KR101813629B1 - Peptides Having Activities of Skin Condition Improvement and Uses Thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피부 상태 개선 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 MMP2 활성을 억제하여 피부상태를 개선하는데 매우 우수한 효능을 발휘하며, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 콜라겐 분해를 억제하고 멜라노좀 이동을 억제하는 등의 우수한 생리활성을 나타내어 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제, 상처 재생, 여드름 개선, 피부 재생 또는 피부 미백에 이용 가능하다. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 MMP-활성 관련 질환 및 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 이용될 수 있다. The present invention provides a peptide having skin condition improving activity. The peptide of the present invention exhibits a very good effect in improving the skin condition by inhibiting MMP2 activity. The composition containing the peptide of the present invention exhibits excellent physiological activity such as inhibition of collagen degradation and inhibition of melanosomal migration, Skin regeneration, skin elasticity improvement, skin aging inhibition, wound regeneration, acne improvement, skin regeneration or skin whitening. The composition comprising the peptide of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating MMP-activity-related diseases and inflammatory diseases.

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Figure 112017025822775-pat00007

Description

피부상태 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides Having Activities of Skin Condition Improvement and Uses Thereof}Peptides Having Activities of Skin Condition Improvement and Uses Thereof

본 발명은 피부상태 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a peptide having a skin condition improving activity and a use thereof.

MMP(Matrix metalloproteinase)는 콜라겐, 프로테오글리칸 및 젤라틴과 같은 거대 생분자들을 분해시킬 수 있는 엔도펩티다아제류 효소로, 크게 콜라게나제, 젤라티나제, 스트로멜리신 및 막형 MMP로 분류 된다. MMP는 모두 전구 효소의 형태로 발현된 후 일부분이 잘려나감으로써 활성화된다(Bond, J. S., et al., Int. J. Biochem., 75, 565-574(1985); Chen, J.M., Chen, W.T., Cell, 48, 193-203(1987); Harris, E.D. et al., Coll Rel Res, 4, 493-512(1984)). Matrix metalloproteinase (MMP) is an endopeptidase enzyme capable of degrading large biomolecules such as collagen, proteoglycan and gelatin, and is largely classified into collagenase, gelatinase, stromelysin, and membrane-type MMP. All MMPs are expressed in the form of a proenzyme and then activated by cutting off a portion (Bond, JS, et al., Int. J. Biochem ., 75, 565-574 (1985); Chen, JM, Chen, WT. , Cell , 48, 193-203 (1987); Harris, ED et al., Coll Rel Res , 4, 493-512 (1984)).

콜라게나제는 삼중나선형 간질성 콜라겐과 젤라틴 등에 작용하며, 섬유아세포 콜라게나제, 호중구 콜라게나제 및 콜라게나제-3의 3종류가 알려져 있고, 제I, Ⅱ 및 Ⅲ 형의 콜라겐 소섬유(Collagen fibrils)들을 절단하는 것으로 보고 되어있다(Goldberg, G.I., et al, J. Biol . Chem ., 261, 6600-6605(1986); Fini, M.E.,et al., Biochemistry, 26, 6155-6165(1987)). 또한, 이들 세 가지 콜라게나제들은 서로 약 50% 이상의 서열 동일성을 가지는 것으로 알려져 있다(Borkakoti, et al., Nature Struct. Biol., 1, 106-110(1994); EMBO, J., 13, 1263-1269(1994)). Collagenase acts on triple helix interstitial collagen and gelatin, and three types of fibroblast collagenase, neutrophil collagenase, and collagenase-3 are known, and collagen fibrils of type I, Ⅱ and Ⅲ ( Collagen fibrils) have been reported to be cleaved (Goldberg, GI, et al, J. Biol . Chem . , 261, 6600-6605 (1986); Fini, ME, et al., Biochemistry , 26, 6155-6165 ( 1987)). In addition, these three collagenases are known to have about 50% or more sequence identity to each other (Borkakoti, et al., Nature Struct. Biol. , 1, 106-110 (1994); EMBO, J. , 13, 1263-1269 (1994)).

MMP는 전펩타이드 부위, 촉매성 부위 및 C-말단 부이의 세부위로 구분된다. MMP는 모두 활성이 없는 잠복형으로 생성 분비된 후, N-말단의 전펩타이드 부위의 80개의 아미노산이 잘려있고, 이 PRCGVPD 서열을 갖는 부위의 시스테인이 제거되면서 활성화 된다(Van Wart, H.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5578-5582(1990)). 활성화된 MMP는 천연 억제제인 MMP 조직저해제(Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase)와 결합하여 활성이 억제되는 것으로 알려져 있는데, 이 결합은 촉매성 부위에 의해서 조절된다(Murphy, et al., J. Niol. Chem., 267, 9612-9618(1992)). 여러 가지 형태의 MMP는 기질특이성을 갖고 있으며, 정상적인 세포에도 세포외 매트릭스(extracellular matrix)나 다른 콜라겐 구조를 분해해야 할 필요성이 있을 때 대사과정에서 발현된다. MMP에 의해 매개되는 질환으로는 동맥경화증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머, 피부 노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 각막궤양, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시, 안과 종양, 각막이식 거부, 혈관신생, 암의 침윤과 전이 등이 있다. 류머티즘성 관절염과 골관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행되면서 관절 연골의 세포 외 매트릭스가 파괴된다. 이러한 관절염 및 관절 외상에서 스트로멜리신이 주요한 효소로 인식되었으며, 프로콜라게나제를 활성 콜라게나제로 전환시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, MMP 활성을 억제함으로써 관절염 진행을 막을 수 있으며, 상기한 MMP는 침투성 백혈구 또는 섬유아세포 또는 외재적으로 미생물로부터 유래 되는 것으로 보고되어 있다. The MMP is divided into a prepeptide site, a catalytic site and a subdivision of the C-terminal buoy. MMPs are all produced and secreted in an inactive, latent form, and then 80 amino acids of the entire peptide site at the N-terminus are cut off, and the cysteine at the site having the PRCGVPD sequence is removed and activated (Van Wart, HE et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5578-5582 (1990)). Activated MMP is known to bind to the natural inhibitor MMP tissue inhibitor (Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase) to inhibit its activity, and this binding is regulated by a catalytic site (Murphy, et al., J. Niol. Chem. . , 267, 9612-9618 (1992)). Various types of MMP have matrix specificity, and are expressed in metabolic processes when there is a need to degrade the extracellular matrix or other collagen structures even in normal cells. Diseases mediated by MMP include arteriosclerosis, central nervous system inflammatory disease, Alzheimer's, skin aging, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, corneal ulcer, bone disease, proteinuria, abdominal aortic aneurysm, degenerative cartilage loss due to traumatic joint injury, Demyelinating disease of the nervous system, liver cirrhosis, glomerular disease, immature rupture of the embryonic membrane, inflammatory bowel disease, periodontal disease, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, proliferative vitreous retinopathy, immature retinopathy, cone cornea, Sjogren's syndrome , Myopia, ophthalmic tumor, corneal transplant rejection, angiogenesis, cancer invasion and metastasis. Rheumatoid arthritis and osteoarthritis are caused by autoimmune abnormalities, but as the disease progresses, the extracellular matrix of articular cartilage is destroyed. In such arthritis and joint trauma, stromelysin has been recognized as a major enzyme, and has been found to play an important role in converting procollagenase into active collagenase. Therefore, it is possible to prevent the progression of arthritis by inhibiting MMP activity, and the above-described MMP is reported to be derived from infiltrating leukocytes or fibroblasts or externally from microorganisms.

