KR20150112999A - 효모 및 곰팡이를 검출하기 위한 방법 및 배양 장치 - Google Patents

효모 및 곰팡이를 검출하기 위한 방법 및 배양 장치 Download PDF

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KR20150112999A
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hydrogel
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사일라자 찬드라파티
테라 엠. 노르드비
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쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
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Abstract

샘플 내의 효모 및 곰팡이 미생물을 검출하기 위한 박형 필름 배양 장치가 제공된다. 배양 장치는 제1 주 표면 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 기재(self-supporting substrate)를 포함하는 본체; 기재의 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제1 접착제 조성물; 제1 접착제 조성물에 접착된 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물; 및 복수의 지시제들을 포함한다. 복수의 지시제들은 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 3개의 지시제, 알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제, 및 포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함하며, 복수의 지시제들의 각각은 검출가능한 리포터 기를 포함한다. 배양 장치의 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

효모 및 곰팡이를 검출하기 위한 방법 및 배양 장치{METHOD AND CULTURE DEVICE FOR DETECTING YEASTS AND MOLDS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2013년 2월 25일자로 출원된 미국 특허 출원 제13/775,495호 및 2013년 2월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/760,412호의 이득을 주장하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
효모 및 곰팡이는 진핵 미생물이다. 이들은 천연 환경, 즉 토양, 공기, 물, 및 식물 표면 어디에나 존재한다. 이들의 종속영양 성질 및 광범위한 환경 조건에 적응하는 이들의 능력으로 인해, 이들 미생물은 식품 성분, 가공 식품, 음료를 비롯한 다양한 상품, 부적절하게 세정된 식품 가공 장비, 및 식품 저장 시설 내 및 상에서 고비용 유해물(expensive nuisance)로서 자주 접하게 된다. 게다가, 일부 효모 및 곰팡이는 인간 및 동물 건강에 잠재적 위험성을 갖는다. 예를 들어, 다수의 곰팡이는 마이코톡신(mycotoxin)을 생산하고, 일부 효모 및 곰팡이는 인간 및 동물 감염의 원인이 된다.
식품 및 기타 상품에서의 효모 또는 곰팡이 오염은 생산자, 가공자, 및 소비자에게 실질적으로의 경제적 손실을 가져올 수 있다. 상품(예컨대, 식품 성분, 가공 식품, 및 음료)에서의 효모 및/또는 곰팡이 오염의 신속하고 정확한 결정은 식품 산업에서 고품질 식품 제품의 생산에 중요하다.
식품 상품에서의 효모 및 곰팡이의 일상적인 결정에 대한 현행 방식은 반고형 한천 배지 상에서의 생존 진균 세포를 계수하기 위한 종래의 배양 기법에 대체로 의지한다. 이들 방법은, 널리 받아들여지고 있기는 하지만, 이들이 일반적으로 노동 집약적이고 낮은 재현성을 제공한다는 점에서 다수의 불리한 점을 갖는다. 게다가, 전통적인 방법에서 접하게 되는 흔한 문제는, 소정 곰팡이의 확산형(spreading type)의 균사 성장(mycelial growth)이 종종 콜로니 부근에서 급속히 진행되고(over-run) 샘플 내의 생존 세포들의 정확한 계수를 방해한다는 것이다.
가장 중요한 것은, 이들 방법 중 대부분은, 정확한 정량적인 결과를 얻을 수 있기 전에, 25℃에서의 5일간의 인큐베이션 기간을 필요로 한다는 것이다. 이들 방법의 오랜 인큐베이션 기간은, 오염성 효모 및/또는 곰팡이의 존재 또는 농도를 최종으로 알기까지, 식품 제품이 수 일 동안 저장되는 것을 필요로 할 수 있다. 따라서, 개선된 검사 및 관련 재료에 대한 필요성이 있다. 검사 절차가 간소화될 수 있고, 검사 결과가 더 짧은 기간 내에 얻어질 수 있다면, 제조자는 제품 발매가 가능할 것이며; 그럼으로써 제품 품질 및 완전성(integrity)을 희생시키지 않고서 저장 비용을 감소시킬 것이다.
본 발명은 대체로 샘플 내의 효모 또는 곰팡이 미생물을 검출하기 위한 배양 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 접착제 조성물 중에 고농도로 배치된 복수의 지시제(indicator agent)들을 포함하는 건성인 재구성가능 배양 장치(dry, reconstitutable culture device)에서의 효모 및 곰팡이 미생물의 신속한 검출에 관한 것이다. 복수의 지시제들은 알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제, 포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제, 및 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 3개의 지시제를 포함한다. 유리하게는, 복수의 지시제들은 매우 다양한 느리게 성장하는 효모 및 곰팡이 미생물의 검출 및 계수를 가능하게 한다. 더욱 더 유리하게는, 특정 지시제들 - 이들의 농도와 함께 미생물에 대해 이들 지시제를 제공하기 위한 수단-은 120시간 미만 이내에, 그리고 바람직하게는 72시간 미만 이내에 효모 및 곰팡이 미생물의 검출 및 계수를 가능하게 한다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치는 맥아 추출물을 포함할 수 있다. 유리하게는, 맥아 추출물은 복수의 지시제들과 협동 작용하여, 달리 가능한 것보다 더 신속한 효모 및/또는 곰팡이 콜로니의 검출을 제공한다.
일 태양에서, 본 발명은 배양 장치를 제공한다. 배양 장치는 제1 주 표면 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 기재(self-supporting substrate)를 포함하는 본체, 기재의 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제1 접착제 조성물, 제1 접착제 조성물에 접착된 실질적으로 건성인(substantially dry) 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물, 및 복수의 지시제들을 포함할 수 있다. 복수의 지시제들은 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 3개의 지시제, 알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제, 및 포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함하며, 복수의 지시제들의 각각은 검출가능한 리포터 기(reporter group)를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치는 본체 부재에 부착되는 커버 시트를 추가로 포함할 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 배양 장치는 본체 부재에 부착되는 커버 시트를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 커버 시트는 본체 부재와 대면하는 제1 주 표면을 포함할 수 있고; 배양 장치는 커버 시트의 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제2 접착제 조성물 및 제2 접착제 조성물에 접착된 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제2 하이드로겔-형성 조성물을 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 적어도 3개의 지시제는 알파-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물, 베타-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물, 및 베타-갈락토시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물을 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 적어도 하나의 영양소는 맥아 추출물을 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 배양 장치는 개구부(aperture)를 갖는 수-불용성 스페이서(spacer)를 추가로 포함할 수 있으며, 스페이서는 본체 부재 또는 커버 시트에 부착되고, 개구부 전체는 본체 부재와 커버 시트 사이에 위치된다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 복수의 지시제들 중 적어도 하나는 제1 접착제 조성물, 제2 접착제 조성물, 제1 하이드로겔-형성 조성물, 및/또는 제2 하이드로겔-형성 조성물 내에 배치될 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 것에서, 제1 하이드로겔-형성 조성물 또는 제2 하이드로겔-형성 조성물은 효모 또는 곰팡이 미생물을 성장시키기 위한 적어도 하나의 영양소를 포함할 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 샘플 내의 효모 및 곰팡이의 검출 방법을 제공한다. 본 방법은 샘플 및 수성 액체를 배양 장치의 겔화제와 접촉시켜, 접종된 배양 장치를 형성하는 단계, 접종된 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계, 및 배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 배양 장치는 제1 주 표면 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 기재, 기재의 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제1 접착제 조성물, 제1 접착제 조성물에 접착된 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물, 및 복수의 지시제들을 포함한다. 