KR20150126947A

KR20150126947A - 크실라나아제를 코딩하는 코돈 돌연변이를 갖는 유전자

Info

Publication number: KR20150126947A
Application number: KR1020157028624A
Authority: KR
Inventors: 주키우 탄
Original assignee: 바스프 엔자임스 엘엘씨
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2015-11-13
Also published as: AR095175A1; EP2970983B1; US10619142B2; EP2970983A4; GB201308853D0; WO2014164458A1; US20190249162A1; EP2970983A1; US20160002616A1; CA2910313A1; TW201441243A; US10131895B2

Abstract

본 발명은 크실라나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 크실라나아제를 코딩하는 코돈 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.

Description

크실라나아제를 코딩하는 코돈 돌연변이를 갖는 유전자{GENES WITH CODON MUTATIONS ENCODING XYLANASE}

크실라나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 특히, 제공된 서열은 특이적, 내열성, 열내성, 압력 안정성 크실라나아제의 향상된 발현을 제공한다.

서열 목록

본 출원은 MPEP § 502.05에서 공인되고 제시된 바와 같이 USPTO EFS-WEB 서버를 통해 전자 출원되고 이 전자 출원은 전자 제출된 서열 목록을 포함하고; 이에 따라 이 서열 목록의 전체 내용은 본 출원의 명세서에 참고 인용된다. 서열 목록은 다음과 같이 전자 출원된 ASCII (.txt) 텍스트 파일 상에서 확인된다:

본 발명은 일반적으로 효소, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 용도, 더욱 구체적으로는 크실라나아제 활성, 예컨대 엔도크실라나아제 활성을 갖고/갖거나; 내부 β-1,4-크실로시드 연결 또는 엔도- β-1,4-글루칸 연결의 가수분해를 촉진하고/하거나; 선형 다당류 베타-1,4-크실란을 크실로스로 분해하는 효소; 또는 예를 들어 내부 엔도- β-1,4- 및/또는 1,3-글루칸 연결의 가수분해를 촉진하는 글루카나아제 활성, 예컨대 엔도글루카나아제 활성, 크실라나아제 활성, 및/또는 만나나아제 활성을 갖는 효소에 관한 것이다.

크실라나아제(예, 엔도-l, 4-베타-크실라나아제, EC 3.2.1.8)는 크실란에서 내부 β-1,4-크실로시드 연결을 가수분해하여 더 작은 분자량 크실로스 및 크실로-소중합체를 생성한다. 크실란은 1,4-β-글리코시드-연결된 D-크실로피라노스로부터 형성된 다당류이다. 크실라나아제는 상당한 상품성이 있는 것이고, 베이킹 및 과일 및 야채 처리의 식품 산업, 농업 폐기물의 분해, 동물 사료의 제조, 및 펄프 및 종이 생산에서 사용된다. 크실라나아제는 균류 및 세균에 의해 형성된다. 아라비노크실란은 다양성 및 성장 조건에 따라 2.5∼7.1% w/w를 나타내는 곡류의 주요 비전분 다당류이다. 아라비노크실란 다당류의 물리화학적 특성은 산화 조건 하에서 점성 용액 또는 심지어 겔이 나타나도록 하는 것이다. 추가적으로, 아라비노크실란은 높은 수분 결합 용량을 갖고 단백질 기포 안정성에 있어서의 역할을 할 수 있다. 이러한 모든 특징들은 양조, 베이킹, 동물 영양 및 종이 제조를 비롯한 여러 가지 산업에 있어서 문제를 일으킨다. 양조 분야에 있어서, 크실란의 존재는 맥즙 여과성 및 헤이즈 형성 이슈를 초래한다. 베이킹 분야(특히, 쿠키 및 크래커 분야)에 있어서, 이러한 아라비노크실란은 기계에 무리를 주고 비스킷 크기를 감소시키는 점착성 도우를 생성한다. 추가적으로, 이러한 탄수화물은 바삭함의 손실을 초래하는 베이킹된 상품의 빠른 재수화와 연관되고 저장 수명을 감소시킨다. 곡류 가공품의 단위 동물 사료 분야의 경우, 아라비노크실란은 위 내용물의 점성에의 주요 기여 인자이며 이에 의해 사료의 소화성 및 동물 성장률에 불리한 영향을 미친다. 반추 동물의 경우, 이러한 다당류는 상당한 섬유소 성분의 흡수를 나타내고 아라비노크실란의 더욱 완전한 소화는 더 높은 사료 전환 효율을 용이하게 한다.

크실라나아제는, 비제한적으로 제지용 펄프의 표백, 펄프 휘도의 증가, 식물 섬유, 식품 및 사료 첨가제의 탈검화(degumming), 베이킹, 커피의 추출을 비롯한 각종 산업 및 상업 목적에 사용된다(Beg, Q. K.; Kapoor, M.; Mahajan, L.; Hoondal, G. S. (2001). "Microbial xylanases and their industrial applications: A review." Applied Microbiology and Biotechnology 56 (3-4): 326-38.)

효소는 촉매로서 작용하는 단백질이다. 단백질은 펩티드 결합에 의한 탈수 반응과 연관된 아미노산의 중합체이다. 아미노산 및 단백질을 형성하도록 연결되는 이들의 순서의 실체는 소정의 단백질의 활성을 결정한다. 아미노산이 단백질로 조립되는 이러한 순서(단백질 "서열")는 단백질을 "코딩하는" DNA 가닥의 서열에 의해 궁극적으로 결정된다.

단백질로 조립되는 소정의 아미노산을 명시하는 3-뉴클레오티드 서열은 "코돈"으로 지칭된다. 단백질로 짜여지는 20개의 아미노산은 64개의 3-뉴클레오티드 코돈 서열에 의해 집합적으로 코딩된다. 단백질을 명시하는 코돈의 연속은 "오픈 리딩 프레임"으로 지칭된다. 아미노산은 적게는 1개 또는 많게는 6개의 별개의 코돈에 의해 명시될 수 있다. 명시된 아미노산에 영향을 미치지 않는 코돈의 트리뉴클레오티드 서열에서의 변화 (또는 돌연변이)는 "침묵" 돌연변이를 지칭한다.

결과적으로, 동일 단백질을 코딩할 수 있는 수많은 DNA 서열이 존재하는데, 그 이유는 DNA 서열이 단지 "침묵" 돌연변이를 통해 서로 상이하기 때문이다. 소정의 단백질을 코딩하는 코돈 중 하나 이상을 변경함으로써, 코딩되는 단백질의 서열에 영향을 미치는 일 없이 유전자가 생성되는 단백질의 양을 크게 증가시키는 것이 가능할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 서열은 단백질을 코딩한다. 일부 구체예에서, 이러한 단백질은 크실라나아제 활성을 갖는 효소이다.

