KR101092912B1

KR101092912B1 - Growth Factor―related Peptides and Uses Thereof

Info

Publication number: KR101092912B1
Application number: KR1020080094490A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김영덕; 김은미; 최정진
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2011-12-12
Also published as: KR20100035240A

Abstract

본 발명은 성장인자 활성을 조절하는 성장인자-관련 펩타이드 및 이를 포함하는 피부 상태 개선, 창상 치료용 조성물 및 성장인자 과발현 증후의 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 성장인자-관련 펩타이드는 천연의 인간 성장인자류와 동일한 기능 또는 억제작용을 할 수 있으며, 안정성이 천연 성장인자와 비교하여 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, 성장인자의 활성이 요구되는 질환 또는 상태를 치료, 예방 및 개선하거나 성장인자의 기능을 조절할 필요가 있는 과발현 질환에 우수한 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.The present invention relates to growth factor-related peptides that regulate growth factor activity and to improve skin conditions, compositions for treating wounds, and therapeutic agents for growth factor overexpression symptoms. Growth factor-related peptides of the present invention can have the same function or inhibitory action as natural human growth factors, have excellent stability compared to natural growth factors, and excellent skin permeability. Accordingly, the composition comprising the peptide of the present invention exhibits excellent efficacy in overexpressing diseases in which it is necessary to treat, prevent and ameliorate a disease or condition in which growth factor activity is required, or control the function of growth factor. In addition, the excellent activity and stability of the peptide of the present invention makes it possible to be very advantageously applied to medicinal, quasi-drugs and cosmetics.

인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1), 제4형 뼈 형태 발생 단백질(BMP-4), 펩타이드, 피부, 주름, 창상, 신장비대증 Insulin-like growth factor-1 (IGF-1), type 4 bone morphogenetic protein (BMP-4), peptides, skin, wrinkles, wounds, nephropathy

Description

Growth Factor-related Peptides and Uses Thereof

본 발명은 성장인자-관련 펩타이드 및 이를 포함하는 피부 상태 개선, 창상 치료용 및 성장인자 과발현 증후의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to growth factor-related peptides and compositions for improving skin conditions, treating wounds, and preventing or treating growth factor overexpression symptoms.

인간의 뇌하수체(pituitary gland)에서 분비되는 성장호르몬은 세포 성장 및 분화에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있어, 연골이나 뼈의 성장 및 발육 촉진, 근육이나 간 등의 장기 복원, 상처의 재생뿐 아니라 감염 등 면역 기능에도 영향을 미친다. 노화가 진행될수록 성장호르몬의 생산량이 점차 감소되어 60대에 이르면 20대에 비해 1/4 수준으로 떨어지는 것으로 보고되고 있어, 부족한 성장호르몬을 보충하는 항노화 호르몬 치료의 중심으로 사용되기 시작하고 있다. 아울러 성장인자의 과발현이나 부위별 이상발현의 증세에 따른 질환군도 문제로 발생되고 있다Growth hormone secreted by the human pituitary gland is known to be directly involved in cell growth and differentiation, promoting growth and development of cartilage and bone, organ restoration of muscles and liver, restoration of wounds as well as infection It also affects immune function. As aging progresses, the production of growth hormone decreases gradually, and it is reported that it reaches a level of 1/4 compared to the 20s when it is reached, and it is being used as a center of anti-aging hormone treatment to supplement the insufficient growth hormone. In addition, the disease group caused by the overexpression of growth factors or abnormal expression by region is also a problem.

성장호르몬은 세포에서 성장호르몬 수용체(growth hormone receptor)에 직접 결합하거나 인슐린-유사 성장인자 I(IGF-I: insulin-like growth factor I)의 분비를 유발하여 세포 내 신호전달물질인 야누스 키나제(JAK; Janus kinases)/전사 신호 전달제 및 활성화제(STAT; Signal Transducers and Activators of Transcription)나 마이토젠-활성화된 단백질 키나제(MAPK; mitogen-activated protein kinase), 포스파티딜-3 키나제(PI3K; phosphatidyl-3 kinase) 등을 활성화시켜 모낭 세포나 피부 내 섬유아세포의 성장을 촉진하고 bcl-2-유사(bcl-2-like) 유전자인 bcl-w를 통해 세포사멸(apoptosis)를 억제하는 것으로 판단되고 있다. 이러한 성장인자의 효능은 많은 연구자들에 의해 밝혀졌으며 그 유용도 때문에 많은 기업들이 상용화를 하고 있다.Growth hormone binds directly to growth hormone receptors in cells, or induces the secretion of insulin-like growth factor I (IGF-I), which causes intracellular signaling, Janus kinase (JAK). Janus kinases / Signal Transducers and Activators of Transcription, mitogen-activated protein kinase (MAPK), phosphatidyl-3 kinase (PI3K) It is believed that kinase promotes the growth of hair follicle cells and fibroblasts in the skin and inhibits apoptosis through bcl-2-w, a bcl-2-like gene. The efficacy of these growth factors has been revealed by many researchers, and because of their usefulness, many companies are commercializing.

또한, IGF-1은 정상적인 경우에 있어, 신장 성장에 매우 중요한 역할을 수행하지만, 당뇨 질환자 또는 한쪽 신장의 적출 시와 같은 특이 상황 하에서 신장의 비대를 일으키는 요인이 되기도 한다. 신장이 커지거나 비대해지는 만성 신장 질환을 치료하기 위하여 많은 연구자 들이 IGF-1의 기능을 억제하는 약물 등을 개발하여 이상 신장 비대를 억제하는 약물로 개발을 시도 중이다(참조: Haylor, J. et al., JB3, an IGF-1 receptor antagonist, inhibits early renal growth in diabetic and uninephrectomized rats. J. Am. Soc. Nephrol. 11:2027-2035(2000)).In addition, IGF-1 plays a very important role in renal growth in normal cases, but may also be a factor causing kidney enlargement under specific circumstances such as diabetic patients or extraction of one kidney. In order to treat chronic kidney disease in which the kidney is enlarged or enlarged, many researchers have been developing drugs that inhibit the function of IGF-1 and suppressing abnormal kidney hypertrophy (see Haylor, J. et al. , JB3, an IGF-1 receptor antagonist, inhibits early renal growth in diabetic and uninephrectomized rats.J. Am. Soc. Nephrol. 11: 2027-2035 (2000)).

골 형태발생 단백질(BMPs)은 전환 성장 인자-β (TGF-β)족 (superfamily)의 일원이다(Science 150:893-897(1965); Science 242:1528-1534(1988)). BMPs는 원래 생체 내 (in vivo)에서 골 형성을 유도할 수 있는 골 형성 단백질로 발견되었 다. 전환 성장 인자는 조직 배양에서 성장한 포유동물 세포의 표현형 전환을 유도하는 그들의 능력, 즉 전통적으로는 정상 세포로 부터 종양 세포로의 생체 내 변화에 관련된 현상에 기초하여 초기에 확인되었다. 액손 유도에서 신경돌기 성장의 자극, 뉴론 형태발생 및 이동 기능을 하는 성상 세포는 신경계에서 발견되는 글리아 세포의 일 형태이다. 성상 세포는 또한 맥관 내피의 혈뇌 관문의 유도 및 뉴론으로의 혈액 수송에 관련되어 있다. 성상 세포는 세포 골격의 중간 필라멘트 단백질인 글리아 원섬유의 산성 단백질 (GFAP), 즉 매우 특이적인 성상 세포의 마커를 발현한다. 두 가지 형태의 성상 세포가 위치 및 형태에 의하여 분류학적으로 나타내어 졌다. 원형질 성상 세포는 전형적으로 회백 질에서 발견되며, 두껍고 널리 분지된 돌기를 갖는 반면, 섬유성 성상 세포는 백질에서 발견되며, 길고 곧은 돌기를 갖는다.Bone morphogenesis proteins (BMPs) are members of the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily (Science 150: 893-897 (1965); Science 242: 1528-1534 (1988)). BMPs were originally found to be bone forming proteins that can induce bone formation in vivo. Transforming growth factors were initially identified based on their ability to induce phenotypic conversion of mammalian cells grown in tissue culture, ie traditionally associated with in vivo changes from normal cells to tumor cells. Astrocytes, which stimulate neurite growth, neuronal morphogenesis and migration in axon induction, are a form of glia cells found in the nervous system. Astrocytes are also involved in the induction of the blood-brain barrier of the vascular endothelium and blood transport to neurons. Astrocytes express the acidic protein of Glia fibrils (GFAP), the intermediate filament protein of the cytoskeleton, ie markers of highly specific astrocytes. Two types of astrocytic cells were labeled by location and morphology. Protoplasmic stellate cells are typically found in gray matter and have thick and widely branched processes, whereas fibrous stellate cells are found in white matter and have long and straight processes.