복수의 지시제들은 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 3개의 지시제, 알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제, 및 포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함하며, 복수의 지시제들의 각각은 검출가능한 리포터 기를 포함한다. 선택적으로, 배양 장치는 커버 시트를 포함하며, 커버 시트는 그 위에 배치된 제2 접착제 조성물, 및 제2 접착제 조성물에 접착된 냉수-가용성 제2 하이드로겔-형성 조성물을 포함한다. 제1 하이드로겔-형성 조성물 또는, 존재한다면 제2 하이드로겔-형성 조성물은 겔화제, 및 선택적으로 효모 또는 곰팡이 미생물을 성장시키기 위한 적어도 하나의 영양소를 포함한다. 복수의 지시제들의 각각은 제1 접착제 조성물, 제2 접착제 조성물, 제1 하이드로겔-형성 조성물, 또는 제2 하이드로겔-형성 조성물 내에 배치된다. 임의의 실시 형태에서, 본 방법은 접종된 배양 장치를 인큐베이팅한 후에, 접종된 배양 장치 내에 존재하는 효모 또는 곰팡이 콜로니를 계수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 검출하는 단계는 복수의 지시제들 중 적어도 하나의 검출가능한 리포터 기의 존재 또는 부재를 배양 장치에서 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 검출가능한 리포터 기의 존재의 검출은 효모 또는 곰팡이 미생물들의 콜로니의 존재를 나타낸다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분말"은 본 발명의 박형 필름 배양 장치(thin film culture device)(들)에서 사용하기에 적합한 평균 직경, 바람직하게는 약 10 내지 400 마이크로미터의 직경, 더 바람직하게는 약 30 내지 90 마이크로미터의 직경을 갖는 하나 이상의 겔화제 또는 영양소의 미립자형 물질을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "재구성된 배지"는 수성 액체를 사용하여 냉수-가용성 분말을 재구성함으로써 형성되는 용액 또는 겔을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "냉수-가용성 분말"은 수성 검사 샘플과 배합될 때 실온의 물(예를 들어, 약 18℃ 내지 24℃)에서 겔을 형성하는 분말을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "미생물 및 수증기에 실질적으로 불투과성인"은 박형 필름 배양 장치(들)의 운송, 저장, 및 사용 동안 냉수-가용성 분말 아래에 놓인 층들의 원치 않는 오염 및 수화를 방지하고, 재구성된 배지가 인큐베이션 기간 동안 미생물의 성장을 지지하기에 적합하도록 재구성된 배지의 건조를 피하는 커버 시트를 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "선택제(selective agent)"는 한 유형의 미생물(예를 들어, 세균)의 성장을 또 다른 한 유형의 미생물(예를 들어, 효모 또는 곰팡이)의 성장에 비하여 억제함으로써, 본 발명에 따른 박형 필름 배양 장치(들) 상에서 성장되는 미생물의 성장 및/또는 확인을 용이하게 하도록 기능하는 임의의 원소, 화합물, 또는 조성물을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "효모"는 분열 및/또는 출아에 의해 무성생식으로 번식되는 자낭균 문(phylum Ascomycota)의 전형적으로 단세포인 진균을 말한다. 효모는 검사 샘플 내에 집합적으로 공존하거나 존재하는 하나 이상의 종을 포함한다. 용어 "효모들"은 또한, 예를 들어 검사 샘플 내에서 발견되는 다수의 효모들을 말한다. 용어 "효모" 또는 "효모들"은 임의의 주어진 수의 이들 종을 의미하는 것으로 제한되지 않으며, 아직 발견되지 않았지만 나중에 당업자에 의해 확인되어서 이 정의 내에 포함될 수 있는 종을 배제하는 것으로 의미되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "곰팡이"는 현미경적(microscopic) 진균을 말한다. 이 용어는 임의의 주어진 수의 이들 종을 의미하는 것으로 제한되지 않으며, 아직 발견되지 않았지만 나중에 당업자에 의해 확인되어서 이 속(genus) 내에 포함될 수 있는 종을 배제하는 것으로 의미되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "검사 샘플"은 식품 제품, 인간 또는 동물 검사 대상체, 제약품 또는 화장품, 토양, 물, 공기 또는 기타 환경 공급원, 또는 효모 및 곰팡이 농도를 결정해야 하는 임의의 다른 공급원으로부터 취해진 성분 또는 일부분을 말한다. 예를 들어 주입(pouring), 피펫팅(pipetting), 면봉 채취(swabbing), 여과, 및 접촉을 비롯한 당업자에게 알려진 기법을 사용하여 공급원으로부터 검사 샘플이 취해질 수 있다. 게다가, 검사 샘플은, 예를 들어 블렌딩, 스토마칭(stomaching), 균질화, 농축, 선택적 농축, 또는 희석등을 비롯한 당업계에 알려진 다양한 샘플 준비 과정을 거칠 수 있다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 환경 하에서 소정의 이득을 제공할 수 있는 본 발명의 실시 형태를 말한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에서 다른 실시 형태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시예의 언급은 다른 실시예가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시예를 배제하고자 하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어, "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "단수형의" 지시제를 포함하는 배양 장치는 이 배양 장치가 "하나 이상의" 지시제를 포함할 수 있음을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 모두를 또는 열거된 요소들 중 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 설명은 그 범위 이내에 포함된 모든 수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
본 발명의 특징 및 이점은 바람직한 실시 형태에 대한 상세한 설명, 및 첨부된 청구범위의 고려시에 이해될 것이다. 본 발명의 이들 특징 및 이점은 본 발명의 다양한 예시적인 실시 형태와 관련하여 하기에 설명될 수 있다.
본 발명의 상기의 개요는 본 발명의 각각의 개시되어 있는 실시 형태 또는 모든 구현예를 설명하고자 하는 것은 아니다. 이하의 도면들과 상세한 설명은 예시적인 실시예를 더욱 구체적으로 예시한다. 다른 특징, 목적 및 이점들은 상세한 설명 및 도면과 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
도 1은 본 발명의 장치의 단면도로서, 여기에는 소정의 특징부들이 도시되어 있다.
도 2는 본 발명에 따른 배양 장치의 일 실시 형태의, 부분 단면 상부 사시도이다.
도 3은 본 발명에 따른 배양 장치의 대안적인 일 실시 형태의 상부 사시도이다.
도 4는 도 2의 선 4-4를 따라 취해진 배양 장치의 단면도이다.
도 5는 미세다공성 막(microporous membrane) 상에 인쇄된 격자 패턴을 나타내는 도 2의 배양 장치의 상면도이다.
본 발명의 실시 형태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그의 응용에 있어서 하기의 설명에 기재되거나 하기의 도면에 도시되는 구성요소의 구성 및 배열의 상세 사항으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 실시 형태 및 다양한 방식으로 실행 또는 실시될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 어법 및 용어는 설명의 목적을 위한 것으로, 제한으로서 여겨져서는 안 된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 "구비하는", "포함하는", 또는 "갖는" 및 이들의 변형의 사용은 그 뒤에 열거된 항목 및 그 등가물뿐만 아니라 추가 항목을 포함하는 것으로 의미된다. 달리 명시되거나 제한되지 않는 한, "연결된" 및 "결합된"이라는 용어 및 이들의 변형은 광범위하게 사용되고, 직접 및 간접 둘 모두의 연결 및 결합을 포괄한다. 또한, "연결된" 및"결합된"은 물리적인 또는 기계적인 연결 또는 결합으로 제한되지 않는다. 다른 실시 형태가 이용될 수 있으며, 구조적 또는 논리적 변화가 본 발명의 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다. 더욱이, "전방", "후방", "상부", "기저부" 등과 같은 용어는, 단지 요소들이 서로 관련될 때 요소들을 설명하기 위해 사용되지만, 결코 장치의 특정 배향을 말하거나, 필요한 또는 요구되는 장치의 배향을 암시 또는 나타내거나, 본 명세서에 설명된 본 발명이 사용 중에 어떻게 사용, 장착, 디스플레이 또는 배치될 것인지를 명시함을 의미하지 않는다.
효모 및 곰팡이는 대부분의 다른 단세포 미생물에 유해한 소정(예를 들어, 낮은 수분 활성, 저 pH) 환경에서 생존을 유지하는 어디에나 존재하는 진핵 미생물이다. 식품 부패 지표 유기체로서 분류된 효모 및 곰팡이에 대한 검사는 모든 일상적으로 수행되는 지표-유기체 검사의 약 14%를 구성하는데, 그 이유는 효모 및 곰팡이 미생물은 다양한 상품(예를 들어, 식품 성분, 가공 식품, 음료), 부적절하게 세정된 식품 가공 장비, 및 식품 저장 시설 내 및 상에서 고비용 유해물로서 자주 접하기 때문이다. 게다가, 일부 효모 및 곰팡이는 인간 및 동물 감염의 원인 물질(causative agent)로서 임상적 관련을 갖는다.
효모 및 곰팡이에 대한 전통적인 검사는, 전형적으로 한천 배지 상에서 또는 박형 필름 배양 장치, 예컨대 쓰리엠 페트리필름 효모 및 곰팡이 카운트 플레이트(3M PETRIFILM Yeast & Mold Count Plate)(미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니(3M Company)로부터 입수가능함) 내에서 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 샘플 내의 효모 및 곰팡이를 검출하기 위한 박형 필름 배양 장치는, 예를 들어 미국 특허 제5,089,413호에 기재되어 있으며, 이 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 전통적인 검사 방법은 정확한 카운트를 얻기 위하여 최대 5 내지 7일의 기간 동안 검사 플레이트를 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 결과를 얻는 데 걸리는 이러한 비교적 긴 시간은, 정상 저장 조건 동안 식품 제품의 품질 및/또는 안전성에 불리한 영향을 줄 수 있는 효모 또는 곰팡이 미생물을 식품 제품이 함유하는지의 여부를 결정하기 위하여, 식품 제조자가 최대 7일 동안 사전에 식품 제품을 보유해두어야 할 수 있다.