본원에 개시된 향상된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1로서 제공되며 이는 환경적 샘플에서 기인한 DNA 라이브러리로부터 단리된 모 크실라나아제 효소로부터 발달된 앞서 개시된 크실라나아제 효소를 코딩한다. 개시된 크실라나아제는 PCT 공개 번호 WO 2003/106654에서, 서열 번호 380(본원에서 서열 번호 3으로서 기술되고, 상기 문헌의 폴리뉴클레오티드 서열 번호 379에 의해 코딩됨)으로 기술된다. 일부 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 이러한 서열은 단백질을 코딩한다. 일부 구체예에서, 단백질은 크실라나아제 활성을 갖는 효소이다.

본 발명은 서열 번호 3에 대한 다중 뉴클레오티드 변화를 포함한다. 이러한 변화는 코딩된 단백질에 대해서 침묵이다. 10개의 염기 변화는 하기에 제시된다. "위치"는 오픈 리딩 프레임 내에서 뉴클레오티드의 숫자를 지칭하고, 제1 코돈의 제1 뉴클레오티드가 1로서 넘버링된다. 돌연변이는 (구 뉴클레오티드) (위치) (신 뉴클레오티드)을 사용하여 명시된다. 돌연변이는 다음과 같다: T6G, A12G, C15T, T33G, A42C, A48C, T57G, A66C, T69C, T72C, 또는 이의 임의의 조합.

일부 구체예에서, 본 발명의 돌연변이는, 관심 단백질(예, 서열 번호 4)의 발현을 향상시킬 수 있는 돌연변이를 선택하기 위해, ORF 또는 관심 유전자(예, 서열 번호 3)의 예측된 mRNA 구조의 5' 말단뿐만 아니라, 호스트의 바람직한 코돈의 2차원 및 3차원 구조의 분석을 비롯한 각종 인자들에 의해 결정되었다. 돌연변이는 단지 호스트의 바람직한 코돈, 또는 코돈 최적화 프로그램에 의한 코돈 최적화를 기초로만 선택되지 않았다. 실시예 1에서 논의되는 바와 같이, 2개의 변이체는, 예컨대 상기 언급된, 향상된 단백질 발현을 위해 테스트된 인자들을 기초로 침묵 코돈 돌연변이가 도입된 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 생성하였다.

개시된 셀룰라아제를 코딩하는 앞서 보고된 서열로부터 서열 번호 1을 구별하는 염기 변화는, 집합적으로 그리고 개별적으로, 동일한 단백질을 코딩하는 앞서 사용된 뉴클레오티드 서열보다 더 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 오픈 리딩 프레임을 유도한다.

일부 구체예에서, 환경적 샘플로부터 유도된 크실라나아제의 뉴클레오티드 서열이 개시되고, 이때 뉴클레오티드 서열은 T6G, A12G, C15T, T33G, A42C, A48C, T57G, A66C, T69C, T72C, 또는 이의 임의의 조합에서 선택된 하나 이상이 돌연변이를 포함한다. 이러한 구체예의 일부 측면에서, 하나 이상의 돌연변이는 코딩된 단백질의 서열에 대해서 침묵이다. 다른 측면에서, 하나 이상의 돌연변이는, 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않고 그 외에는 상기의 뉴클레오티드 서열과 상이하지 않은 뉴클레오티드 서열보다 더 높은 수준에서 상기 크실라나아제의 발현을 유도하는 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 뉴클레오티드 서열을 생성한다.

일부 구체예에서, 크실라나아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 개시되고, 이때 뉴클레오티드 서열은 T6G, A12G, C15T, T33G, A42C, A48C, T57G, A66C, T69C, T72C, 또는 이의 임의의 조합에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 서열 번호 3을 포함한다.

일부 구체예에서, 야생형 게놈 서열과 비교하였을 때 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 환경적 공급원으로부터의 뉴클레오티드 서열이 개시된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 돌연변이는 침묵이다.

일부 구체예에서, 서열 번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열이 개시되며, 이때 뉴클레오티드 서열은, 단백질의 발현 수준이 제2 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 것에 비해 증가되도록 서열 번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 제2 서열에 대하여 돌연변이되었다.

발현계

또 다른 구체예에서, 본 발명의 크실라나아제를 코딩하는 DNA는, 플라스미드에 도입될 수 있거나, 예를 들어, 임의의 수의 그람 음성 세균계, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 예컨대 플루오레센스(fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 랄스토니아(Ralstonia) 종, 또는 카우로박터(Caulobacter) 종의 게놈 내로 안정적으로 도입되어 형질전환될 수 있다. 마찬가지로, 크실라나아제는 임의의 수의 그람 양성 세균 발현계, 예컨대 바실루스(Bacillus) 종, 예컨대 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 락토코쿠스(Lactococcus) 종, 예컨대 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실루스(Lactobacillus) 종, 스트렙토미세스(Streptomyces) 종, 예컨대 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans) 내에 도입될 수 있다. 기타 그람 음성, 그람 양성 또는 관련 없는 진정세균 또는 고세균 발현계가 크실라나아제를 발현하는 데 사용될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 서열번호 1은, 개시된 크실라나아제 단백질이 발현될 수 있는 다수의 계에서 증가된 수준의 발현을 유도하도록 사용될 수 있다. 서열번호 1은 임의의 수의 발현계 내에 도입되어 개선된 축적 수준(accumulation level)에서 개시된 크실라나아제를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1은 플라스미드에 도입될 수 있거나, 예를 들어, 임의의 수의 그람 음성 세균계, 예컨대 이. 콜라이, 슈도모나스 종, 예컨대 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 아에루기노사, 랄스토니아 종, 또는 카우로박터 종의 게놈 내로 안정적으로 도입되어 형질전환될 수 있다. 마찬가지로, 서열번호 1은 임의의 수의 그람 양성 세균 발현계, 예컨대 바실루스 종, 예컨대 바실루스 수브틸리스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 브레비스, 락토코쿠스 종, 예컨대 락토코쿠스 락티스, 락토바실루스 종, 스트렙토미세스 종, 예컨대 스트렙토미세스 리비단스 내에 도입될 수 있다. 기타 그람 음성, 그람 양성 또는 관련 없는 진정세균 또는 고세균 발현계가 서열번호 1을 발현하도록 사용될 수 있다. 추가 구체예에서, 서열번호 1 은 임의의 수의 진핵세포 발현계, 예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 및 한사누엘라 폴리모르파(Hansanuela polymorpha)에 도입될 수 있다.

