KR101719354B1

KR101719354B1 - Peptides Having Growth Factor Activity and Uses Thereof

Info

Publication number: KR101719354B1
Application number: KR1020160132767A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 정현아
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2016-10-13
Publication date: 2017-03-27
Also published as: KR20160121802A

Abstract

본 발명의 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 성장인자 활성을 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 안정성이 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, 성장인자의 활성이 요구되거나 억제되어야 하는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다. 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.The peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID No. 1 of the present invention exhibits growth factor activity. The peptide of the present invention is very stable and has excellent skin permeability. Thus, compositions comprising the peptides of the present invention exhibit very good efficacy in treating, preventing or ameliorating diseases or conditions in which the activity of growth factors is required or inhibited. The above-mentioned excellent activity and stability of the peptide of the present invention can be very advantageously applied to medicines, quasi-drugs and cosmetics.

Description

Peptides having growth factor activity and uses thereof {Peptides Having Growth Factor Activity and Uses Thereof}

본 발명은 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드 및 이를 포함하는 과각화증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물, 그리고 골 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a peptide exhibiting growth factor activity, a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hyperkeratosis comprising the same, and a composition for promoting bone differentiation.

피부조직은 표피와 진피 그리고 피하(hypodermis)로 이루어져 있다. 피부의 성질을 결정짓는 부분은 표피로서 표피는 외부로부터 직접적이고 잦은 손상을 받으므로 표피의 수선과 재생은 매우 중요하다. 사람의 표피는 2주일에 한 번씩 교체되므로 표피를 조성하는 피부 줄기세포의 증식능력은 엄청나다고 할 수 있다. 또한, 피부의 만능줄기세포가 모낭의 지질샘 바로 밑 벌지(bulge) 부위에 위치한다는 보고도 많이 언급이 되고 있는데, 이 벌지 줄기세포는 표피 줄기세포, 모근줄기세포(hair matrix stem cells), 지질샘 줄기세포(sebaceous glands stem cells)를 만드는 근간이 되는 줄기세포이다. 대부분의 표피 줄기세포는 3-6번을 증식하고 나면 분화의 길을 밟는다. 반면에 벌지 줄기세포는 증식은 다른 세 줄기세포보다 느리지만 사람이 사는 동안 무한정 증식하면서 표피줄기세포, 모근줄기세포, 지질샘 줄기세포를 만드는 동시에 그 자신의 줄기세포 성격을 유지할 수 있는 것으로 보인다.The skin tissue consists of the epidermis, the dermis and the subcutaneous (hypodermis). The part that determines the nature of the skin is the epidermis, and since the epidermis is directly and frequently damaged from the outside, repair and regeneration of the epidermis is very important. Since the human epidermis is replaced every two weeks, it can be said that the proliferation capacity of the skin stem cells that make up the epidermis is enormous. In addition, there are many reports that the pluripotent stem cells of the skin are located in the bulge area just under the lipid gland of the hair follicle.These bulge stem cells are epidermal stem cells, hair matrix stem cells, and lipids. These stem cells are the basis for making sebaceous glands stem cells. Most epidermal stem cells proliferate 3-6 times and then go on the path of differentiation. Bulge stem cells, on the other hand, proliferate more slowly than the other three stem cells, but they seem to be able to proliferate indefinitely during human life to produce epidermal stem cells, hair root stem cells, and lipid gland stem cells while maintaining their own stem cell characteristics.

표피는 체내와 체외 사이의 물리화학적 장벽의 제조자로서의 기능 외에, 활성 면역 장벽으로서의 기능도 한다. 케라티노사이트(keratinocyte)는 면역계 및 염증계 세포와 교통하며 상호작용하는 다수의 사이토킨 및 기타 염증 매개체에 반응하는 것은 물론 이들을 생산할 수 있는 능력을 가지는데, 이는 미생물 감염에 대한 숙주 방어 및 상처 치료에서 큰 중요성을 가진다. 또한, 케라티노사이트는 건선 및 좌창과 같은 많은 염증 피부병에서 활발한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.In addition to functioning as a manufacturer of physicochemical barriers between the body and the outside, the epidermis also functions as an active immune barrier. Keratinocytes have the ability to produce as well as respond to a number of cytokines and other inflammatory mediators that communicate and interact with immune and inflammatory cells, which are used in host defense against microbial infections and wound healing. Have great importance. In addition, keratinocytes are known to play an active role in many inflammatory skin diseases such as psoriasis and acne.

각질층은 피부의 가장 분화된 구조를 가지며, 표피 분화 과정의 최종 산물, 즉 피부의 최외 부분을 차지하는 중층 편평상피이다. 대부분의 표피 세포들은 다양한 분화 상태의 케라티노사이트(keratinocytes)로 구성되며, 표피의 연결 조직인 진피와 접촉해 있는 기저막 상에 존재하는 기저 세포는 분할능을 가지는 유일한 케라티노사이트이다. 기저 세포의 분획은 연속적으로 기저막을 출발하여 분화 과정을 거쳐 결국에는 세포가 각질층의 건축 저해물이 되도록 한다. 인접 세포들의 중간 필라멘트는 증가된 수의 교소체에 의해 기능 단위체에 결합된다. 각질층의 가장 극적인 변화는 최외각 생 세포층인 과립층으로부터 생육불능 각질층으로의 전이 과정(keratination) 중에 발생한다. 공유 결합된 단백질은 매우 저항성을 가지는 세포 외피를 형성하는 원형결막의 내면에 밀접하게 침전된다. 또한 케라티노사이트-특이적인 세포 소기관에서 생성되는 지질-풍부 물질은 세포의 공간으로 배출되고, 각질층 세포를 에워싸고 있는 지질 라멜라를 형성함으로써 친수성 물질에 대한 투과성 장벽을 구성한다. 최종적으로 꽉 채워져 있는 세포케라틴 필라멘트를 제외한 모든 세포내 구조들은 사라진다.The stratum corneum has the most differentiated structure of the skin, and is the final product of the epidermal differentiation process, that is, the middle-layer squamous epithelium that occupies the outermost part of the skin. Most of the epidermal cells are composed of keratinocytes of various differentiation states, and the basal cells present on the basement membrane in contact with the dermis, the connective tissue of the epidermis, are the only keratinocytes that have the ability to divide. The fraction of basal cells successively starts with the basement membrane, undergoes a differentiation process, and eventually causes the cells to become architectural inhibitors of the stratum corneum. Intermediate filaments of adjacent cells are bound to functional units by an increased number of mates. The most dramatic change in the stratum corneum occurs during keratination from the granular layer, the outermost viable cell layer, to the inviable stratum corneum. Covalently bound proteins are intimately precipitated on the inner surface of the circular conjunctiva, forming a highly resistant cell envelope. In addition, lipid-rich substances produced in keratinocyte-specific organelles are discharged into the space of the cells, and form a lipid lamella surrounding the stratum corneum cells, thereby constituting a permeable barrier to hydrophilic substances. Eventually, all intracellular structures, except for the full cell keratin filaments, disappear.

