30.3 EDTA-2NaEDTA-2Na 0.020.02 히드록시에틸 셀룰로오스Hydroxyethylcellulose 0.10.1 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 8.08.0 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 0.20.2 트리에탄올아민Triethanolamine 0.180.18 옥틸도데세스-16Octyldodec-16 0.40.4 에탄올ethanol 6.06.0 향, 방부제, 색소Fragrance, preservative, pigment 적량Suitable amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

시험예 4: 합성 펩타이드에 의한 골 분화 촉진 효과Test Example 4: Promotion of bone differentiation by synthetic peptide

본 발명의 펩타이드가 골 분화 촉진 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 세포 염색(ALP staining 및 alizarin red staining) 및 조골세포 분화 마커들의 발현 조사를 실시하였다.
In order to confirm whether or not the peptides of the present invention exhibit the bone differentiation promoting effect, the present inventors performed cell staining (ALP staining and alizarin red staining) and expression of osteoblast differentiation markers.

4-1. ALP 염색4-1. ALP staining

MC3T3-E1 세포(ATCC, 미국)를 24-웰 플레이트에 4 X 10⁴ 세포로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이후 아스코르빈산(50 μg/ml, SIGMA) 및 β-글라이세로포스페이트(10 mM, SIGMA)를 포함하는 α-MEM(alpha modification of Eagles MEM, Gibco) 배지로 교체한 후, 펩타이드를 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 농도로 10일 동안 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP(bone morphogenetic protein)-2(Cell Signaling)는 30 ng/ml로 10일 동안 처리하였다. 상기 과정 중에 3일 마다 새로운 배지로 교체하였고, 동일 농도의 펩타이드 및 BMP-2를 처리하였다. 배양 완료 후 상기 세포들을 PBS로 2회 세척하고 고정 완충액(acetone, 37% formaldehyde, citrate solution)에서 30초 동안 고정시켰다. Leukocyte alkaline phosphatase staining kit (SIGMA)에 포함된 FBB-알칼린 용액과 소듐 나이트리트 용액(sodium nitrite solution)을 1:1로 섞어 2분 동안 처리한 후, 증류수와 나프톨(Naphthol) AS-BI 알칼린 용액으로 이루어진 완충액을 처리하여 37℃ 반응기에서 1시간 동안 발색시켰다. 그 결과, 양성대조군(BMP-2)과 유사하게도 상기 골세포의 분화가 서열목록 제1서열의 펩타이드(50 μg/ml)에 의해 증가되었다(참고: 도 5).
MC3T3-E1 cells (ATCC, USA) were plated in 24-well plates at 4 × 10 ⁴ cells and cultured at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 24 hours. Subsequently, the medium was replaced with α-MEM (alpha modification of Eagles MEM, Gibco) medium containing ascorbic acid (50 μg / ml, SIGMA) and β-glycerophosphate (10 mM, SIGMA) / ml or 50 μg / ml for 10 days or bone morphogenetic protein (BMP) -2 (Cell Signaling) used as a positive control were treated for 30 days at 30 ng / ml for 10 days. During this procedure, the medium was replaced with fresh medium every 3 days, and the same concentration of peptide and BMP-2 was treated. After completion of the incubation, the cells were washed twice with PBS and fixed in a fixed buffer (acetone, 37% formaldehyde, citrate solution) for 30 seconds. The FBB-alkaline solution and the sodium nitrite solution contained in the Leukocyte alkaline phosphatase staining kit (SIGMA) were mixed at a ratio of 1: 1 for 2 minutes. Then, distilled water and Naphthol AS-BI alkaline Buffer solution was treated and developed in a 37 ° C reactor for 1 hour. As a result, similar to the positive control (BMP-2), the osteoclast differentiation was increased by the peptide of the first sequence of the sequence listing (50 μg / ml) (see FIG. 5).