보다 구체적으로, 서열번호 1은 플라스미드에 도입되어 이의 발현을 유도할 수 있다. 서열번호 1이 도입될 수 있는 플라스미드는, 예를 들어, pQE, pET, 및 pASK 군의 이. 콜라이 발현 벡터; pCN51 LT8, RSF1010, pWZ112T, 및 pMYC 군의 슈도모나스 발현 벡터; pBAX, pHT01, 및 pHIS1525 군의 바실루스 발현 벡터; pIJ6021 및 pIJ2460 군의 스트렙토미세스 발현 벡터; 및 pNZ9530 및 pNZ8148 군의 락토코쿠스 발현 벡터 등을 포함한다. 이들 예는 예시 목적을 위한 것이며 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열이 발현될 수 있는 벡터의 전체 세트를 나타내지 않는다.

또 다른 구체예에서, 발현계는 당해 분야에 공지된 임의의 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 발현계, 예를 들어 다우 글로벌 테크놀로지스 인크(Dow Global Technologies Inc.), 균주 DC454(미국 특허 공개 출원 제20050130160호 및 미국 특허 공개 출원 제20050186666호)로부터 시판되는 슈도모나스 플루오레센스 발현계일 수 있다. 크실라나아제 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 pMYC 벡터(다우 글로벌 테크놀로지스 인크, 미국 특허 공개 출원 제20050130160호)에 또는 pDOW1169 벡터(다우 글로벌 테크놀로지스 인크, 미국 특허 공개 출원 제20080058262호)에 삽입되고 이후 전기천공에 의해 슈도모나스 플루오레센스 호스트 내에 도입된다. 당업자는 본 발명의 구체예와 같이 사용될 수 있는 대안적인 벡터를 알 것이다.

일부 구체예에서, 크실라나아제는 하기 발현 수준 이상으로 발현할 것이다: 65 U/ml, 70 U/ml, 75 U/ml, 80 U/ml, 85 U/ml, 90 U/ml, 95 U/ml, 100 U/ml, 105 U/ml, 110 U/ml, 115 U/ml, 120 U/ml, 125 U/ml, 130 U/ml, 135 U/ml, 140 U/ml, 145 U/ml, 150 U/ml, 155 U/ml, 160 U/ml, 165 U/ml, 170 U/ml, 175 U/ml, 180 U/ml, 또는 그 초과.

핵산

본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함하는 합성 또는 재조합의 단리된 핵산을 제공한다(상보적(비 코딩) 및 코딩 서열은 또한 이하 내용에서 총괄하여 본 발명의 핵산 서열로 지칭된다).

본 발명은 크실라나아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 합성 또는 재조합의 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 서열번호 1의 핵산을 비롯한 본 발명의 예시적인 핵산에 대해 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 그 초과, 또는 완전한(100%) 서열 동일성(상동성)을 갖는 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 핵산 서열 서열번호 1(본 발명의 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하는 합성 또는 재조합의 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 서열 번호 4에 제시된 바의 서열(본 발명의 예시적인 폴리펩티드 서열)을 포함하는 합성 또는 재조합의 단리된 핵산, 및 이의 효소 활성 단편을 제공한다.

폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드는 합성 또는 재조합의 단리된 폴리펩티드이다. 펩티드 및 단백질은 생체 외(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 재조합을 통해 발현될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 당해 기술에 공지된 임의 방법을 사용하여 제조 및 단리될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 또한, 전체 또는 일부가, 당해 기술에 주지된 화학법을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 크실라나아제 폴리펩티드는 (본원에서 기술된 바와 같은) 표준 재조합 발현계에서 생산될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 상기 크실라나아제 폴리펩티드가 자연적으로 발현되는 유기체로부터 정제될 수 있다.

본 발명은, 본 발명의 예시적인 아미노산 서열(예: 서열 번호 4)에 대해 약 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상, 또는 그 초과, 또는 100%(완전한) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 크실라나아제 활성을 갖는 합성 또는 재조합의 단리된 폴리펩티드, 또는 이의 효소 활성 단편을 제공한다.

본 발명은 서열 번호 4에 제시된 바와 같은 서열을 포함하는 합성 또는 재조합의 단리된 폴리펩티드, 및 이의 효소 활성 단편, 및 이의 변이체를 제공한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 크실라나아제 활성을 가지나 신호 서열, 프리프로 도메인, 도커린 도메인, 및/또는 탄수화물 결합 모듈(carbohydrate binding module, CBM)을 결여하는 폴리펩티드(및 이를 코딩하는 핵산)를 제공하며; 한 양태에서, 탄수화물 결합 모듈(CBM)은 크실란 결합 모듈, 셀룰로오스 결합 모듈, 리그닌 결합 모듈, 크실로오스 결합 모듈, 만노오스 결합 모듈, 크실로글루칸 특이적 모듈 및/또는 아라비노퓨라노시드 결합 모듈을 포함하거나 이들로 이루어진다.

일부 구체예에서, 본 발명은 이종 서열을 추가로 포함하는 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드(및 이를 코딩하는 핵산)를 제공하며; 한 양태에서, 이종 서열은 하기를 코팅하는 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어지며: (i) 이종 신호 서열, 이종 탄수화물 결합 모듈, 이종 도커린 도메인, 이종 촉매 도메인(CD), 또는 이들의 조합; (ii) (i)의 서열로서, 이종 신호 서열, 탄수화물 결합 모듈 또는 촉매 도메인(CD)이 이종 효소로부터 유도된 것인 서열; 또는 (iii) 태그, 에피토프, 표적 펩티드, 절단 가능한 서열, 검출 가능한 모이어티 또는 효소; 한 양태에서, 이종 탄수화물 결합 모듈(CBM)은 크실란 결합 모듈, 셀룰로오스 결합 모듈, 리그닌 결합 모듈, 크실로오스 결합 모듈, 만노오스-결합 모듈, 크실로글루칸-특이적 모듈 및/또는 아라비노퓨라노시드 결합 모듈을 포함하거나 이들로 이루어지며; 한 양태에서, 이종 신호 서열은 코딩된 단백질을 액포, 소포체, 엽록체 또는 녹말 입자로 표적화한다.

열 안정성

한 양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 열 안정성인 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드, 서열 번호 4, 또는 본 발명의 변이체로부터 생성된 효소는 열 안정성일 수 있다. 본 발명에 따른 열 안정성 폴리펩티드는 37℃ 초과 내지 약 95℃, 또는 약 55℃ 내지 약 85℃, 또는 약 70℃ 내지 약 75℃, 또는 약 70℃ 내지 약 95℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 105℃, 또는 약 95℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도를 포함하는 조건 하에서, 결합 활성 및/또는 효소 활성, 예를 들어 크실라나아제 활성을 보유할 수 있다. 한 양태에서, 폴리펩티드는 1℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃를 포함하는 조건 하에서, 결합 활성 및/또는 효소 활성, 예를 들어 크실라나아제 활성을 보유할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 103℃, 104℃, 105℃, 107℃, 108℃, 109℃, 또는 110℃, 또는 그 초과를 포함하는 조건 하에서, 결합 활성 및/또는 효소 활성, 예를 들어 크실라나아제 활성을 보유할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 열 안정성 폴리펩티드는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5, 또는 pH 4 또는 그 미만(더 산성)을 포함하는 산성 조건 하에서 상기 기술한 범위의 온도에서 활성, 예를 들어 크실라나아제 활성을 보유하거나, 또는 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5, 또는 pH 4 또는 그 미만(더 산성)을 포함하는 산성 조건 하에서 크실라나아제 활성을 보유하거나; 또는, 약 pH 7, pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 또는 그 초과(더 염기성)을 포함하는 염기성 조건 하에서 크실라나아제 활성을 보유하거나, 약 pH 7, pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 또는 그 초과(더 염기성)을 포함하는 염기성 조건 하에서 크실라나아제 활성을 보유한다.

