KR20150127809A - 초고압 처리 콩나물 당 침지 추출물을 함유하는 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물, 및 간보호용 건강기능식품 - Google Patents

초고압 처리 콩나물 당 침지 추출물을 함유하는 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물, 및 간보호용 건강기능식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초고압 처리 콩나물의 당 침지 추출물을 유효성분으로 하는 간보호용 건강기능식품, 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물 및 초고압 처리 콩나물의 추출방법에 관한 것으로, 본 발명의 초고압 처리 콩나물의 당 침지 추출물은 통상의 콩나물 추출물이나 콩나물즙에 비하여 아스파라긴이 현저히 많이 추출되고, 동시에 이소플라본 함량, 특히 흡수가 용이한 비배당체 이소플라본의 추출량이 높고, HepG2 세포에서 과산화수소에 의한 간손상 억제 활성이 뛰어나다.

Description

초고압 처리 콩나물 당 침지 추출물을 함유하는 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물, 및 간보호용 건강기능식품{A pharmaceutical composition for treating and preventing liver demage and a functional food for protecting liver comprising the soybean sprout sugar dipping extract by high hydrostatic pressure}
본 발명은 천연 식물 추출물을 유효성분으로 하는 간보호용 건강기능식품, 또는 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.
콩나물(bean sprout)은 대두를 발아시킨 것으로 계절에 관계없이 단시간에 쉽게 기를 수 있어 경제적이고 영양적으로 우수한 상용식품으로 알려져 있다. 콩나물의 빛깔은 흰색이나 담황색의 것이 좋고, 비타민 B 1 , 비타민 B 2 , 비타민 C가 많이 함유되어 있다.
콩나물을 일부 구성으로 포함하는 선행기술로는, 한국공개특허 제2011-0108686호에서는 콩나물 추출물을 택일적 성분의 하나로 포함하는 천연식물의 복합 추출물을 글루코시다아제로 처리하여 얻은 추출물이 항산화 활성을 나타냄을 개시하고 있으며, 한국등록특허 제098109호에서는 칼슘 화합물과 콩나물을 포함하는 십여종 이상의 천연 식물의 추출물을 포함하는 숙취 해소용 식품 조성물을 개시하고 있으며, 한국등록특허 제0504351호에도 다른 식물 추출물과 함께 콩나물즙을 일부 구성으로 포함하는 숙취해소용 식품 조성물에 대해 개시하고 있다.
콩나물을 주요 구성으로 포함하는 선행기술로는, 한국등록특허 제0989869호에 콩나물에 쌀 추출물과 설탕을 가하여 자연발효시킨 콩나물 발효액의 숙취 해소 효과가 개시되어 있다.
이처럼 지금까지의 선행기술들은 생콩나물의 착즙이나, 건조 콩나물의 열수 또는 알코올 등의 단순 추출물로서 콩나물즙이나 콩나물 추출물만으로는 충분한 간보호 효과를 나타내지 못하였기 때문에 다른 성분들과 혼합하여 사용하여 왔으나, 본 발명에서는 콩나물에 함유된 간보호에 효과를 나타내는 성분을 초고압 및 당 침지를 통해 추출함으로써 현저히 우수한 간보호 효과를 달성할 수 있게 됨을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 초고압 처리 콩나물의 당침 추출물을 유효성분으로 하는 간보호용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 초고압 처리 콩나물의 당침 추출물을 유효성분으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한 본 발명은 초고압 처리 콩나물의 추출방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 초고압 처리 콩나물의 당침 추출물을 유효성분으로 하는 간보호용 건강기능식품을 제공한다.