4-2. 알리자린 레드(Alizarin Red) S 염색4-2. Alizarin Red S dyeing

MC3T3-E1 세포를 24-웰 플레이트에 4 X 10⁴ 세포로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이후 아스코르빈산(50 μg/ml) 및 β-글라이세로포스페이트(10 mM)를 포함하는 α-MEM 배지로 교체한 후, 펩타이드를 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 농도로 15일 동안 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP-2는 30 ng/ml로 15일 동안 처리하였다. 상기 과정 중에 3일 마다 새로운 배지로 교체하였고, 동일 농도의 펩타이드 및 BMP-2를 처리하였다. 배양 완료 후 상기 세포들을 PBS로 2회 세척하고 70% 에탄올(SIGMA)에서 1시간 동안 고정시켰다. 40 mM 알리자린 레드 S(pH 4.2, SIGMA)로 10분 동안 염색한 후, 10 mM 소듐 포스페이트(pH 7.0)에 녹여진 10% 세틸피리디니움 클로라이드(cetylpyridinium chloride, SIGMA)를 15분 동안 처리하고 560 nm에서 분광광도계(spectrophotometer; Molecular devices, 미국)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(참고: 도 6).MC3T3-E1 cells were plated in 24-well plates at 4 x 10 ⁴ cells and cultured for 24 hours at 37 ° C and 5% CO ₂ . After replacing the α-MEM medium with ascorbic acid (50 μg / ml) and β-glycerophosphate (10 mM), the peptide was treated at 10 μg / ml or 50 μg / ml for 15 days Or BMP-2 used as a positive control was treated with 30 ng / ml for 15 days. During this procedure, the medium was replaced with fresh medium every 3 days, and the same concentration of peptide and BMP-2 was treated. After completion of the incubation, the cells were washed twice with PBS and fixed in 70% ethanol (SIGMA) for 1 hour. After staining with 40 mM alizarin red S (pH 4.2, SIGMA) for 10 minutes, 10% cetylpyridinium chloride (SIGMA) dissolved in 10 mM sodium phosphate (pH 7.0) nm was measured using a spectrophotometer (Molecular devices, USA) (see Fig. 6).

그 결과, 서열목록 제1서열의 펩타이드(50 μg/ml)에 의해 광물화가 증가되는 것을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that the mineralization was increased by the peptide of the first sequence of the sequence listing (50 μg / ml).

4-3. RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)4-3. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

MC3T3-E1 세포를 6-웰 플레이트에 1 X 10⁵ 세포로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이후, 펩타이드를 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 농도로 3일 동안 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP-2는 100 ng/ml로 30분 동안 분화를 유도시킨 후 OPG(osteoprotegerin), OPN(osteopontin), OCN(osteocalcin), ALP(alkaline phosphatase) 및 BSP(bone sialoprotein) 같은 조골세포 분화 마커들의 mRNA 발현 확인 실험을 진행하였다. 도 7은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 조골세포의 분화마커인 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: OPG 정방향 프라이머 서열, 5’-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3’ 및 OPG 역방향 프라이머, 5’-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3’(어닐링 온도, 60℃); OPN 정방향 프라이머 서열, 5’-GATGAATCTGACGAATCTCAC-3’ 및 OPN 역방향 프라이머, 5’ -CTGCTTAATCCTTCACTAACAC-3’(어닐링 온도, 60℃); OCN 정방향 프라이머 서열, 5’-GCGCTCTGTCTCTCTGACCT-3’및 OCN 역방향 프라이머, 5’-TTTGTAGGCGGTCTTCAAGG-3’(어닐링 온도, 60℃); ALP 정방향 프라이머 서열, 5’-CCAGCAGGTTTCTCTCTTGG-3’ 및 ALP 역방향 프라이머, 5’ -CTGGGAGRCRCATCCTGAGC-3’(어닐링 온도, 60℃); BSP 정방향 프라이머 서열, 5’-AAAGTGAAGGAAAGCGACGA-3’ 및 BSP 역방향 프라이머, 5’ -GTTCCTTCTGCACCTGCTTC-3’; 및 GAPDH 정방향 프라이머 서열, 5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3’ 및 GAPDH 역방향 프라이머, 5’ -GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’(어닐링 온도, 60℃). 양성대조군(BMP-2)과 유사하게도, 상기 유전자들의 mRNA 레벨이 서열목록 제1서열의 펩타이드에 의해 증가되는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 조골세포 분화 마커인 OPG, OPN, OCN, ALP 및 BSP의 유전자 발현을 증가시킴으로써 골 분화를 촉진시킬 수 있다.
MC3T3-E1 cells were plated on 6-well plates at 1 × 10 ⁵ cells and cultured for 24 hours at 37 ° C and 5% CO ₂ . BMP-2, which was used as a positive control for 3 days at a concentration of 10 μg / ml or 50 μg / ml, induced OPG (osteoprotegerin), OPN osteopontin), OCN (osteocalcin), ALP (alkaline phosphatase) and BSP (bone sialoprotein). FIG. 7 shows that the target-specific primer sequences used in PCR, which is a marker for osteoblast differentiation when treated with the peptide of the present invention, are as follows: OPG forward primer sequence, 5'-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3 'and OPG reverse primer, 5 '-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3' (annealing temperature, 60 ° C); OPN forward primer sequence, 5'-GATGAATCTGACGAATCTCAC-3 'and OPN reverse primer, 5' -CTGCTTAATCCTTCACTAACAC-3 '(annealing temperature, 60 ° C); OCN forward primer sequence, 5'-GCGCTCTGTCTCTCTGACCT-3 'and OCN reverse primer, 5'-TTTGTAGGCGGTCTTCAAGG-3' (annealing temperature, 60 ° C); ALP forward primer sequence, 5'-CCAGCAGGTTTCTCTCTTGG-3 'and ALP reverse primer, 5' -CTGGGAGRCRCATCCTGAGC-3 '(annealing temperature, 60 ° C); BSP forward primer sequence, 5'-AAAGTGAAGGAAAGCGACGA-3 'and BSP reverse primer, 5'-GTTCCTTCTGCACCTGCTTC-3'; And GAPDH forward primer sequence, 5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3 'and GAPDH reverse primer, 5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3' (annealing temperature, 60 ° C). Similar to the positive control (BMP-2), the mRNA levels of these genes are shown to be increased by the peptides of the first sequence listing. Therefore, the peptide of the present invention can promote bone differentiation by increasing gene expression of OPG, OPN, OCN, ALP and BSP, which are osteoblast differentiation markers.

