KR20150130064A - 지황 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용, 피부 항상성 유지용, 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한, 지황 추출물은 피부에서 스테롤 조절인자 결합 단백질의 합성을 촉진한다.

Description

지황 추출물을 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING THE REHMANNIA ROOT EXTRACT}

본 발명은 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용, 피부 항상성 유지용, 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한, 지황 추출물은 피부에서 스테롤 조절인자 결합 단백질(sterol regulatory element-binding proteins, 이하 ‘SREBP-1c’라 한다)의 합성을 촉진한다.

피부 장벽은 피부의 가장 바깥쪽을 감싸는 매우 얇은 각질층을 의미한다. 각질층은 각질세포와 피지막 성분이 함께 쌓여 피부를 보호해주는 중요한 구조이다. 각질세포간 지질은 콜레스테롤, 세라마이드, 자유지방산으로 이루어져 있고 이 성분들이 시멘트처럼 각질세포들을 촘촘하게 하여 피부장벽을 견고하게 해준다. 각질세포간 지질이 피부장벽 기능에서 가장 중요한 역할을 담당하고, 피지막은 피부의 표면을 덮고 있으면서 경계를 담당한다. 피지는 세균이나 곰팡이로부터 피부를 보호해주고, 먼지, 메이크업 잔여물이나 유해물질을 흡착한 다음 피부에서 분리해줌으로써 피부를 보호해준다. 또한 각질층의 수분을 유지시켜주고 항산화 물질을 공급하는 역할도 한다. 피지막은 각질층 안에 스며들어 있기 때문에, 각질층 표면에서 벗겨져 떨어지는 각질세포를 서로 붙게 하여 여분의 각질조각이 벗겨지지 않도록 하고 매끄러움을 유지해 준다.

그러나 외부 환경 변화 등으로 인한 피부 내의 여러 변화에 의해 피부 장벽이 손상을 입게 되고, 이에 따라 피부 염증, 건조증, 가려움증 등이 발생할 수 있다. 따라서 피부 장벽을 강화함으로써 피부에 발생하는 다양한 트러블들을 개선해 줄 수 있으며 최근 들어 이에 대해 활발한 연구가 진행되고 있지만 피부 장벽을 개선해 주는 원료들은 현재까지 많이 보고되어 있지 않다.

한국 등록특허 제10-1310110호는 숙지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 항주름 및 미백용 조성물에 관한 것이고, 한국 등록특허 제10-1010744호는 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 각질 제거용 조성물에 관한 것이다. 이 특허들은 콜라게나제와 티로시나제의 활성을 억제함으로써 나타나는 효과를 기술한 것이며, 지황 추출물이 스테롤 조절인자 결합 단백질의 발현을 촉진함으로써 나타나는 효과에 대해서는 알려지지 않았다.

본 발명은 지황 추출물을 연구하여, 지황 추출물이 피부에서 스테롤 조절인자 결합 단백질의 합성을 촉진하여 콜레스테롤, 스쿠알렌, 세라마이드 또는 트리글리세라이드의 함량을 증가시키는 것을 밝혀내었다. 이에 따라, 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용, 피부 항상성 유지용, 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 항상성 유지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 지황 추출물은 스테롤 조절인자 결합 단백질(SREBP-1c)의 생합성을 촉진한다.

바람직하게는, 상기 지황 추출물은 스테롤 조절인자 결합 단백질의 생합성을 촉진하여 콜레스테롤, 스쿠알렌, 세라마이드 또는 트리글리세라이드의 함량을 증가시킨다.

또한, 본 발명은 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 화장료 조성물 중 지황 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 40.0 중량% 함유된다.

상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는다.

또한, 본 발명은 지황 추출물을 이용하여 피부에서 스테롤 조절인자 결합 단백질(SREBP-1c)의 생합성을 촉진하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 지황 추출물은 SREBP-1c 증가(실험예 2), 지질 생성량 증가(실험예 3), 콜레스테롤 발현량(실험예 4) 및 스쿠알렌 발현량 증가(실험예 5)에 효과적이다. 또한, 이러한 지황 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 보습효과(실험예 6), 세라마이드 발현량 증가(실험예 7) 및 피부 장벽기능 강화 효과(실험예 8)가 우수하다.