쓰리엠 페트리필름 효모 및 곰팡이 카운트 플레이트에서 사용되는 배양 배지를 비롯한 일부 배양 배지는, 효모 또는 곰팡이 미생물에 의해, 검출가능한(예를 들어, 광 흡수, 반사, 및/또는 형광에 의해 검출가능한) 생성물로 변환되는 적어도 하나의 지시 시약(예를 들어, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 나트륨 염)을 포함한다. 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,387,650호는 검사 샘플 내의 효모 및 진균을 검출하기 위한 조성물을 개시하는데, 여기서 조성물은, 이들 미생물에서 발견되는 상응하는 효소 활성에 의해 가수분해될 때, 동일한 유형의 검출가능한 신호(예를 들어, 형광)를 야기하거나 생성하는 3개의 효소 기질을 포함한다. 하나의 효소 기질은 글리코시다제 효소 활성에 의해 가수분해되고, 두 번째 효소 기질은 펩티다제 효소 활성에 의해 가수분해되고, 세 번째 효소 기질은 포스파타제 효소 활성에 의해 가수분해된다. 이 특허에서, 타운센드(Townsend) 및 첸(Chen)은 배양 장치에서의 지시 시약을 함유하는 배지의 사용을 추가로 기재하는데, 이는 검사 샘플 내의 미생물들의 최확수(most probable number, MPN)의 계산을 가능하게 한다.
첸 및 구(Gu)(미국 특허 제5,854,011호; 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)는 샘플 내의 효모 및/또는 곰팡이를 검출하기 위한 방법 및 조성물을 기재하는데, 여기서 조성물은 아미노펩티다제 효소 기질, 및 검사 샘플에 대해 내인성인 아미노펩티다제 활성을 억제하기에 유효한 양의 아미노펩티다제 효소 활성의 억제제를 포함한다. 실시예 1에서, 첸 및 구는 포스파타제, β-글루코시다제, 및 α-글루코시다제 효소가, 검사된 미생물들의 64% 이하에서 발견되었기 때문에, 이들 효소가 샘플 내의 총 효모 및 곰팡이를 검출하기 위한 표적 효소로서 사용되기에는 부적합하다고 결론짓는다.
첸 및 구에 의해 입증된 바와 같이, 천연에서 발견되는 매우 다양한 효모 및 곰팡이를 검출할 수 있는 효소 기질을 찾는 것은 어렵다. 본 발명의 진보적인 물품 및 방법은 다양한 효모 및 곰팡이의 검출을 제공한다. 게다가, 본 발명의 물품 및 방법은 효모 및 곰팡이 미생물의 신속한 검출을 제공할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 연구자들은 맥아 추출물을 포함하는 영양소 배지 내에 지시제들의 특유의 조합을 포함하는 조성물을 알아내었다. 본 발명의 배양 장치에서, 조성물은 다양한 효모 및 곰팡이 미생물의 신속한 검출에 적합하다.
일 태양에서, 본 발명은 샘플 내의 효모 및 곰팡이 미생물을 검출하기 위한 배양 장치를 제공한다. 배양 장치의 성분들은, 수성 액체와 접촉될 때, 효모 및 곰팡이(예를 들어, 사상 진균) 미생물을 배양하는 데 사용되는 수성 배양 배지를 형성하도록 협동 작용할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 배양 배지는 효모 및 곰팡이의 성장을 지지하는 데 필요한 모든 또는 실질적으로 모든 영양소를 포함하는 혼합물일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 효모 및 곰팡이 미생물의 성장을 지지하기 위한 하나 이상의 영양소가 샘플 내에 제공될 수 있다.
본 발명의 배양 장치는 당업계에 알려진 다른 장치 및 방법과 비교하여 개선된 검출(즉, 감소된 검출 시간, 지정된 인큐베이션 기간 내에 효모 및 곰팡이 미생물의 더 포괄적인 검출)을 제공한다. 일부 태양에서, 본 발명의 배양 장치는 미국 특허 제4,565,783호; 제5,089,413호; 및 제5,681,712호에 개시된 박형 필름 배양 장치에 관한 것이며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 배양 장치와 함께 사용하기에 적합한 샘플은 다양한 공급원으로부터 얻어지거나 유래될 수 있다. 용어 "공급원"은 일반적으로 미생물에 대하여 검사하기를 원하는 식품 또는 비식품을 말하기 위하여 사용된다. 공급원은 고형물, 액체, 반고형물, 젤라틴성 물질, 가스(예를 들어, 공기) 및 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 공급원은, 예를 들어 관심있는 표면으로부터 또는 공기로부터 공급원을 수집하는 데 사용된 포착 요소(capture element)(예를 들어, 필터 막, 면봉, 직물, 또는 스폰지)에 의해 제공될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플 액체는 포착 요소를 포함할 수 있으며, 포착 요소는 관심있는 임의의 미생물 및 공급원의 회수를 향상시키기 위하여 (예를 들어, 교반 또는 용해 과정 동안) 추가로 파쇄될 수 있다. 관심있는 표면은 (문을 포함하는) 벽, 바닥, 천장, 배수구, 냉동 시스템, 덕트(예를 들어, 통풍관), 통기구, 변좌, 핸들, 문 손잡이, 핸드레일(handrail), 조리대, 테이블 표면(tabletop), 식기 표면(eating surface)(예를 들어, 트레이, 접시 등), 작업 표면, 장비 표면, 의류 등, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 표면의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 상기 공급원 전부 또는 일부분이 본 방법에서 사용될 수 있다. 공급원의 일부분이 사용될 때, 때로 이것은 공급원의 "샘플"로 지칭될 수 있다. 그러나, 용어 "샘플"은 일반적으로, 공급원으로부터 얻어지고 미생물의 검출을 위한 검사 장치 내로 도입되는 물질의 부피 또는 질량의 일부분을 말하기 위하여 본 명세서에서 사용된다.
일반적으로 용어 "식품"은 고형물, 액체(예를 들어, 용액, 분산물, 에멀젼, 현탁액 등 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않음) 및/또는 반고형 식용 조성물을 말하기 위하여 사용된다. 식품의 예에는 육류, 가금류, 난류, 생선, 해산물, 야채류, 과일류, 조리 식품(예를 들어, 수프, 소스, 페이스트), 곡물 제품(예를 들어, 곡분, 시리얼, 빵), 통조림, 밀크, 기타 유제품(예를 들어, 치즈, 요구르트, 사워 크림(sour cream)), 지방, 오일, 디저트, 양념류, 향신료, 파스타, 음료, 물, 동물 사료, 기타 적합한 식용 물질 및 이들의 조합이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
도 1을 참고하면, 본 발명의 장치가 다음 3개의 핵심 특징부를 갖는 본체 부재(10)로서 도시되어 있다: 방수성 기재(waterproof substrate)(12), 공기-투과성 막(14), 및 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물(22). 이들은 임의의 적합한 관계로 배열될 수 있기는 하지만, 도 1은 이들 구성요소의 바람직한 배열을 예시하며, 여기서 공기 투과성 막(14)은 기재(12)의 상부 표면의 적어도 성장 영역(도시되지 않음)에 고정되고 이를 덮는다. 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)은 막(14)의 상부 표면의 적어도 성장 영역에 고정되고 이를 덮는다. 운송, 저장, 및 인큐베이션 동안 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)을 덮기 위한 커버 수단(커버 시트(18))이 또한, 본체 부재(10)의 하나의 에지를 따라 힌지-유사(hinge-like) 방식으로 부착되는 것으로 도 1에 도시되어 있다. 커버 수단은 선택적이지만 본 발명의 장치에서 바람직하다. 적합한 기재, 제1 하이드로겔-형성 조성물 및 커버 수단은 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 것들을 포함하며, 이 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
기재(12)는 비교적 강성인 필름(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌) 또는 내수성 코팅을 위에 갖는 비교적 강성인 종이 또는 판지 - 이는 물을 흡수하지 않거나 달리 물에 의한 영향을 받지 않을 것임 - 일 수 있다. 대략 100μ 내지 180μ 두께의 폴리에스테르 필름, 대략 100μ 내지 200μ 두께의 폴리프로필렌 필름, 및 대략 300μ 내지 380μ 두께의 폴리스티렌 필름이 기재(12)에 적합한 재료의 비제한적인 예이다. 기재(12)는 기재를 통해 미생물 콜로니를 관찰하기를 원하는지의 여부에 따라 투명하거나 또는 불투명할 수 있다. 미생물 콜로니의 카운팅을 용이하게 하기 위하여, 기재(12)에는 선택적으로 격자 패턴(예를 들어, 정사각형들; 도시되지 않음)이 그 위에 인쇄될 수 있다.
공기-투과성 막(14)은, 장치에 접종한 후에 커버 시트(18)가 정위치에 있을 때, 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)에 대한 공기의 적절한 공급을 가능하게 한다. 그렇게 함에 있어서, 막(14)은 장치 내에서의 호기성 미생물의 성장을 지지하는 데 유용하다. 막의 공기 투과성으로 인해, 그리고 막이 그의 에지(들)에서 공기에 실질적으로 노출됨으로 인해, 공기는 막의 에지(들) 내로 지나가고, 수평으로 막을 통과하고, 배지 내로 지나갈 수 있다. 특정 막에 대한 공기의 수평 통과는 막의 수직 공기 투과성(즉, 막의 상부 및 하부 표면에 대해 직각인 방향으로의 투과성)을 평가함으로써 가장 편리하게 추정된다. 합성 또는 천연 재료의 미세다공성 필름 및 미세다공성 부직 웨브를 비롯한 적합한 공기 투과성 막(14) 재료는 미국 특허 제5,089,413호에 기재되어 있으며, 이 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 바람직한 막 재료의 비제한적인 예는 미세다공성 폴리올레핀 필름(트레데거 엑사이어(TREDEGAR EXXAIRE) 필름; 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 트레데거 필름 프로덕츠(Tredegar Film Products))이다.