또한 본 발명에서는 초고압 처리 콩나물의 당침 추출물을 유효성분으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 초고압 처리는 콩나물을 압력 200 내지 600 MPa, 바람직하게는 400 내지 550 MPa, 온도 15 내지 35 ℃, 시간 1 내지 30 분, 바람직하게는 2 내지 10 분 처리하는 것이 바람직하다. 초고압 처리 압력이 상기 범위 미만인 경우에는 아스파라긴 및 비배당체 이소플라본의 추출량이 저하되고, 또한 간세포 보호 활성이 저하된다. 초고압 처리 압력이 상기 범위를 초과하는 경우 아스파라긴 및 비배당체 이소플라본의 추출량이 더 이상 증가하지 않으면서, 간세포 보호 활성이 오히려 약간씩 저하된다. 초고압 처리 온도가 상기 범위 미만인 경우에는 아스파라긴 및 비배당체 이소플라본의 추출량이 저하되고, 상기 상한치를 초과하는 경우 간세포 보호 활성이 오히려 저하된다. 초고압 처리 시간을 상기 범위 미만으로는 일정하게 조절하기 어렵고, 상기 범위를 초과하는 경우 더 이상 아스파라긴 및 비배당체 이소플라본의 추출량이 증가되지 않는다.
본 발명에서 초고압 처리 콩나물의 당침 추출물은 과당, 포도당, 젖당, 설탕, 맥아당 및 올리고당 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 당에 침지하여 얻은 추출물이고, 바람직하게는 삼투압에 의한 콩나물의 항산화 물질 추출에 유리한 과당, 포도당, 젖당, 설탕, 맥아당과 같은 단당류 또는 이당류이다. 추출물 제조는 15 내지 35 ℃, 바람직하게는 15 내지 25 ℃에서 2 내지 48 시간, 바람직하게는 6 내지 24 시간 추출한다. 초고압 처리를 통해 콩나물의 조직이 추출이 용이한 상태로 변화되기 때문에 상기 조건으로도 통상의 열수 추출이나 알코올 환류 추출에 비하여 아스파라긴의 추출량, 항산화 활성을 나타내는 물질의 추출량이 증대된다. 상기 초고압 처리한 콩나물과 당의 혼합비율은 초고압 처리한 콩나물과 초고압 처리 과정에서 콩나물에서 배출된 물을 포함한 전체 100 중량부에 대하여 당 50 내지 200 중량부를 혼합한다. 통상 초고압 처리를 통해 콩나물에서는 약 5 내지 20 중량%의 물이 배출되므로, 분말상의 당이 혼합되어 침지되기에 충분하지만 필요에 따라 별도의 물을 콩나물 무게의 5 내지 10 중량% 정도 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 간보호 효과 또는 간질환 치료 및 예방 효과는 당 침지 추출물에 포함된 아스파라긴, 비배당체 이소플라본 또는 본 명세서에서 특정되지 않은 성분의 함량이 증가한 결과로 인한 것으로 해석될 수 있다.
상기 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 단독으로 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합의 형태로 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 저제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 간보호 효과를 나타내는 건강기능식품은 본 발명에 따른 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명에 따른 초고압 처리 콩나물의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 추출물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
상기 건강기능식품의 제형이나 종류는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료 식품은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 기능성 식품 100 mL당 약 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 간보호용 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 간보호용 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 조성물 100 중량부 대비 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 초고압 처리 콩나물의 당 침지 추출물은 아스파라긴이 현저히 많이 추출되고, 동시에 이소플라본 함량, 특히 흡수가 용이한 비배당체 이소플라본의 추출량이 높고, HepG2 세포에서 과산화수소에 의한 간손상 억제 활성이 뛰어나기 때문에, 간보호용 식품 조성물 또는 간질환 치료 및 예방용 약학 조성물로서 활용될 수 있다.
도 1은 실험예 1의 아미노산 분석 크로마토그램으로 표준물질로 사용된 아스파라긴의 피크를 크로마토그램에서 표시하였다.
도 2는 실험예 2의 이소플라본 분석의 표준물질로 사용된 배당체인 다이즈진(daidzin, DI) 및 제니스틴(genistin, GI)과 비배당체인 다이드제인(daidzein, DE) 및 제니스테인(genistein, GE)의 크로마토그램이다.
도 3은 실험예 3에서 각 군의 HepG2 세포의 생존율을 과산화수소를 처리하지 않은 군에 대한 상대 세포생존율로 나타낸 그래프이다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1: 초고압 콩나물 설탕 침지 추출물의 제조
콩나물은 '준저리' 품종을 발아시킨 것으로 통상의 방법으로 7 내지 10 일 정도 재배하여 5 내지 6 cm 자란 것을 사용하였다.