또한 염증매개체의 자극에 의하여 분비된 콜라게나제 및 세균으로부터 분비된 콜라게나제는 치주조직의 기질인 콜라겐을 분해하여 잇몸 퇴축을 발생시키고, 점차 진행되어 치주 질환을 야기한다. 염증을 일으킨 잇몸에서 분리된 섬유아세포 콜라게나제 및 스트로멜리신의 활성이 확인되었고, 효소의 수준은 관찰된 치은염의 정도와 상호 연관됨이 확인되었다(Overall, C.M. et al., J. Periodontal Res. 22, 81-88(1987)). In addition, collagenase secreted by stimulation of inflammatory mediators and collagenase secreted from bacteria decompose collagen, a matrix of periodontal tissues, to cause gum regression, and gradually progress to cause periodontal disease. The activities of fibroblast collagenase and stromelysin isolated from inflamed gums were confirmed, and the levels of enzymes were confirmed to be correlated with the observed degree of gingivitis (Overall, CM et al., J. Periodontal Res . 22, 81-88 (1987)).

MMP는 여러 가지 중추신경계(CNS)의 발병과 관련이 있다. MMP는 염증성의 단핵구 세포를 중추신경으로 유입시켜 마이엘린을 파괴시키거나 혈액뇌 관문 (Blood-Brain Barrier)을 파괴시키며 알츠하아이머 질환에서는 아밀로이드 베타단백질의 축적에 관여하는 것으로 추정되고 있다(Yong, VW, et al., Trends Neurosci 21(2),75-80(1998)). 또한, MMP는 알츠하이머 질환의 뇌에서 정상의 뇌보다 그 농도가 높은 것으로 보고되고 있으며(Leake A, Morris CM, & Whateley J. Neurosci Lett 291(3),201-3(2000), 뇌척수액에서의 젤라티나제 B수준은 다발성 경화증 및 기타 신경성 질환과 관련되어 있으며(Miyazaki, K, et al., Nature 362,839~841(1993)), 아밀로이드 베타단백질을 분해하여 축적시키는 데도 기여하는 것으로 보고되고 있다(Backstrom JR, et al., J neurosci 16(24),7910-9(1996)).MMP is associated with the development of several central nervous systems (CNS). MMP destroys myelin by introducing inflammatory monocytes into the central nervous system or destroys the blood-brain barrier, and it is estimated that it is involved in the accumulation of amyloid beta protein in Alzheimer's disease (Yong, VW, et al., Trends Neurosci 21(2),75-80(1998)). In addition, MMP has been reported to have a higher concentration in the brain of Alzheimer's disease than in the normal brain (Leake A, Morris CM, & Whateley J. Neurosci Lett 291(3), 201-3(2000), gela in cerebrospinal fluid. Tinase B level is associated with multiple sclerosis and other neurological diseases (Miyazaki, K, et al., Nature 362,839~841 (1993)), and is reported to contribute to the decomposition and accumulation of amyloid beta protein (Backstrom JR, et al., J neurosci 16(24),7910-9(1996)).

또한, MMP는 피부 노화를 유도하므로, 이를 억제하면 주름 치료 및 예방작용을 기대할 수 있으며, MMP는 또한, 기저막 분해작용으로 혈관신생, 암의 침윤과 전이를 촉진시킨다. 따라서, MMP는 기저막의 분해를 통하여 암의 침윤과 전이에 매추 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 이에 의해 매개되는 질환이 매우 다양하므로 이를 억제할 수 있는 약제의 개발이 요구되고 있다. 그러나 이러한, 억제제는 장기간 사용시에 안전하게 사용할 수 있어야 이상적인 치료제로 사용할 수 있으므로 MMP활성 억제제로서 독성이 적은 제제의 개발이 요구되고 있다. MMP에 의해 매개되는 다양한 질환들의 효과적인 치료를 위해 MMP 억제제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, MMP 억제제의 개발은 다양한 질환들의 치료에 효과적으로 사용된다.In addition, since MMP induces skin aging, suppressing it can be expected to treat and prevent wrinkles, and MMP also promotes angiogenesis and invasion and metastasis of cancer by decomposing the basement membrane. Therefore, MMP not only plays an important role in cancer invasion and metastasis through the decomposition of the basement membrane, and diseases mediated by it are very diverse, so development of a drug capable of suppressing this is required. However, since these inhibitors can be used as an ideal therapeutic agent only when they can be safely used for a long period of time, the development of a formulation with low toxicity as an inhibitor of MMP activity is required. In order to effectively treat various diseases mediated by MMP, research on MMP inhibitors is actively being conducted, and the development of MMP inhibitors is effectively used in the treatment of various diseases.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, a number of papers and patent documents are referenced and citations are indicated. The disclosure contents of the cited papers and patent documents are incorporated by reference in this specification as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 MMP2 억제 활성 및 콜라겐 분해 억제 활성 등을 나타내며 피부상태 개선에 유용하게 이용될 수 있다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.As a result of the present inventors' efforts to develop excellent peptides having biologically effective activity, the peptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 exhibit MMP2 inhibitory activity and collagen degradation inhibitory activity, and are useful for improving skin condition. By finding that it can be usefully used, the present invention has been completed.