피부에서의 많은 병리적 조건 하에서 케라틴화 과정에 장애가 발생한다. 건선은 전형적인 만성 염증을 나타낼 뿐 아니라 전형적인 낙설을 초래하는 미성숙 각질층의 과다생산을 보인다. 또한, 어린선(ichthyosis)은 피부의 각질층이 잘 안 떨어져나가서 두터워지는 병으로 유전성 피부질환의 일종으로, 낙설률이 감소된다. 어린선보다 경중이기는 하지만, “건조 피부(건피증)” 또한 단일 세포나 세포들의 소집단과 같은 정상적인 조건 하에서가 아니라, 대규모의 육안 관찰가능한 인설(scales)로서 각질층으로부터 코르네오사이트(corneocyte)가 박리되는 특징이 있다. 좌창의 경우에는 여드름 및 전색(plugging)의 생성을 초래하는 피지선관에 케라틴화 장애가 발생한다. 상술한 케라틴화 장애는 다양한 인자들이 관여한다. 예를 들어, 생육성 표피층과 각질화된 표피층 사이에서 전환이 일어나는 동안 발생하는 세포케라틴 필라멘트를 제외한 모든 세포내 구조들의 소멸에 단백질분해가 관여한다는 것을 고려해 볼 때, 단백질 가수분해 효소가 중요하다. 즉, 단백질분해는 결국에는 낙설을 초래하는 과정 중 각질층에서의 세포내 응집성 구조 분해에서 중요한 역할을 한다.Impairment of the keratinization process occurs under many pathological conditions in the skin. Psoriasis not only exhibits typical chronic inflammation, but also exhibits an overproduction of the immature stratum corneum leading to typical fallout. In addition, ichthyosis is a disease in which the stratum corneum of the skin is difficult to fall off and becomes thicker. It is a kind of hereditary skin disease, and the drop rate is reduced. Although heavier than larval gland, “dry skin (schinoderma)” is also large-scale, visually observable scales, not under normal conditions such as single cells or subpopulations of cells, where corneocytes are exfoliated from the stratum corneum. There are features. In the case of acne, a keratinization disorder occurs in the sebaceous gland which causes the production of acne and plugging. Various factors are involved in the aforementioned keratinization disorder. For example, proteolytic enzymes are important considering that proteolysis is involved in the disappearance of all intracellular structures except for the cell keratin filaments that occur during the transition between the viable and keratinized epidermal layers. In other words, proteolysis plays an important role in the decomposition of intracellular cohesive structures in the stratum corneum during the process of eventually causing fallout.

따라서, 상기 질환에서 표피층의 케라틴화의 조절이 매우 중요하며, 본 발명의 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드가 이에 효과적으로 적용될 수 있다.Therefore, it is very important to control the keratinization of the epidermal layer in the disease, and the peptide exhibiting the growth factor activity of the present invention can be effectively applied thereto.

통상적으로, 성장인자류는 병리학적 상태에 대한 효능이 매우 뛰어난 반면에 자연형의 성장인자를 얻기 위하여 재 접힘이라는 추가 공정과 시간이 요구되고, 또한 정제과정에서 대장균 유래의 오염원을 제거하기 위한 복잡한 정제 과정을 필요로 하게 되며, 안정성 및 높은 분자량으로 인한 피부 조직으로의 낮은 침투 가능성 등이 비싼 가격과 맞물려 활용도를 떨어뜨리고 있는 실정이다. 상기 성장인자의 발현의 문제점을 해결하기 위하여 일부 성장인자들의 일부분만을 고체상 합성의 방법을 이용하여 생산하여 유사기능을 얻고자 하는 시도들이 보고되었다(미국 등록특허 제5,473,054호, WO 03/048192, 미국 등록특허 제7,105,481호).In general, growth factors have excellent efficacy against pathological conditions, but require an additional process and time, such as refolding, to obtain natural growth factors, and are complex to remove contaminants derived from E. coli in the purification process. The purification process is required, and the stability and the possibility of low penetration into the skin tissue due to the high molecular weight are combined with the high price, thereby reducing the utilization. In order to solve the problem of expression of the growth factor, attempts to obtain a similar function by producing only a part of the growth factor by using a solid-phase synthesis method have been reported (US Patent No. 5,473,054, WO 03/048192, US Registered Patent No. 7,105,481).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, a number of papers and patent documents are referenced and citations are indicated. The disclosure contents of the cited papers and patent documents are incorporated by reference in this specification as a whole, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

본 발명자들은 천연 성장인자보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 각질세포 증식 억제 및 사멸 촉진, Bax 및 p-p53 단백질 발현 촉진, 골 분화 촉진, 등)이 우수한 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.As a result of trying to develop a material that has superior activity, skin permeability and stability than natural growth factors, the present inventors have physiologically active (e.g., inhibit keratinocyte proliferation and promote apoptosis, promote Bax and p-p53 protein expression, bone The present invention was completed by selecting peptides having excellent differentiation promotion, etc.).

따라서, 본 발명의 목적은 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a peptide exhibiting growth factor activity.

본 발명의 다른 목적은 과각화증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hyperkeratosis.

본 발명의 또 다른 목적은 골 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for promoting bone differentiation.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent by the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a peptide exhibiting growth factor activity comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명자들은 천연 성장인자보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 상술한 특성을 나타내는 우수한 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 합성하였다.As a result of trying to develop a material having superior activity, skin permeability, and stability than the natural growth factor, the present inventors synthesized a peptide exhibiting excellent growth factor activity exhibiting the above-described properties.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.The peptide of the present invention includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Specifically, the peptide of the present invention consists essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열의 펩타이드는 각질세포의 증식을 억제하고 사멸(apoptosis)을 촉진시키는 활성을 나타낸다.According to certain embodiments of the present invention, the peptide of the first sequence in the sequence listing exhibits an activity of inhibiting the proliferation of keratinocytes and promoting apoptosis.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열의 펩타이드는 각질세포 및 골 분화를 촉진시키는 활성을 가진다.According to certain embodiments of the present invention, the peptide of SEQ ID NO: 1 has an activity of promoting keratinocyte and bone differentiation.

본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.The term “peptide” as used herein refers to a linear molecule formed by bonding amino acid residues to each other by peptide bonds. The peptides of the present invention are chemically synthesized methods known in the art, in particular solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd.ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis technology (US Patent No. 5,516,891).

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 높은 열 안정성을 갖는다(참고: 도 8).The peptides of the present invention as such have high thermal stability (reference: Fig. 8).