임의의 실시 형태에서, 미생물 콜로니의 카운팅을 용이하게 하기 위하여, 도 5에 도시된 바와 같이, 막(14)에는 가시적인 정사각형 그리드 패턴이 그 위에 인쇄되어 있다. 본 발명의 장치는 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 장치는 하기에 상세히 기재된 바와 같이 일반적인 실험 장비를 사용하여 제조되거나 또는 수작업으로 제조될 수 있다.
도 2 및 도 4는 본 발명에 따른 장치를 예시한다. 장치(28)는 방수성 기재(12)를 갖는 본체 부재(10')를 포함하며, 방수성 기재(12)는 상부 표면 및 하부 표면을 갖는다. 막(14)의 하부 표면은 기재(12)의 상부 표면의 적어도 성장 영역(도시되지 않음)에 고정된다(예를 들어, 접착제로 고정되거나 또는 달리 부착되는다). 바람직하게는, 기재(12)의 상부 표면은 접착제 층(30)으로 코팅되고, 접착제 층(30)은 막(14)을 고정시키는 데 사용된다. 접착제 층(30)은 바람직하게는 감압성이며, 물에 불용성이며, 의도된 미생물들의 성장에 대해 실질적으로 비억제성이며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 바람직한 접착제는 제1 접착제 조성물(20) 및 제2 접착제 조성물(20')과 관련하여 하기에 논의된 것들을 포함한다. 종종, 적합한 기재는 적합한 접착제로 이미 코팅된 것으로 이용가능하다. 그러나, 필요하다면, 적합한 기재가 선택되고, 적합한 접착제로 (예를 들어, 나이프 코터를 사용하여) 코팅될 수 있다.
기재(12)에 막(14)을 고정시키는 방법은 접착제 층(30)의 성질에 좌우될 것이다. 접착제 층(30)이, 예를 들어 감압성인 경우, 막(14)은 접착제 층(30) 상에 놓이고, 누르고, 그럼으로써 정위치에 접착될 수 있다.
도 2 및 도 3을 참고하면, 기재(12)는 제1 접착제 조성물(20)의 층으로 그의 제1 표면의 일부분 상에 코팅된다. 임의의 실시 형태에서, 제1 접착제 조성물(20)은 본 명세서에 기재된 바와 같이 하나 이상의 지시제(도시되지 않음) 및/또는 하나 이상의 선택제(도시되지 않음)를 포함할 수 있다. 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물(22) - 이는 선택적으로 분말형 영양소(16)를 포함함 - 이 제1 접착제 조성물(20)에 접착된다. 따라서, 제1 접착제 조성물(20)의 두께는 바람직하게는 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)을 구성하는 분말형 겔화제 및/또는 영양소의 입자의 직경보다 더 작아야 한다. 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)의 균일한 단일층은 수화를 위해 충분한 표면적이 노출될 것이 요구된다.
접착된 분말 배지 - 도 2 및 도 3에 예시됨 - 가 준비되고, 먼저 제1 접착제 조성물(20)의 층을 막(14)의 상부 표면의 적어도 성장 영역 상에 형성함으로써 고정된다. 제1 접착제 조성물(20)의 접착제는 바람직하게는 감압성이며, 물에 불용성이며, 의도된 미생물들의 성장에 대해 실질적으로 비억제성이다. 바람직하게는, 제1 접착제 조성물(20)은 또한, 습윤될 때, 미생물 콜로니의 관찰을 가능하게 하기에 충분히 투명하다.
선택적인 커버 시트(18)가 기재(12)에 부착되는다. 임의의 실시 형태에서, 커버 시트(18)는 (예를 들어, 열 밀봉 또는 양면 테이프를 통해) 기재(12)의 하나의 에지에 부착될 수 있다. 커버 시트(18)는 미생물 콜로니의 카운팅을 용이하게 하기 위하여 반투명하거나 바람직하게는 투명하고, 미생물 및 수증기 둘 모두에 대해 실질적으로 불투과성이다. 일반적으로, 커버 시트(18)는 기재(12)와 동일한 특성, 예컨대 투명성 및 바람직한 수분 불투과성을 가질 것이다. 더욱이, 커버 시트(18)에는 그 위에 패턴, 예컨대 정사각형 격자 패턴이 인쇄될 수 있거나, 또는 미생물 콜로니의 카운팅을 돕고/돕거나, 수성 검사 샘플의 배치를 위한 타깃을 제공하고/제공하거나 미적 이유로 마스크-에지(도시되지 않음)를 가질 수 있다. 커버 시트(18)는 효모 및 곰팡이 미생물 - 이들 중 일부는 최적 성장 조건을 위하여 비교적 산소-풍부한 환경을 필요로 함 - 에 필요한 산소 투과량을 제공하도록 선택될 수 있다. 적합한 커버 시트 재료는 미국 특허 제5,681,712호에 개시되어 있다.
커버 수단(예를 들어, 커버 시트(18))에는 어떠한 코팅도 없을 수 있거나, 또는 배지에 걸친 커버 수단의 밀봉을 용이하게 하기 위하여, 예를 들어 감압 접착제의 층으로 건성 배지와 대면하는 표면 상에 코팅될 수 있다. 더욱이, 커버 시트(18)는 선택적으로, 제2 접착제 조성물(20') 및 제2 하이드로겔-형성 조성물(22')의 층들로 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)과 대면하는 표면 상에 코팅될 수 있으며, 이때 제2 접착제 조성물(20') 및 제2 하이드로겔-형성 조성물(22')은 각각 제1 접착제 조성물(20) 및 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)과 동일하거나 상이하다. 커버 시트(18) 상의 코팅은 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)과 대면하는 전체 표면을 덮을 수 있지만, 바람직하게는 배양 장치의 성장 영역을 덮도록 의도된 표면의 적어도 일부분을 덮는다. 그러한 코팅된 커버 시트는, 단독으로의 제1 하이드로겔-형성 조성물 내에 혼입될 수 있는 것보다 더 많은 겔화제를 장치에 제공하도록 요구될 때, 특히 바람직하다.
커버 시트(18)는 바람직하게는 스페이서(24)의 하나의 에지를 따라 힌지-유사 방식으로 접착되며, 선택적으로 제2 접착제 조성물(20') 및 제2 하이드로겔-형성 조성물(22')의 층으로 코팅된다. 임의의 실시 형태에서, 제2 접착제 조성물은 효모 및/또는 곰팡이 미생물을 검출하는 데 사용되는 복수의 지시제들 중 하나 이상(예를 들어, 전부)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 커버 시트(18)는 도 3에 예시된 바와 같이 기재(12)에 직접 접착될 수 있다.
본 발명의 배양 장치(도시되지 않음)가 기재에 부착되는 커버 시트를 포함하지 않을 경우, 접종 전과 후에 장치 및 샘플의 오염 및/또는 건조를 방지하기 위하여 배양 장치는 용기(예를 들어, 페트리 디쉬) 내에 저장되고 인큐베이팅되어야 한다.
또한, 도 2에는, 커버 시트(18)의 적어도 일부분 상에 배치된 선택적인 제2 접착제 조성물(20'); 제2 접착제 조성물(20') 상에 배치된 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제2 하이드로겔-형성 조성물(22'); 및 선택적인 스페이서(24)가 도시되어 있다. 수성 액체(예를 들어, 액체 샘플 및/또는 수성 현탁 매체, 예컨대 물 또는 완충액)로 수화될 때, 제1 하이드로겔-형성 조성물(22) 및/또는 제2 하이드로겔-형성 조성물(22') 내에 존재하는 겔화제는 하이드로겔을 형성한다.
도 2 및 도 4에 도시된 바와 같이, 배양 장치는 기재(12)의 제1 표면, 제1 접착제 조성물(20), 및/또는 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)에 (예를 들어, 열 접합 또는 감압 접착제를 통해) 부착되는 스페이서(24)를 포함할 수 있다. 스페이서(24)는 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)을 노출시키도록 중심을 통해 절취된 개구부(예를 들어, 원형 개구부(26))를 포함한다. 개구부(26)의 벽들은, 수성 액체에 의한 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)의 수화 후에 하이드로겔을 국한시키도록 사전결정된 크기 및 형상의 웰을 제공한다. 개구부(26)는 대체로 배양 장치의 성장 영역의 윤곽을 나타낸다. 스페이서(24)는 원하는 부피, 예를 들어 1, 2 또는 3 밀리리터의 웰을 형성하기에 충분히 두꺼워야 한다. 폐쇄 셀 폴리에틸렌 폼(closed cell polyethylene foam)이 스페이서(24)에 바람직한 재료이지만, 소수성(비-습윤성)이며 미생물에 대하여 불활성이고 멸균을 견딜 수 있는 임의의 재료가 사용될 수 있다. 일부 실시 형태(도시되지 않음)에서, 스페이서는 복수의 개구부들(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 또는 20개의 개구부)을 포함할 수 있으며, 이들 각각에는 서로 상이한 샘플이 접종될 수 있다.