따라서, 본 발명의 목적은 피부 상태 개선 활성을 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a peptide having an activity for improving skin conditions.

본 발명의 다른 목적은 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for improving skin conditions.

본 발명의 또 다른 목적은 MMP-활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diseases related to MMP-activity.

본 발명의 또 다른 목적은 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 피부 상태 개선 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. According to an aspect of the present invention, the present invention provides a peptide having skin condition improving activity consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.

본 발명자들은 생물학적으로 유효한 활성을 갖는 우수한 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 MMP2 억제 활성 및 콜라겐 분해 억제 활성 등을 나타내며 피부상태 개선에 유용하게 이용될 수 있다는 것을 규명하였다. As a result of the present inventors' efforts to develop excellent peptides having biologically effective activity, the peptides having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 exhibit MMP2 inhibitory activity and collagen degradation inhibitory activity, and are useful for improving skin condition. It has been found that it can be usefully used.

본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다. According to the present invention, the peptide of the present invention comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Specifically, the peptide of the present invention is essentially composed of the amino acid sequence of the first sequence of sequence listing or the second sequence of sequence listing.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.The term “peptide” as used herein refers to a linear molecule formed by bonding amino acid residues to each other by peptide bonds. The peptides of the present invention are chemically synthesized methods known in the art, in particular solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd.ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis technology (US Patent No. 5,516,891).

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시킨 높은 반감기를 가질 수 있다.The peptide of the present invention may select a part of the amino acid sequence and induce a modification at the N-terminus or C-terminus in order to increase its activity. Through this modification, the peptide of the present invention can have a high half-life by increasing the half-life when administered in vivo.

또한, 본 발명의 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH2), 아자이드(-NHNH2) 등으로 변형되어 있으며, 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.In addition, the C-terminus of the peptide of the present invention is modified with a hydroxy group (-OH), an amino group (-NH 2 ), an azide (-NHNH 2 ), and the like, and the N-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluorenyl group. A protecting group selected from the group consisting of oxycarbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group and polyethylene glycol (PEG) may be bonded.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. The above-described amino acid modification acts to greatly improve the stability of the peptide of the present invention.

본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. In the present specification, the term “stability” means not only in vivo stability, but also storage stability (eg, room temperature storage stability).

상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.The above-described protecting group functions to protect the peptide of the present invention from attack by protein cleavage enzymes in vivo.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 MMP2(matrix metalloproteinase-2)의 활성을 직접적으로 억제 하는 기능을 가질 뿐 아니라, MMP2에 의한 콜라겐 분해를 억제하는 기능을 갖는다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 피부 미백에 관여하는 멜라노좀 이동(melanosome transfer)에 대한 억제 효과가 뛰어나다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 피부상태 개선에 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다.According to an embodiment of the present invention, the peptide of the present invention not only has a function of directly inhibiting the activity of MMP2 (matrix metalloproteinase-2), but also has a function of inhibiting collagen degradation by MMP2. In addition, the peptide of the present invention has an excellent inhibitory effect on melanosome transfer, which is involved in skin whitening. These results mean that the peptides of the present invention have very excellent efficacy in improving skin conditions.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 화장료 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a cosmetic composition for improving skin conditions comprising the peptide of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention contains the peptide of the present invention described above as an active ingredient, descriptions of the contents in common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 있어서 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처 제거, 여드름 개선, 피부재생 또는 미백이다.According to one embodiment of the present invention, the improvement of the skin condition in the present invention is wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging prevention, skin moisturizing improvement, wound removal, acne improvement, skin regeneration or whitening.

본 발명의 펩타이드는 다른 단백질 보다 분자량이 훨씬 작기 때문에, 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 피부상태를 효과적으로 개선할 수 있다.Since the peptide of the present invention has a much smaller molecular weight than other proteins, the skin penetration rate is very good. Therefore, when the composition of the present invention is topically applied to the skin, the skin condition can be effectively improved.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.According to one embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a cosmetically effective amount of the peptide of the present invention described above; And (b) a cosmetically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term "cosmetically effective amount" means an amount sufficient to achieve the skin improvement effect of the composition of the present invention described above.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, and may be formulated as a spray, but is not limited thereto. In more detail, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutritional lotion, nutritional cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, or zinc oxide may be used as a carrier component. I can.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder may be used as a carrier component. In particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane / May contain propellants such as butane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid ester of sorbitan.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, as a carrier component, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, and crystallites Sex cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth, and the like can be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a surfactant containing cleansing, as a carrier component, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters may be used.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.Ingredients included in the cosmetic composition of the present invention include ingredients commonly used in cosmetic compositions, in addition to peptides and carrier ingredients as active ingredients, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and perfumes. May contain adjuvants.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 MMP-활성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 MMP-활성 관련 질환은 관절염, 당뇨병성 망막증, 비대성 반흔, 건선, 점막 및 상피 조직의 궤양, 자가면역에 의한 염증, 기저막의 분해와 관련된 질병인 낭창, 자가 면역성 신경장애, 근세포 파괴, 녹내장 또는 과다한 혈관신생인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating MMP-activity-related diseases comprising the peptide of the present invention as an active ingredient, wherein the MMP-activity-related diseases are arthritis, diabetic retinopathy, Hypertrophic scars, psoriasis, ulcers of mucous membranes and epithelial tissues, inflammation due to autoimmune, lupus, autoimmune neuropathy, myocyte destruction, glaucoma or excessive angiogenesis, which are diseases related to the decomposition of the basement membrane, are provided.