본 발명의 펩타이드는 매우 저렴하게 대량 합성이 가능하고 고온 등에서 물리화학적인 안정하기 때문에, 생리활성의 저하를 최대한으로 방지할 수 있으며 체내 외에서의 잔존 기간을 증가시킴으로 좀 더 향상된 치료 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 의약품, 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.Since the peptide of the present invention can be synthesized in large quantities at very low cost and is physicochemically stable at high temperatures, it is possible to prevent a decrease in physiological activity as much as possible, and has a more improved therapeutic effect by increasing the remaining period in and outside the body. Therefore, the peptide of the present invention can be advantageously applied to products requiring long-term storage such as pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.According to certain embodiments of the present invention, the N- or C-terminus of the peptide is an acetyl group, a fluorenyl methoxy carbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group, and a polyethylene glycol (PEG). A protecting group selected from the group consisting of may be combined.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 “안정성”은 “인 비보”안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.The above-described amino acid modification acts to greatly improve the stability of the peptide of the present invention. The term “stability” referred to in the present specification means not only “in vivo ” stability, but also storage stability (eg, room temperature storage stability). The above-described protecting group functions to protect the peptide of the present invention from attack by protein cleavage enzymes in vivo.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 과각화증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hyperkeratosis comprising, as an active ingredient, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 described above.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention contains the peptide of the first sequence of the sequence list of the present invention as an active ingredient, descriptions of common contents are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 건선 및 아토피성 피부염 같은 과도한 각질세포층의 증식을 억제할 뿐 아니라 각질세포의 분화를 효과적으로 촉진하기 때문에 과각화증의 치료 또는 예방에 매우 유효하다.As demonstrated in the following examples, the peptide of the first sequence of the sequence listing of the present invention not only inhibits the proliferation of excessive keratinocytes such as psoriasis and atopic dermatitis, but also effectively promotes the differentiation of keratinocytes, thus treating hyperkeratosis or It is very effective in prevention.

본 명세서에서 언급되고 있는 용어 “과각화증(hyperkerotosis)”은 거칠고 단단한 케라틴을 다량 포함하는 피부의 바깥층(outer layer)이 비대해지는 증상을 가지는 질환, 질병 또는 상태를 의미한다. 케라틴화는 정상적으로는, 국소적인 마찰, 압력 또는 자극으로부터 피부를 보호하거나 또는 만성 염증, 감염, 자외선, 등으로부터 피부를 보호하기 위한 과정이다. 하지만, 조절되지 않은 케라틴화는 심각한 질병으로 발전할 수 있다. 예를 들어, 과각화증은 건선, 어린선(ichthyosis), 좌창, 만성 습진, 아토피성 피부염, 피부건조증, 각질증식 및 모공성 각화증, 광선 각화증, 지루각화증, 상처 치유, 자가면역 천포창, 다리어병(darier’s disease), 티눈(corns), 사마귀(warts), 검버섯 및 편평태선을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.The term "hyperkerotosis" as used herein refers to a disease, disease, or condition in which the outer layer of the skin including a large amount of rough and hard keratin is enlarged. Keratinization is normally a process to protect the skin from local friction, pressure or irritation, or to protect the skin from chronic inflammation, infection, ultraviolet rays, etc. However, uncontrolled keratinization can lead to serious disease. For example, hyperkeratosis is psoriasis, ichthyosis, acne, chronic eczema, atopic dermatitis, dry skin, keratoplasty and follicular keratosis, actinic keratosis, seborrheic keratosis, wound healing, autoimmune pemphigus, darier's disease), corns, warts, age spots and lichen planus.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.According to some embodiments of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the peptide of the present invention described above; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-described peptide.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used at the time of formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It does not become. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc. I can.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 어떤 투여량은 1일 당 0.0001-200 ㎍이다.A suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is formulated in various ways depending on factors such as the formulation method, the mode of administration, the patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity. Can be. On the other hand, a certain dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-200 μg per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the art. Or it can be prepared by placing it in a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet, capsule or gel (eg, hydrogel), and may additionally include a dispersant or a stabilizer. .

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 성장인자-관련 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.According to certain embodiments of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a cosmetically effective amount of the growth factor-related peptide of the present invention described above; And (b) a cosmetically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물이 피부(표피) 케라틴화의 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term "cosmetically effective amount" means an amount sufficient for the composition of the present invention described above to achieve the effect of improving skin (epidermal) keratinization.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, and may be formulated as a spray, but is not limited thereto. In more detail, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutritional lotion, nutritional cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, or zinc oxide may be used as a carrier component. I can.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.When the formulation of the present invention is a powder or spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, or polyamide powder may be used as a carrier component. In particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane / May contain propellants such as butane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or emulsion, a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or fatty acid ester of sorbitan.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, as a carrier component, a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, and crystallites Sex cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth, and the like can be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a surfactant containing cleansing, as a carrier component, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters may be used.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.Ingredients included in the cosmetic composition of the present invention include ingredients commonly used in cosmetic compositions, in addition to peptides and carrier ingredients as active ingredients, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and perfumes. May contain adjuvants.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 분화 촉진용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for promoting bone differentiation comprising, as an active ingredient, a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as described above.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention contains the above-described peptide of the present invention as an active ingredient, descriptions of common contents are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 골모세포주의 분화를 촉진시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 골 분화를 효과적으로 촉진시킬 수 있다.As demonstrated in the following examples, the peptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention promotes the differentiation of osteoblastic cell lines. Therefore, the composition of the present invention can effectively promote bone differentiation.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 조골세포 분화 마커들인 OPG, OPN, OCN, ALP 및 BSP 유전자 발현을 증가시킨다.According to certain embodiments of the present invention, the composition of the present invention increases the expression of osteoblast differentiation markers OPG, OPN, OCN, ALP and BSP genes.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 골 질환을 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.According to certain embodiments of the present invention, the composition of the present invention can be used for improving or treating bone diseases.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 개선 또는 치료될 수 있는 골 질환은 골다공증, 소년기 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증, 골 괴사증, 구루병, 골수염, 치조골 소실, 뼈의 파젯병(Paget’s disease), 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증, 전이성(metastatic) 골 질환, 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환, 암에 의한 골 소실, 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환 및 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.According to certain embodiments of the present invention, the bone diseases that can be improved or treated by the composition of the present invention are osteoporosis, juvenile osteoporosis, bone insufficiency, osteomalacia, bone necrosis, rickets, osteomyelitis, alveolar bone loss, and Paget's disease of the bone ( Paget's disease), hypercalcemia, primary hyperparathyroidism, metastatic bone disease, myeloma, bone loss in rheumatoid arthritis, metastatic bone disease, bone loss due to cancer, fibrous bone dysplasia, aplastic bone disease, metabolic bone disease And loss of bone mass according to age, but is not limited thereto.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(i) 본 발명의 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 성장인자 활성을 나타낸다. (i) The peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention exhibits growth factor activity.

(ⅱ) 본 발명의 펩타이드는 안정성이 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다.(Ii) The peptide of the present invention has excellent stability and excellent skin permeability.

(ⅲ) 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, 성장인자의 활성이 요구되거나 억제되어야 하는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.(Iii) Therefore, the composition comprising the peptide of the present invention exhibits very excellent efficacy in treating, preventing or improving diseases or conditions in which the activity of growth factors is required or should be suppressed.