열 내성

한 양태에서, 본 발명의 재조합 핵산은 열 내성인 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드, 서열 번호 4, 또는 본 발명의 변이체로부터 생성된 효소는 열 내성일 수 있다. 한 실시양태에서, 크실라나아제 활성은 열 내성이고, 예를 들어, 폴리펩티드는 37℃ 초과 내지 약 95℃, 또는 약 55℃ 내지 약 85℃, 또는 약 70℃ 내지 약 75℃, 또는 약 70℃ 내지 약 95℃, 약 90℃ 내지 약 95℃, 약 95℃ 내지 약 105℃, 또는 약 95℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도에 노출된 후에도 크실라나아제 활성을 보유한다. 한 양태에서, 폴리펩티드는 약 1℃ 내지 약 5℃, 약 5℃ 내지 약 15℃, 약 15℃ 내지 약 25℃, 약 25℃ 내지 약 37℃의 온도 범위를 포함하는 조건에 노출된 후에도 크실라나아제 활성을 보유한다. 한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 90℃, 91℃, 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃, 101℃, 102℃, 103℃, 104℃, 105℃, 107℃, 108℃, 109℃, 또는 110℃ 이하, 또는 그 초과의 온도에 노출된 후에도 크실라나아제 활성을 보유한다. 한 양태에서, 본 발명의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드의 크실라나아제 활성은 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5, 또는 pH 4 또는 그 미만(더 산성)을 포함하는 산성 조건에 노출된 후에도 활성을 보유하거나; 약 pH 6.5, pH 6, pH 5.5, pH 5, pH 4.5, 또는 pH 4 또는 그 미만(더 산성)을 포함하는 산성 조건에 노출된 후에도 크실라나아제 활성을 보유하거나; 또는, 약 pH 7, pH 7.5, pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 또는 그 초과(더 염기성)을 포함하는 염기성 조건 하에서 활성을 보유하거나, 약 pH 7, pH 7.5 pH 8.0, pH 8.5, pH 9, pH 9.5, pH 10, pH 10.5, pH 11, pH 11.5, pH 12, pH 12.5 또는 그 초과(더 염기성)을 포함하는 염기성 조건에 노출된 후에도 크실라나아제 활성을 보유한다.

셀룰로오스 분해

본 발명의 크실라나아제는 베이킹, 동물 먹이, 음료 및 목재, 목재 펄프, 크라프타 펄프, 종이, 종이 제품 또는 종이 펄프 가공에서 특히 유용하다. 한 양태에서, 본 발명의 효소는 열 내성이고/이거나 높은 및/또는 낮은 pH 조건에 내성이다. 예를 들어, 한 양태에서, 본 발명의 크실라나아제, 만나나아제 및/또는 글루카나아제는 약 80℃, 85℃, 86℃, 87℃, 88℃, 89℃, 90℃, 91℃ , 92℃, 93℃, 94℃, 95℃, 96℃, 97℃, 98℃, 99℃, 100℃,101℃, 102℃, 103℃, 103.5℃, 104℃, 105℃, 107℃_, 108℃, 109℃ 또는 110℃ 이상, 또는 그 초과의 온도, 및 약 pH 11 이상, 또는 그 초과의 염기성 pH를 포함하는 조건 하에서 활성을 보유한다.

본 발명은 산업적, 농업적 또는 의학적 용도: 예를 들어, 감소된 효소 비용, 예를 들어 바이오매스의 바이오연료로의 전환 공정에서의 감소된 비용을 갖는 본 발명의 효소를 사용하는 에탄올, 프로판올, 부탄올 및/또는 메탄올을 비롯한 바이오매스의 바이오연료로의 전환 공정을 제공한다. 따라서, 본 발명은, 임의의 바이오매스로부터, 바이오알코올을 포함하는 합성, 액체 또는 기체 연료를 비롯한, 바이오알코올, 바이오연료 및/또는 바이오연료- (예를 들어, 바이오에탄올-, 프로판올-, 부탄올- 및/또는 메탄올-) 함유 조성물을 제조하는 효과적인 방법을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명의 효소 "칵테일"을 포함하는 본 발명의 효소("칵테일"은 본 발명의 하나 이상의 효소를 포함하는 효소 혼합물을 의미함)는, 리그노셀룰로오스계 바이오매스, 또는 셀룰로오스 및/또는 헤미셀룰로오스를 포함하는 임의의 조성물(리그노셀룰로오스계 바이오매스는 리그닌도 포함함), 예를 들어 종자, 낟알, 덩이줄기, 식물 폐기물(예를 들어 건초 또는 짚, 예컨대 볏짚 또는 밀짚, 또는 임의의 곡초류의 임의의 건조 줄기) 또는 식품 가공 또는 공업 가공의 부산물(예를 들어, 줄기), 옥수수(옥수수속, 여물 등을 포함), 초류[예를 들어, 인디안 그래스(Indian grass), 예컨대 소르그하스트룸 누탄스(Sorghastrum nutans); 또는 스위치 그래스(switch grass), 예를 들어 수수종(Panicum species), 예컨대 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum)], 목류(목재 칩, 가공 폐기물, 예컨대 목재 폐기물을 포함), 종이, 펄프, 재생지(예를 들어 신문지); 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물, 또는 외떡잎 식물 곡물, 사탕수수 또는 그의 일부분(예를 들어, 줄기 머리부), 쌀, 밀, 보리, 스위치 그래스 또는 억새속(Miscanthus)을 또한 포함하는 조합물; 또는 쌍떡잎 식물 유지 작물, 대두, 캐놀라, 평지씨, 아마, 목화, 팜유, 사탕무, 땅콩, 나무, 포플러 또는 루핀; 또는 목재 또는 목재 가공 부산물, 예컨대 목재 폐기물, 예를 들어 목재 가공, 펄프 및/또는 제지 산업에서의 부산물, 섬유 제조 및 가정용 및 산업용 세정제에서의 부산물, 및/또는 바이오매스 폐기물 처리에서의 부산물의 주성분을 가수분해하기 위해 사용된다.