잘 알려진 BMP종은 BMP-1 내지 BMP-14이다. 이 중 BMP-2 내지 BMP-14는 뼈 형태 발생 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. BMP-2 내지 BMP-14의 BMP는 여러 가지 뼈 기능 장애 및 뼈 질환의 치료적 및 예방적 처치에 효과적인 것으로 여겨지고 있지만, 이들은 자연계에 극소량으로 존재한다.Well known BMP species are BMP-1 to BMP-14. Among them, BMP-2 to BMP-14 are known to exhibit bone morphogenesis activity. Although BMPs of BMP-2 to BMP-14 are believed to be effective in the therapeutic and prophylactic treatment of various bone dysfunctions and bone diseases, they are present in very small amounts in nature.

이러한 성장인자들을 대량으로 생산하기 위하여 많은 연구자들이 대장균 발현시스템을 이용한 재조합 단백질의 생산을 시도하고 있으나, 이 방법은 자연형의 성장인자를 얻기 위하여 재 접힘이라는 추가 공정과 시간이 요구되고, 또한 정제과정에서 대장균 유래의 오염원을 제거하기 위한 복잡한 정제 과정을 필요로 하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 일부 성장인자들의 일부분만을 고체상합성 의 방법을 이용하여 생산하여 유사기능을 얻고자 하는 시도들이 보고되었다. 예컨대, 미국 특허 제 5,473,054호에서 Jameson 등은 IGF-1의 29-38 및 61-70번의 단편을 각각 JB2와 JB1으로 명명하고 이 펩타이드 단편의 세포성장효과와 JB1의 거울상이성질체인 JB3의 IGF-1 저해효과를 보고하였다. 또한 Teruo 등은 WO 03/048192에서 IGF-1의 33-37 단편과 Substance P-유래 테트라펩타이드와 상처치유에 있어서의 상호 보완 작용에 대하여 보고하고 있다. 이외에도 Kodama 등은 Autoimmunity 37:481-487(2004)에서 IGF-1의 50-70 단편이 마우스에서 당뇨병 치료에 도움을 주는 것으로 보고하고 있다. In order to produce these growth factors in large quantities, many researchers have attempted to produce recombinant proteins using an E. coli expression system, but this method requires an additional process and time of refolding to obtain natural growth factors, and is also purified. The process requires a complex purification process to remove E. coli-derived contaminants. In order to solve this problem, attempts have been made to obtain a similar function by producing only a part of some growth factors using the method of solid phase synthesis. For example, in US Pat. No. 5,473,054, Jameson et al. Name fragments 29-38 and 61-70 of IGF-1 as JB2 and JB1, respectively, and the cell growth effects of the peptide fragment and IGF-1 of JB3, the enantiomer of JB1. Inhibitory effect was reported. Teruo et al. Also report on the complementary action of 33-37 fragment of IGF-1, Substance P-derived tetrapeptide and wound healing in WO 03/048192. In addition, Kodama et al. Reported in Autoimmunity 37: 481-487 (2004) that 50-70 fragments of IGF-1 help treat diabetes in mice.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 성장인자 중 인간의 인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1), 골 형성인자-4(BMP-4)와 동일한 기능을 하거나 또는 반대로 IGF-1의 활성을 억제할 수 있으면서도, 천연 성장인자보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 천연 성장인자의 아미노산 서열에 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 성장인자 관련 펩타이드를 합성함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have the same function as human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and bone formation factor-4 (BMP-4) among growth factors, or conversely, can inhibit the activity of IGF-1, As a result of efforts to develop materials having better activity, skin permeability and stability than growth factors, the present invention has been completed by synthesizing a plurality of growth factor-related peptides having the above-described characteristics based on the amino acid sequence of natural growth factors.

따라서, 본 발명의 목적은 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a peptide exhibiting growth factor activity.

본 발명의 다른 목적은 피부 상태의 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention to provide a composition for improving the skin condition.

본 발명의 또 다른 목적은 항증식(antiproliferative) 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide an antiproliferative composition.

본 발명의 다른 목적은 BMP-4-유효성(BMP-4-effective)의 질환 또는 상태(conditions)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a composition for the prevention or treatment of diseases or conditions of BMP-4-effective (BMP-4-effective).

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제4서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열을 포함하는 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.According to an aspect of the present invention, the present invention provides a peptide that exhibits growth factor activity comprising one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences described in SEQ ID NOS: 1 to 4.

본 발명자들은 성장인자 중 인간의 인슐린-유사 성장인자-1(IGF-1), 골 형성인자-4(BMP-4)와 동일한 기능을 하거나 또는 반대로 IGF-1의 활성을 억제할 수 있으면서도, 천연 성장인자보다 활성, 피부 투과도 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력한 결과, 천연 성장인자의 아미노산 서열에 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 성장인자 관련 펩타이드를 합성하였다.The present inventors have the same function as human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and bone formation factor-4 (BMP-4) among growth factors, or conversely, can inhibit the activity of IGF-1, As a result of efforts to develop materials having better activity, skin permeability and stability than growth factors, a number of growth factor-related peptides having the above-described characteristics were synthesized based on the amino acid sequence of natural growth factors.

본 발명의 펩타이드는 인간 성장인자-유래의 서열목록 제1서열 내지 제4서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제4서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제4서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.The peptide of the present invention comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of human growth factor-derived SEQ ID NO: 1 to 4 sequences. Preferably, the peptide in the present invention consists essentially of an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, most preferably the peptide of the present invention It consists essentially of an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of 1 to 4 sequences.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열 및 제2서열은 인간 IGF-1(insulin like growth factor-1)에서 유래되고 서열목록 제3서열 및 제4서열은 BMP-4(bone morphogenetic protein-4)로부터 유래된 것이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the first and second sequences are derived from human IGF-1 (insulin like growth factor-1) and the third and fourth sequences are BMP-4 (bone morphogenetic) protein-4).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열의 펩타이드는 천연 의 IGF-1과 동일한 활성, 보다 바람직하게는 세포성장 촉진능을 갖는다.According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide of SEQ ID NO: 1 sequence has the same activity as natural IGF-1, more preferably has the ability to promote cell growth.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제2서열의 펩타이드는 IGF-1의 과발현에 의한 영향을 감소시키는 활성을 갖는다. 즉, 서열목록 제2서열의 펩타이드는 천연 IGF-1에 의한 세포 또는 조직의 증식성(proliferative) 활성을 억제할 수 있다.According to a preferred embodiment of the invention, the peptide of SEQ ID NO: 2 sequence has the activity of reducing the effect of overexpression of IGF-1. That is, the peptide of SEQ ID NO: 2 sequence can inhibit the proliferative activity of cells or tissues by natural IGF-1.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 펩타이드는 천연의 BMP-4와 동일한 활성을 갖는다. 예를 들어, 서열목록 제3서열 및 제4서열의 펩타이드는 멜라닌 생성을 감소시키는 활성을 갖는다.According to a preferred embodiment of the invention, the peptides of SEQ ID NOs: 3 and 4 have the same activity as native BMP-4. For example, the peptides of SEQ ID NOs: 3 and 4 have activity to reduce melanin production.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.As used herein, the term "peptide" refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).Peptides of the invention can be prepared according to chemical synthesis methods known in the art, in particular solid-phase synthesis techniques (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963) Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis , 2nd.ed., Pierce Chem. Co .: Rockford, 111 (1984)).

본 발명에서 펩타이드는 표 1에 기재되어 있다.Peptides in the present invention are listed in Table 1.

성장인자의 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 예측하고, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화 하여 본 발명의 펩타이드가 제조된다. 수용체 결합가능 예상부위를 검사하여 후보 펩타이드들을 제조하고, 이들 후보 펩타이드들 중에서 가장 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 펩타이드가 제공된다.The peptide of the present invention is prepared by predicting a binding site for a receptor protein of growth factor and optimizing the amino acid sequence of this predicted site. By examining candidate receptor-binding sites, candidate peptides are prepared, and peptides of the present invention are provided by screening the peptides having the highest activity among these candidate peptides.