스페이서 부재에 적합한 재료는, 시트 형태로 용이하게 이용가능하지만 미생물 성장 영역이 아닌 임의의 고형 비억제성 천연 또는 합성 물질이다. 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리스티렌은 적합한 합성 재료의 몇몇 예이다. 특히, 비교적 저렴한 구매가능한 폴리스티렌 폼 및 폴리에틸렌 폼이 바람직하다.
스페이서(24)는 비교적 두꺼운 디자인, 예컨대 미국 특허 제5,681,712호에 기재된 것들을 포함할 수 있다. 더 두꺼운(예를 들어, 약 0.5 mm 두께, 약 1 mm 두께, 약 1.5 mm 두께, 및 약 2 mm 두께 이상의) 개구부 형성된 스페이서(24)의 한 가지 목적은 스페이서(24)의 개구부(26) 내에 배치되는 막(예를 들어, 미세다공성 필터 막; 도시되지 않음)을 위치시키고 보호하는 것이다. 더 두꺼운 스페이서(24)의 다른 목적은 커버 시트(18)가 성장 중인 미생물 콜로니와 접촉하는 것을 감소 또는 방지하는 것이다(즉, 성장 표면과 커버 시트(18) 사이에 "헤드 스페이스(head space)"를 제공하는 것이며, 헤드 스페이스는 또한 성장 중인 미생물 콜로니에 대해 증가된 통기를 제공할 수 있다).
제1 접착제 조성물(20), 및 존재한다면 제2 접착제 조성물(20')은 바람직하게는 감압 접착제이다. 더 바람직하게는, 접착제는 알킬 아크릴레이트 단량체와 알킬 아미드 단량체의 공중합체를 포함하는 수-불용성 접착제와 같은 감압 접착제이다. 바람직하게는, 이들 공중합체 내의 알킬 아크릴레이트 단량체 대 알킬 아미드 단량체의 중량비는 약 90:10 내지 99:1, 더 바람직하게는 94:6 내지 98:2이다. 알킬 아크릴레이트 단량체는 아크릴산의 저급 알킬(C2 내지 C10) 단량체를 포함하며, 이에는, 예를 들어 아이소옥틸 아크릴레이트(IOA), 2-에틸헥실 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 아이소아밀 아크릴레이트, 및 이들의 혼합물이 포함되며; 알킬 아미드 단량체는, 제한 없이, 아크릴아미드(ACM), 메타크릴아미드, N-비닐피롤리돈(NVP), N-비닐카프로락탐(NVCL), N-비닐-2-피페리딘, N-(모노- 또는 다이-저급 알킬(C2 내지 C5))(메트)아크릴아미드, N-메틸(메트)아크릴아미드, N,N-다이메틸(메트) 아크릴아미드, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 제1 접착제 조성물(20) 및/또는 제2 접착제 조성물(20')은 지시제(도시되지 않음) 및/또는 선택제를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 지시제는, 접착제 조성물을 기재(12) 및/또는 커버 시트(18)에 적용하기 전에, 유기 용매(예를 들어, 메탄올) 중에 용해되고 접착제 조성물과 블렌딩될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 접착제 조성물(20) 및/또는 제2 접착제 조성물(20')은 복수의 지시제들을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 접착제 조성물(20) 및 제2 접착제 조성물(20') 각각은 동일한 지시제를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 접착제 조성물(20) 및 제2 접착제 조성물(20') 각각은 다른 한 접착제 조성물 내에 포함되지 않은 지시제 또는 선택제를 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명의 하나 이상의 지시제는 본 명세서에 개시된 제1 하이드로겔-형성 조성물(22) 및/또는 제2 하이드로겔-형성 조성물(22') 내에 분말(또는 응집된 분말)로서 배치될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명의 배양 장치는 복수의 지시제(예를 들어, 효소 기질)들을 포함하며, 각각의 지시제는, 지시제와 생물학적 활성(즉, 효모 또는 곰팡이 미생물과 관련된 효소 활성) 사이의 반응의 검출을 가능하게 하는 리포터 기(예를 들어, 형광발생성 기 또는 발색성 기)를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 복수의 지시제들은 5개의 지시제를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 5개의 지시제는 3개의 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 3개의 지시제, 에스테라제 효소 활성(예를 들어, 알킬 에스테라제 효소 활성)을 검출하기 위한 지시제, 및 포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함할 수 있다. 배양 배지는 겔화제를 추가로 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 복수의 지시제들은 아미노펩티다제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함하지 않는다.
효모 및 곰팡이 미생물은 다양한 글리코시다제 효소 활성들 중 하나 이상을 생산하며, 각각의 글리코시다제 효소 활성은 지시 시약과 반응하여 검출가능한 생성물을 생성할 수 있다. 표 1 및 표 2는, 효모 또는 곰팡이 미생물들의 콜로니 내에서의 또는 부근에서의, 상응하는 효소 활성이 존재한다면 그와 반응할 수 있는 지시제의 비제한적인 예를 열거한다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
효모 및 곰팡이 미생물은 다양한 에스테라제 효소 활성 - 예를 들어, 알킬 에스테라제(예를 들어, 지방산 알킬 에스테라제) 효소 활성을 포함함 - 및 포스파타제(예를 들어, 인산 모노에스테르 하이드롤라제) 효소 활성을 생성한다. 표 2는, 효모 또는 곰팡이 미생물들의 콜로니 내에서의 또는 부근에서의, 상응하는 에스테라제 효소 활성이 존재한다면 그와 반응할 수 있는 지시제의 비제한적인 예를 열거한다.
[표 2]
Figure pct00003
바람직한 일 실시 형태에서, 본 발명의 배양 장치는 α-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제, β-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제, 및 β-갈락토시다제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 상기 언급된 3개의 지시제는 모두 유사하거나 동일한 리포터 기를 포함한다. 특히 바람직한 일 실시 형태에서, 본 발명의 배양 장치는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-α-D-글루코피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루코피라노사이드, 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드를 포함한다.
본 발명에 따르면, 지시제들은 분말 또는 응집된 분말로서(즉, 본 명세서에 기재된 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물 및/또는 냉수-가용성 제2 하이드로겔-형성 조성물의 성분으로서), 또는 본 명세서에 기재된 제1 접착제 조성물 및/또는 제2 접착제 조성물의 일부분으로서 배양 장치 내에 제공될 수 있다. 유리하게는, 접착제 조성물들 중 적어도 하나의 접착제 조성물 내에 제공될 때, 지시제들은 배양 장치의 성장 영역 내에 균일하게 분포될 수 있고, 매우 높은 농도로 접착제 조성물 내에 제공될 수 있다. 이론에 의해 구애되지 않고서, 지시제들은 비교적 소수성인 접착제 조성물로부터 비교적 소수성인 재구성된 겔 내로 효율적으로 분배되며, 그럼으로써 효모 또는 곰팡이 미생물이 샘플 내에 존재한다면 그와 반응하도록 지시제들의 일관되고 균일한 농도를 배양 장치 내에 제공하는 것으로 여겨진다.
임의의 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 접착제 조성물은 5개의 지시제를 포함할 수 있다. 5개의 지시제는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 아세테이트, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루코피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-α-D-글루코피라노사이드, 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 p-톨루이딘 염을 포함할 수 있다. 하기 표 13에 나타낸 바와 같이, 본 연구자들은 지시제들의 이러한 특정 조합이 적어도 하나의 유기체(예를 들어, 보트리티스 속(genus Botrytis)에 속하는 미생물)의 검출을 제공하는 의외의 효과를 갖는다는 것 - 이는 그렇지 않으면 상기 언급된 지시제들 중 하나만을 갖는 유사한 배양 장치를 사용하여 검출될 수 없음 - 을 알아내었는데, 이는 이러한 조합의 가능한 상승적 효과(synergistic effect)를 나타낸다.
임의의 실시 형태에서, 제1 또는 제2 접착제 조성물은 약 0.05 내지 1.0 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 아세테이트, 약 0.05 내지 1.0 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드, 0.05 내지 1.0 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루코피라노사이드, 약 0.05 내지 1.0 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-α-D-글루코피라노사이드 및/또는 약 0.05 내지 1.0 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 p-톨루이딘 염을 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 제1 또는 제2 접착제 조성물은 약 0.18 내지 0.5 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 아세테이트를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 또는 제2 접착제 조성물은 약 0.34 내지 0.72 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 또는 제2 접착제 조성물은 약 0.34 내지 0.72 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루코피라노사이드를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 또는 제2 접착제 조성물은 약 0.34 내지 0.72 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-α-D-글루코피라노사이드를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 또는 제2 접착제 조성물은 약 0.36 내지 0.76 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 p-톨루이딘 염을 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 제1 또는 제2 접착제 조성물은 약 0.18 내지 0.5 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 아세테이트, 약 0.34 내지 0.72 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드, 약 0.34 내지 0.72 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루코피라노사이드, 약 0.34 내지 0.72 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-α-D-글루코피라노사이드, 및 약 0.36 내지 0.76 중량%의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 p-톨루이딘 염을 포함할 수 있다.
냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)이 제1 접착제 조성물(20)에 접착된다. 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)은 적어도 하나의 냉수-가용성 겔화제를 포함한다. 상기에 나타낸 바와 같이, 건성 배지는 겔화제만을 함유하고 영양소를 함유하지 않을 수 있다. 선택적으로, 임의의 실시 형태에서, 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)은 또한 효모 또는 곰팡이 미생물을 성장시키기 위한 영양소를 포함할 수 있다. 제1 하이드로겔-형성 조성물(22)에 사용하기에 적합한 겔화제는 냉수-가용성 천연 및 합성 겔화제를 포함한다. 적합한 천연 겔화제의 비제한적인 예에는 알긴, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 로커스트 빈 검, 잔탄 검이 포함된다. 적합한 합성 겔화제는, 예를 들어 폴리아크릴아미드를 포함한다. 천연 및/또는 합성 겔화제들의 조합이 고려된다. 바람직한 겔화제는 로커스트 빈 검 및 잔탄 검을 포함하며, 이들 겔화제는 개별적으로 유용하거나, 또는 임의의 실시 형태에서는 서로 조합하는 것이 유용하다.
제1 하이드로겔-형성 조성물(22)은 건성 배지와 관련하여 상기 논의된 성분들을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 겔화제가 제1 하이드로겔-형성 조성물(22) 내에 포함될 때, 이는 배지 상에 놓여지는 물 또는 수성 샘플의 사전결정된 양, 예를 들어 1 내지 3 mL가, 25℃에서 브룩필드(Brookfield) 모델 L VF 점도계를 사용하여 60 rpm에서 측정될 때, 적합한 점도, 예를 들어 약 1500 cps 이상을 갖는 재구성된 배지를 형성하게 되도록 하는 양으로 포함된다. 이러한 점도의 배지는 인큐베이션 동안 장치들의 편리한 취급 및 적층을 가능하게 하고, 배지 내의 서로 상이한 콜로니 형성을 제공한다. 예를 들어, 20.3 ㎠의 표면적에 걸쳐 실질적으로 균일하게 확산된 0.025 g 내지 0.050 g의 분말형 구아 검은, 1 내지 3 mL의 수성 샘플을 사용하여 재구성될 때, 충분히 점성인 배지를 제공할 것이다. 분말 입자의 크기를 단위 면적당 코팅 중량을 제어하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 100 메쉬의 구아 검이 약 0.05 g/20.3 ㎠의 중량으로 코팅되는 조건 하에서, 400 메쉬의 구아 검은 약 0.025 g/20.3 ㎠의 중량으로 코팅된다. 제1 하이드로겔-형성 조성물은 미국 특허 제5,089,413호에 기재된 방법을 사용하여 제1 접착제 조성물(20)에 적용될 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 건성 배지는 겔화제만을 함유하고 영양소는 함유하지 않을 수 있다. 수성 샘플 액체(예를 들어, 효모 또는 곰팡이 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 액체 샘플)를 배양 장치에 첨가하기 전에, 사용자는 성장시키고자 하는 미생물들의 유형에 맞추어진 영양소들을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 건조 분말형 영양소가 에탄올 또는 휘발성 클로로플루오로카본과 같은 속증발성(rapidly-evaporating) 액체 중에 현탁될 수 있다. 다른 경우에, 건조 분말형 영양소는 수용액 중에 현탁, 예를 들어 분산 또는 용해될 수 있다. 어느 경우에도, 영양소 현탁액 또는 용액의 분취물이 배지의 표면에 첨가될 때, 액체는 증발되게 하여 겔화제와 함께 충분한 영양소를 남길 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 임의의 실시 형태에서, 배양 장치에 접종할 때, 효모 또는 곰팡이 미생물을 성장시키기 위한 하나 이상의 영양소가, 수성 액체(예를 들어, 수성 현탁 매체 또는 희석제) 중에 있는 상태로 배양 장치 내로 침적될 수 있다.
본 발명의 제1 및/또는 제2 하이드로겔-형성 조성물(각각 22 및 22')은 효모 또는 곰팡이 미생물의 성장을 촉진시키기 위하여 적어도 하나의 영양소를 추가로 포함할 수 있다. 효모 및 곰팡이 미생물은 대사적으로 및 생태학적으로 다종다양하며, 이에 따라, 그들의 성장 및 번식을 지지하기 위해 다양한 영양소를 이용할 수 있다. 표 3은 본 발명에 따라 효모 및 곰팡이 미생물을 포함하는 속의 비제한적인 예를 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00004
효모 및 곰팡이 미생물의 성장 및 번식을 촉진시키기 위해 영양소를 포함하는 배양 배지(예를 들어, 탈수된 분말형 배양 배지)가 당업계에 알려져 있다. 이러한 배양 배지의 성분들은, 예를 들어 질소 공급원(예를 들어, 효모 추출물, 육류 또는 기타 단백질의 효소 분해물(enzymatic digest), 맥아 추출물); 탄소 공급원(예를 들어, 다양한 당(sugar), 다당, 올리고당, 맥아 추출물); 하나 이상의 다양한 무기 염(예를 들어, 염화칼슘, 시트르산암모늄제2철, 황산마그네슘, 염화망간, 황산아연); 선택적으로, 완충제; 및 선택적으로, 세균의 성장을 억제하기 위한, 예를 들어 테트라사이클린 또는 클로람페니콜과 같은 항생제를 포함한다. 본 발명을 고려할 때, 당업자는 효모 및 곰팡이 미생물을 검출하기 위하여 본 발명의 효소 기질 혼합물과 함께 사용될 수 있는 다양한 영양소 조성물을 인식할 것이되, 단 영양소 조성물의 성분은 효소 기질 혼합물 내의 효소 기질들의 가수분해를 실질적으로 억제하지 않으며, 영양소 조성물의 성분은 효소 기질 혼합물 내의 효소 기질들의 생성물을 (예를 들어, 형광 소광에 의해) 실질적으로 차폐하지 않는다.
임의의 실시 형태에서, 배양 장치는 단백질, 올리고펩티드, 및/또는 아미노산을 포함하는 영양소를 포함할 수 있다. 그러한 영양소의 비제한적인 예에는 효모 추출물(예를 들어, 효모 자가용해물(autolysate)), 맥아 추출물, 및 육류의 펩신 분해물(peptic digest)이 포함된다.
임의의 실시 형태에서, 배양 장치는 단당, 이당, 삼당, 올리고당, 또는 이들 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함하는 탄수화물 영양소를 포함할 수 있다. 당업자는 또한 다양한 탄수화물 공급원이 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 이들은 천연 공급원들의 혼합물로서의, 순수 형태(예컨대, 올리고당 또는 단당)로의, 순수 형태들의 혼합물로의, 또는 순수 형태와 천연 형태의 혼합물로서의 천연 공급원(예를 들어, 감자 또는 식물 추출물)일 수 있다. 천연 혼합물은 다양한 양의 탄수화물을 함유할 수 있다. 따라서, 탄수화물은 다양한 공급원으로부터 제공될 수 있다. 맥아 추출물은 다양한 탄수화물의 예시적인 공급원이다. 효모 및 곰팡이 미생물의 성장 및 번식을 촉진시키는 단백질, 올리고펩티드, 및/또는 아미노산을 포함하는 것에 더하여, 맥아 추출물은 또한 효모 및 곰팡이 미생물의 성장 및 번식을 촉진시키는 탄수화물 영양소를 포함한다.
천연 혼합물은 다양한 유형 및 양의 탄수화물, 예컨대 다당, 올리고당, 및 단당을 함유할 수 있다. 효모 및 곰팡이에 의해 흡수될 수 있는 다당은 가용성 전분 또는 이눌린을 포함한다. 효모 및 곰팡이에 의해 흡수될 수 있는 올리고당은 수크로스, 말토스, 셀로비오스, 트레할로스, 락토스, 멜리비오스, 라피노스, 및 멜레지토스이다. 효모 및 곰팡이에 의해 대사될 수 있는 단당은 헥소스(육탄소당): 예를 들어, D-글루코스, D-프룩토스, D-갈락토스, D-만노스, L-람노스, 및 L-소르보스; 이뿐만 아니라 펜토스(오탄당): 예를 들어, D-자일로스, D-리보스, L-아라비노스, 및 D-아라비노스를 포함한다.
모든 탄수화물이 제공되어야 하는 것은 아니며, 각각의 상대량은 변할 수 있다. 당업자는 단당들의 많은 상이한 조합이 본 발명의 배양 배지에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 통상적으로, 효모 및 곰팡이에 의해 대사될 수 있는 당만이 제공된다.