도 1은 웨스턴 블랏팅을 이용하여 SREBP-1c가 발현되는 것을 나타낸다.

지황 추출물이 피부에서 지질생합성과 관련된 스테롤 조절인자 결합 단백질(sterol regulatory element-binding proteins, 이하 ‘SREBP-1c’라 한다)의 생합성을 촉진시키고, 또한 지질을 구성하는 콜레스테롤, 스쿠알렌 및 세라마이드를 증가시키는 것을 확인하였다. 따라서, 지황 추출물이 SREBP-1c 생합성 증가를 유도하여 피부 항상성을 유지하고 피부장벽을 강화하는 효과를 달성할 수 있다.

본 발명의 지황 추출물은 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다.

본 발명에서는 바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용하였다.

본 발명에서 지황 추출물은 다양한 추출용매, 예를 들어, 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출 용매를 사용하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다.

한편, 본 발명의 상기 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 지황 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의해 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결 건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205).

이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다.

지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다.

본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다.

이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다.

또한 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다.

초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 하기 특정 제조예를 참조하여 지황 추출물의 제조방법을 설명하면 다음과 같다: 지황을 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 그 건조 중량의 1-10배의 저급알코올을 가한다. 일정온도에서 일정기간 추출하고 여과한 후, 회전 감압증발기로 건조한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 지황 추출물은 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 40.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 0.001 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 유효한 효과가 나타나지 않으며, 40.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 비하여 개선 효과 증대 정도가 미미하고, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

따라서, 이러한 지황 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 SREBP-1c 발현량 증가, 지질 생성량 증가, 콜레스테롤 발현량 증가 및 스쿠알렌 발현량을 증가시켜 피부 항상성을 유지하는 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 성분은 상기 유효 성분 이외에 피부 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1: 지황 추출물 제조

본 발명에서 사용한 지황 추출물의 제조방법은 다음과 같다.

지황 추출물을 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 그 건조 중량의 1-10배의 70% 저급알코올을 가한다. 15-35℃에서 5일간 추출한 후 300메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 감압 농축기(Vacuum rotary evaporator)를 이용하여 각각 농축하였다. 농축된 것을 다시 1,3 부틸렌 글리콜 용액 30%에 1%(w/v)되게 녹여서 각 시료를 만든 후 본 발명의 실험에 적용하였다.

실험예 1: 세포 배양

실험에 사용한 세포는 SZ95 피지세포로 다음과 같은 방법으로 배양하였다.

사람의 피지세포주인 SZ95 세포는 독일 베를린 자유대학의 대학의학센터 벤자민 프랭크린(The Free University of Berlin University Medical center Benjamin Franklin)의 Dr. Zouboulis로부터 분양받은 Human immortalized sebocyte(SZ95) 세포를 10% FBS가 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)/F12(1:1)을 사용하여 CO₂ 배양기(37℃,5% CO₂)에서 배양하였다. 그리고 48시간 주기로 배양액을 교체하면서 배양하였다.

실험예 2: 지황 추출물에 의한 SREBP -1c 발현량 측정

실험예 1에서 배양된 피지세포에 대하여 다음과 같은 방법으로 SREBP-1c 단백질 발현량을 측정하였다. 발현량 측정은 웨스턴 블라팅(Western Blotting)을 통한 단백질 발현양 측정방법을 이용하였다.