서열목록 제1서열 및 제2서열 펩타이드는 천연 인간 IGF-1(인슐린-유사 성장인자-1)의 수용기와 결합하여 성장인자와 같은 기능을 수행하거나 또는 성장인자의 활성을 억제하는 펩타이드이다. 서열목록 제3서열 및 제4서열 펩타이드는 골 형성 성장인자-4의 수용체와 결합을 하여 BMP-4와 유사한 역할을 수행하는 펩타이드이다.SEQ ID NO: 1 and 2 SEQ ID NO: 1 peptides are peptides that bind to receptors of native human IGF-1 (insulin-like growth factor-1) to function as growth factors or to inhibit growth factor activity. SEQ ID NO: 3 and 4 peptides are peptides that play a role similar to BMP-4 by binding to receptors of bone formation growth factor-4.

본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 성장인자보다 안정성이 우수하지만, 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH₂)로 변형되어 있다.The peptide of the present invention is superior in stability to natural growth factors by itself, but may be further improved by modification of amino acids. According to a preferred embodiment of the invention, the C-terminus of the peptide is modified with a hydroxyl group (-OH) or an amino group (-NH ₂ ).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.According to a preferred embodiment of the invention, the N-terminus of the peptide is from the group consisting of acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group and polyethylene glycol (PEG) The protecting group selected is combined.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.Modification of the above-mentioned amino acid serves to greatly improve the stability of the peptide of the present invention. The term “stability” herein means not only in vivo stability but also storage stability (eg, room temperature storage stability). The above protecting groups serve to protect the peptides of the present invention from the attack of protein cleavage enzymes in vivo.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for improving skin conditions comprising a peptide comprising the amino acid sequence of the above-mentioned first sequence listing as an active ingredient.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 성장인자-관련 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the composition of the present invention includes the growth factor-related peptide of the present invention described above as an active ingredient, common descriptions are omitted to avoid excessive complexity of the present specification.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드는 IGF-1과 유사하게 섬유아세포 및 각질세포 성장 촉진능력을 가지며 또한 콜라겐과 피브로넥틴 생성 촉진을 갖는다. 따라서 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 유효하다.As demonstrated in the following examples, the peptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention has fibroblast and keratinocyte growth promoting ability similar to IGF-1 and also has collagen and fibronectin production promotion. Therefore, the composition of the present invention is very effective for improving the skin condition.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 창상 치료, 여드름 치료, 검버섯 제거 또는 발모촉진과 같은 피부 상태 개선에 이용된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention is used to improve skin conditions such as wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging prevention, skin moisturization improvement, wound treatment, acne treatment, blotch removal or hair growth promotion.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항증식(antiproliferative) 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides an antiproliferative composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제2서열의 펩타이드는 IGF-1 성장인자의 과발현에 의한 증상의 예방 또는 치료에 이용된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide of SEQ ID NO: 2 sequence is used for the prevention or treatment of symptoms caused by overexpression of IGF-1 growth factor.

IGF-1 성장인자의 과발현에 의한 증상은 세포 또는 조직의 비정상적 증식에 의한 증상을 의미하며, 바람직하게는 신장비대증, 암, 건선, 재발협착증, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 협착증, 심근경색증 및 사구체신염을 포함하며, 가장 바 람직하게는 신장비대증(예컨대, 당뇨 또는 신장 절제술 환자들에서 나타내는 신장 비대증)이다.Symptoms due to overexpression of IGF-1 growth factor refer to symptoms due to abnormal proliferation of cells or tissues, preferably renal hypertrophy, cancer, psoriasis, restenosis, arteriosclerosis, atherosclerosis, stenosis, myocardial infarction and glomeruli Nephritis, most preferably nephropathy (eg, nephropathy in patients with diabetes or nephrectomy).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제3서열 또는 제4서열의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 BMP-4-유효성(BMP-4-effective)의 질환 또는 상태(conditions)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a disease or condition of BMP-4-effective (BMP-4-effective) comprising a peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 Provided are compositions for the prophylaxis or treatment of conditions.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, BMP-4-유효성의 질환 또는 상태는 피부 미백, 골절, 골퇴행, 골다공증, 척수 퓨젼, 척수 퇴행성 디스크 질환, 급성 또는 만성 신장 질환, 재관류에 의한 신장 손상, 의약에 의한 신장 독성, 신장 섬유증, 신성 골이영양증, 간경화증, 간 섬유증, 천식, 폐기종, 폐섬유증, 상처 치유, 암, 염증성 장 질환, 뇌졸중, 파킨슨 질환, 종양성 뇌 손상 또는 근위축성 측삭경화증이다.According to a preferred embodiment of the invention, the disease or condition of BMP-4-effectiveness is skin whitening, fracture, osteodegeneration, osteoporosis, spinal cord fusion, spinal degenerative disc disease, acute or chronic kidney disease, kidney damage by reperfusion, medicament Renal toxicity, renal fibrosis, nephrotic dystrophy, liver cirrhosis, liver fibrosis, asthma, emphysema, pulmonary fibrosis, wound healing, cancer, inflammatory bowel disease, stroke, Parkinson's disease, tumorous brain injury or amyotrophic lateral sclerosis.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the above-described peptide of the present invention; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 성장인자-관련펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the growth factor-associated peptide described above.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니 톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin , Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. It is not limited. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, or the like. Can be.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-100 ㎍이다.Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. On the other hand, the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 μg per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets, capsules, or gels (eg, hydrogels), and may further include dispersants or stabilizers. .

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 성장인자-관련 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a cosmetically effective amount of the growth factor-related peptide of the present invention described above; And (b) a cosmetically acceptable carrier.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.As used herein, the term “cosmetic effective amount” means an amount sufficient to achieve the skin improving efficacy of the composition of the present invention described above.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.The cosmetic composition of the present invention may be prepared in any form conventionally produced in the art and may be in the form of a solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant- , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it can be manufactured in the form of a soft lotion, a nutritional lotion, a nutritional cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a cleansing cream, a cleansing foam, a cleansing water, a pack, a spray or a powder.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, trachants, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicas, talc or zinc oxide may be used as carrier components. Can be.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.In the case where the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component. Especially, in the case of a spray, a mixture of chlorofluorohydrocarbons, propane / Propane or dimethyl ether.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.When the formulation of the present invention is a solution or an emulsion, a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a suspension, liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol, suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, microcrystals Soluble cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.When the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing, the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide. Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters and the like can be used.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.The components included in the cosmetic composition of the present invention include components conventionally used in cosmetic compositions, in addition to the peptide and carrier components as active ingredients, and include, for example, conventional agents such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. Adjuvants may be included.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(ⅰ) 본 발명의 성장인자-관련 펩타이드는 천연의 인간 성장인자와 동일하거나 또는 억제하는 기능을 할 수 있다.(Iii) The growth factor-related peptide of the present invention may function to be the same as or inhibit the natural human growth factor.

(ⅱ) 본 발명의 펩타이드는 안정성이 천연 성장인자와 비교하여 매우 우수하며, 피부 투과도가 매우 우수하다.(Ii) The peptides of the present invention have very good stability compared to natural growth factors, and have excellent skin permeability.

(ⅲ) 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은, 성장인자의 활성이 요구되거나 억제되어야 하는 질환 또는 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.(Iii) Thus, a composition comprising the peptide of the present invention exhibits very good efficacy in treating, preventing or ameliorating a disease or condition in which the activity of the growth factor is required or should be inhibited.

(ⅳ) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은, 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.(Iii) The excellent activity and stability of the peptides of the present invention described above make it possible to be very advantageously applied to medicines, quasi-drugs and cosmetics.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

합성예 1: Asp-Ser-Asp-Phe-Tyr-Thr-Leu-Ile-Ser-Asn-Leu-Met(서열목록 제1서열)의 합성Synthesis Example 1 Synthesis of Asp-Ser-Asp-Phe-Tyr-Thr-Leu-Ile-Ser-Asn-Leu-Met (SEQ ID NO: 1)