일반적인 지침을 위하여, 탄수화물들의 구체적인 양이 본 명세서에 나타나 있다. 이들 양은 단지 일반적인 지침을 위한 것이며, 당업자에게 알려진 정보에 따라 결정가능하고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 당업자는 탄수화물들의 많은 상이한 조합이 본 발명의 배양 장치에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 통상적으로, 검출하고자 하는 임의의 특정 효모 및 곰팡이에 의해 이용될 수 있는 당만이 배양 배지 내에 제공되어야 한다. 당업자는 다른 탄수화물들이 본 발명으로부터 벗어나지 않고서 제공될 수 있음을 이해할 것이다.
임의의 실시 형태에서, 배양 장치는 완충제를 포함할 수 있다. 완충제는 제1 및/또는 제2 하이드로겔-형성 조성물 내에 제공될 수 있다. 적합한 완충제의 비제한적인 예에는 인산염 화합물(예를 들어, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨), 탄산나트륨, MOPS(2-[N-모르폴리노]에탄설폰산) 유리산, 및 MOPS 나트륨 염이 포함된다.
본 발명의 배양 장치는 효모 및/또는 곰팡이의 성장을 촉진시키기 위하여 하나 이상의 무기 원소를 포함할 수 있다. 이들은 (배양 배지의 다양한 성분들의 상기 공급원 내에 이미 제공되어 있지 않는 한) 하기 중 임의의 하나 이상을 포함한다: 칼슘, 염화물, 코발트, 철, 망간, 인, 칼륨, 황, 나트륨, 주석, 및 아연. 염이 이온의 공급원으로서 제공될 수 있다. 염은 하기를 포함할 수 있다(배지 리터당 양): 인산칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 염화칼슘, 붕산, 황산구리, 요오드화칼륨, 염화제2철, 황산망간, 몰리브덴산나트륨, 및 황산아연. 무기 원소(들) 및/또는 염(들)은 제1 분말 및/또는, 존재한다면 제2 분말 내에 제공될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명의 배양 장치는 선택제를 추가로 포함할 수 있다. 세균으로부터 방해받지 않고서 효모 또는 곰팡이 샘플을 성장시키기 위하여, 예를 들어 클로람페니콜, 클로르테트라사이클린, 타르타르산, 또는 적합한 페니실린과 같은 정균성 또는 살균성 선택제가 포함될 수 있다. 선택제는 제1 하이드로겔-형성 조성물 및/또는, 존재한다면 제2 하이드로겔-형성 조성물 내에 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 선택제는 제1 접착제 조성물 및/또는, 존재한다면 제2 접착제 조성물 내에 제공될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 효모 또는 곰팡이 미생물의 검출 방법을 제공한다. 본 방법은 샘플 및 수성 액체를 본 명세서에 개시된 배양 장치의 임의의 실시 형태의 제1 또는 제2 접착제 조성물 상에 배치된 겔화제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 샘플은 수성 액체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 배양 장치 내의 겔화제; 지시제; 및 영양소(존재한다면)의 양은, 이들이 사전결정된 부피(예를 들어, 1 밀리리터, 2 밀리리터, 5 밀리리터)의 수성 액체로 재구성될 때, 효모 또는 곰팡이 미생물을 검출하기에 유효한 농도를 제공하도록 선택된다. 수성 액체는 샘플 재료와 함께 첨가될 수 있다(예를 들어, 샘플 재료는, 예를 들어 멸균수, 수성 완충액, 또는 수성 영양소 배지와 같은 수성 액체 중에 용해, 균질화, 현탁, 및/또는 희석될 수 있다). 샘플이 고형물(예를 들어, 잔류 재료가 위에 또는 안에 있는 막 필터) 또는 반고형물 재료를 포함하는 임의의 실시 형태에서, 고형물 또는 반고형물 샘플을 사용하여 장치에 접종하기 전 또는 후에, 사전결정된 부피의 액체(예를 들어, 멸균수, 수성 영양소 배지)가 배양 장치를 재구성하는 데 사용될 수 있다.
샘플은 당업계에 알려진 방법을 사용하여(예를 들어, 액체 샘플을 겔화제 상으로 주입 또는 피펫팅함으로써) 겔화제와 접촉될 수 있다. 배양 장치가 커버 시트를 포함하는 일 실시 형태에서, 커버 시트와 기재 사이에의; 바람직하게는, 배양 장치 내에 존재한다면 스페이서의 개구부 내로의 샘플의 침적을 가능하게 하도록, 커버 시트는 전형적으로 들어올려진다. 임의의 실시 형태에서, 샘플 및 수성 액체의 겔화제와의 접촉은 접종된 배양 장치를 형성한다. 접종된 배양 장치를 형성한 후에, 커버 시트가 존재한다면 이를 내려서, 인큐베이션 동안 수성 액체의 과도한 증발 및/또는 오염에 대한 보호 배리어를 형성한다. 임의의 실시 형태에서, 샘플은, 예를 들어 덮여진 장치의 상부 상에 가중판(weighted plate)을 둠으로써 성장 영역에 걸쳐 골고루 확산될 수 있다. 커버 시트가 존재하지 않는 경우, 바람직하게는, 접종된 배양 장치는 멸균 용기 내에 넣어서, 인큐베이션 동안 수성 액체의 과도한 증발 및/또는 오염을 방지한다.
도 3에 예시된 장치(11)의 실시 형태는, 스페이서(24)가 도 3에 존재하지 않는다는 것을 제외하고는, 도 2의 실시 형태와 동일하다. 그러한 실시 형태를 사용하기 위하여, 닫은 후에 일시적으로 커버 시트(18)의 상부 상에 템플레이트(예를 들어, 성장 영역을 한정하는 가중 원형 고리(weighted circular ring))를 적용하여, 배지의 재구성을 배지의 성장 영역으로 국한시킬 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 샘플을 배양 장치의 제1 또는 제2 접착제 조성물 상에 배치된 겔화제와 접촉시키는 단계는 샘플을 적어도 하나의 영양소와 유체 연통 상태에 두는 단계를 포함한다. 이는, 영양소를 포함하는 액체(예를 들어, 수성 액체) 중에 샘플을 현탁 또는 희석시킴으로써, 또는 샘플 및 수성 액체를 적어도 하나의 영양소를 포함하는 본 명세서에 기재된 제1 하이드로겔-형성 조성물 또는 제2 하이드로겔-형성 조성물과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 방법은 접종된 배양 장치를 (예를 들어, 온도-제어된 환경 챔버 내에서) 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계를 추가로 포함한다. 인큐베이션 조건(예를 들어, 인큐베이션 온도)은 샘플 내에 존재하는 효모 및 곰팡이 미생물의 성장 속도에 영향을 줄 수 있다. 당업자는 특정 효모 및 곰팡이 미생물을 검출하기에 적합한 인큐베이션 온도를 인식할 것이다. 본 발명의 접종된 배양 장치는, 예를 들어 약 20℃ 내지 약 32℃(종점 포함)의 온도에서 인큐베이팅될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치는 호기성 조건 하에서 인큐베이팅될 수 있다.
접종된 배양 장치는 효모 또는 곰팡이 미생물의 성장을 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 인큐베이팅된다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 약 36시간 내지 약 120시간(종점 포함)일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 약 48시간 내지 약 120시간(종점 포함)일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 약 48시간 내지 약 96시간(종점 포함)일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 약 48시간 내지 약 72시간(종점 포함)일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 약 48시간 내지 약 48시간(종점 포함)일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 최대 약 72시간일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 최대 약 60시간일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 기간은 최대 약 48시간일 수 있다.
본 발명의 방법은 배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 검출하는(예를 들어, 배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 관찰하는) 단계를 추가로 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 검출하는 단계는 지시제들 중 적어도 하나의 검출가능한 리포터 기의 존재 또는 부재를 배양 장치에서 검출하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 검출가능한 리포터 기의 존재의 검출은 효모 또는 곰팡이 미생물들의 콜로니의 존재를 나타낸다. 효모 또는 곰팡이 콜로니가 본 발명의 배양 장치 내에서 성장함에 따라, 콜로니 내의 세포는 지시제들 중 하나 이상과 반응하여 리포터 기를 (예를 들어, 발색성 또는 형광발생성 효소 기질의 가수분해에 의해) 활성화시키며, 그럼으로써 직접적으로 또는 간접적으로 리포터 기를 검출가능하게 한다. 발색성 지시제의 경우에, 리포터 기는 그것이 흡수 및/또는 반사하는 광의 특징적인 파장(characteristic wavelength)에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 인돌릴 리포터 기를 포함하는 지시제는 이량화되어서 인디고 또는 그의 유도체를 형성할 수 있다. 따라서, 특정 리포터 기와 관련된 색상을 갖는 콜로니(예를 들어, 색상을 갖는 콜로니 또는 색상을 갖는 콜로니 부근의 하이드로겔)의 존재는 효모 또는 곰팡이 미생물의 콜로니를 나타낸다.
형광발생성 지시제의 경우에, 검출가능한 리포터 기는 배양 장치를 광의 적절한 파장(예를 들어, 4-메틸움벨리페론을 포함하는 리포터 기를 검출하기 위해서는 약 365 nm)으로 조광하고 리포터 기에 의해 방출되는 광을 관찰함으로써 관찰될 수 있다. 당업자는 배양 장치를 조광하는 데, 그리고 특정 형광발생성 지시제와 관련된 리포터 기를 검출하는 데 각각 필요한 광의 적합한 파장을 인식할 것이다. 형광 리포터 기의 색상을 갖는 콜로니, 또는 콜로니 부근의 하이드로겔 내의 형광 리포터 기의 존재는 콜로니가 효모 콜로니 또는 곰팡이 콜로니임을 나타낸다.