(ⅳ) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.(Iv) The excellent activity and stability of the peptide of the present invention described above makes it possible to be applied very advantageously to medicines, quasi-drugs, and cosmetics.

도 1은 본 발명의 펩타이드에 의한 각질세포의 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 펩타이드에 의한 각질세포의 사멸 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 프로-아팝토틱 단백질(pro-apoptotic protein)인 Bax 및 p-p53 단백질에 대한 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드에 의한 각질세포의 분화 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 5는 ALP(alkaline phosphatase) 염색을 통해 본 발명의 펩타이드에 의한 골 분화 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 6은 알리자딘 레드 S 염색을 통해 본 발명의 펩타이드에 의한 골 분화 촉진 효과를 보여주는 그래프 결과이다.
도 7은 RT-PCR을 통해 본 발명의 펩타이드에 의한 골 분화 촉진 효과를 보여주는 결과이다.
도 8은 본 발명에서 기술한 펩타이드의 열 안정성을 보여주는 결과이다.1 is a graph showing the effect of inhibiting the proliferation of keratinocytes by the peptide of the present invention.
2A and 2B are results showing the effect of promoting the death of keratinocytes by the peptide of the present invention.
3A and 3B are results of Western blotting for Bax and p-p53 proteins, which are pro-apoptotic proteins, respectively.
Figure 4 is a result showing the effect of promoting the differentiation of keratinocytes by the peptide of the present invention.
5 is a result showing the effect of promoting bone differentiation by the peptide of the present invention through Alkaline phosphatase (ALP) staining.
6 is a graph showing the effect of promoting bone differentiation by the peptide of the present invention through alizadine red S staining.
7 is a result showing the effect of promoting bone differentiation by the peptide of the present invention through RT-PCR.
8 is a result showing the thermal stability of the peptide described in the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for describing the present invention in more detail, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

합성예 1: Arg - Arg -Leu- Ile -Asp- Arg - Thr - Asn -Ala- Asn - Phe -Leu-Val-Met(서열목록 제1서열)의 합성Synthesis of Phe -Leu-Val-Met (SEQ ID NO: 1) - Arg - Arg -Leu- Ile -Asp- Arg - Thr - Asn -Ala- Asn: Synthesis Example 1

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Met-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Met-CTL 레진(Resin)을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Val(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Val-Met-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(pbf) 및 Fmoc-Arg(pbf) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅ 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH₂-Arg-Arg-Leu-Ile-Asp-Arg-Thr-Asn-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-Met-COOH 펩타이드 1을 0.77g 합성하였다(수율: 88.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1720(이론값 : 1719.0)를 얻을 수 있었다.700 mg of chloro trityl chloride resin (CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) was placed in a reaction vessel, and 10 ml of methylene chloride (MC) was added, followed by stirring for 3 minutes. The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added, stirred for 3 minutes, and the solvent was removed again. 10 ml of dichloromethane solution was added to the reactor, 200 mmole of Fmoc-Met-OH (Bachem, Swiss) and 400 mmole of diisopropyl ethylamine (DIEA) were added, then stirred to dissolve well, and reacted with stirring for 1 hour. After the reaction was washed, methanol and DIEA (2:1) were dissolved in DCM (dichloromethane), reacted for 10 minutes, and washed with an excess of DCM/DMF (1:1). The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added, stirred for 3 minutes, and the solvent was removed again. 10 ml of a deprotection solution (20% piperidine/DMF) was added to the reaction vessel and stirred at room temperature for 10 minutes, and then the solution was removed. After the same amount of the deprotection solution was added and the reaction was maintained for another 10 minutes, the solution was removed and washed twice with DMF, once with MC, and once with DMF for 3 minutes each to prepare Met-CTL resin. 10 ml of DMF solution was added to a new reactor, 200 mmole of Fmoc-Val (Bachem, Swiss), 200 mmole of HoBt and 200 mmole of Bop were added, followed by stirring to dissolve well. After adding 400 mmole DIEA to the reactor twice as a fraction, the mixture was stirred for at least 5 minutes until all solids were dissolved. The dissolved amino acid mixture solution was placed in a reaction vessel with a deprotected resin and reacted with stirring at room temperature for 1 hour. The reaction solution was removed, and the mixture was stirred 3 times for 5 minutes with a DMF solution, and then removed. A small amount of reaction resin was taken and the degree of reaction was checked using a Kaiser test (Nihydrin Test). Val-Met-CTL resin was prepared by performing a deprotection reaction twice in the same manner as above with a deprotection solution. After sufficiently washing with DMF and MC, performing the Kaiser test again, the following amino acid adhesion experiment was performed in the same manner as above. Based on the selected amino acid sequence, Fmoc-Leu, Fmoc-Phe, Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Ala, Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Asp (tBu), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(pbf) and Fmoc-Arg(pbf) were sequentially subjected to chain reaction. The Fmoc-protecting group was reacted twice with a deprotection solution for 10 minutes each, and then washed well and removed. After performing acetylation for an hour by adding acetic anhydride, DIEA, and HoBt, the prepared peptidyl resin was washed 3 times with DMF, MC and methanol, respectively, and dried by slowly flowing nitrogen air, and then P ₂ O ₅ Decompression solution (Trifluroacetic acid 81.5%, distilled water 5%, thioanisole 5%, phenol 5%, EDT 2.5% and TIS 1%) ] After adding 30 ml, the reaction was maintained for 2 hours by occasionally shaking at room temperature. The resin was filtered by filtering, and the resin was washed with a small amount of TFA solution and then combined with the mother liquor. After distillation using reduced pressure so that the total volume remains about half, 50 ml of cold ether was added to induce precipitation, centrifuged to collect the precipitate, and washed with cold ether twice. The mother liquor was removed and sufficiently dried under nitrogen _{to synthesize 0.77 g of NH 2} -Arg-Arg-Leu-Ile-Asp-Arg-Thr-Asn-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-Met-COOH peptide 1 before purification. (Yield: 88.9%). When measured using a molecular weight analyzer, a molecular weight of 1720 (theoretical value: 1719.0) could be obtained.

펩타이드Peptide 아미노산 서열Amino acid sequence 분석값(질량분석기)Analysis value (mass spectrometer) 분석치Analysis value 이론치Theoretical value 서열 1SEQ ID NO: 1 RRLIDRTNANFLVMRRLIDRTNANFLVM 17201720 1719.01719.0

시험예Test example 1: 합성 1: synthesis 펩타이드에Peptide 의한 각질세포의 증식 억제 효과 Keratinocyte proliferation inhibitory effect

합성예 1에서 합성된 펩타이드에 대한 성장인자의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res. 48:4266(1988))을 참조하여 HaCaT 각질세포주(한국세포주은행)에서 SRB(Sulforhodamine B) 비색법을 이용하여 합성 펩타이드에 의한 세포 성장 억제 효과를 측정하였다.In order to analyze the similar efficacy and inhibitory efficacy of the growth factor for the peptide synthesized in Synthesis Example 1, referring to the method of Rizzino et al. (Rizzino, et al. Cancer Res. 48:4266 (1988)), the HaCaT keratin cell line (Korea Cell line bank) using the SRB (Sulforhodamine B) colorimetric method was used to measure the cell growth inhibitory effect by the synthetic peptide.