본 발명의 펩타이드는 MMP2의 활성 억제, 콜라겐 분해 억제 및 멜라노좀 이동 억제 등의 다양한 생리활성을 나타냄으로써 이와 관련된 질병 치료에 유용하게 이용될 수 있다.The peptides of the present invention exhibit various physiological activities such as inhibition of MMP2 activity, inhibition of collagen degradation, and inhibition of melanosome movement, and thus may be usefully used in the treatment of diseases related thereto.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention described above; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-described peptide.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used at the time of formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It does not become. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc. I can.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-1000 ㎍이다.A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is formulated in various ways depending on factors such as the formulation method, the mode of administration, the patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity. Can be. Meanwhile, the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-1000 μg per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be prepared by placing it in a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising the peptide of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 염증 질환은 치주염, 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염(건초열), 알레르기성 피부염(습진), 만성 부비동염 또는 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)이다.According to an embodiment of the present invention, inflammatory diseases to which the composition of the present invention can be applied include periodontitis, asthma, eczema, psoriasis, allergies, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, atopic dermatitis, acne, atopic rhinitis ( Hay fever), allergic dermatitis (eczema), chronic sinusitis or seborrheic dermatitis.

본 발명의 펩타이드는 염증반응에 관여하는 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 PAR2(Protease-activated receptor 2) 및 IL-1β의 발현을 억제시켜 염증반응을 감소시킴으로써 이와 관련된 염증질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.The peptide of the present invention reduces the inflammatory response by inhibiting the expression of pro-inflammatory cytokines PAR2 (Protease-activated receptor 2) and IL-1β involved in the inflammatory response, thereby preventing and treating related inflammatory diseases. It can be usefully used.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(i) 본 발명은 피부 상태 개선 활성을 갖는 펩타이드를 제공한다. (i) The present invention provides a peptide having skin condition improvement activity.

(ⅱ) 본 발명의 펩타이드는 MMP2 활성을 억제하여 피부상태를 개선하는데 매우 우수한 효능을 발휘하며, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 콜라겐 분해를 억제하고 멜라노좀 이동을 억제하는 등의 우수한 생리활성을 나타내어 주름개선, 피부재생, 피부탄력 개선, 피부노화 억제, 상처 재생, 여드름 개선, 피부 재생 또는 피부 미백에 이용 가능하다. (Ii) The peptide of the present invention exhibits very excellent efficacy in improving the skin condition by inhibiting MMP2 activity, and the composition containing the peptide of the present invention has excellent physiological activities such as inhibiting collagen degradation and melanosome movement. It can be used for wrinkle improvement, skin regeneration, skin elasticity improvement, skin aging inhibition, wound regeneration, acne improvement, skin regeneration or skin whitening.

(ⅲ) 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 MMP-활성 관련 질환 및 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 이용될 수 있다. (Iii) The composition comprising the peptide of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for preventing or treating MMP-activity-related diseases and inflammatory diseases.

도 1은 본 발명의 펩타이드에 대한 HPLC 분석 결과이다.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
도 2는 본 발명의 펩타이드에 의한 인간 1차 진피 섬유아세포(Human primary dermal fibroblast Cells)의 증식 촉진 효능을 평가한 결과이다.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
도 3은 인간 1차 진피 섬유아세포에서 본 발명의 펩타이드에 의한 신호전달 변화를 확인한 결과이다.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
도 4는 본 발명의 펩타이드에 의한 MMP2 활성 억제 효과를 평가한 결과이다.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
도 5는 섬유아세포에서 본 발명의 펩타이드에 의한 MMP2 활성 억제 효과를 평가한 결과이다.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
도 6 및 도 7은 본 발명의 펩타이드에 의한 콜라겐 분해 억제 효과를 평가한 결과이다.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
도 8은 CG-Renuin에 의한 멜라노좀 이동(melanosome transfer) 억제 효과를 평가한 결과이다.
도 9는 치수줄기세포(dental pulp stem cells)에서 CG-Noverin에 의한 항염증 효과를 평가한 결과이다.1 is an HPLC analysis result of the peptide of the present invention.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
Figure 2 is a result of evaluating the proliferation promoting efficacy of human primary dermal fibroblast cells (Human primary dermal fibroblast Cells) by the peptide of the present invention.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
3 is a result of confirming the change in signal transduction by the peptide of the present invention in human primary dermal fibroblasts.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
4 is a result of evaluating the effect of inhibiting MMP2 activity by the peptide of the present invention.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
5 is a result of evaluating the effect of inhibiting MMP2 activity by the peptide of the present invention in fibroblasts.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
6 and 7 are results of evaluating the effect of inhibiting collagen degradation by the peptide of the present invention.
(a) CG-Renuin, (b) CG-Noverin
8 is a result of evaluating the inhibitory effect of melanosome transfer by CG-Renuin.
9 is a result of evaluating the anti-inflammatory effect of CG-Noverin in dental pulp stem cells.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