먼저, 배양한 피지세포에 지황 추출물(10 μg/ml 및 100 μg/ml)과 인슐린 10 μg/ml를 각각 처리하고 추가로 48시간 더 배양하였다. 이후 배지 제거와 세척을 진행하고 여기에 라이시스 완충액 200㎕로 용해시킨 후 4℃, 13,000rpm에서 5분간 원심 분리 후 상층액을 모았다. 세포 용해액(lysate)에 함유된 단백질의 양은 브래드퍼드(Bradford) 법으로 측정하였다. 50㎕의 단백질을 12% 폴리아크릴아마이드를 함유한 SDS-PAGE로 분리하고 80V에서 1시간 30분 동안 PVDF 막으로 일렉트로블라팅(electro blotting)을 실시하였다. 이어 PVDF 막을 5% 탈지유(skim milk)-함유 TBST 완충용액에서 1시간동안 방치한 뒤, 1차 항체(primary antibody)-함유 TBST 완충용액에서 4℃, 하룻밤 동안 두었다. 다시 TBST 완충용액으로 세 번 세척한 뒤 2차 항체(secondary antibody)-함유 TBST 완충용액에서 상온, 2시간동안 반응시킨 뒤 TBST 완충용액으로 세 번 세척하고 ECL kit(Amersham-Pharmacia)를 이용해서 형광발광하고, BioRad chemiDoc을 이용하여 정량화 하였다.

각각의 시험 값의 밴드 강도를 읽어서 대조군 대비 함량증가를 백분율로 변환하여 표 1에 나타내었다.

피지세포에서의 웨스턴 블라팅(Western Blotting) SREBP-1c 발현양

	농도 (μg/ml)	SREBP-1c (%)
지황 추출물	10	173.5
지황 추출물	100	201.5
인슐린	10	151.3

도 1은 웨스턴 블랏팅을 이용하여 SREBP-1c가 발현되는 것을 나타낸다.

지황 추출물을 농도별(10 μg/ml, 100 μg/ml)로 처리하고 48시간 배양한 후 SREBP-1c 단백질 발현을 조사한 결과 농도의존적인 단백질 발현 증가를 보여주었다. 양성 대조군인 인슐린(10 μg/ml)도 SREBP-1c의 발현을 증가시켰다.

실험예 3: 지황 추출물에 의한 지질 생성량 측정

Oil red O staining을 통하여 지질 생성량을 측정하였다.

실험예 1에서 피지세포를 12웰에 배양하고 지황 추출물(10 μg/ml 및 100 μg/ml)과 인슐린 10 μg/ml를 각각 처리하고 추가로 48시간 더 배양하였다. 상기 각 웰을 PBS로 세척 후, 4% 포름알데하이드로 1시간 처리하였다. 처리 후 0.8% Oil red O 용액으로 1시간 동안 염색하였다. 염색된 피지세포를 현미경으로 관찰한 결과 지질 생성량 증가를 확인할 수 있었다.

실험예 4: 지황 추출물에 의한 콜레스테롤량 측정

실험예 1에서 배양한 피지 세포를 10 cm 배양용기에 1 X 10⁵ 개씩 분주하고 지황 추출물을 각각 1, 10, 50, 100 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 5일간 배양하여 콜레스테롤를 정량하였다. 콜레스테롤 정량 방법은 상기 5일간 배양된 세포에 라이시스 완충액(EDTA 10 μL, 100mM SPB 용액, PMSF 1 μL, Triton X-100 10 μL)을 처리하고 초음파로 분해하였다. 세포 용해액에 클로로포름:메탄올 (2:1) 용액을 첨가하고 혼합한 다음, 원심분리(2000 rpm, 15분)하여 하층액을 취하여 질소가스(N₂)로 농축시켰다.

상기 농축된 시료에 에탄올 300 μL를 넣어 녹인 후 total cholesterol kit(AM 202-K)를 이용하여 콜레스테롤의 양을 측정하였다. 1 mL의 효소 시액에 100 μL의 시료를 첨가하고 혼합하여 37℃에서 5분 동안 배양 후 500 nm의 파장에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 표준액의 콜레스테롤은 3 mL의 효소시액에 20uL의 표준액을 넣어 3 mg/mL 값으로 하였다.

측정된 콜레스테롤의 양을 표 2에 나타내었다. 표 2를 보면, 대조군의 경우 0.74 mg/ml인데 비해, 지황 추출물 10 μg/ml 이상 처리한 군들의 콜레스테롤량이 보다 증가한 것을 알 수 있었다.