HaCaT 각질세포주를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM, Gibco, 미국)에서 배양하였다. 배양된 세포주를 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 DMEM 배양액에 재현탁한 후, 48-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 5 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 24시간 뒤 표준을 잡기 위한 공 시료와 인 합성 펩타이드를 물에 멸균상태로 녹인 뒤 농도 별(0.1-50 μg/ml)로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 50 μl MTT 시약(Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue, 5 mg/ml; SIGMA, 미국)을 처리하고 4시간 동안 37℃에서 추가적으로 배양시켜 생성된 포르마잔(formazan)을 300 μl DMSO로 녹여 540 nm에서 분광광도계(spectrophotometer; Molecular devices, 미국)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(참고: 도 1).Each HaCaT keratin cell line was cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma) using a flask for tissue culture with a volume of 250 ml each. The cultured cell line was removed from the bottom of the culture vessel with a 0.25% trypsin solution, and then centrifuged to collect only the cell precipitate. This was resuspended in DMEM culture medium, and then placed in a 48-well tissue culture plate to be 5×10 ³ cells per well, and cultured under conditions of 37°C and 5% CO _{2 for 24 hours.} After 24 hours, the blank sample and the phosphorus-synthetic peptide for standardization were dissolved in water in a sterilized state, and then cultured for 72 hours at different concentrations (0.1-50 μg/ml) under the same conditions as above. After the incubation was completed, 50 μl MTT reagent (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue, 5 mg/ml; SIGMA, USA) was treated and further incubated at 37° C. for 4 hours to dissolve the produced formazan in 300 μl DMSO and 540 nm. Absorbance was measured using a spectrophotometer (Molecular devices, USA) in (Reference: FIG. 1).

도 1은 본 발명의 펩타이드 처리 후의 각질세포의 성장에 대한 효과를 보여주는 결과이다.1 is a result showing the effect on the growth of keratinocytes after the peptide treatment of the present invention.

시험예 2: 합성 펩타이드에 의한 각질세포의 사멸 촉진 효과Test Example 2: Effect of promoting keratinocyte death by synthetic peptide

합성예 1에 따라 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 각질세포 사멸 촉진 효과를 확인하기 위해, 각질세포에 대한 펩타이드의 세포 사멸 효과를 조사하였다.In order to confirm the effect of promoting keratinocyte death of the peptide of SEQ ID NO: 1 prepared according to Synthesis Example 1, the apoptosis effect of the peptide on keratinocytes was investigated.

우선, HaCaT 각질세포주를 조직 배양용 플라스크(SPL, Korea)를 이용하여 0.03 mM CaCl₂ 및 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 DMEM(Dulbecco’s modied Eagle's medium, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 세포주를 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 DMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 60-mm 조직 배양용 디쉬(SPL, Korea)에 1.5 X 10⁵ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 24시간 뒤 1% FBS를 포함하는 배지로 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료, 양성대조군(2.8 mM CaCl₂를 포함하는 고농도 칼슘 DMEM 배지 처리군) 및 본 발명의 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 1-50 μg/ml의 농도로 5일 동안 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 아넥신 V-PI 염색 키트(Annexin V-PI staining kit; BD pharmigen)을 이용하여 세포를 염색시킨 후, 유세포 측정기인 FACS(BD pharmigen)를 이용하여 FL1 및 FL2 강도를 측정하였다(참고: 도 2a). 세포 사멸 중인 아넥신 V-양성 세포의 수를 카운팅하고 초기 아팝토틱 세포의 비율을 측정하였다(참고: 도 2b). 세포 사멸 효과를 추가 확인하기 위해 위의 실험과 동일한 조건으로 처리한 세포를 얻어 프로-아팝토틱 단백질(pro-apoptotic protein)인 Bax 및 p-p53 단백질의 발현량을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다(참고: 도 3a 및 도 3b).First, using a HaCaT keratin cell line in a tissue culture flask (SPL, Korea), DMEM (Dulbecco's modied Eagle's medium, Gibco, USA) containing _{0.03 mM CaCl 2 and 10% fetal bovine serum (FBS).} ) In culture. The cultured cell line was removed from the bottom of the culture vessel with a 1% trypsin solution, and then centrifuged to collect only the cell precipitate. This was re-suspended in DMEM culture solution, and then placed in a 60-mm tissue culture dish (SPL, Korea) to be 1.5×10 ⁵ cells and cultured under conditions of 37° C. and 5% CO _{2 for 24 hours.} After 24 hours, the sample was replaced with a medium containing 1% FBS, and a blank sample for standardization, a positive control group ( _{treated with a high concentration calcium DMEM medium containing 2.8 mM CaCl 2} ), and the peptide of the present invention were sterilized in 10% distilled water. After dissolving with, it was incubated under the same conditions as above for 5 days at a concentration of 1-50 μg/ml. After the culture was completed, the culture supernatant was removed, the cultured cell lines were removed from the bottom of the culture vessel with 1% trypsin solution, and then centrifuged to collect only the cell precipitate. After staining the cells using an Annexin V-PI staining kit (BD pharmigen), FL1 and FL2 intensities were measured using a flow cytometer, FACS (BD pharmigen) (Reference: Fig. 2A ). The number of annexin V-positive cells in apoptosis was counted and the proportion of initial apoptotic cells was measured (reference: FIG. 2b). In order to further confirm the apoptosis effect, cells treated under the same conditions as in the above experiment were obtained and the expression levels of the pro-apoptotic proteins Bax and p-p53 proteins were confirmed by Western blotting (Ref. : FIGS. 3A and 3B).

시험예 1 및 시험예 2에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 각질세포의 성장을 억제하고 크게 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.As can be seen in Test Example 1 and Test Example 2, it can be seen that the peptide of the first sequence of the Sequence Listing of the present invention inhibits and greatly promotes the growth of keratinocytes.

시험예 3: 합성 펩타이드에 의한 각질세포 분화 촉진 효과Test Example 3: Effect of promoting keratinocyte differentiation by synthetic peptide

합성예 1에 따라 제조된 서열목록 제1서열의 펩타이드의 각질세포 분화 촉진 효과를 확인하기 위해, 각질세포에 대한 펩타이드의 세포 분화 촉진 효과를 조사하였다.In order to confirm the effect of promoting keratinocyte differentiation of the peptide of SEQ ID NO: 1 prepared according to Synthesis Example 1, the effect of promoting cell differentiation of the peptide on keratinocytes was investigated.