상기 콩나물 100 g 을 믹서기로 0.5 내지 1 cm 크기로 조분쇄한 후 온도 20℃, 500 Mpa 초고압으로 3분 처리 후, 상기 초고압 처리 콩나물에 설탕 100 g을 혼합한 후, 20 ℃ 실온에서 24시간 동안 추출하고, 이를 여과백을 이용하여 여과하여 침지액을 얻고, 다시 0.45 ㎛ syringe filter로 여과한 후, 냉동진공건조기를 사용하여 초고압 처리 콩나물의 설탕 침지 추출물 분말을 제조하였다.
실시예 2: 초고압 콩나물 올리고당 침지 추출물의 제조
실시예 1과 동일하게 초고압 처리 콩나물의 당 침지 추출물 분말을 제조하되, 설탕 대신 40 브릭스의 올리고당을 사용하여 초고압 처리 콩나물의 올리고당 침지 추출물 분말을 제조하였다.
비교예 1: 콩나물 설탕 침지 추출물의 제조
콩나물 100 g 을 믹서기로 0.5 내지 1 cm 크기로 조분쇄하고, 상기 분쇄한 콩나물에 설탕 100 g을 혼합한 후, 20 ℃ 실온에서 24시간 동안 추출하고, 이를 여과백을 이용하여 여과하여 침지액을 얻고, 다시 0.45 ㎛ syringe filter로 여과한 후, 냉동진공건조기를 사용하여 콩나물 설탕 침지 추출물 분말을 제조하였다.
비교예 2: 콩나물 올리고당 침지 추출물의 제조
비교예 1과 동일하게 콩나물의 당 침지 추출물 분말을 제조하되, 설탕 대신 40 브릭스의 올리고당을 사용하여 올리고당 침지 추출물 분말을 제조하였다.
비교예 3: 초고압 콩나물 추출물의 제조
콩나물 100 g 을 믹서기로 분쇄 후 온도 20℃, 500 Mpa 초고압으로 3분 처리 후, 상기 초고압 처리 콩나물에 물 400 mL를 첨가한 후, 20 ℃실온에서 3시간 동안 추출하고, 이를 원심분리 및 여과하고 추출액을 얻어 냉동진공건조기를 사용하여 초고압 처리 콩나물의 추출물 분말을 제조하였다.
비교예 4: 설탕 침지 후 초고압 처리 추출물의 제조
콩나물 100 g 을 믹서기로 0.5 내지 1 cm 크기로 조분쇄하고, 상기 조분쇄한 콩나물에 설탕 100 g을 혼합하고, 온도 20℃, 500 Mpa 초고압으로 3분 처리 후, 20 ℃ 실온에서 24시간 동안 유지하면서 추출하고, 이를 여과백을 이용하여 여과하여 침지액을 얻고, 다시 0.45 ㎛ syringe filter로 여과한 후, 냉동진공건조기를 사용하여 초고압 처리 콩나물의 설탕 침지 추출물 분말을 제조하였다.
비교예 5: 올리고당 침지 후 초고압 처리 추출물의 제조
비교예 4와 동일하게 콩나물의 당 침지 추출물 분말을 제조하되, 설탕 대신 40 브릭스의 올리고당을 사용하여 올리고당 침지 추출물 분말을 제조하였다.
실험예 1: 아스파라긴 함량 분석
아스파라긴은 숙취 해소에 도움을 주는 아미노산으로 알려져 있으므로, 실시예 1 및 2와 비교예 1 내지 5의 추출물의 아스파라긴 함량을 하기 문헌에 기재된 방법을 응용하여 분석하여 비교하였다(문헌 : 식품의약안전청. 고시일 2012.01.20. 식품공전전문. 고시번호 제2012-1호).