상술한 결과를 종합해 보면, 본 발명의 펩타이드는 골 분화를 현저하게 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있다.
Taken together with the above results, it can be confirmed that the peptide of the present invention significantly promotes bone differentiation.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is obvious that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> CAREGEN Co,.LTD. <120> Peptides Having Growth Factor Activity and Uses Thereof <130> PN130666 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Met 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Forward Primer <400> 2 ctgcctggga agaagatcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Reverse Primer <400> 3 ttgtgaagct gtgcaggaac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Forward Primer <400> 4 gatgaatctg acgaatctca c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Reverse Primer <400> 5 ctgcttaatc cttcactaac ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Forward Primer <400> 6 gcgctctgtc tctctgacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Reverse Primer <400> 7 tttgtaggcg gtcttcaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Forward Primer <400> 8 ccagcaggtt tctctcttgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Reverse Primer <400> 9 ctgggagrcr catcctgagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Forward Primer <400> 10 aaagtgaagg aaagcgacga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Reverse Primer <400> 11 gttccttctg cacctgcttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 12 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 13 gtgatggcat ggactgtggt 20 <110> CAREGEN Co., .LTD. <120> Peptide Having Growth Factor Activity and Uses Thereof <130> PN130666 <160> 13 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Met 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Forward Primer <400> 2 ctgcctggga agaagatcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Reverse Primer <400> 3 ttgtgaagct gtgcaggaac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Forward Primer <400> 4 gatgaatctg acgaatctca c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Reverse Primer <400> 5 ctgcttaatc cttcactaac ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Forward Primer <400> 6 gcgctctgtc tctctgacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Reverse Primer <400> 7 tttgtaggcg gtcttcaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Forward Primer <400> 8 ccagcaggtt tctctcttgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Reverse Primer <400> 9 ctgggagrcr catcctgagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Forward Primer <400> 10 aaagtgaagg aaagcgacga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Reverse Primer <400> 11 gttccttctg cacctgcttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 12 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 13 gtgatggcat ggactgtggt 20

Claims

A peptide exhibiting growth factor activity consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

The peptide according to claim 1, wherein the peptide inhibits proliferation of keratinocytes.

The peptide according to claim 1, wherein the peptide has an activity of promoting the differentiation of keratinocytes.

The peptide according to claim 1, wherein the peptide has an activity of promoting bone differentiation.

The peptide according to claim 1, wherein the peptide has an activity of increasing gene expression of osteoblast differentiation markers OPG, OPN, OCN, ALP and BSP.

A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hyperkeratosis comprising the peptide of any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.

7. The method of claim 6, wherein the hyperkeratosis is selected from the group consisting of psoriasis, ichthyosis, acne, chronic eczema, atopic dermatitis, dry skin, hyperkeratosis and poreal keratosis, actinic keratosis, bruch keratosis, wound healing, A pharmaceutical composition for the treatment or prophylaxis of hyperkeratosis, characterized in that it comprises darier's disease, corns, warts, blotch, or squamous cell.

A composition for promoting bone differentiation comprising the peptide of any one of claims 1 to 5 as an active ingredient.

9. The composition of claim 8, wherein the composition is used to ameliorate or treat bone disease.

10. The method of claim 9, wherein the bone disease is selected from the group consisting of osteoporosis, boyhood osteoporosis, osteogenesis imperfecta, osteomalacia, osteonecrosis, rickets, osteomyelitis, alveolar bone loss, Paget's disease, hypercalcemia, primary hyperparathyroidism, metastatic metastatic bone disease, myeloma, bone loss in rheumatoid arthritis, metastatic bone disease, bone loss due to cancer, fibrous bone dysplasia, intractable bone disease, metabolic bone disease or loss of bone mass according to age / RTI >