시험예 2(아넥신 V-PI 염색)와 동일한 조건으로 HaCaT 각질세포주를 배양 및 씨딩(seeding)하고 본 발명의 펩타이드를 처리하였다. 이후, 세포에 용해 완충액(0.4% SDS, 100mM NaCl, 1% Tritonx-100, 50mM Tris(pH 7.4), 1mM EDTA - Sigma)을 처리하고얼음에서 1시간 동안 반응시키고 원심분리(15,000 rpm, 20분)한다. 상등액의 단백질만을 수득하여 Bio-Red 단백질 정량 키트(bio-red protein assay kit I: 500-0001)를 이용하여 단백질 값을 정량하고 SDS-PAGE에 30 ㎍의 총 단백질을 로딩한 후 PVDF 막(Amersham)으로 옮겼다. 타겟 단백질인, 인볼루크린에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시하여 서열목록 제1서열 펩타이드의 효과를 관찰하였다.The HaCaT keratinocyte line was cultured and seeded under the same conditions as in Test Example 2 (annexin V-PI staining), and the peptide of the present invention was treated. Then, the cells were treated with a lysis buffer (0.4% SDS, 100 mM NaCl, 1% Tritonx-100, 50 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA-Sigma), reacted on ice for 1 hour, and centrifuged (15,000 rpm, 20 minutes). )do. Only the supernatant protein was obtained, the protein value was quantified using the Bio-Red protein assay kit I (500-0001), and 30 µg of total protein was loaded on SDS-PAGE, and then the PVDF membrane (Amersham ). Western blot was performed using an antibody against involukrin, which is a target protein, (Santa Cruz Biotechnology, USA) to observe the effect of the peptide of SEQ ID No. 1.

인볼루크린(involucrin)에 대한 웨스턴 블랏팅 결과, 4일 동안의 펩타이드 처리 결과, 10 μg/ml의 펩타이드 처리군에서 양성대조군(high Ca² ⁺ 처리된 배지)보다 더 높은 인볼루크린 발현양을 확인할 수 있었다(참고: 도 4).Western blotting results for involucrin, peptide treatment for 4 days, 10 μg/ml of peptide treatment group showed higher involucrin expression than ^{positive control (high Ca 2} ^{+ treated medium).} It could be confirmed (reference: Fig. 4).

시험예 4 : 제조된 펩타이드의 열 안정성Test Example 4: Thermal stability of the prepared peptide

합성예 1에서 합성된 서열목록 제1서열의 펩타이드와 NIBSC(UK)에서 구입한 표준품 PDGF-C를 0.1 mg/ml의 농도의 인산완충용액으로 제조하였다. 준비된 용액을 1 ml씩 유리 바이알에 넣은 후 37℃에서 정치하였다. 37℃에 정치된 용액을 0, 5, 10, 20, 30, 50 그리고 70일째에 샘플링하여 날자별로 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용해 정량을 하였다(참고: 도 8).The peptide of SEQ ID No. 1 synthesized in Synthesis Example 1 and the standard PDGF-C purchased from NIBSC (UK) were prepared in a phosphate buffer solution having a concentration of 0.1 mg/ml. 1 ml of the prepared solution was put into a glass vial and left to stand at 37°C. The solution allowed to stand at 37°C was sampled on days 0, 5, 10, 20, 30, 50, and 70, centrifuged by day to remove denatured peptides or proteins, and the supernatant was taken and quantified using HPLC (Reference: Fig. 8).

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조Example 1: Preparation of nano-ized peptide

상기 합성예 1에서 얻은 펩타이드 50 mg을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다. After accurately weighing 50 mg of the peptide obtained in Synthesis Example 1, it was sufficiently stirred and dissolved with 500 ml of distilled water. After mixing the mixture solution with 5 g of lecithin, 0.3 ml of sodium oleate, 50 ml of ethanol, and a little oil, adjust the amount with distilled water so that the total amount becomes 1 L, and then use a microfluidizer to high pressure. Using the emulsification to prepare nanosomes having a size of about 100 nm. The prepared nanosomes had a final concentration of about 50 ppm and were used alone or in combination for the manufacture of cosmetics.

제형예 1: 유연화장수Formulation Example 1: Softening lotion

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.A flexible cosmetic lotion comprising the peptide nanosomes prepared in Example 1 and consisting of the following composition was prepared according to a general lotion preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0010.001 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 6.06.0 글리세린glycerin 4.04.0 PEG 1500PEG 1500 1.01.0 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 1.01.0 폴리솔베이트 20Polysorbate 20 0.50.5 에탄올ethanol 8.08.0 방부제, 색소Preservatives, pigments 적량Appropriate amount 벤조페논-9Benzophenone-9 0.050.05 향incense 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예Formulation example 2: 영양크림 2: nourishing cream

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.A nutrient cream comprising the peptide nanosomes prepared in Example 1 and consisting of the following composition was prepared according to a general nutrient cream preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0010.001 메도우폼오일Meadow Foam Oil 3.03.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 1.51.5 스테아린산Stearic acid 1.51.5 글리세릴스테아레이트Glyceryl stearate 1.51.5 유동 파라핀Liquid paraffin 10.010.0 밀납Beeswax 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate60 0.60.6 솔비탄 세스퀴올레이트Sorbitan sesquioleate 2.52.5 스쿠알란Squalane 3.03.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 3.03.0 글리세린glycerin 5.05.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.50.5 토코페릴아세테이트 Tocopheryl acetate 0.5 0.5 방부제, 색소Preservatives, pigments 적량Appropriate amount 향incense 적량Appropriate amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예Formulation example 3: 영양화장수 3: nourishing lotion

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.A nutrient lotion containing the peptide nanosomes prepared in Example 1 and having the following composition was prepared according to a general lotion preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0020.002 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 4.04.0 글리세린glycerin 4.04.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 0.80.8 글리세릴스테아레이트Glyceryl stearate 1.01.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.130.13 토코페릴아세테이트Tocopheryl acetate 0.30.3 유동파라핀Floating paraffin 5.05.0 스쿠알란Squalane 3.03.0 마카다미아너트오일Macadamia Nut Oil 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate60 1.51.5 솔비탄세스퀴올레이트Sorbitansquioleate 0.50.5 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 1.01.0 방부제,색소Preservatives, pigments 적량Appropriate amount 향incense 적량Appropriate amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예Formulation example 4: 에센스 4: essence

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.An essence comprising the peptide nanosomes prepared in Example 1 and consisting of the following composition was prepared according to a general essence preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide nanosome 0.0050.005 글리세린glycerin 10.010.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 5.05.0 PEG 1500PEG 1500 2.02.0 알란토인Allantoin 0.10.1 DL-판테놀DL-panthenol 0.30.3 EDTA-2NaEDTA-2Na 0.020.02 히드록시에틸 셀룰로오스Hydroxyethyl cellulose 0.10.1 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 8.08.0 카르복시비닐폴리머Carboxyvinyl polymer 0.20.2 트리에탄올아민Triethanolamine 0.180.18 옥틸도데세스-16Octyldodeces-16 0.40.4 에탄올ethanol 6.06.0 향, 방부제, 색소Fragrance, preservative, color 적량Appropriate amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

시험예Test example 4: 합성 4: synthesis 펩타이드에Peptide 의한 골 분화 촉진 효과 Bone differentiation promoting effect

본 발명의 펩타이드가 골 분화 촉진 효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 세포 염색(ALP staining 및 alizarin red staining) 및 조골세포 분화 마커들의 발현 조사를 실시하였다.In order to confirm whether the peptide of the present invention exhibits an effect of promoting bone differentiation, the present inventors performed cell staining (ALP staining and alizarin red staining) and the expression of osteoblast differentiation markers.