식이(dietary)

한 구체예에서, 본 발명의 크실라나아제는 동물 또는 인간을 위한 식품, 식품 첨가물 또는 식이 보충제의 전처리, 변성 또는 소화에 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 크실라나아제는 동물 또는 인간을 위한 식품, 식품 첨가물 또는 식이 보충제로서 사용될 수 있다. 한 양태에서, 크실라나아제는 소화 장애를 치료하거나 예방할 것이다. 본 발명의 다른 양태에서, 크실라나아제는 소화를 변화시키거나 증진시킬 것이다. 본 발명의 다른 양태에서, 크실라나아제는 식품의 소화를 증진시키거나, 변화시키거나, 또는 보조할 것이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 크실라나아제는 식품의 영양가를 증진시키거나, 보조하거나, 또는 변화시킬 것이다. 다른 양태에서, 크실라나아제는 소화관에서, 예를 들어 위 및/또는 장에서 활성이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 크실라나아제는 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제로서 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 크실라나아제의 열안정성 및/또는 열내성은 보조제(secondary agent), 예컨대 염 또는 왁스를 필요로 하는 일 없이 펠릿이 형성되도록 한다. 크실라나아제를 포함하는 동물 사료는 당업자에게 공지된 임의의 제형으로 동물에게 제공될 수 있다. 동물 사료 제형의 예로는 전달 매트릭스, 펠릿, 정제, 겔, 액상, 스프레이, 제분된 곡물 또는 분말이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

본 발명은 열안정성 재조합 크실라나아제를 포함하는 식용 효소 전달 매트릭스, 예컨대 본 발명의 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 크실라나아제를 동물에게 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은, 과립형 식용 담체 및 열안정성 재조합 크실라나아제, 만나나아제 및/또는 글루카나아제 효소를 포함하는 펠릿 형태의 식용 효소 전달 매트릭스를 제조하는 단계로서, 펠릿이 그에 함유된 크실라나아제, 만나나아제 및/또는 글루카나아제 효소를 수성 매체에 용이하게 분산시키는 것인 단계, 및 식용 효소 전달 매트릭스를 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 재조합 크실라나아제 효소는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 과립형 식용 담체는 곡물 배아, 오일로 소비되는 곡물 배아, 건초, 알팔파, 티모시, 대두 외피, 해바라기씨박 및 밀 중간부(wheat midd)로 이루어진 군으로부터 선택되는 담체를 포함할 수 있다. 식용 담체는 오일로 소비되는 곡물 배아를 포함할 수 있다. 크실라나아제 효소는 글리코실화되어 펠릿화 조건에서 열안정성을 제공할 수 있다. 전달 매트릭스는 곡물 배아 및 크실라나아제를 포함하는 혼합물을 펠릿화함으로써 형성될 수 있다. 펠릿화 조건은 스팀의 적용을 포함할 수 있다. 펠릿화 조건은 약 80℃ 초과의 온도를 약 5 분간 적용하는 것을 포함할 수 있으며, 효소는 효소 밀리그램당 350 ∼ 약 900 단위 이상의 비활성(specific activity)을 보유한다.

에탄올의 제조 방법

본 발명은 에탄올의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은 전분 함유 조성물을, 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계로서, 폴리펩티드가 본 발명의 서열을 갖거나, 폴리펩티드가 본 발명의 서열을 포함하는 핵산, 또는 그의 효소적으로 활성인 단편에 의해 코딩되는 것인 단계를 포함한다. 본 발명은 전분 및 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드을 포함하는 조성물로서, 폴리펩티드가 본 발명의 서열을 갖거나, 폴리펩티드가 본 발명의 서열을 포함하는 핵산, 또는 그의 효소적으로 활성인 단편에 의해 코딩되는 것인 조성물을 제공한다.

양조 및 발효

본 발명은 본 발명의 크실라나아제를 포함하는 맥주를 양조(예를 들어, 발효)하는 방법을 제공한다. 한 예시적 공정에서, 전분 함유 원료는 분쇄되고 가공되어 맥아를 형성한다. 본 발명의 효소는 발효 공정의 어느 시점에서도 사용된다. 본 발명의 크실라나아제는 양조업에서 베타 글루칸의 분해를 위해 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 크실라나아제는 양조업에서 음료의 정화를 위해 사용된다. 본 발명의 효소는, 예를 들어 미국 특허 제4,746,517호에 기술된 바와 같이, 음료 산업에서 맥아즙 또는 맥주의 여과성을 향상시키는 데에 사용될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명의 크실라나아제는 보리 맥아의 가공에서 사용될 수 있다. 맥주 양조의 주원료는 보리 맥아이다. 가공은 3단계 공정일 수 있다. 먼저, 보리 낟알은 함수량을, 예를 들어 약 40% 근처로 증가시키기 위해 침지될 수 있다. 두 번째로, 그 낟알은 지베렐린의 제어 하에서 효소 합성이 촉진되는 3 ∼ 6 일 동안 15℃ ∼ 25℃에서의 항온 처리에 의해 발아될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 효소는 공정의 이 단계(또는 임의의 다른 단계)에서 첨가된다.

한 양태에서, 본 발명의 효소는 담금(mashing) 및 전환 공정에서 사용된다. 양조 및 발효 산업에서, 담금 및 전환 공정은 수용성 글루칸, 만난, 아라비녹실란 또는 크실란, 또는 다른 다당류의 충분한 분해를 촉진하기에 너무 낮은 온도에서 수행된다. 이들 폴리머는 담금 맥아즙에서 점도를 증가시킬 수 있는 점착성 기질을 형성하며, 그 결과 매시(mash) 런오프(run-off)가 길어지고, 비효율적인 여과 및 낮은 추출 수율로 인해 최종 맥주 제품에 잔류 혼탁 및 침전물이 생긴다.

한 양태에서, 본 발명의 효소는 맥아 저장고 작업에서 사용되며, 예를 들어, 글루카나아제는 발아 시간의 단축 및/또는 저품질 보리의 적당한 맥아로의 전환의 촉진을 위해 공정 용수에 첨가된다. 한 양태에서, 본 발명의 효소는 담금에 사용되며, 예를 들어 이들은 맥아즙 여과성의 증가 및/또는 라우터링(맥아즙을 매시로부터 분리하는 것)의 향상을 위해 첨가된다. 한 양태에서, 본 발명의 효소는, 예를 들어 혼탁 정화의 보조 및/또는 여과 향상을 위해 발효기 및/또는 침전조에 사용된다. 한 양태에서, 본 발명의 효소는 부가물 양조에서 사용되며, 예를 들어 본 발명의 글루카나아제는 맥아 내의 글리칸을 포함하여, 글루칸, 만난, 아라비녹실란 또는 크실란, 또는 보리, 밀 및/또는 기타 곡류 유래의 기타 다당류를 분해하기 위해 첨가된다. 한 양태에서, 본 발명의 효소는 맥아 양조에서 사용되며, 예를 들어, 본 발명의 글루카나아제는 높은 글루칸 함량을 갖는 불량한 맥아를 개질하기 위해 첨가된다.