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Met-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Met-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Leu(tBu)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Leu-Met-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Asn(trt), Fmoc-Ser(tbu), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Thr(tbu), Fmoc-Tyr(tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Asp(tBu), Fmoc-Ser(tBu), 및 Fmoc-Asp(tBu) 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Asp-Ser-Asp-Phe-Tyr-Thr-Leu-Ile-Ser-Asn-Leu-Met 펩타이드 1을 1.37 g 합성하였다(수율: 82.6%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1419.2(이론값 : 1418.6)를 얻 을 수 있었다. 700 mg of chloro trityl chloride resin (CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) was added to a reaction vessel, and 10 ml of methylene chloride (MC) was added thereto, followed by stirring for 3 minutes. The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added thereto, stirred for 3 minutes, and then the solvent was removed again. 10 ml of dichloromethane solution was added to the reactor, 200 mmole of Fmoc-Met-OH (Bachem, Swiss) and 400 mmole of diisopropyl ethylamine (DIEA) were added thereto, stirred to dissolve well, and reacted with stirring for 1 hour. After the reaction, the mixture was washed with methanol and DIEA (2: 1) in dichloromethane (DCM) for 10 minutes and washed with excess DCM / DMF (1: 1). The solution was removed, 10 ml of dimethylformamide (DMF) was added thereto, stirred for 3 minutes, and then the solvent was removed again. 10 ml of deprotection solution (20% of piperidine / DMF) was added to the reaction vessel and stirred at room temperature for 10 minutes to remove the solution. After adding the same amount of deprotection solution and maintaining the reaction again for 10 minutes, the solution was removed and washed 3 times with DMF, once with MC, once with DMF for 3 minutes each to prepare Met-CTL Resin. 10 ml of DMF solution was added to a new reactor, 200 mmole of Fmoc-Leu (tBu) -OH (Bachem, Swiss), 200 mmole of HoBt, and 200 mmole of Bop were stirred, and then dissolved. 400 mmole DIEA was added to the reactor twice in fractions and stirred for at least 5 minutes until all solids dissolved. The dissolved amino acid mixture solution was placed in a reaction vessel with deprotected resin and reacted with stirring at room temperature for 1 hour. The reaction solution was removed and stirred with a DMF solution three times for 5 minutes and then removed. A small amount of the reaction resin was taken and the degree of reaction was checked using a Nihydrin Test. Leu-Met-CTL Resin was prepared by the same deprotection reaction twice as the deprotection solution. After sufficient washing with DMF and MC, once again Kaiser test was performed, and the following amino acid attachment experiment was performed as above. Fmoc-Asn (trt), Fmoc-Ser (tbu), Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Thr (tbu), Fmoc-Tyr (tBu), Fmoc-Phe, Fmoc-Asp based on selected amino acid sequences (tBu), Fmoc-Ser (tBu), and Fmoc-Asp (tBu) were sequentially chained. The Fmoc-protector was reacted twice with a deprotection solution twice for 10 minutes and then washed well. Acetylation of acetic anhydride, DIEA, and HoBt was carried out for one hour, and then the prepared peptidyl resin was washed three times with DMF, MC, and methanol, and dried slowly with nitrogen air, followed by vacuum under P ₂ O ₅ . After drying completely under reduced pressure, 30 ml of fugitive solution (Trifluroacetic acid 81.5%, distilled water 5%, Thianisole 5%, Phenol 5%, EDT 2.5%, and TIS 1%) 30 ml After the addition, the reaction was kept shaking at room temperature for 2 hours. The resin was filtered off and the resin was washed with a small amount of TFA solution and then combined with the mother liquor. Distillation was carried out using reduced pressure to half the total volume and 50 ml of cold ether was added to induce precipitation, followed by centrifugation to collect the precipitate and washing with two more cold ethers. The mother liquor was removed and dried sufficiently under nitrogen to synthesize 1.37 g of Asp-Ser-Asp-Phe-Tyr-Thr-Leu-Ile-Ser-Asn-Leu-Met peptide 1 prior to purification (yield: 82.6%). Molecular weight 1419.2 (theoretical value: 1418.6) was obtained when the molecular weight was measured.

합성예 2: 다른 펩타이드들의 합성Synthesis Example 2 Synthesis of Other Peptides

상기 합성예 1과 동일한 방법으로 합성하되, 아미노산은 서열에 부합되는 아미노산을 사용하여 서열목록 제2서열 내지 제4서열의 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드 제2서열(Asp-Pro-Phe-Tyr-Ser-Met-Leu-Gln-Arg-Leu-Ala-His: DPFYSMLQRLAH), 펩타이드 제3서열(Cys-Leu-Ala-Lys-His-Pro-Ser-His-Phe-Leu-Arg-Pro : CLAKHPSHFLRP), 펩타이드 제4서열(Tyr-Leu-Asp-Glu-Asn-Glu-Lys-Val-Val-Leu-Lys-Asn : YLDENEKVVLKN)에 해당하는 것이다. 각 합성된 펩타이드의 HPLC 그림은 도 1a-1d에 기재하였다. 아울러 합성된 펩타이드들에 대한 분자량 측정기 측정값은 다음 표 1과 같다:Synthesis was carried out in the same manner as in Synthesis Example 1, wherein amino acids were synthesized peptides of SEQ ID NOs: 2 to 4 using amino acids conforming to the sequence. Peptide second sequence (Asp-Pro-Phe-Tyr-Ser-Met-Leu-Gln-Arg-Leu-Ala-His: DPFYSMLQRLAH ), peptide third sequence (Cys-Leu-Ala-Lys-His-Pro-Ser -His-Phe-Leu-Arg-Pro: CLAKHPSHFLRP ), peptide 4 (Tyr-Leu-Asp-Glu-Asn-Glu-Lys-Val-Val-Leu-Lys-Asn: YLDENEKVVLKN ). HPLC plots of each synthesized peptide are shown in FIGS. 1A-1D. In addition, the molecular weight measurement values for the synthesized peptides are shown in Table 1 below:

펩타이드Peptide 아미노산 서열Amino acid sequence 분석값(질량분석기)Analytical Values (Mass Spectrometer) 분석치Analytical value 이론치Theoretical value 서열 1SEQ ID NO: 1 DSDFYTLISNLMDSDFYTLISNLM 1419.21419.2 1418.61418.6 서열 2SEQ ID NO: 2 DPFYSMLQRLAHDPFYSMLQRLAH 1467.91467.9 1477.71477.7 서열 3SEQ ID NO: 3 CLAKHPSHFLRPCLAKHPSHFLRP 1406.41406.4 1405.71405.7 서열 4SEQ ID NO: 4 YLDENEKVVLKNYLDENEKVVLKN 1464.71464.7 1463.71463.7

시험예 1: 합성 펩타이드를 활용한 세포 성장효과의 확인Test Example 1 Identification of Cell Growth Effect Using Synthetic Peptides

합성예 1 및 2에서 합성된 펩타이드들에 대한 성장인자의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res. 48:4266(1988))을 참조하여 HaCaT 각질세포주와 NIH3T3 섬유아세포에서 SRB(Sulforhodamine B) 비색법을 이용하여 합성 펩타이드에 의한 세포 성장효과를 측정하였다.In order to analyze the similar and inhibitory effects of growth factors on the peptides synthesized in Synthesis Examples 1 and 2, the HaCaT keratin was referred to by the method of Rizino et al. (Rizzino, et al. Cancer Res. 48: 4266 (1988)). The cell growth effect of the synthetic peptide was measured by SRB (Sulforhodamine B) colorimetric method in cell lines and NIH3T3 fibroblasts.

HaCaT 각질세포주(한국세포주은행) 및 NIH3T3 섬유아세포(한국세포주은행)를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 Eagle's minimal essential media(EMEM, Gibco, USA)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 0.25% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS 부재 EMEM 배양액에 재현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 4 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 7% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기 위한 공 시료와 사람의 인슐린-유사 성장인자-1(NIBSC, UK) 그리고 합성 펩타이드를 물과 10% DMSO에 멸균상태로 녹인 뒤 10 ng과 1,000 ng의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 1회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 PBS로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.Eagle's minimal essential containing 10% fetal bovine serum (Sigma) using HaCaT keratinocyte cells (Korea Cell Line Bank) and NIH3T3 fibroblasts (Korea Cell Line Bank) each using a 250 ml tissue culture flask. The cells were cultured in media (EMEM, Gibco, USA). Cultured cell lines were removed from the bottom of the culture vessel with 0.25% trypsin solution and centrifuged to collect only cell precipitates. After resuspending in FBS-free EMEM culture, the plate was put into 96-well tissue culture plate to 4 X 10 ³ cells per well and incubated at 37 ℃, 7% CO ₂ conditions for 24 hours. After 24 hours, the medium was changed to the same culture except for serum, and the blank sample, human insulin-like growth factor-1 (NIBSC, UK), and synthetic peptides were sterilely dissolved in water and 10% DMSO for standardization. Then 72 hours at 10 ng and 1,000 ng concentration were incubated under the same conditions. After the incubation was completed, the culture supernatant was removed and washed once with PBS (phosphate buffer saline). After removing the washing solution, treated with a colorless SRB solution, washed sufficiently with PBS, and observed the cells under a microscope to observe the state of the viable cells, the absorbance was measured at ultraviolet light 590 nm to measure the viability of the cells.