		콜레스테롤 (ml/ml protein)
대조군		0.74
지황 추출물 (μg/ml)	1	0.68
	10	0.88
	50	1.02
	100	1.29

실험예 5: 지황 추출물에 의한 스쿠알렌 함량 측정

실험예 1에서 배양한 피지 세포를 10 cm 배양용기에 1 X 10⁵ 개씩 분주하고 지황 추출물을 각각 1, 10, 50, 100 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 5 일간 배양하고 콜레스테롤 함량을 정량하였다. 스쿠알렌 정량 방법은 상기 5일간 배양된 세포에 라이시스 완충액(EDTA 10uL, 100mM SPB 용액, PMSF 1uL, Triton X-100 10uL)을 처리하고 초음파로 분해하였다. 세포용해액에 클로로포름:메탄올 (2:1) 용액을 첨가하고 혼합하여 원심분리기(2000 rpm, 15분)하여 하층액을 취하여 질소가스(N₂)로 농축시켰다.

상기 농축된 시료에 에탄올 300 μl를 넣어 녹인 후 Triglycerides kit(GPO-PAP)를 이용하여 스쿠알렌 함량을 측정하였다. 1mL의 효소시액에 100 μL의 시료를 첨가하고 혼합하여 37℃에서 5분 동안 배양 후 546nm의 파장에서 ElISA Reader로 흡광도를 측정하였다. 표준액의 스쿠알렌은 3mL의 효소시액에 20 μl의 표준액을 넣어 3 mg/ml 값으로 하였다.

		스쿠알렌 (ml/ml protein)
대조군		1.18
지황 추출물 (μg/ml)	1	1.37
	10	1.46
	50	1.78
	100	2.03

표 3의 결과에서도 알 수 있듯이, 대조군에 비해 지황 추출물이 함유된 모든 실험군이 대조군에 비해 스쿠알렌 함량이 증가한 것을 확인할 수 있다.

제형예 1: 지황 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조

하기의 표 4와 같이, 본 발명에 따른 지황 추출물(제조예 1)을 포함하는 제형예 1과 비교제형예를 제조하였다. 비교제형예 1은 보습제로서 글리세린 및 솔비톨을 포함하는 조성물이고, 비교제형예 2는 추출물이나 보습제를 모두 포함하지 않는 조성물이다.

성분 (단위: 중량%)	제형예 1	비교 제형예1	비교 제형예2
지황추출물 (제조예 1)	2	-	-
글리세린	-	2	-
솔비톨	-	2	-
EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02
정제수	to 100	to 100	to 100
세토스테아릴알코올	2.0	2.0	2.0
글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5
마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7
스쿠알렌	5.0	5.0	5.0
유동파라핀	3.0	3.0	3.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0
폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2
솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5
토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2
사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0
BHT	0.05	0.05	0.05
향,방부제	적량	적량	적량

실험예 6: 지황 추출물을 함유하는 화장료의 보습 효과

세포간 지질이 생성되어 증가되면, 피부의 항상성, 면역력 및 보습력도 증가한다. 지황 추출물의 보습효과를 확인하기 위하여, 상기 제형예 및 비교제형예 1 내지 2의 조성물에 대한 임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다.

설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 60 명을 무작위로 20 명씩 3개 그룹(A, B 및 C)으로 나눈 후, A 그룹에는 제형예 1의 조성물을, B 그룹에는 비교제형예 1의 조성물을 C 그룹에는 비교제형예 2의 조성물을 각각 1일 2회씩 4주간 얼굴에 사용하도록 하였다. 보습 효과는 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 실험 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

지황 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습 효과

구분	사용전	사용 2주 후	사용 4주 후
제형예 1	48.6	63.4	67.5
비교제형예 1	49.3	55.2	60.5
비교제형예 2	47.5	52.3	51.9

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 비교제형예 1 및 비교제형예 2에 비하여 본 발명의 지황 추출물 함유한 조성물(제형예 1)의 보습효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 지황 추출물을 함유하는 화장료의 세라마이드 함량 증가

실험예 6에서 실험을 실시한 피험자들의 피부 각질 시료를 테잎 방법(tape method)를 이용하여 시료를 채취하고 세라마이드 함량을 측정하였다. 테잎 방법으로 적출된 시료의 단위 단백질당 세라마이드의 함량을 구하였으며 단백질의 함량은 BSA 단백질 분석 키트로 구하였다.