본 발명의 글루카나아제(또는 셀룰라아제), 만나나아제, 크실라나아제, 아밀라아제, 크산타나아제 및/또는 글리코시다아제, 예를 들어　셀로바이오하이드로라아제, 만나나아제 및/또는 베타글루코시다아제는, 예를 들어, 미국 특허 제5,762,991호; 제5,536,650호; 제5,405,624호; 제5,021,246호; 제4,788,066호에 기술된 바와 같은 임의의 맥주 또는 알코올 음료 제조 공정에서 사용될 수 있다.

식품 처리 및 식품 가공

본 발명의 크실라나아제는 식품 가공업에서 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어, 한 양태에서, 본 발명의 효소는 오일이 풍부한 식물 재료, 예컨대 오일이 풍부한 종자로부터의 오일, 예를 들어 대두로부터 대두유, 올리브로부터 올리브유, 평지씨로부터 평지씨유 및/또는 해바라기씨로부터 해바라기씨유를 추출하는 것을 향상시키기 위해 사용된다.

본 발명의 크실라나아제는 식물 세포 물질의 성분 분리에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 효소는 글루칸이 풍부한 물질(예를 들어, 식물 세포)의 성분 분리에 사용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 효소는 글루칸이 풍부하거나 오일이 풍부한 작물을 가치 있는 단백질 및 오일과 외피 부분으로 분리하기 위해 사용될 수 있다. 분리 공정은 당업꼐에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 크실라나아제는 과일 또는 야채 주스, 시럽, 추출물 등의 제조에서 수율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 효소는, 예를 들어 씨리얼, 곡물, 와인 또는 쥬스 생산으로부터의 다양한 식물 세포벽 유래 물질 또는 폐기물, 또는 농업 잔류물, 예컨대 야채 껍질, 대두 껍질, 사탕무 박, 올리브 박, 감자 박 등의 효소 처리(예를 들어, 글루칸 함유 식물 재료의 가수분해)에 사용될 수 있다. 본 발명의 효소는 가공된 과일 또는 야채의 연경도(consistency) 및 외형을 변화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 효소는 식물 재료를 처리하여 식품을 포함한 식물 재료의 가공을 용이하게 하고, 식물 성분의 정제 또는 추출을 용이하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 크실라나아제는 사료 가치를 높히고, 수분 결합능을 감소시키며, 폐수 공장에서의 분해성을 향상시키고, 및/또는 식물 재료의 엔실리지(ensilage)로의 전환을 향상시키는 등을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 크실라나아제는 또한 과수 산업 및 양조업에서 설비 세정 및 유지에 또한 사용될 수 있다.

세제 조성물

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 세제 조성물 및 이들 조성물을 제조 및 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 세제 조성물을 제조 및 이용하는 모든 방법을 포함하며, 예를 들어 미국 특허 제6,413,928호; 제6,399,561호; 제6,365,561호; 제6,380,147호를 참조하라. 세제 조성물은 1액형 및 2액형 수성 조성물, 비수성 액체 조성물, 캐스트 고체, 과립형, 미립자형, 압축 정제, 겔 및/또는 페이스트 및 슬러리 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 이들 세제 조성물을 이용하여 조식품 토양, 식품 잔류물의 막 및 다른 부수적인 식품 조성물을 신속히 제거할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 효소는 전분 다당류의 촉매 가수분해에 의해 전분성 얼룩의 제거를 촉진할 수 있다. 본 발명의 주방 세제 및 섬유 세탁 세제에 사용될 수 있다. 실제 활성 효소 함량은 세제 조성물의 제조법에 좌우되고, 엄격하지는 않으며, 세제 용액이 필요한 효소 활성을 갖는 정도로 생각된다. 한 양태에서, 최종 용액에 존재하는 글루코시다아제의 양은 세제 조성물의 그램당 약 0.001 mg ∼ 0.5 mg 범위이다. 이 발명의 생성물 및 공정에서 사용하기 위해 선택되는 특정 효소는 생성물의 물리적 형태, 사용 pH, 사용 온도, 및 분해되거나 교체될 토양형을 포함하는 최종 효용의 조건에 좌우된다. 효소는 임의의 주어진 세트의 효용 조건에 최적 활성 및 안정성을 제공하도록 선택될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 약 4 ∼ 약 12의 pH 범위 및 약 20℃ ∼ 약 95℃ 범위의 온도에서 활성이다. 본 발명의 세제는 양이온계, 반극성 비이온계 또는 양성이온계 계면활성제; 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

본 발명은 경질 표면 세척용 세제 조성물, 섬유 세정용 세제 조성물, 주방세제 조성물, 구강 세정 조성물, 의치 세정 조성물, 및 콘택트 렌즈 세정액을 포함하는 세정 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 대상물을 세척하는 방법으로서, 그 대상물을 세척에 충분한 조건 하에서 본 발명의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 세제 첨가제로서 포함될 수 있다. 본 발명의 세제 조성물은, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 손 빨래용 또는 세탁기용 세제 조성물로서 제조될 수 있다. 얼룩진 섬유의 전처리에 적합한 세탁 첨가제는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 섬유 유연제 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 폴리펩티드는 일반적인 가정의 경질 표면 세척 작업에서 사용하기 위한 세제 조성물로서 제조될 수 있다.

도 1은 실시예 2에 개시된 바와 같이, 다양한 단백질 발현 수준을 나타내는 SDS PAGE 겔 전기영동의 이미지이다.
도 2는 실시예 3에 개시된 바와 같이, 단백질 제제의 활성 수준을 나타내는 막대 그래프이다.
도 3은 서열 번호 3과 비교하여, 10개의 침묵 돌연변이, T6G, A12G, C15T, T33G, A42C, A48C, T57G, A66C, T69C, T72C를 갖는 폴리뉴클레오티드인 서열 번호 1이다.
도 4는 서열 번호 3과 비교하여 10개의 침묵 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드인 서열 번호 2이다.
도 5는 서열 번호 1 및 2의 비변형된 폴리뉴클레오티드 모서열인 서열 번호 3이다.
도 6은 서열 번호 1, 2 및 3에 의해 코딩되는 폴리펩티드인 서열 번호 4이다.
도 7은 서열 번호 1과 서열 번호 3의 서열 정렬이다.
도 8은 서열 번호 2와 서열 번호 3의 서열 정렬이다.

용어의 정의

"코돈"은 단백질에 추가하고자 하는 아미노산의 정체를 특정하는 3개의 폴리뉴클레오티드 서열이다.