도 2은 펩타이드 처리 후의 각질세포 및 섬유아세포의 성장에 대한 결과가 나타나 있으며, 도 3에는 세포에 펩타이드 처리 후 72시간 뒤 세포의 생존상태를 현미경으로 관찰하여 각질세포 및 섬유아세포의 성장을 확인하였다.Figure 2 shows the results of the growth of keratinocytes and fibroblasts after the peptide treatment, Figure 3 shows the growth of keratinocytes and fibroblasts by observing the survival state of the cells 72 hours after peptide treatment on the cells. .

도 2에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 서열 1 펩타이드는 각질세포와 섬유아세포의 성장을 크게 증진시켰다.As can be seen in Figure 2, the sequence 1 peptide of the present invention greatly enhanced the growth of keratinocytes and fibroblasts.

하지만, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 펩타이드들은 큰 성장 효과가 없었다. 또한, 도 3에서 본 발명의 서열 1 펩타이드가 각질세포 및 섬유아세포의 성장을 크게 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.However, the peptides of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 had no significant growth effect. In addition, in Figure 3 it can be seen that the SEQ ID NO: 1 peptide of the present invention greatly promotes the growth of keratinocytes and fibroblasts.

시험예 2: 합성 펩타이드의 콜라겐 및 피브로넥틴 생성 촉진 효과 분석Test Example 2: Analysis of collagen and fibronectin production promoting effect of the synthetic peptide

48시간을 배양한 HaCaT 세포에 합성예 1 및 2에서 합성한 펩타이드들을 처리하고 72시간 경과 후, 피부주름개선의 표지인 프로콜라겐 및 피브로넥틴의 농도를 측정하였다. 농도 측정은 Procollagen ELISA 키트(Takara, Japan) 및 Fibronectin ELISA 키트(CHEMICON, USA)를 이용하여 실시하였다. 본 발명의 서열 1 펩타이드의 경우 섬유아세포의 프로콜라겐 생성을 증가시켰다(도 4a). 또한, 서열 1 펩타이드는 섬유아세포의 피브로넥틴 생성을 증가시켰다(도 4b).After 48 hours of treatment with the peptides synthesized in Synthesis Examples 1 and 2 in HaCaT cells cultured for 48 hours, the concentrations of procollagen and fibronectin, which are markers of skin wrinkle improvement, were measured. Concentration measurements were performed using a Procollagen ELISA kit (Takara, Japan) and Fibronectin ELISA kit (CHEMICON, USA). The sequence 1 peptide of the present invention increased the procollagen production of fibroblasts (FIG. 4A). In addition, the SEQ ID NO 1 peptide increased fibronectin production in fibroblasts (FIG. 4B).

시험예 1 및 2의 실험 결과를 종합하면, 본 발명의 서열 1 펩타이드는 매우 우수한 피부개선 효능을 발휘한다는 것을 알 수 있다.Combining the experimental results of Test Examples 1 and 2, it can be seen that the sequence 1 peptide of the present invention exhibits very good skin improvement efficacy.

시험예 3: 합성 펩타이드류의 멜라닌색소의 감소Test Example 3 Reduction of Melanin Pigment in Synthetic Peptides

합성예 1 및 2에서 합성한 4개의 펩타이드와 BMP-4 성장인자의 멜라닌색소 감소효과를 측정하기 위해 C57BL/6 마우스의 멜라노사이트를 배양한 뒤 α-MSH(-melanocyte stimulating hormone, Sigma)로 멜라닌 생성을 유발시킨 뒤, 펩타이드를 농도별로 처리한 뒤 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였다. 마우스의 멜라노사이트는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1 X 10⁵세포/웰(cells/well)의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리 하지 않고 용매만 넣었으며, 양성대조군은 α-MSH를 200 ㎍/ml, 그리고 나머지 디쉬에는 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4 펩타이드를 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬는 시험물질을 가한 뒤 3일 동안 배양하였다. 여기서 시험물질은 각각의 성분을 배지 용매에 용해시킨 후, 프로필렌글리콜:에탄올:정제수의 비율이 5:3:2인 혼합용매에 용해시켜 시험농도로 희석되고 동일한 비율로 혼합된 것이다. 원심분리를 통해 배양액을 제거한 뒤 세포의 멜라닌 생성량을 육안으로 확인할 수 있었으며, 그 중 10 ㎍/ml 농도의 처리군에 대한 결과가 도 5에 나타나 있다. 도 5에서 확인할 수 있듯이, α-MSH를 넣은 군에서는 멜라닌 생성이 급격히 높아졌으나, 펩타이드 서열 3 및 서열 4를 처리한 군에서는 α-MSH를 처리하지 않았을 때와 유사한 멜라닌 생성을 나타내었으며 천연 BMP-4의 경우보다 저해 효과가 더욱 좋았다(서열 1 및 서열 2는 α-MSH의 경우와 같이 나와 결과에서는 기술하지 않았다). 이는 피부에 멜라닌의 생성을 유발시키는 요인이 적용되었을 때 서열 3 및 서열 4 펩타이드가 그 활성을 억제해 피부의 톤을 밝게 할 수 있다는 것을 의미한다.In order to measure the melanin reduction effect of the four peptides synthesized in Synthesis Examples 1 and 2 and BMP-4 growth factor, the melanocytes of C57BL / 6 mice were incubated and melanin with α-MSH (-melanocyte stimulating hormone, Sigma). After inducing production, the peptide was treated by concentration, and then the melanin production inhibitory effect was measured. Melanosite of mice was incubated at 37 ° C. and 5% CO ₂ with medium containing 10% fetal bovine serum (Sigma) in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma). After incubating the cells at a concentration of 1 X 10 ⁵ cells / well in a 24-well plate and confirming cell adhesion, the control group was treated with nothing but only the solvent, and the positive control group received α-MSH 200. Μg / ml and the remaining dishes were treated with the concentrations of 1 μg / ml and 10 μg / ml of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 peptides. Each dish was incubated for 3 days after adding test substance. In this case, the test substance is dissolved in each of the components in a medium solvent, and then dissolved in a mixed solvent having a propylene glycol: ethanol: purified water ratio of 5: 3: 2, diluted to a test concentration, and mixed in the same ratio. After removing the culture medium by centrifugation, it was possible to visually check the melanin production of the cells, and the results of the treatment group of 10 ㎍ / ml concentration is shown in FIG. As can be seen in Figure 5, in the group containing α-MSH, the melanin production was sharply increased, but in the group treated with peptide sequence 3 and 4, the melanin production was similar to that without treatment with α-MSH, and natural BMP- The inhibitory effect was better than that of 4 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are the same as in the case of α-MSH and not described in the results). This means that when a factor causing melanin production is applied to the skin, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 peptides can inhibit the activity to brighten the tone of the skin.

보다 정밀히 실험하기 위해 세포를 PBS로 세척한 후 1 N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400 nm에서 흡광도를 측정하였고, 멜라닌 생성 억제율을 계산하여(Dooley의 방법) 도 6에 나타내었다. 도 6의 결과는 도 5의 결과와 일치 된다.For more precise experiments, the cells were washed with PBS, the cells were dissolved with 1 N sodium hydroxide, and the absorbance was measured at 400 nm. The melanin production inhibition rate was calculated (Dooley's method) and is shown in FIG. 6. The result of FIG. 6 is consistent with the result of FIG. 5.