4-1. ALP 염색4-1. ALP staining

MC3T3-E1 세포(ATCC, 미국)를 24-웰 플레이트에 4 X 10⁴ 세포로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이후 아스코르빈산(50 μg/ml, SIGMA) 및 β-글라이세로포스페이트(10 mM, SIGMA)를 포함하는 α-MEM(alpha modification of Eagles MEM, Gibco) 배지로 교체한 후, 펩타이드를 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 농도로 10일 동안 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP(bone morphogenetic protein)-2(Cell Signaling)는 30 ng/ml로 10일 동안 처리하였다. 상기 과정 중에 3일 마다 새로운 배지로 교체하였고, 동일 농도의 펩타이드 및 BMP-2를 처리하였다. 배양 완료 후 상기 세포들을 PBS로 2회 세척하고 고정 완충액(acetone, 37% formaldehyde, citrate solution)에서 30초 동안 고정시켰다. Leukocyte alkaline phosphatase staining kit (SIGMA)에 포함된 FBB-알칼린 용액과 소듐 나이트리트 용액(sodium nitrite solution)을 1:1로 섞어 2분 동안 처리한 후, 증류수와 나프톨(Naphthol) AS-BI 알칼린 용액으로 이루어진 완충액을 처리하여 37℃ 반응기에서 1시간 동안 발색시켰다. 그 결과, 양성대조군(BMP-2)과 유사하게도 상기 골세포의 분화가 서열목록 제1서열의 펩타이드(50 μg/ml)에 의해 증가되었다(참고: 도 5).MC3T3-E1 cells (ATCC, USA) ^{were aliquoted into a 24-well plate at 4×10 4} cells and cultured for 24 hours at 37° C. and 5% CO ₂ conditions. Then, after replacing with α-MEM (alpha modification of Eagles MEM, Gibco) medium containing ascorbic acid (50 μg/ml, SIGMA) and β-glycerophosphate (10 mM, SIGMA), 10 μg of the peptide BMP (bone morphogenetic protein)-2 (Cell Signaling) used as a positive control or treated at a concentration of /ml or 50 μg/ml for 10 days was treated at 30 ng/ml for 10 days. During the above process, a new medium was replaced every 3 days, and peptides and BMP-2 of the same concentration were treated. After completion of the culture, the cells were washed twice with PBS and fixed in a fixation buffer (acetone, 37% formaldehyde, citrate solution) for 30 seconds. Mix 1:1 of FBB-alkaline solution and sodium nitrite solution contained in Leukocyte alkaline phosphatase staining kit (SIGMA) and treat for 2 minutes, then distilled water and Naphthol AS-BI Alkaline The buffer solution consisting of the solution was treated and the color was developed in a reactor at 37° C. for 1 hour. As a result, similar to the positive control group (BMP-2), the differentiation of the bone cells was increased by the peptide (50 μg/ml) of the first sequence in the sequence listing (reference: FIG. 5).

4-2. 알리자린 레드(Alizarin Red) S 염색4-2. Alizarin Red S staining

MC3T3-E1 세포를 24-웰 플레이트에 4 X 10⁴ 세포로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 이후 아스코르빈산(50 μg/ml) 및 β-글라이세로포스페이트(10 mM)를 포함하는 α-MEM 배지로 교체한 후, 펩타이드를 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 농도로 15일 동안 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP-2는 30 ng/ml로 15일 동안 처리하였다. 상기 과정 중에 3일 마다 새로운 배지로 교체하였고, 동일 농도의 펩타이드 및 BMP-2를 처리하였다. 배양 완료 후 상기 세포들을 PBS로 2회 세척하고 70% 에탄올(SIGMA)에서 1시간 동안 고정시켰다. 40 mM 알리자린 레드 S(pH 4.2, SIGMA)로 10분 동안 염색한 후, 10 mM 소듐 포스페이트(pH 7.0)에 녹여진 10% 세틸피리디니움 클로라이드(cetylpyridinium chloride, SIGMA)를 15분 동안 처리하고 560 nm에서 분광광도계(spectrophotometer; Molecular devices, 미국)를 이용하여 흡광도를 측정하였다(참고: 도 6).MC3T3-E1 cells were aliquoted into a 24-well plate at 4×10 ⁴ cells and cultured for 24 hours at 37°C and 5% CO ₂ . Then, after replacing with α-MEM medium containing ascorbic acid (50 μg/ml) and β-glycerophosphate (10 mM), the peptide was treated at a concentration of 10 μg/ml or 50 μg/ml for 15 days. Or, BMP-2, which was used as a positive control, was treated at 30 ng/ml for 15 days. During the above process, a new medium was replaced every 3 days, and peptides and BMP-2 of the same concentration were treated. After completion of the culture, the cells were washed twice with PBS and fixed in 70% ethanol (SIGMA) for 1 hour. After staining with 40 mM Alizarin Red S (pH 4.2, SIGMA) for 10 minutes, 10% cetylpyridinium chloride (SIGMA) dissolved in 10 mM sodium phosphate (pH 7.0) was treated for 15 minutes and 560 Absorbance was measured at nm using a spectrophotometer (Molecular devices, USA) (Reference: FIG. 6).

그 결과, 서열목록 제1서열의 펩타이드(50 μg/ml)에 의해 광물화가 증가되는 것을 확인하였다.As a result, it was confirmed that mineralization was increased by the peptide (50 μg/ml) of the first sequence in Sequence Listing.