"침묵 돌연변이(silent mutation)"는 상이한 아미노산 내용을 초래하지 않는 코돈의 돌연변이이다.

"오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame)"은 단백질의 아미노산 서열을 특정하는 일련의 코돈이다.

염기 "위치"는 오픈 리딩 프레임의 시점으로부터 또는 일부 다른 기준 마커로부터 연속적으로 계수되는, 폴리뉴클레오티드 서열에서 수로 표시되는 염기의 위치이다.

단백질을 "코딩하는"이란 그 단백질의 아미노산 서열을 특정하는 것을 의미한다.

본원에 개시된 "코돈 최적화(codon optimization)"란 ORF 또는 유전자의 코돈을 표적 및 숙주 유기체에서 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 것으로 변경하지만, 본래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않는 것을 의미한다. 코돈 최적화 소프트웨어의 예는 Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 커스텀 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, VA 20171)이다. 최적화된 코돈을 위한 공개적으로 이용가능한 다른 데이터베이스가 입수가능하며, 또한 일부 실시양태에서 동등하게 작용할 수 있다.

"돌연변이"는 기준 서열과 비교한 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 변화이다.

"뉴클레오티드"는 DNA 서열 - 아데닌(A), 티민(T), 구아니딘(G), 및 시토신(C)을 포함하는 4개의 염기 중 하나를 나타낸다.

"크실라나제(Xylanase)"는 크실라나제, 만나나제 및/또는 글루카나제 활성을 갖는 효소이다.

"유닛"(U로 약기함)은 pH 6.5 및 40℃에서 분당 1 μ몰의 환원당으로서 정의된다.

실시예 1

발현 증강 변이체의 제조 방법

서열 번호 3을 기초로 하여 유전자 발현을 향상시키기 위해서 DNA 수준에서 돌연변이시켜 2종의 변이체(서열 번호 1 및 서열 번호 2)를 고안하였다. 2종의 돌연변이 변이체의 고안은, 2차원, 3차원의 DNA 서열 구조와, 숙주의 바람직한 코돈을 고려하였는데, 이들은 모두 유전자 발현에 영향을 미칠수 있다. PCR 프라이머에 돌연변이를 도입하였다. 표준 분자 클로닝 기법을 이용하여 유전자 둘다를 PCR 증폭시키고 슈도모나스(Pseudomonas) 벡터 pDOW1169(DOW AgroSciences, IN)로 클로닝하였다. 생성된 발현 구성물을 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) DC454(DOW AgroSciences, IN)로 형질전환시키고 단백질 발현 수준을 측정하였다. 서열 번호 1에 의한 형질전환체를 리드(lead)로서 고안하였으며, 이는 모서열인 서열 번호 3에 비하여 유의적으로 향상된 발현 수준을 나타내었다.

실시예 2

변이체의 발현 수준을 시각적으로 측정하는 SDS-PAGE의 제조 방법. Criterion^TM precast 트리스-HCl 폴리아크릴아미드 겔(Bio-rad Laboratories, Inc)를 사용하여 단백질을 분리하였다. 트리스-글리신 완충액을 사용하여 150V에서 겔을 조작하였다(도 1). 단백질 로딩을 표준화하여 각 레인에서 0.33 OD₆₀₀ 세포로부터의 단백질을 로딩하였다. SeeBlue® 사전 염색한 단백질 표준물을 사용하였다(Life Technologies). 도 1에 도시된 바와 같이, 서열 번호 2의 발현 수준은 모서열인 서열 번호 3 및 서열 번호 1의 발현 수준보다 낮았다.

실시예 3

변이체에 대한 상대적 발현 수준의 측정 방법

서열 번호 1, 2 및 3 유전자를 진탕 플라스크에서 발현시켰다. 배양물을 30℃ 및 220 rpm에서 고안된 복합 매질에서 OD600이 ~19가 되도록 증식시키고, 24 시간 동안 0.3 mM IPTG(이소프로필β-D-1-티오갈락토피라노시드)로 유도하였다. 세포를 수거하고 65℃에서 1 시간 동안 열처리 또는 음파 처리에 의해 용해시켰다. 기질로서 밀 아라비노크실란을 사용한 Nelson-Somogyi 환원당 분석에 의해 크실라나제 활성을 측정하였다. (Roger A. O'Neill, Alan Darvill, Peter Albersheim, A fluorescence assay for enzymes that cleave glycosidic linkages to produce reducing sugars, Analytical Biochemistry, Volume 177, Issue 1, (1989)11-15). 도 2에 도시된 바와 같이 U/ml로서 활성 수준을 측정하여 각 배양물로부터의 상대적 발현 수준을 결정하였다. 유닛(U로 약기함)은 pH6.5 및 40℃에서 분당 1 μ몰의 환원당으로서 정의된다. 이 분석에 있어서 분석에 대한 비활성(specific activity)은 533 유닛/mg 단백질로 측정되었다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 서열 번호 2의 발현 수준은 모서열인 서열 번호 3 및 서열 번호 1의 발현 수준보다 낮았다.