시험예 4 : 펩타이드류의 타이로시나제의 활성감소Test Example 4: Deactivation of Tyrosinase in Peptides

합성예 1 및 2에서 합성한 4개의 펩타이드와 BMP-4 성장인자의 미백활성을 검증하기 위하여 멜라닌 생성인자인 α-MSH를 처리한 뒤의 멜라닌 생성 억제능을 조사하였다. 1 X 10⁵개의 B16F10 세포(한국세포주은행)를 접종하여 3일을 배양하였다. 세포가 정착된 뒤에 2% 혈청으로 배지를 교환하면서, 음성대조군에는 아무런 처리를 하지 않았으며 양성대조군에는 α-MSH를 200 ng/ml의 농도로 처리 하였다. 나머지 다른 디쉬에는 α-MSH 200 ㎍/ml과 함께 합성예 1과 2에서 제조한 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4 펩타이드를 각각 1 ㎍/ml와 10 ㎍/ml의 농도로 각각 처리하였다. 4일 배양 후 세포의 모습을 관찰한 뒤 세포를 수집하여 라이시스 완충액으로 처리하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 BCA (bicinchonic acid) 방법으로 정량한 뒤 각 군별로 90 ㎕의 단백질용액에 10 ㎕의 L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, Sigma)를 넣고 37℃에서 30분간 반응한 뒤, 405 nm 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 타이로시나제의 활성을 측정하였다(도 7).In order to verify the whitening activity of the four peptides synthesized in Synthesis Examples 1 and 2 and BMP-4 growth factor, melanin production inhibitory ability after treatment with α-MSH, a melanogenesis factor, was investigated. Three days were cultured by inoculating 1 X 10 ⁵ B16F10 cells (Korea Cell Line Bank). After the cells were settled, the medium was replaced with 2% serum, and the negative control group was not treated. The positive control group was treated with α-MSH at a concentration of 200 ng / ml. The other dishes were treated with 200 μg / ml of α-MSH and the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 prepared in Synthesis Examples 1 and 2, respectively, at concentrations of 1 μg / ml and 10 μg / ml, respectively. . After culturing for 4 days, the cells were collected and the cells were collected and treated with lysis buffer to extract proteins. The extracted protein was quantified by BCA (bicinchonic acid) method, and 10 μl of L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, Sigma) was added to 90 μl of protein solution for each group, followed by reaction at 37 ° C. for 30 minutes. Absorbance was measured on a 405 nm spectrophotometer to determine the activity of tyrosinase (FIG. 7).

도 7에서 볼 수 있듯이, α-MSH만을 넣은 군에서는 타이로시나제의 활성이 강화되었으나, 펩타이드 서열 3에 의해서 30% 이상 감소하였다. 놀랍게도, 서열 4 펩타이드는 타이로시나제의 활성을 음성대조군과 유사한 수준으로 억제하는 것을 알 수 있었다. 펩타이드 양에 대하여 상조되는 수치로 나타내었다. 이는 피부 등에 타이로시나제의 활성을 높이는 요인이 적용되었을 때 본 발명의 서열 3 및 서열 4 펩타이드가 BMP-4와 동일하게 활성을 억제해 피부의 톤을 밝게 할 수 있다는 것과, 본 발명의 서열 3 및 서열 4 펩타이드는 형질전환성장인자와 같은 활성 기전을 보이고 있는 것으로 판단되며, 서열 4 펩타이드의 경우, 완벽한 멜라닌 합성 억제 및 타이로신 카이네이즈 활성 억제를 보인다. 이는 천연 TGF보다 훨씬 우수한 것으로 판단된다.As shown in FIG. 7, in the group containing only α-MSH, tyrosinase activity was enhanced, but was reduced by more than 30% by peptide sequence 3. Surprisingly, the sequence 4 peptide was found to inhibit tyrosinase activity to a similar level as the negative control. It is shown as a numerical value that is complimentary to the amount of peptide. This means that when the factor for increasing the activity of tyrosinase is applied to the skin and the like, the sequence 3 and the sequence 4 peptides of the present invention can inhibit the activity similarly to BMP-4 to brighten the tone of the skin. 3 and SEQ ID NO: 4 peptides are believed to exhibit the same mechanism of activity as the transforming growth factor, and SEQ ID NO: 4 peptides show complete melanin synthesis inhibition and tyrosine kinase activity inhibition. It is believed to be much better than natural TGF.

시험예 5 : 펩타이드류의 멜라닌 생성 표지인자들의 억제실험Test Example 5 Inhibition Experiment of Melanin Marker Markers of Peptides

α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성이 유발된 마우스 흑색종 세포에서 BMP-4 유사 서열 3 및 서열 4 펩타이드의 미백활성을 보다 확실하게 검증하기 위하여, 멜라노좀 유도실험과 역전사 중합효소 연쇄반응을 실시하였다.In order to more reliably verify the whitening activity of BMP-4-like SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 peptides in mouse melanoma cells treated with α-MSH, melanosomal induction experiments and reverse transcriptase polymerase chain reaction were performed. .

우선, 멜라노좀 유도실험은 6-웰의 세포배양접시에 1 X 10⁵개의 B16F10 세포를 접종하여 3일을 배양하였다. 세포가 정착된 뒤에 2% 혈청으로 배지를 교환하면서, 대조군에는 용매만을, 양성대조군은 α-MSH를 200 ㎍/ml로 넣어 주었으며, 나머지 디쉬에는 α-MSH 200 ㎍/ml과 서열 3 및 서열 4 펩타이드를 10 ㎍/ml 농도로 처리하였다. 4일 배양하고 현미경을 통하여 세포의 형태를 관찰하였다. α-MSH에 의해 유도된 멜라노좀이 서열 3 및 서열 4 펩타이드에 의해 사라지는 것을 볼 수 있었다.First, melanosome induction experiments were inoculated with 1 X 10 ⁵ B16F10 cells in a 6-well cell culture dish and cultured for 3 days. After the cells had settled, the medium was exchanged with 2% serum, and the control group added only solvent and the positive control group contained 200 μg / ml of α-MSH, and the remaining dishes contained 200 μg / ml of α-MSH and SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 Peptides were treated at a concentration of 10 μg / ml. The cells were cultured for 4 days and the morphology of the cells was observed through a microscope. Melanosomes induced by α-MSH were seen to disappear by the SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 peptides.

이어, 대조군, α-MSH 및 α-MSH과 서열 4번을 처리한 배양세포로부터 mRNA를 추출하여 타이로시나제, TRP1 및 TRP2의 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: Tyrosinase; F-primer(전방향), 5`-AGGACCTGCCAGTGCTCTGG-3`, R-primer(역방향), 5`-CTCCTCCAATCGGCTACAGAC-3`; TRP1; F-primer, 5`-GACAGACCGCTGTGGCTCAT-3`; R-primer, 5`-CTCCAGACGCAGGAGGTGGTA-3`; TRP2; F-primer, 5`-GCATGACGGTGGACAGCCTAGT-3`; R-primer, 5`-GTGTGGTGATCACGTAGTCGG-3`이었다.Subsequently, mRNA was extracted from cultured cells treated with the control group, α-MSH and α-MSH, and SEQ ID NO: 4, and reverse transcription polymerase chain reaction was performed using primers of tyrosinase, TRP1 and TRP2. Primer sequences are as follows: Tyrosinase; F-primer (forward), 5`-AGGACCTGCCAGTGCTCTGG-3`, R-primer (reverse), 5`-CTCCTCCAATCGGCTACAGAC-3`; TRP1; F-primer, 5′-GACAGACCGCTGTGGCTCAT-3 ′; R-primer, 5′-CTCCAGACGCAGGAGGTGGTA-3 ′; TRP2; F-primer, 5′-GCATGACGGTGGACAGCCTAGT-3 ′; R-primer, 5`-GTGTGGTGATCACGTAGTCGG-3`.

실험 결과, 서열 4 펩타이드는 BMP-4와 같이 멜라닌 생성과 관계가 있는 유전자인 타이로시나제, TRP1 및 TRP2의 발현을 억제한다는 것을 알 수 있었다(도 8). As a result, the sequence 4 peptide was found to inhibit the expression of tyrosinase, TRP1 and TRP2, genes related to melanin production, such as BMP-4 (FIG. 8).

시험예 6: 제조된 펩타이드의 열 안정성Test Example 6: Thermal Stability of Prepared Peptides

합성예 1 및 2를 통해 제조된 4가지 펩타이드와 NIBSC (UK)에서 구입한 표준폼 성장인자(IGF-1, BMP-4)를 0.11 mg/ml의 농도의 인산완충용액으로 제조하였다. 준비된 용액을 1 ml씩 유리 바이알에 넣은 후 37℃에서 정치하였다. 37℃에 정치된 용액을 0, 5, 10, 20, 30, 40, 그리고 70일째에 샘플링한 후 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용하여 정량하였다.(도 9) 합성 펩타이드의 경우 천연의 성장인자들보다 잔존량이 높았으며, 이를 시료로 삼아 시험예 1과 동일한 방법으로 세포에 처리한 뒤, MTT 방법(Scudiero, D. A., et al. Cancer Res. 48:4827-4833(1988))을 사용하여 잔존해 있는 활성을 측정함으로써 펩타이드의 열 안정성을 분석하여 모든 경우 성장인자류보다 보다 활성도가 더 높았음을 알 수 있었다.Four peptides prepared through Synthesis Examples 1 and 2 and standard foam growth factors (IGF-1, BMP-4) purchased from NIBSC (UK) were prepared in a phosphate buffer solution at a concentration of 0.11 mg / ml. The prepared solution was placed in a glass vial of 1 ml each and left at 37 ° C. The solution, which was left at 37 ° C., was sampled at 0, 5, 10, 20, 30, 40, and 70 days, and then centrifuged to remove denatured peptides or proteins, and the supernatant was taken and quantified using HPLC. 9) In the case of synthetic peptides, the residual amount was higher than that of natural growth factors, and the samples were treated with cells in the same manner as in Test Example 1, followed by MTT method (Scudiero, DA, et al. Cancer Res. 48: 4827). -4833 (1988)) was used to measure the residual activity of the peptides, which showed that the activity was higher than the growth factor in all cases.