아미노산 함량 변화 분석은 자동아미노산분석기(HITACH L-8900)를 이용하여 분석하였다. 표준용액의 제조는 Wako 표준 아미노산 Amino acid Mixture Standard Solution Type AN Ⅱ, Type B로부터 각각 시료 2 mL를 취하여 0.02 N HCl로 희석하여 사용하였다. 시험용액의 제조 및 분석은 시료와 16% 트리클로로초산용액을 동량을 넣은 후 15분간 진탕 후 3000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 사용해 분석에 사용하였다. 분석 컬럼은 Column for physiological Fluids Analysis #2622 4.6 × 60 mm 사용하였다. 도 1은 상기 컬럼의 크로마토그램으로 표준물질로 사용된 아스파라긴의 피크를 크로마토그램에서 표시하였다.
구분 아스파라긴(mg/100g)
실시예 1 4655.0±29.4
실시예 2 4311.0±35.6
비교예 1 592±12.9
비교예 2 684±16.3
비교예 3 3652.8±22.5
비교예 4 143±11.5
비교예 5 346±14.1
실시예 1 및 2는 초고압 처리만 실시한 비교예 3에 비해서도 약 20 % 많은 아스파라긴이 추출되었고, 특히 당 침지를 먼저한 비교예 4 및 5나 당 침지만 실시한 비교예 1 및 2에 비하여 현저히 높은 함량으로 아스파라긴이 추출되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 2: 이소플라본 함량 분석
설탕을 사용하여 당 침지를 실시한 실시예 1과 비교예 1 및 4의 추출물의 아스파라긴 함량을 하기 문헌에 기재된 방법을 응용하여 분석하여 비교하였다(문헌 : 식품의약안전청. 고시일 2011.11.17. 건강기능식품의 기준 및 규격. 고시번호 제2011-68호).
이소플라본 분석은 메탄올을 이용하여 시료의 이소플라본을 추출하였으며 Agilent 1100 series를 이용하여 분석하였고, 최대 흡수파장인 260 nm에서 Shiseido capcell pack C18 Column 4.6 × 250 mm를 사용하여 정량 분석하였다. 시험용액의 제조 및 분석은 시료 0.5 g을 50 mL 부피 플라스크에 메탄올로 정용 후 30 분간 초음파 처리 및 0.45㎛의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 사용하였다. 이동상은 solvent A (물:메탄올:초산 = 88:10:2)와 solvent B (메탄올:초산 = 92:2)로 사용하였다. 도 2는 상기 컬럼의 크로마토그램으로 표준물질로 사용된 배당체인 다이즈진(daidzin, DI) 및 제니스틴(genistin, GI)과 비배당체인 다이드제인(daidzein, DE) 및 제니스테인(genistein, GE)의 크로마토그램이다.
구분 실시예1 비교예1 비교예4
DI(μg/g) 19.2±2.6 0.0 37.6±3.2
GI(μg/g) 20.4±3.2 0.0 30.4±1.5
DE(μg/g) 63.2±4.6 19.2±2.5 68.7±1.9
GE(μg/g) 83.1±2.5 17.4±3.1 23.5±2.6
총 이소플라본(μg/g) 185.9 36.6 160.2
총 비배당체(μg/g) 146.3 36.6 92.2
실시예1은 동일하게 설탕 침지 공정이 포함된 비교예 1에 비해서 총 이소플라본의 함량 및 총 비배당체 이소플라본의 함량이 현저히 증가하였고, 역시 설탕 침지 공정이 포함되고 초고압 처리와 공정 순서가 변경된 비교예 4와는 총 이소플라본 함량에서는 차이가 크지 않지만, 총 비배당체 함량은 58.7% 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 간손상 억제 활성 확인
실시예 1 및 2와 비교예 1 내지 5의 추출물의 간 손상 억제 효능을 하기와 같이 문헌에 기재된 방법을 응용하여 측정하였다(문헌 : Mba Gachou, C. and Dumenil, G. 1999. The protective activity of α-hederine against H2O2 genotoxicity in HepG2 cells by alkaline comet assay. Mutation Res./Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 445(1): 9 - 20).