합성예 1: 펩타이드 합성Synthesis Example 1: Peptide Synthesis

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Gly-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Gly-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Cys(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Cys-Gly-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Ile, Fmoc-Trp, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu) 및 Fmoc-Glu(OtBu) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한 뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH2-Cys-Thr-Lys-Ile-Tyr-Asp-Pro-Val-Cys-COOH 서열목록 제1서열의 펩타이드를 0.5 g(수율: 95%), NH2-Cys-Pro-Arg-His-Phe-Asn-Pro-Val-Cys-COOH 서열목록 제2서열의 펩타이드를 0.7 g 합성(수율: 95%)하였다. 분자량 측정기를 이용하여 측정시 서열목록 제1서열의 펩타이드 분자량은 1041.2(이론값: 1041.25), 서열목록 제2서열의 펩타이드 분자량은 1072.2(이론값 :1072.27)이다.700 mg of chloro trityl chloride resin (CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) was placed in a reaction vessel, and 10 ml of methylene chloride (MC) was added, followed by stirring for 3 minutes. The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added, stirred for 3 minutes, and the solvent was removed again. 10 ml of dichloromethane solution was added to the reactor, 200 mmole of Fmoc-Gly-OH (Bachem, Swiss) and 400 mmole of diisopropyl ethylamine (DIEA) were added, then stirred to dissolve well, and reacted with stirring for 1 hour. After the reaction was washed, methanol and DIEA (2:1) were dissolved in DCM (dichloromethane), reacted for 10 minutes, and washed with an excess of DCM/DMF (1:1). The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added, stirred for 3 minutes, and the solvent was removed again. 10 ml of a deprotection solution (20% piperidine/DMF) was added to the reaction vessel and stirred at room temperature for 10 minutes, and then the solution was removed. After the same amount of the deprotection solution was added and the reaction was maintained for another 10 minutes, the solution was removed and washed twice with DMF, once with MC, and once with DMF for 3 minutes each to prepare Gly-CTL resin. 10 ml of DMF solution was added to a new reactor, 200 mmole of Fmoc-Cys (Bachem, Swiss), 200 mmole of HoBt and 200 mmole of Bop were added, followed by stirring to dissolve well. After adding 400 mmole DIEA to the reactor twice as a fraction, the mixture was stirred for at least 5 minutes until all solids were dissolved. The dissolved amino acid mixture solution was placed in a reaction vessel with a deprotected resin and reacted with stirring at room temperature for 1 hour. The reaction solution was removed, and the mixture was stirred 3 times for 5 minutes with a DMF solution, and then removed. A small amount of reaction resin was taken and the degree of reaction was checked using a Kaiser test (Nihydrin Test). Cys-Gly-CTL resin was prepared by performing a deprotection reaction twice in the same manner as above with a deprotection solution. After sufficiently washing with DMF and MC, performing the Kaiser test again, the following amino acid adhesion experiment was performed in the same manner as above. Fmoc-Ile, Fmoc-Trp, Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Ser(tBu) and Fmoc-Glu(OtBu) in order based on the selected amino acid sequence The chain reaction was carried out. The Fmoc-protecting group was reacted twice with a deprotection solution for 10 minutes each, and then washed well and removed. After performing acetylation for an hour by adding acetic anhydride, DIEA, and HoBt, the prepared peptidyl resin was washed three times with DMF, MC, and methanol, respectively, dried by slowly flowing nitrogen air, and then vacuumed under P 2 O 5. After completely drying under reduced pressure, 30 ml of a degreasing solution [Trifluroacetic acid 81.5%, distilled water 5%, thioanisole 5%, phenol 5%, EDT 2.5% and TIS 1%] After putting in, the reaction was maintained for 2 hours by shaking occasionally at room temperature. The resin was filtered by filtering, and the resin was washed with a small amount of TFA solution and then combined with the mother liquor. After distillation using reduced pressure so that the total volume remains about half, 50 ml of cold ether was added to induce precipitation, centrifuged to collect the precipitate, and washed with cold ether twice. Remove the mother liquor and dry it sufficiently under nitrogen to add 0.5 g (yield: 95%) of the peptide of the first sequence of NH 2 -Cys-Thr-Lys-Ile-Tyr-Asp-Pro-Val-Cys-COOH sequence listing before purification, NH 2 -Cys-Pro-Arg-His-Phe-Asn-Pro-Val-Cys-COOH 0.7 g of the peptide of SEQ ID NO: 2 was synthesized (yield: 95%). When measured using a molecular weight analyzer, the molecular weight of the peptide in the first sequence of Sequence Listing is 1041.2 (theoretical value: 1041.25), and the molecular weight of the peptide in the second sequence of Sequence Listing is 1072.2 (theoretical value: 1072.27).

펩타이드Peptide 아미노산 서열Amino acid sequence 분석값(질량분석기)Analysis value (mass spectrometer) 분석치Analysis value 이론치Theoretical value 서열 1SEQ ID NO: 1 CTKIYDPVCCTKIYDPVC 1041.21041.2 1042.251042.25 서열 2SEQ ID NO: 2 CPRHFNPVCCPRHFNPVC 1072.21072.2 1072.271072.27

실시예 1: 인간 진피 섬유아세포의 증식 촉진Example 1: Promotion of human dermal fibroblast proliferation

인간 1차 진피 섬유아세포(human primary dermal fibroblast cells)에 CG-Renuin(서열목록 제1서열의 펩타이드) 또는 CG-Noverin(서열목록 제2서열의 펩타이드)을 농도별(1 ng/ml - 1 μg/ml)로 처리하고 세포 배양기에서 72시간 동안 배양한 다음, 펩타이드 처리에 의한 세포 증식 변화를 SRB 어세이(OD 590 nm)를 통해 분석하였다. CG-Renuin 또는 CG-Noverin 처리량에 의존적으로 인간 1차 진피 섬유아세포의 증식이 증가되었다(도 2a-2b). CG-Renuin (peptide of SEQ ID NO: 1) or CG-Noverin (peptide of SEQ ID NO: 2) in human primary dermal fibroblast cells by concentration (1 ng/ml-1 μg) /ml) and cultured for 72 hours in a cell incubator, and then, the change in cell proliferation by peptide treatment was analyzed by SRB assay (OD 590 nm). The proliferation of human primary dermal fibroblasts was increased depending on the amount of CG-Renuin or CG-Noverin treatment (FIGS. 2A-2B ).