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조Example 1: Preparation of Nanonized Peptides

상기 합성예에서 얻은 펩타이드 4종을 50 mg을 각 각 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml로 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 그리고 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 총량이 1 L가 되도록 증류수로 양을 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다. 50 mg of each of the four peptides obtained in the above synthesis example was accurately weighed, and then sufficiently dissolved in 500 ml of distilled water and dissolved. The blend solution is mixed with 5 g of lecithin, 0.3 ml of sodium oleate, 50 ml of ethanol and a little oil phase, then the amount is adjusted to 1 L with distilled water and then with a microfluidizer. Emulsification using a high pressure to prepare a nanosome of size 100 nm. The prepared nanosomes were used for cosmetic preparation alone or in combination with a final concentration of about 50 ppm.

제형예 1: 유연화장수Formulation Example 1: Softening Longevity

상기 실시예 1에서 제조된 4종의 펩타이드 나노좀 중 적어도 한 종류의 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.At least one kind of nanosomes of the four peptide nanosomes prepared in Example 1 was prepared, and a flexible lotion having the following composition was prepared according to a general lotion preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide Nanosomes 0.0010.001 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 6.06.0 글리세린glycerin 4.04.0 PEG 1500PEG 1500 1.01.0 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 1.01.0 폴리솔베이트 20Polysorbate 20 0.50.5 에탄올ethanol 8.08.0 방부제, 색소Preservative, pigment 적량Quantity 벤조페논-9Benzophenone-9 0.050.05 향incense 미량a very small amount 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예 2: 영양크림Formulation Example 2: Nutrition Cream

상기 실시예 1에서 제조된 4종의 펩타이드 나노좀 중 적어도 한 종류의 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조방법에 따라 제조하였다.At least one kind of nanosomes of the four peptide nanosomes prepared in Example 1, the nutrition cream consisting of the following composition was prepared according to the general nutrition cream manufacturing method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide Nanosomes 0.0010.001 메도우폼오일Meadowfoam oil 3.03.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 1.51.5 스테아린산Stearic acid 1.51.5 글리세릴스테아레이트Glyceryl Stearate 1.51.5 유동 파라핀Floating paraffin 10.010.0 밀납Beeswax 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate 60 0.60.6 솔비탄 세스퀴올레이트Solbitan Sesquioleate 2.52.5 스쿠알란Squalane 3.03.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 3.03.0 글리세린glycerin 5.05.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.50.5 토코페릴아세테이트 Tocopheryl acetate 0.5 0.5 방부제, 색소Preservative, pigment 적량Quantity 향incense 적량Quantity 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예 3: 영양화장수Formulation Example 3: Nutrients

상기 실시예 1에서 제조된 4종의 펩타이드 나노좀 중 적어도 한 종류의 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.At least one kind of nanosomes of the four peptide nanosomes prepared in Example 1, and the nutrient lotion consisting of the following composition was prepared according to a general lotion manufacturing method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide Nanosomes 0.0020.002 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 4.04.0 글리세린glycerin 4.04.0 세테아릴알콜Cetearyl alcohol 0.80.8 글리세릴스테아레이트Glyceryl Stearate 1.01.0 트리에탄올아민Triethanolamine 0.130.13 토코페릴아세테이트Tocopheryl acetate 0.30.3 유동파라핀Liquid paraffin 5.05.0 스쿠알란Squalane 3.03.0 마카다미아너트오일Macadamia Nut Oil 2.02.0 폴리솔베이트60Polysorbate 60 1.51.5 솔비탄세스퀴올레이트Sorbitan sesquioleate 0.50.5 카르복시비닐폴리머Carboxy Vinyl Polymer 1.01.0 방부제,색소Preservative, pigment 적량Quantity 향incense 적량Quantity 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

제형예 4: 에센스Formulation Example 4: Essence

상기 실시예 1에서 제조된 4종의 펩타이드 나노좀 중 적어도 한 종류의 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.At least one kind of nanosomes of the four peptide nanosomes prepared in Example 1 was prepared, and an essence consisting of the following composition was prepared according to a general essence preparation method.

성분ingredient 함량(중량%)Content (% by weight) 펩타이드 나노좀Peptide Nanosomes 0.0050.005 글리세린glycerin 10.010.0 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 5.05.0 PEG 1500PEG 1500 2.02.0 알란토인Allantoin 0.10.1 DL-판테놀DL-Panthenol 0.30.3 EDTA-2NaEDTA-2Na 0.020.02 히드록시에틸 셀룰로오스Hydroxyethylcellulose 0.10.1 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 8.08.0 카르복시비닐폴리머Carboxy Vinyl Polymer 0.20.2 트리에탄올아민Triethanolamine 0.180.18 옥틸도데세스-16Octyldodec-16 0.40.4 에탄올ethanol 6.06.0 향, 방부제, 색소Incense, preservative, coloring 적량Quantity 정제수Purified water 잔량Balance 합계Sum 100100

실시예 2: 서열 4번 펩타이드의 모발 생장 관련 억제 효과 분석Example 2: Analysis of hair growth related inhibitory effect of SEQ ID NO: 4

실시 예에서 합성한 서열 4번 펩타이드의 BMP-4 성장인자의 모발 생장 억제 효과를 분석하기 위해 생쥐(C57BL/6, 중앙실험동물, 한국)의 등 부위 털을 제모크림을 이용하여 제모한 뒤 마우스의 등 윗부분에는 1 ㎍/㎕ 농도의 서열 4 펩타이드를 10 ㎕, 그리고 등 하부에는 대조군으로 PBS 10 ㎕를 각각 0일, 2일 및 4일째 투여하고 10일 후에 모발 생장을 관찰하였다. 그림 10에서 볼 수 있듯이, 생쥐에서 서열 4 펩타이드에 의한 모발 성장 억제 효과를 확인하였다.In order to analyze the hair growth inhibitory effect of the BMP-4 growth factor of the peptide sequence 4 synthesized in the Example, the hair of the back of the mouse (C57BL / 6, a central laboratory animal, Korea) was depilated using hair removal cream. 10 μl of the sequence 4 peptide at a concentration of 1 μg / μl was applied to the upper part of the back, and 10 μl of PBS was administered to the lower part of the back, respectively, on days 0, 2, and 4, and hair growth was observed after 10 days. As shown in Fig. 10, the effect of inhibiting hair growth by the sequence 4 peptide was confirmed in mice.

실시예 3: 제조된 펩타이드 나노좀의 동물모델에서의 IGF-1 억제 효과Example 3: IGF-1 Inhibitory Effects in Animal Models of Prepared Peptide Nanosomes

8주령이 된 쥐(SD, 중앙실험동물, 한국)들을 4 그룹으로 나눈 뒤 5일간 실험실 안정기를 거쳤다. 두 개의 그룹을 선정하여 각 서열 1 및 서열 2 펩타이드 나노좀을 3일 동안 하루 10 씩 피하 주사하였다. 전 그룹의 쥐를 구강을 통해 튜브를 삽관 한 뒤 할로테인(halothane)을 투여하여 전신 마취시켰다. 마취된 쥐는 수술대에 고정한 뒤 그 중 펩타이드를 처리하지 않은 모조실험은 우측면을 절개한 뒤 다시 봉합하였으며, 나머지 3그룹은 수술대에 고정한 뒤 오른쪽 신장을 측면 절개를 통해 노출시킨 뒤, 신장을 적출하였다. 적출된 신장의 무게를 측정하고 다시 봉합하여 정상식이로 11일간 사육하였다. 11일간 대조군은 살린(Saline)을, 서열 1 및 서열 2군은 각 해당 펩타이드를 10 씩 피하 주사하였다. 신장 적출 11일째, 실험쥐들을 할로테인 마취 상태에서 도살한 다음 나머지 신장을 적출하였다. 적출된 신장들의 무게 측정을 통해 서열 1 및 서열 2 펩타이드의 효능을 검사하였다. 도 11와 같이 서열 2 펩타이드는 IGF-1의 과발현으로 인한 신장의 비대를 약 15% 정도 감소시키는 것으로 관찰 되어 IGF-1 과발현 증후의 치료 등에 활용이 가능할 것으로 사료된다. 나머지 서열 1 펩타이드는 신장의 비대와는 아무 영향이 없었다.Rats who were 8 weeks old (SD, CB, Korea) were divided into 4 groups and passed through a lab ballast for 5 days. Two groups were selected to inject each SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 peptide nanosomes subcutaneously 10 times per day for 3 days. All groups of rats were intubated via the oral cavity, followed by general anesthesia by administering halotane. The anesthetized rats were fixed on the operating table, and after the imitation experiment without the peptides, the right side was incised and then sutured again. The kidneys were weighed, sutured, and reared for 11 days in a normal diet. For 11 days, the control group was injected with Saline, and the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 groups were subcutaneously injected with 10 of each corresponding peptide. Kidney Extraction On day 11, mice were slaughtered under halotanes anesthesia and the rest of the kidneys were removed. The efficacy of the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 peptides was examined by weighing the isolated kidneys. As shown in FIG. 11, the sequence 2 peptide was observed to reduce the hypertrophy of the kidney due to overexpression of IGF-1 by about 15%, and thus may be used for the treatment of IGF-1 overexpression symptoms. The remaining SEQ ID NO 1 peptide had no effect on renal hypertrophy.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