먼저 HepG2 세포주를 (ATCC, Manassas VA U.S.A 구입처) 1 mL MEM (Minimum Essential Medium (MEM), Hyclone, 01486)에 함유해 24 well plate 에 5 × 104 cells/well로 분주한 후에 24시간 동안 배양하였다. 상기 24 시간 배양 후에 배지(Minimum Essential Medium (MEM))를 제거하고, 각 well에 시료가 포함되어져 있는 혈청이 3% 함유된 배지(Minimum Essential Medium (MEM), Hyclone, 01486)를 첨가하고 24시간 동안 37℃ 에서 배양기에서 반응시킨 후, 배지를 제거하고 0.3 mM H2O2가 포함되어져 있는 혈청이 3% 함유된 배지(Minimum Essential Medium (MEM), Hyclone, 01486)를 첨가하고 24시간 동안 37℃ 에서 배양기에서 반응시킨 후 배지를 제거하고 XTT-PMS 용액(1 mg XTT (XTT Sodium Cell Culture Test, Sigma제조사, X4626) and 10 g PMS(phenazine methosulfate, Sigma 제조사, P9625)/mL을 넣어 2시간 동안 반응시켰다. 과산화수소에 의한 간손상으로부터의 보호효과는 생성된 포르마잔(formazan)의 형성 정도를 마이크로 플레이트 리더(microplate reader(BIO-TEK, 1010-1))를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 기기(BIO-TEK, 1010-1)를 이용하여 측정하였다. 상기 흡광도는 0.3 mM H2O2를 처리하지 않은 세포의 흡광도를 100%로 하여, 음성 대조군은 시료 대신 배양액만을 처리한 군의 상대 흡광도로 나타내고, 실시예 및 비교예의 각 시료는 300 μg/ml로 첨가하고 0.3 mM H2O2을 처리한 것의 상대 흡광도이고, 양성 대조군은 카페익산을 40 μg/ml로 첨가하고 0.3 mM H2O2을 처리한 것의 상대 흡광도로서, 이를 표 3 및 도 3에 나타내었다.
구분 음성대조군 양성대조군 실시예1 비교예1
상대흡광도(%) 55.0±2.4d 85.1±2.4c 94.1±5.9a 57.0±4.8d
구분 비교예2 비교예3 비교예4 비교예5
상대흡광도(%) 64.5±4.9d 63.0±3.5d 68.1±4.2d 76.1±5.9c
상기 결과 실시예1의 초고압 처리 콩나물의 당침 추출물은 과산화수소만 처리한 음성 대조군은 물론 비교예 1 내지 5에 비해서도 유의적으로 과산화수소에 의한 간세포 손상에 대하여 강력한 보호효과가 있음을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 4: DPPH 라디칼 소거능 확인
실시예 1 및 2와 비교예 1 내지 5의 추출물의 DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 시약을 이용한 라디칼 소거능을 확인하기 위하여 하기와 같이 문헌에 개시된 실험방법을 응용하여 실험하였다(문헌 : Yu, L., Perret, J., Davy, D., Wilson, J., & Melby, C. L. (2002). Antioxidant properties of cereal products. Journal of Food Science, 67, 2600-2603).
실시예 1 및 2와 비교예 1 내지 5의 추출물 분말 0.5 mg/ml로 희석하여 10 ㎕를 0.25 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액 (Sigma 제조사, D9132) 190 ㎕을 첨가 한 후 13000 rpm에서 5 분간 원심분리 후 상온에서 30분간 반응시킨 후에 상등액만 취해 517 nm에서 측정기(BIO-TEK 제조사)로 측정하고 대조군와의 흡광도 감소정도를 측정함으로써 DPPH 라디칼 소거능을 조사하였다.
DPPH는 그 자체가 매우 안정한 자유 라디칼로서 517 nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이며, 알코올 등에 안정하고 항산화 기작 중에 단백질-라디칼 소거제(proton-radical scavenger)에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있다.