실시예 2: 인간 섬유아세포에서 CG-Renuin 또는 CG-Noverin의 신호전달Example 2: Signaling of CG-Renuin or CG-Noverin in human fibroblasts

2 x 105 세포/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트에 NIH3T3(표피세포주)를 시딩하고 하룻밤 동안 배양한 후, CG-Renuin 또는 CG-Noverin 펩타이드를 농도별(1-10 μg/ml)로 처리하고 30분 동안 37℃ 배양기에서 배양 후 UVA(8 J)를 조사하고 24시간 배양하였다. 세포 용해 버퍼를 처리하여 용해물을 확보한 후 단백질을 정량하였다. 세포활성 인자의 발현 확인을 위해 anti-pERK(Santa Cruz Biotechnology, USA), p38(Santa Cruz Biotechnology, USA) 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. NIH3T3 (epidermal cell line) was seeded in a 6-well plate at a cell density of 2 x 10 5 cells/well, incubated overnight, and then CG-Renuin or CG-Noverin peptides were added at different concentrations (1-10 μg/ml). After treatment and incubation at 37° C. for 30 minutes, UVA (8 J) was irradiated and cultured for 24 hours. After the cell lysis buffer was treated to obtain a lysate, the protein was quantified. Western blot was performed using anti-pERK (Santa Cruz Biotechnology, USA), p38 (Santa Cruz Biotechnology, USA) antibodies to confirm the expression of the cell activating factor.

CG-Renuin 또는 CG-Noverin을 처리하는 경우, 세포의 증식, 이동 및 생존에 관여하는 ERK 및 P38의 인산화 증가가 확인되었다(도 3a-3b). In the case of treatment with CG-Renuin or CG-Noverin, phosphorylation of ERK and P38, which are involved in cell proliferation, migration, and survival, was increased (FIGS. 3A-3B ).

실시예 3: CG-Renuin 또는 CG-Noverin에 의한 rhMMP2의 억제Example 3: Inhibition of rhMMP2 by CG-Renuin or CG-Noverin

rhMMP2와 펩타이드를 농도별(0.1 μg/ml, 1 μg/ml) 로 혼합하여 상온에서 1시간 배양 후 젤라틴 자이모그라피(gelatin zymography)를 시행하여 그의 발현을 알아보기 위해 먼저, 젤라틴(2 mg/ml)을 기질로 하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 시행하였다. 전기영동 후 겔을 2.5% Triton X-100에 30분간 담가두었다가, 다시 50 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl2, 1% Triton X-100을 조성으로 하는 완충제에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후 겔은 Coo-massie Brilliant Blue R250(Sigma)으로 염색하였고, 5% 메탄올과 7.5% 아세트산, 증류수로 조성된 용액으로 탈 염색 하였다. 그리고 젤라틴 가수분해에 의하여 나타나는 밴드를 관찰하였는데 활성(active) MMP-2는 66 kDa, pro-MMP-2는 72 kDa 밴드를 찾아 관찰하였다.After mixing rhMMP2 and peptide at different concentrations (0.1 μg/ml, 1 μg/ml) and incubating for 1 hour at room temperature, gelatin zymography was performed. ml) as a substrate was subjected to protein electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the gel was immersed in 2.5% Triton X-100 for 30 minutes, and then again at 37°C for 24 hours in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 and 1% Triton X-100. Cultured in. After incubation, the gel was stained with Coo-massie Brilliant Blue R250 (Sigma), and destained with a solution composed of 5% methanol, 7.5% acetic acid and distilled water. In addition, the bands exhibited by gelatin hydrolysis were observed. Active MMP-2 was 66 kDa and pro-MMP-2 was 72 kDa.

CG-Renuin 및 CG-Noverin에 의해 MMP2의 활성이 직접적으로 억제되는 것을 젤라틴 자이모그라피를 통해 확인하였다(도 4a-4b). It was confirmed through gelatin zymography that the activity of MMP2 was directly inhibited by CG-Renuin and CG-Noverin (FIGS. 4a-4b).

실시예 4: 섬유아세포에서 CG-Renuin 또는 CG-Noverin에 의한 rhMMP2의 억제 Example 4: Inhibition of rhMMP2 by CG-Renuin or CG-Noverin in Fibroblasts

3 x 104 세포/웰의 세포 밀도로 24웰 플레이트에 섬유아세포(NIH3T3)를 시딩하였다. 다음날 무혈청 배지로 24시간 배양하고 TNF-α로 MMP2의 발현 및 활성화를 유도한 후 CG-Renuin 또는 CG-Noverin을 각각 농도(10 ng/ml, 100 ng/ml, 1000 ng/ml) 별로 처리한 후 24시간 배양하였다. 14,000 x g로 10분간 원심 분리해 얻은 상층액을 배양 후 젤라틴 자이모그라피를 시행하여 그의 발현을 알아보기 위해 젤라틴(2 mg/ml)을 기질로 하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 시행하였다. 전기영동 후 겔을 2.5% Triton X-100에 30분간 담가두었다가, 다시 50 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl2, 1% Triton X-100을 조성으로 하는 완충제에서 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후 겔은 Coo-massie Brilliant Blue R250(Sigma)으로 염색하였고, 5% 메탄올과 7.5% 아세트산, 증류수로 조성된 용액으로 탈 염색 하였다. 그리고 젤라틴 가수분해에 의하여 나타나는 밴드를 관찰하였는데, 활성 MMP-2는 66 kDa, pro-MMP-2는 72 kDa 밴드를 찾아 관찰하였다.Fibroblasts (NIH3T3) were seeded in a 24-well plate at a cell density of 3 x 10 4 cells/well. The next day, after 24 hours incubation in serum-free medium and induction of expression and activation of MMP2 with TNF-α, CG-Renuin or CG-Noverin was treated at each concentration (10 ng/ml, 100 ng/ml, 1000 ng/ml). And then incubated for 24 hours. After incubation of the supernatant obtained by centrifugation at 14,000 xg for 10 minutes, gelatin zymography was performed, and protein electrophoresis (SDS-PAGE) was performed using gelatin (2 mg/ml) as a substrate to determine its expression. After electrophoresis, the gel was immersed in 2.5% Triton X-100 for 30 minutes, and then again at 37°C for 24 hours in a buffer containing 50 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl 2 and 1% Triton X-100. Cultured in. After incubation, the gel was stained with Coo-massie Brilliant Blue R250 (Sigma), and destained with a solution composed of 5% methanol, 7.5% acetic acid and distilled water. Then, a band appeared by gelatin hydrolysis was observed. Active MMP-2 was 66 kDa and pro-MMP-2 was 72 kDa.