SEQUENCE LISTING <110> Verenium Corporation <120> Genes With Codon Mutations Encoding Xylanase <130> VEREN.068WO/D2540-1WO <140> Filed herewith <141> Filed herewith <150> US 61/777,348 <151> 2013-03-12 <150> GB 1308853.9 <151> 2013-05-16 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 1 atggcgtcga cgttttactg gcacaattgg acggatggta tcgggaccgt aaatgcgacc 60 aatggctccg acggcaatta cagcgtttca tggtcaaatt gcgggaattt tgttgttggt 120 aaaggctgga ctaccggatc agcaactagg gtaataaact ataatgccca cgccttttcg 180 ccggtgggta atgcttattt ggctctttat gggtggacga gaaattcact catagaatat 240 tacgtcgttg atagctgggg gacttataga cctactggaa cttataaagg cactgtgact 300 agtgatggag ggacttatga catatacacg actacacgaa ccaacgcacc ttccattgac 360 ggcaataata caactttcac ccagttctgg agtgttaggc agtcgaagag accgattggt 420 accaacaata ccatcacctt tagcaaccat gttaacgcct ggaagagtaa aggaatgaat 480 ttggggagta gttggtctta tcaggtatta gcaacagagg gctatcaaag tagtgggtac 540 tctaacgtaa cggtctggtg a 561 <210> 2 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 2 atggcgtcga cgttttactg gcacaattgg acggatggta ttgggaccgt aaatgcgacc 60 aatggctccg atggcaatta cagcgtttca tggtcaaatt gcgggaattt tgttgttggt 120 aaaggctgga ctaccggatc agcaactagg gtaataaact ataatgccca cgccttttcg 180 ccggtgggta atgcttattt ggctctttat gggtggacga gaaattcact catagaatat 240 tacgtcgttg atagctgggg gacttataga cctactggaa cttataaagg cactgtgact 300 agtgatggag ggacttatga catatacacg actacacgaa ccaacgcacc ttccattgac 360 ggcaataata caactttcac ccagttctgg agtgttaggc agtcgaagag accgattggt 420 accaacaata ccatcacctt tagcaaccat gttaacgcct ggaagagtaa aggaatgaat 480 ttggggagta gttggtctta tcaggtatta gcaacagagg gctatcaaag tagtgggtac 540 tctaacgtaa cggtctggtg a 561 <210> 3 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 3 atggcttcga cattctactg gcacaattgg actgatggta tagggacagt aaatgctacc 60 aatggatctg atggcaatta cagcgtttca tggtcaaatt gcgggaattt tgttgttggt 120 aaaggctgga ctaccggatc agcaactagg gtaataaact ataatgccca cgccttttcg 180 ccggtgggta atgcttattt ggctctttat gggtggacga gaaattcact catagaatat 240 tacgtcgttg atagctgggg gacttataga cctactggaa cttataaagg cactgtgact 300 agtgatggag ggacttatga catatacacg actacacgaa ccaacgcacc ttccattgac 360 ggcaataata caactttcac ccagttctgg agtgttaggc agtcgaagag accgattggt 420 accaacaata ccatcacctt tagcaaccat gttaacgcct ggaagagtaa aggaatgaat 480 ttggggagta gttggtctta tcaggtatta gcaacagagg gctatcaaag tagtgggtac 540 tctaacgtaa cggtctggtg a 561 <210> 4 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Obtained from an environmental sample <400> 4 Met Ala Ser Thr Phe Tyr Trp His Asn Trp Thr Asp Gly Ile Gly Thr 1 5 10 15 Val Asn Ala Thr Asn Gly Ser Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ser Trp Ser 20 25 30 Asn Cys Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ala 35 40 45 Thr Arg Val Ile Asn Tyr Asn Ala His Ala Phe Ser Pro Val Gly Asn 50 55 60 Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Ser Leu Ile Glu Tyr 65 70 75 80 Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys 85 90 95 Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Thr 100 105 110 Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Asp Gly Asn Asn Thr Thr Phe Thr Gln 115 120 125 Phe Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Pro Ile Gly Thr Asn Asn Thr 130 135 140 Ile Thr Phe Ser Asn His Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Gly Met Asn 145 150 155 160 Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Val Thr Val Trp 180 185

Claims

서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열.
제1항에 있어서, 상기 서열은 단백질을 코딩하는 것인 뉴클레오티드 서열.
T6G, A12G, C15T, T33G, A42C, A48C, T57G, A66C, T69C, T72C, 또는 이의 임의의 조합에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 환경적 공급원으로부터 유도된 크실라나아제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 3의 뉴클레오티드 서열에 대하여 T6G, A12G, C15T, T33G, A42C, A48C, T57G, A66C, T69C, T72C 또는 이의 임의의 조합에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제3항 또는 제4항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는 침묵 돌연변이인 뉴클레오티드 서열.
제3항 또는 제4항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이는, 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않고 그 외에는 제3항 또는 제4항의 뉴클레오티드 서열과 상이하지 않은 뉴클레오티드 서열보다 더 높은 수준에서 상기 크실라나아제의 발현을 유도하는 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 뉴클레오티드 서열을 생성하는 것인 뉴클레오티드 서열.
크실라나아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로서, 돌연변이가 없는 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준과 비교하였을 때 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 단백질의 발현 수준을 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열.
제7항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 침묵 돌연변이인 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 4의 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 단백질의 발현 수준이 제2 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 상기 단백질의 것에 비해 증가되도록 서열 번호 4를 코딩하는 제2 서열에 대하여 돌연변이된 것인 제1 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 1, 또는 2와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편으로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 T6G, A12G, C15T, T33G, A42C, A48C, T57G, A66C, T69C, T72C, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드 서열.
제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고, 이때 폴리펩티드는 재조합 세균 발현계에서 생성되는 것인 뉴클레오티드 서열.
제11항에 있어서, 세균 발현계는 그람 음성 세균 발현계인 뉴클레오티드 서열.
제12항에 있어서, 그람 음성 세균 발현계는 슈도모나스(Pseudomonas), 이. 콜라이(E. coli), 랄스토니아(Ralstonia), 또는 카우로박터(Caulobacter) 발현계인 뉴클레오티드 서열.
제13항에 있어서, 슈도모나스 발현계는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 발현계인 뉴클레오티드 서열.
제12항에 있어서, 크실라나아제는 적어도 65 U/ml, 70 U/ml, 75 U/ml, 80 U/ml, 85 U/ml, 90 U/ml, 95 U/ml, 100 U/ml, 105 U/ml, 110 U/ml, 115 U/ml, 120 U/ml, 125 U/ml, 130 U/ml, 135 U/ml, 140 U/ml, 145 U/ml, 150 U/ml, 155 U/ml, 160 U/ml, 165 U/ml, 170 U/ml, 175 U/ml, 180 U/ml로 생성되는 것인 뉴클레오티드 서열.
제9항에 있어서, 폴리펩티드는 신호 서열, 프로단백질(proprotein) 서열, 프로모터 서열, 또는 이의 임의의 조합을 갖지 않는 것인 제1 뉴클레오티드 서열.
제9항에 있어서, 폴리펩티드는 신호 서열, 태그, 에피토프, 프로모터 서열, N-말단 연장부, C-말단 연장부, 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 이종 서열을 추가로 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열.
제9항에 있어서, 폴리펩티드는 적어도 제2 효소를 추가로 포함하는 것인 제1 뉴클레오티드 서열.
제18항에 있어서, 제2 효소는 락타아제, 리파아제, 프로테아제, 카탈라아제, 크실라나아제, 셀룰라아제, 글루카나아제, 만나나아제, 아밀라아제, 아미다아제, 에폭시드 히드로라아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 트랜스아미나아제, 아민 옥시다아제, 셀로비오히드로라아제, 암모니아 리아제, 또는 이의 임의의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 제1 뉴클레오티드 서열.
서열 번호 1을 포함하는 핵산 서열을 갖는 단리된, 재조합 또는 합성 뉴클레오티드로서, 핵산 서열은 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드.
서열 번호 1의 핵산 서열을 포함하는 단리된, 재조합 또는 합성 뉴클레오티드로서, 핵산 서열은 크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하고 폴리펩티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열, 또는 이의 효소 활성 단편을 포함하는 뉴클레오티드.
크실라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 번호 1을 포함하는 단리된, 재조합 또는 합성 핵산 서열로서, 폴리펩티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고 폴리펩티드는 재조합 슈도모나스 플루오레센스 발현계에서 생성되는 핵산 서열.