구분 DPPH라디칼 소거능(%)
실시예 1 67.34
실시예 2 31.89
비교예 1 22.21
비교예 2 12.91
비교예 3 32.42
비교예 4 22.13
비교예 5 6.71
양성대조군(Vit.C 50ppm) 31.71
양성대조군(Vit.C 100ppm) 66.3
실시예 1은 비타민 C 100 ppm에 상당하는 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었고, 실시예 2 및 비교예 3은 비타민 C 50 ppm에 상당하는 소거능을 나타내었다. 항산화 활성을 나타내는 물질은 올리고당보다 설탕을 이용하여 당침할 때 더욱 높은 함량으로 추출됨을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 간세포 독성 확인
실시예 1 및 2와 비교예 1 내지 5의 추출물의 세포 독성을 확인하고자 Rochem 등의 방법을 변형하여 하기와 같이 측정하였다(문헌 : Dai, Y. and A. I. Cederbaum. 1995. Cytotoxicity of acetaminophen in human cytochrome P4502E1-transfected HepG2 cells. J. Pharmacol . Exp . Ther. 273: 1497 - 1505).
24 wells plate에 2 × 105 cells/well의 HepG2 세포주(ATCC, Manassas VA U.S.A 구입처)를 분주한 후에 24 시간동안 배지(Minimum Essential Medium (MEM), Hyclone, 01486)를 이용하였다. 상기 1차 배양을 마친 배지를 제거하고 대상 시료가 용해된 혈청(serum)이 3% 함유된 배지(Minimum Essential Medium (MEM), Hyclone, 01486), fetal bovine serum, Hyclone 구입처, KTJ32092 (FBS)) 1 mL을 분주하고 재 배양을 5일간 반복하였다. 배양 후, 7일째 되는 날에 각 웰(well)에 0.25 mL의 XTT-PMS 용액(페놀 레드 무첨가한 1 mg XTT (XTT Sodium Cell Culture Test, Sigma, X4626) 및 10 g PMS(phenazine methosulfate, Sigma 제조사, P9625)/mL of MEM(Minimum Essential Medium (MEM), Hyclone, 01486) 혼합용액)을 첨가하고 다시 2시간 배양하였다. 샘플에 대한 세포독성도는 포르마잔(formazan)의 형성 정도를 마이크로 플레이트 리더(microplate reader; BIO-TEK)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 기기(BIO-TEK)를 이용하여 측정하였다.
본 실험 결과, 본 발명의 실시예 1 및 2의 초고압 처리 당침 콩나물의 추출물은 물론 비교예 1 내지 5의 추출물은 1000 ㎍/mL 농도까지 세포독성이 나타나지 않음을 확인 하였다.

Claims (9)

  1. 초고압 처리 콩나물의 당 침지 추출물을 유효성분으로 하는 간보호용 건강기능식품.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 초고압 처리는 콩나물을 200 내지 600 MPa, 15 내지 35 ℃, 1 내지 30 분 처리하는 것을 특징으로 하는 간보호용 건강기능식품.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 당 침지 추출물은 과당, 포도당, 젖당, 설탕, 맥아당 및 올리고당 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 당에 침지하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 간보호용 건강기능식품.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 추출물은 15 내지 35 ℃에서 2 내지 48 시간 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 간보호용 건강기능식품.
  5. 초고압 처리 콩나물의 당 침지 추출물을 유효성분으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 초고압 처리는 콩나물을 200 내지 600 MPa, 15 내지 35 ℃, 1 내지 30 분 처리하는 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 당 침지 추출물은 과당, 포도당, 젖당, 설탕, 맥아당 및 올리고당 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 당에 침지하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 추출물은 15 내지 35 ℃에서 2 내지 48 시간 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 간질환 예방 및 치료용 약학 조성물.
  9. 콩나물을 200 내지 600 MPa, 15 내지 35 ℃, 1 내지 30 분 초고압 처리하는 단계; 및
    상기 초고압 처리된 콩나물을 과당, 포도당, 젖당, 설탕, 맥아당 및 올리고당 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 당에 15 내지 35 ℃에서 2 내지 48 시간 침지하여 추출하는 단계;를 포함하는 초고압 처리 콩나물의 당 침지 추출물의 제조방법.
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김영 외 9명. 초고압 저온 처리에 의한 매자나무의 면역 활성. 한국약용작물학회지. 16(6): 439-445(2008.).* *

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