MMP2의 활성을 관찰한 결과, CG-Renuin 및 CG-Noverin에 의해 MMP2의 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 5a-5b). As a result of observing the activity of MMP2, it was confirmed that the activity of MMP2 was inhibited by CG-Renuin and CG-Noverin (FIGS. 5A-5B ).

실시예 5: CG-Renuin 또는 CG-Noverin에 의한 콜라겐 분해 억제 Example 5: Inhibition of collagen degradation by CG-Renuin or CG-Noverin

HDF(Human dermal fibroblast) 세포(3x104 세포)를 24웰 플레이트에 시딩하였다. 다음날 5% 혈청 배지로 42시간 배양한 후 MMP2(20 ng/ml)(SIGMA/USA)과 CG-Noverin, CG-Renuin을 각각 처리한 후 6시간 배양하였다. 14,000 x g로 10분간 원심 분리해 얻은 상층액을 pro-collagen type I kit(RnD system/USA)를 이용하여 분석하였다.Human dermal fibroblast (HDF) cells (3x10 4 cells) were seeded in 24-well plates. The next day, after 42 hours incubation in 5% serum medium, MMP2 (20 ng/ml) (SIGMA/USA), CG-Noverin, and CG-Renuin were respectively treated, followed by incubation for 6 hours. The supernatant obtained by centrifugation at 14,000 xg for 10 minutes was analyzed using a pro-collagen type I kit (RnD system/USA).

HDF(Human dermal fibroblast) 세포(3x104 세포)를 24웰 플레이트에 시딩하고 다음 날 5% 혈청 배지로 교체 후 IGF-1(100 ng/ml)(Sigma/USA)를 처리하여 44시간 배양한 후 MMP2(20 ng/ml)와 CG-Noverin, CG-Renuin을 처리한 후 4시간 배양하였다. 14,000 x g로 10분간 원심 분리해 얻은 상층액을 pro-collagen type I kit를 이용하여 분석하였다. HDF (Human dermal fibroblast) cells (3x10 4 cells) were seeded in a 24-well plate, replaced with 5% serum medium the next day, treated with IGF-1 (100 ng/ml) (Sigma/USA) and incubated for 44 hours. After treatment with MMP2 (20 ng/ml), CG-Noverin, and CG-Renuin, they were incubated for 4 hours. The supernatant obtained by centrifugation at 14,000 xg for 10 minutes was analyzed using a pro-collagen type I kit.

CG-Renuin 및 CG-Noverin이 MMP2에 의해 유도되는 콜라겐 분해를 억제하는 기능을 갖는지에 대해 실험을 실시한 결과, MMP2를 처리하였을 때 세포 내 콜라겐 분해가 대조군과 비교하여 증가되며 CG-Renuin 또는 CG-Noverin와 동시에 처리하였을 경우, 콜라겐 분해 유도가 억제 되는 것을 확인하였다(도 6a-6b 및 도 7a-7b). As a result of an experiment on whether CG-Renuin and CG-Noverin have the function of inhibiting collagen degradation induced by MMP2, the results of an experiment showed that when MMP2 was treated, intracellular collagen degradation was increased compared to the control group, and CG-Renuin or CG- When treated with Noverin at the same time, it was confirmed that the induction of collagen degradation was inhibited (FIGS. 6A-6B and 7A-7B ).

실시예 6: CG- Noverin , CG- Renuin에 의한 멜라노좀 이동( melanosome transfer) 억제 Example 6: CG- Noverin, moving some melanocytes by CG- Renuin (melanosome transfer) suppression

멜라노좀 이동을 관찰하기 위해서 HaCaT 각질 세포를 이용하여 파고사이토시스 시험(Phagocytosis assay)을 진행 하였다. 파고사이토시스를 위한 물질로는 형광(fluoroscence)물질이 붙은 생입자(bioparticle)를 이용하였다. 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 x 103 세포가 되도록 하여 24시간 동안 배양 후 무혈청 배지로 6시간 동안 배양하였다. 이후 파고사이토시스를 유도하기 위해 1 ㎍/㎖ 의 트립신을 처리하고 1 ㎍/㎖의 펩타이드들을 48시간 동안 처리하였다. 그 결과, 현광 현미경을 통해 생입자가 각질 세포내로 파고사이토시스되는 것을 확인하였다. 파고사이토시스 유도군, 즉 트립신 처리군을 100%로 하여 데이터 관찰하였을 때 CG-Noverin, 과 CG-Renuin 처리군에서 파고사이토시스가 억제되는 것을 확인하였다. In order to observe melanosome migration, a Phagocytosis assay was performed using HaCaT keratin cells. As a material for pagocytosis, bioparticles with a fluoroscence material were used. In a 96-well tissue culture plate, each well was cultured to have 3 x 10 3 cells for 24 hours and then cultured in a serum-free medium for 6 hours. Thereafter, in order to induce phagocytosis, 1 µg/ml of trypsin was treated and 1 µg/ml of peptides were treated for 48 hours. As a result, it was confirmed that the live particles were phagocytosed into keratinocytes through a fluorescence microscope. When the data were observed with the induction group for phagocytosis, that is, the trypsin-treated group as 100%, it was confirmed that phagocytosis was inhibited in the CG-Noverin and CG-Renuin-treated groups.