도 1a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1 서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.Figure 1a is a graph showing the results of high performance liquid chromatography analysis of the peptide of SEQ ID NO: 1 prepared by the synthesis example of the present invention.

도 1b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 2 서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.Figure 1b is a graph showing the results of high performance liquid chromatography analysis of the peptide of SEQ ID NO: 2 sequence prepared by the synthesis example of the present invention.

도 1c는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 3 서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.Figure 1c is a graph showing the results of high performance liquid chromatography analysis of the peptide of SEQ ID NO: 3 sequence prepared by the synthesis example of the present invention.

도 1d는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 4 서열의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.Figure 1d is a graph showing the results of high performance liquid chromatography analysis of the peptide of SEQ ID NO: 4 sequence prepared by the synthesis example of the present invention.

도 2a는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 펩타이드 1-4를 처리한 각질세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.Figure 2a is a graph showing the cell growth promoting effect of keratinocytes treated with peptides 1-4 prepared by the synthesis example of the present invention.

도 2b는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 펩타이드 1-4를 처리한 섬유아세포의 세포성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.Figure 2b is a graph showing the cell growth promoting effect of the fibroblasts treated with peptides 1-4 prepared by the synthesis example of the present invention.

도 3는 본 발명의 펩타이드 1-4를 처리한 각질세포 및 섬유아세포의 세포성장 촉진 효과를 현미경으로 확인한 사진이다.Figure 3 is a photograph confirming the effect of the cell growth promotion of keratinocytes and fibroblasts treated with peptides 1-4 of the present invention under a microscope.

도 4a는 본 발명의 펩타이드 1-4가 처리된 섬유아세포에서의 증가된 콜라겐 생성량을 나타낸 그래프이다.4A is a graph showing increased collagen production in fibroblasts treated with peptides 1-4 of the present invention.

도 4b는 본 발명의 펩타이드 1-4가 처리된 섬유아세포에서의 증가된 피브로넥틴 생성량을 나타낸 그래프이다.4B is a graph showing increased fibronectin production in fibroblasts treated with peptides 1-4 of the present invention.

도 5은 α-MSH로 처리한 B16 흑색종 세포에서 본 발명의 실시예에 의하여 제 조된 펩타이드류를 처리한 후의 멜라닌 세포의 멜라닌 생성 감소효과를 비교한 실험결과이다.5 is an experimental result comparing melanin production reduction effect of melanocytes after treatment with the peptides prepared according to the embodiment of the present invention in B16 melanoma cells treated with α-MSH.

도 6는 α-MSH로 처리한 B16 흑색종 세포에서 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 펩타이드류를 처리한 후의 멜라닌 생성 감소를 UV로 측정한 실험이다.Figure 6 is an experiment measuring the reduction in melanin production after treatment of the peptides prepared according to the embodiment of the present invention in B16 melanoma cells treated with α-MSH by UV.

도 7은 α-MSH로 처리한 B16 흑색종 세포에서 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 펩타이드류를 처리한 후의 타이로시나제의 활성을 측정한 그림이다. Figure 7 is a figure measuring the activity of tyrosinase after treatment of the peptides prepared according to the embodiment of the present invention in B16 melanoma cells treated with α-MSH.

도 8은 α-MSH로 처리한 B16 흑색종 세포에서 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 서열 4 펩타이드에 의한 멜라닌 생성 표지인자의 감소효과를 증명하는 역전사 중합효소 연쇄반응 실험결과이다.8 is a result of reverse transcriptase polymerase chain reaction experiment demonstrating the effect of reducing the melanogenesis marker by the sequence 4 peptide prepared according to the present invention in B16 melanoma cells treated with α-MSH.

도 9은 본 발명의 펩타이드의 열안정성을 비교한 그래프이다.9 is a graph comparing the thermal stability of the peptide of the present invention.

도 10은 본 발명의 펩타이드를 처리한 마우스 등 피부의 모발성장 억제효과를 나타낸다.Figure 10 shows the hair growth inhibitory effect of the skin, such as a mouse treated with the peptide of the present invention.

도 11는 본 발명의 펩타이드 서열 1 및 서열 2 나노좀의 신장 비대증 완화에 대한 실험 결과이다.11 is an experimental result of renal hypertrophy of the peptide sequence 1 and sequence 2 nanosomes of the present invention.

<110> Caregen, Co. Ltd. <120> Growth Factor-related Peptides and Uses Thereof <130> PN080411 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1-derived peptide 1 <400> 1 Asp Ser Asp Phe Tyr Thr Leu Ile Ser Asn Leu Met 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1-derived peptide 2 <400> 2 Asp Pro Phe Tyr Ser Met Leu Gln Arg Leu Ala His 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-4-derived peptide 1 <400> 3 Cys Leu Ala Lys His Pro Ser His Phe Leu Arg Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-4-derived peptide 2 <400> 4 Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn 1 5 10 <110> Caregen, Co. Ltd. <120> Growth Factor-related Peptides and Uses Thereof <130> PN080411 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1-derived peptide 1 <400> 1 Asp Ser Asp Phe Tyr Thr Leu Ile Ser Asn Leu Met 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1-derived peptide 2 <400> 2 Asp Pro Phe Tyr Ser Met Leu Gln Arg Leu Ala His 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-4-derived peptide 1 <400> 3 Cys Leu Ala Lys His Pro Ser His Phe Leu Arg Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-4-derived peptide 2 <400> 4 Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn 1 5 10

Claims

Peptides exhibiting growth factor activity consisting of one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 1 to 4 sequences.

The method of claim 1, wherein the first and second sequences are derived from human IGF-1 (insulin like growth factor-1) and the third and fourth sequences are BMP-4 (bone morphogenetic protein- Peptide, characterized in that derived from 4).

[Claim 2] The peptide of claim 1, wherein the peptide of SEQ ID NO: 1 has a cell growth promoting ability.

[Claim 2] The peptide of claim 1, wherein the peptide of SEQ ID NO: 2 has an activity of reducing the effect of overexpression of IGF-1.

The peptide of claim 1, wherein the peptides of the third and fourth sequences of the sequence listing have an activity of reducing melanogenesis.

Composition for improving skin conditions comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of the first sequence of the sequence list as an active ingredient.

The method of claim 6, wherein the improvement of the skin condition is wrinkle improvement, skin elasticity improvement, skin aging prevention, skin moisturization improvement, wound treatment, acne treatment, mushroom removal or hair growth promoting composition.

Antiproliferative composition comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence as an active ingredient.

The composition of claim 8, wherein the composition is used for the prevention or treatment of nephropathy, cancer, psoriasis, restenosis, arteriosclerosis, atherosclerosis, stenosis, myocardial infarction or glomerulonephritis.

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Skin whitening, fracture, osteodegeneration, osteoporosis, spinal cord fusion, spinal cord degenerative disc disease, acute or chronic kidney disease, kidney damage due to reperfusion, comprising peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NO: 3 or 4 Of kidney renal toxicity, renal fibrosis, nephrotic dystrophy, cirrhosis, liver fibrosis, asthma, emphysema, pulmonary fibrosis, wound healing, cancer, inflammatory bowel disease, stroke, Parkinson's disease, tumorous brain injury or muscular dystrophy Prophylactic or therapeutic composition.

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