세라마이드 분석을 위해 UPLC-MS는 Waters사 Aquity UPLC 시스템과 연결된 Quattro Premier XE MS 모델을 사용하였다.

<분석조건>

컬럼 Acquity BEH C*(2.1 mm X 50 mm, 1.7um)

이동상 5mM 암모늄 포메이트/메탄올(4:6, 0.1% 포름산)

유속: 0.3 ml/min

컬럼 온도: 40℃

<MS 분석조건>

이온화조건-ESI 양이온 모드

공급원 온도-130 ℃

탈용매화온도-350℃

콘 가스 유소 800 L/h

모세관 전압-3.2 Kv

이온 모니터 MRM

세라마이드	제형예 1(ng/mg)	비교제형예 2(ng/mg)
C16 세라마이드	123.7	83.7
C18 세라마이드	124.5	81.1
C24 세라마이드	176.8	129.4

표 6에 나타난 바와 같이, 제형예 1과 비교제형예 2를 비교하였을 때, 시험결과 단위 단백질당 세라마이드 3종의 함량이 증가한 것을 확인하였다.

실험예 8: 지황 추출물의 피부 장벽 기능 강화 효과

세포간 지질이 생성되어 증가되면, 피부의 항상성, 면역력, 보습력뿐 아니라, 피부 장벽 기능도 증가한다. 지황 추출물의 피부 장벽 기능 강화 효과를 확인하기 위하여, 상기 제형예, 비교제형예의 조성물에 대한 피부 장벽 증진 효과를 다음과 같이 측정하였다. 건강한 성인 남녀 40 명을 무작위로 20 명씩 2개 그룹 (A, B)으로 나눈 후, 소듐 라우릴 설페이트(SLS :Sodium Lauryl Sulfate) 0.5% 수용액을 이용하여 피부 장벽 손상을 유발하였다. 피부 장벽 손상 유발 후 A그룹에는 제형예 1의 조성물을, B 그룹에는 지황 추출물이 전혀 들어가지 않은 베이스 비교제형예 2를 각각 1일 2회씩 적용하였다. 피부 장벽 증진 효과는 시험 시작 후부터 매일 측정하면서 피부 장벽 강화 효과를 TEWAmeter TM 300 (Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 실험 결과는 하기 표 7에 나타내었다.

지황 추출물을 함유하는 화장료의 피부 장벽 손상 회복률

구분	제형예 1	비교제형예 2
1D	51.3%	30.2%
2D	63.8%	46.3%
3D	65.6%	46.6%
6D	84.4%	64.4%
7D	86.9%	65.8%
8D	91.9%	75.1%
9D	93.8%	74.4%
10D	96.3%	79.2%

상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 비교제형예 2와 비교하여 본 발명의 지황 추출물 함유한 제형예 1의 피부 장벽 강화 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화용 화장료 조성물.
2. 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 항상성 유지용 화장료 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 지황 추출물은 스테롤 조절인자 결합 단백질(SREBP-1c)의 생합성을 촉진하는, 화장료 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 지황 추출물은 스테롤 조절인자 결합 단백질의 생합성을 촉진하여 콜레스테롤, 스쿠알렌, 세라마이드 또는 트리글리세라이드의 함량을 증가시키는, 화장료 조성물.
5. 지황 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물.
6. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 지황 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 40.0 중량% 함유되는, 화장료 조성물.
7. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말파운데이션, 유탁액파운데이션, 왁스파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것인, 화장료 조성물.
8. 지황 추출물을 이용하여 피부에서 스테롤 조절인자 결합 단백질(SREBP-1c)의 생합성을 촉진하는 방법.

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