실시예 7: CG-Noverin의 항-치주질환(anti-periodontal) 기능Example 7: Anti-periodontal function of CG-Noverin

합성 펩타이드에 의한 치주염세포에서의 항염증 효과Anti-inflammatory effect of synthetic peptides in periodontitis cells

상기 합성예에서 합성된 펩타이드들에 치주염 세포에서의 항염증 효과를 관찰하기 위해 인간 치근막 섬유아세포(Human periodontal ligament fibroblast cell)(ATCC, USA)를 이용하여 실험을 진행하였다. 인간 치근막 섬유아세포를 6-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 5 x 101 세포가 되도록 하여 24시간동안 배양하였다. 치주 세포에 염증을 유도하기 위해 10 μg/ml의 농도로 트립신(시그마, USA)를 처리한 후, 본 발명의 펩타이드들을 1 μg/ml의 농도로 같이 처리하여 4시간 동안 배양한 후 대조군과 유발 물질 그리고 유발물질과 펩타이드를 처리한 배양세포로부터 mRNA를 추출하여 PAR-2, IL-1β의 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 사용한 각 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 표 2와 같다.In order to observe the anti-inflammatory effect in periodontitis cells on the peptides synthesized in Synthesis Example, an experiment was conducted using human periodontal ligament fibroblast cells (ATCC, USA). Human periodontal fibroblasts were cultured for 24 hours in a 6-well tissue culture plate so as to be 5 x 10 1 cells per well. After treatment with trypsin (Sigma, USA) at a concentration of 10 μg/ml to induce inflammation in periodontal cells, the peptides of the present invention were treated at a concentration of 1 μg/ml and incubated for 4 hours, and then induced with the control group. MRNA was extracted from the cultured cells treated with the substance, the inducer and the peptide, and reverse transcription polymerase chain reaction was performed using primers of PAR-2 and IL-1β. The nucleotide sequence of each used primer is shown in Table 2.

IL-1βIL-1β 정방향Forward direction 5’-CCGTGGACCTTCCAGGATCA-3’5’-CCGTGGACCTTCCAGGATCA-3’ 역방향Reverse 5’-GATCCACACTCTCCAGCTGC-3’5’-GATCCACACTCTCCAGCTGC-3’ PAR2PAR2 정방향Forward direction 5’-GGGTTTGCCAAGTAACGGC-3’5’-GGGTTTGCCAAGTAACGGC-3’ 역방향Reverse 5’-GGGAACCAGATGACAGAGAGG-3’5’-GGGAACCAGATGACAGAGAGG-3’

도 9에서 볼 수 있듯이, 인간 치근막 섬유아세포에 트립신을 처리하여 염증을 유도하였을 때 염증성 사이토카인인, PAR-2, IL-1β의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 본 발명의 펩타이드를 동시에 처리하였을 때에는 위 2가지의 염증성 사이토카인의 발현이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 9).As can be seen in Figure 9, it was observed that the expression of inflammatory cytokines, PAR-2, and IL-1β was increased when inflammation was induced by trypsin treatment in human periodontal fibroblasts, and the peptides of the present invention were simultaneously used. When treated, it was confirmed that the expression of the above two inflammatory cytokines was remarkably suppressed (FIG. 9).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, a specific part of the present invention has been described in detail, and it is clear to those of ordinary skill in the art that this specific technology is only an embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

<110> CAREGEN Co,.LTD. <120> Peptides Having Activities of Skin Condition Improvement and Uses Thereof <130> PN140559D <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-Renuin <400> 1 Cys Thr Lys Ile Tyr Asp Pro Val Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-Noverin <400> 2 Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val Cys 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> IL-1beta forward primer <400> 3 ccgtggacct tccaggatca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> IL-1beta reverse primer <400> 4 gatccacact ctccagctgc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> PAR2 forward primer <400> 5 gggtttgcca agtaacgg 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> PAR2 reverse primer <400> 6 gggaaccaga tgacagagag g 21 <110> CAREGEN Co,. Ltd. <120> Peptides Having Activities of Skin Condition Improvement and Uses Thereof <130> PN140559D <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-Renuin <400> 1 Cys Thr Lys Ile Tyr Asp Pro Val Cys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CG-Noverin <400> 2 Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val Cys 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> IL-1beta forward primer <400> 3 ccgtggacct tccaggatca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> IL-1beta reverse primer <400> 4 gatccacact ctccagctgc 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> PAR2 forward primer <400> 5 gggtttgcca agtaacgg 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> PAR2 reverse primer <400> 6 gggaaccaga tgacagagag g 21

Claims (3)

서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 상처 치료 또는 여드름 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition for treating or preventing acne or wound healing, comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 주름개선, 피부탄력 개선, 여드름 개선 및 피부 미백으로 이루어진 군에서 선택된 피부 상태 개선용 화장품 조성물.A skin elasticity improvement, acne improvement, and skin whitening comprising the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 관절염, 당뇨병성 망막증, 비대성 반흔, 건선, 점막 및 상피 조직의 궤양, 자가면역에 의한 염증, 기저막의 분해와 관련된 질병인 낭창, 자가 면역성 신경장애, 근세포 파괴 또는 녹내장의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.A disease associated with arthritis comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient, diabetic retinopathy, hypertrophic scarring, psoriasis, mucosal and epithelial tissue ulcers, autoimmune inflammation, Leprosy, autoimmune neuropathy, myocardial destruction or glaucoma.
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