4-3. RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)4-3. RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)

MC3T3-E1 세포를 6-웰 플레이트에 1 X 10⁵ 세포로 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 이후, 펩타이드를 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 농도로 3일 동안 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP-2는 100 ng/ml로 30분 동안 분화를 유도시킨 후 OPG(osteoprotegerin), OPN(osteopontin), OCN(osteocalcin), ALP(alkaline phosphatase) 및 BSP(bone sialoprotein) 같은 조골세포 분화 마커들의 mRNA 발현 확인 실험을 진행하였다. 도 7은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 조골세포의 분화마커인 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: OPG 정방향 프라이머 서열, 5’-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3’ 및 OPG 역방향 프라이머, 5’-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3’(어닐링 온도, 60℃); OPN 정방향 프라이머 서열, 5’-GATGAATCTGACGAATCTCAC-3’ 및 OPN 역방향 프라이머, 5’ -CTGCTTAATCCTTCACTAACAC-3’(어닐링 온도, 60℃); OCN 정방향 프라이머 서열, 5’-GCGCTCTGTCTCTCTGACCT-3’및 OCN 역방향 프라이머, 5’-TTTGTAGGCGGTCTTCAAGG-3’(어닐링 온도, 60℃); ALP 정방향 프라이머 서열, 5’-CCAGCAGGTTTCTCTCTTGG-3’ 및 ALP 역방향 프라이머, 5’ -CTGGGAGRCRCATCCTGAGC-3’(어닐링 온도, 60℃); BSP 정방향 프라이머 서열, 5’-AAAGTGAAGGAAAGCGACGA-3’ 및 BSP 역방향 프라이머, 5’ -GTTCCTTCTGCACCTGCTTC-3’; 및 GAPDH 정방향 프라이머 서열, 5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3’ 및 GAPDH 역방향 프라이머, 5’ -GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’(어닐링 온도, 60℃). 양성대조군(BMP-2)과 유사하게도, 상기 유전자들의 mRNA 레벨이 서열목록 제1서열의 펩타이드에 의해 증가되는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 조골세포 분화 마커인 OPG, OPN, OCN, ALP 및 BSP의 유전자 발현을 증가시킴으로써 골 분화를 촉진시킬 수 있다.MC3T3-E1 cells were aliquoted into a 6-well plate at 1×10 ⁵ cells and cultured for 24 hours at 37°C and 5% CO ₂ conditions. Thereafter, the peptide was treated at a concentration of 10 μg/ml or 50 μg/ml for 3 days, or BMP-2 used as a positive control induces differentiation at 100 ng/ml for 30 minutes, and then OPG (osteoprotegerin), OPN ( osteopontin), OCN (osteocalcin), ALP (alkaline phosphatase), and BSP (bone sialoprotein) mRNA expression confirmation experiments were conducted. 7 is a target-specific primer sequence used for PCR, which is a differentiation marker of osteoblasts when the peptide of the present invention is treated: OPG forward primer sequence, 5'-CTGCCTGGGAAGAAGATCAG-3' and OPG reverse primer, 5 '-TTGTGAAGCTGTGCAGGAAC-3' (annealing temperature, 60°C); OPN forward primer sequence, 5'-GATGAATCTGACGAATCTCAC-3' and OPN reverse primer sequence, 5'-CTGCTTAATCCTTCACTAACAC-3' (annealing temperature, 60° C.); OCN forward primer sequence, 5'-GCGCTCTGTCTCTCTGACCT-3' and OCN reverse primer sequence, 5'-TTTGTAGGCGGTCTTCAAGG-3' (annealing temperature, 60° C.); ALP forward primer sequence, 5'-CCAGCAGGTTTCTCTCTTGG-3' and ALP reverse primer sequence, 5'-CTGGGAGRCRCATCCTGAGC-3' (annealing temperature, 60° C.); BSP forward primer sequence, 5'-AAAGTGAAGGAAAGCGACGA-3' and BSP reverse primer sequence, 5'-GTTCCTTCTGCACCTGCTTC-3'; And GAPDH forward primer sequence, 5'-GGAGCCAAAAGGGTCATCAT-3' and GAPDH reverse primer, 5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3' (annealing temperature, 60° C.). Similar to the positive control (BMP-2), it was shown that the mRNA levels of the genes were increased by the peptide of the first sequence in the sequence listing. Therefore, the peptide of the present invention can promote bone differentiation by increasing the expression of genes of the osteoblast differentiation markers OPG, OPN, OCN, ALP and BSP.

상술한 결과를 종합해 보면, 본 발명의 펩타이드는 골 분화를 현저하게 촉진시킨다는 것을 확인할 수 있다.Taking the above results together, it can be seen that the peptide of the present invention remarkably promotes bone differentiation.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above, a specific part of the present invention has been described in detail, and it is clear to those of ordinary skill in the art that this specific technology is only an embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, it will be said that the practical scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.

<110> CAREGEN Co,.LTD. <120> Peptides Having Growth Factor Activity and Uses Thereof <130> PN130666D <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Met 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Forward Primer <400> 2 ctgcctggga agaagatcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Reverse Primer <400> 3 ttgtgaagct gtgcaggaac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Forward Primer <400> 4 gatgaatctg acgaatctca c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Reverse Primer <400> 5 ctgcttaatc cttcactaac ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Forward Primer <400> 6 gcgctctgtc tctctgacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Reverse Primer <400> 7 tttgtaggcg gtcttcaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Forward Primer <400> 8 ccagcaggtt tctctcttgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Reverse Primer <400> 9 ctgggagrcr catcctgagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Forward Primer <400> 10 aaagtgaagg aaagcgacga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Reverse Primer <400> 11 gttccttctg cacctgcttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 12 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 13 gtgatggcat ggactgtggt 20 <110> CAREGEN Co,. Ltd. <120> Peptides Having Growth Factor Activity and Uses Thereof <130> PN130666D <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Arg Leu Ile Asp Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Met 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Forward Primer <400> 2 ctgcctggga agaagatcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPG Reverse Primer <400> 3 ttgtgaagct gtgcaggaac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Forward Primer <400> 4 gatgaatctg acgaatctca c 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN Reverse Primer <400> 5 ctgcttaatc cttcactaac ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Forward Primer <400> 6 gcgctctgtc tctctgacct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN Reverse Primer <400> 7 tttgtaggcg gtcttcaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Forward Primer <400> 8 ccagcaggtt tctctcttgg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP Reverse Primer <400> 9 ctgggagrcr catcctgagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Forward Primer <400> 10 aaagtgaagg aaagcgacga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSP Reverse Primer <400> 11 gttccttctg cacctgcttc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 12 ggagccaaaa gggtcatcat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 13 gtgatggcat ggactgtggt 20

Claims

A pharmaceutical composition for prevention or treatment of hyperkeratosis or bone disease comprising, as an active ingredient, a peptide comprising an amino acid sequence of the first sequence of Sequence Listing and exhibiting keratinocyte proliferation inhibitory activity and bone mineralization promoting activity,
The hyperkeratosis is selected from the group consisting of psoriasis, ichthyosis, keratoplasty, poreal keratosis, actinic keratosis, biliary keratosis and corns,
The above-mentioned bone diseases can be classified into osteoporosis, boyhood osteoporosis, osteoarthritis, osteomalacia, osteonecrosis, rickets, alveolar bone loss, Paget's disease, bone loss in rheumatoid arthritis, bone loss due to cancer, Bone loss, and loss of bone mass with age.

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the peptide has an activity of promoting differentiation of keratinocytes.

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the peptide has an activity of increasing gene expression of osteoblast differentiation markers OPG, OPN, OCN, ALP and BSP.