임의의 실시 형태에서, 리포터 기를 검출하는 단계는 배양 장치를 시각적으로 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 리포터 기를 검출하는 단계는 배양 장치의 이미지를 얻는 단계 및 이미지를 시각적으로 관찰하거나 자동화 이미지-분석 기법을 사용하여 이미지를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 배양 장치 내의 미생물 콜로니의 자동화 검출을 위한 방법 및 장치는, 예를 들어 미국 특허 제5,448,652호; 제6,058,209호; 제6,243,486호; 제6,271,022호; 제7,298,885호; 및 제7,319,031호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명의 방법은, 접종된 배양 장치를 인큐베이팅한 후에, 접종된 배양 장치 내에 존재하는 효모 또는 곰팡이 콜로니를 계수하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 효모 또는 곰팡이 콜로니가 본 명세서에 기재된 바와 같이 검출된 후에, 검출된 콜로니의 수는 수동으로 또는 당업계에 알려진 자동화 프로세스를 사용하여 결정된다.
실시 형태
실시 형태 A는 배양 장치로서, 본 배양 장치는
제1 주 표면 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 기재를 포함하는 본체;
기재의 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제1 접착제 조성물;
제1 접착제 조성물에 접착된 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물; 및
복수의 지시제들을 포함하며, 복수의 지시제들은
서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 3개의 지시제;
알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제;
포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함하며,
복수의 지시제들의 각각은 검출가능한 리포터 기를 포함한다.
실시 형태 B는 본체 부재에 부착되는 커버 시트를 추가로 포함하는 실시 형태 A의 배양 장치이다.
실시 형태 C는 커버 시트가 본체 부재와 대면하는 제1 주 표면을 포함하고; 배양 장치가 커버 시트의 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제2 접착제 조성물 및 제2 접착제 조성물에 접착된 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제2 하이드로겔-형성 조성물을 추가로 포함하는 실시 형태 B의 배양 장치이다.
실시 형태 D는 복수의 지시제들 중 적어도 하나가 제1 접착제 조성물, 제2 접착제 조성물, 제1 하이드로겔-형성 조성물, 및/또는 제2 하이드로겔-형성 조성물 내에 배치되는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 E는 복수의 지시제들 중 적어도 3개가 제1 접착제 조성물 및/또는 제2 접착제 조성물 내에 배치되는 실시 형태 D의 배양 장치이다.
실시 형태 F는 지시제들 중 적어도 5개가 제1 접착제 조성물 및/또는 제2 접착제 조성물 내에 배치되는 실시 형태 E의 배양 장치이다.
실시 형태 G는 기재와 제1 하이드로겔-형성 조성물 사이에 배치된 공기-투과성 막을 추가로 포함하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 H는 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 적어도 3개의 지시제가 알파-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물, 베타-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물, 및 베타-갈락토시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물을 포함하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 I는 복수의 지시제들 중 적어도 하나가 발색성 효소 기질 또는 형광발생성 효소 기질인 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 J는 복수의 지시제들의 각각이 발색성 효소 기질 또는 형광발생성 효소 기질인 실시 형태 I의 배양 장치이다.
실시 형태 K는 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 적어도 3개의 지시제가 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-알파-D-글루코피라노사이드, 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-글루코피라노사이드를 포함하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 L은 알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제가 3-인돌릴-아세테이트를 포함하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 M은 알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제가 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-아세테이트를 포함하는 실시 형태 L의 배양 장치이다.
실시 형태 N은 포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제가 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트를 포함하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 O는 개구부를 갖는 수-불용성 스페이서를 추가로 포함하며, 스페이서는 본체 부재 또는 커버 시트에 부착되고, 개구부 전체는 본체 부재와 커버 시트 사이에 위치되는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 P는 본체 부재와 커버 시트 사이에 배치된 미리 정해진(predefined) 부피의 수성 액체를 추가로 포함하며, 수성 액체와 겔화제는 하이드로겔을 형성하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 Q는 적어도 하나의 영양소가 맥아 추출물을 포함하는 실시 형태 P의 배양 장치이다.
실시 형태 R은 적어도 하나의 영양소가 육류의 펩신 분해물, 효모 추출물, 덱스트로스, 인산칼륨, 시트르산암모늄제2철, 황산마그네슘, 염화망간, 탄산나트륨, 황산아연, 또는 이들 영양소 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 실시 형태 P 또는 실시 형태 Q의 배양 장치이다.
실시 형태 S는 제1 하이드로겔-형성 조성물 또는 제2 하이드로겔-형성 조성물이 실질적으로 건성인 응집된 분말을 포함하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 T는 복수의 지시제들 중 적어도 하나가 제2 접착제 조성물 내에 배치되는 실시 형태 S의 배양 장치이다.
실시 형태 U는 스페이서가 성장 영역 및 두께 치수를 한정하는 주연부를 포함하며, 두께 치수는 성장 영역 내에서의 커버 시트와 하이드로겔 사이의 접촉을 방지하도록 선택되는, 실시 형태 N의 종속항으로서의 실시 형태 O의 배양 장치이다.
실시 형태 V는 제1 접착제 조성물 또는 제2 접착제 조성물 내에 배치된 선택제를 추가로 포함하는 선행 실시 형태들 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치이다.
실시 형태 W는 샘플 내의 효모 및 곰팡이의 검출 방법으로서, 본 방법은
샘플 및 수성 액체를 실시 형태 A 내지 실시 형태 V 중 어느 하나의 실시 형태의 배양 장치의 제1 또는 제2 접착제 조성물 상에 배치된 겔화제와 접촉시켜, 접종된 배양 장치를 형성하는 단계;
접종된 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계; 및
배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 검출하는 단계를 포함한다.
실시 형태 X는 배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 검출하는 단계가 지시제들 중 적어도 하나의 검출가능한 리포터 기의 존재 또는 부재를 배양 장치에서 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 검출가능한 리포터 기의 존재의 검출은 효모 또는 곰팡이 미생물들의 콜로니의 존재를 나타내는 실시 형태 W의 방법이다.
실시 형태 Y는 샘플을 배양 장치의 제1 또는 제2 접착제 조성물 상에 배치된 겔화제와 접촉시키는 단계가 샘플을 적어도 하나의 영양소와 유체 연통 상태에 두는 단계를 포함하는 실시 형태 W 또는 실시 형태 X의 방법이다.
실시 형태 Z는 접종된 배양 장치를 인큐베이팅하는 단계가 접종된 배양 장치를 약 20℃ 내지 약 32℃(종점 포함)의 온도에서 인큐베이팅하는 단계를 포함하는 실시 형태 W 내지 실시 형태 Y 중 어느 하나의 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 AA는 접종된 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계가 접종된 배양 장치를 최대 약 72시간 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함하는 실시 형태 W 내지 실시 형태 Z 중 어느 하나의 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 BB는 접종된 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계가 접종된 배양 장치를 최대 약 60시간 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함하는 실시 형태 AA의 방법이다.
실시 형태 CC는 접종된 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계가 접종된 배양 장치를 최대 약 48시간 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함하는 실시 형태 BB의 방법이다.
실시 형태 DD는 접종된 배양 장치를 인큐베이팅한 후에, 접종된 배양 장치 내에 존재하는 효모 또는 곰팡이 콜로니를 계수하는 단계를 추가로 포함하는 실시 형태 W 내지 실시 형태 CC 중 어느 하나의 실시 형태의 방법이다.
본 발명의 장점들 및 실시 태양들은 하기 실시예들에 의해 추가로 예시되며, 이 실시예들에 인용되는 특정 물질 및 그의 양은 물론, 다른 조건들 및 상세들은 본 발명을 부당하게 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 모든 재료는 달리 기술되지 않거나 또는 명백하지 않으면 구매가능하거나 또는 당업자에게 공지되어 있다.
실시예
지시제
실시예에서 사용한 발색성 기질 지시제들이 표 4에 열거되어 있으며, 이들은 바이오신쓰 인터내셔널, 인크.(Biosynth International, Inc.)(미국 일리노이주 이타스카 소재)로부터 구매하였다.
[표 4]
Figure pct00005
지시제 코팅 제형 A 내지 D(표 5) 각각을, 표 5에 명시된 양의 5개의 발색성 기질 지시제, 및 (하기에 기재된) 아이소옥틸 아크릴레이트와 아크릴아미드의 비억제성 접착성 공중합체 100 g으로부터 제조하였다.
[표 5]
Figure pct00006
배양 배지 제형
6개의 서로 상이한 배양 배지 제형들을, 제형 성분들을 함께 블렌딩함으로써 균질한 혼합물로서 제조하였다. 배양 배지 제형 E 내지 J의 조성이 표 6 내지 표 11에 기재되어 있다.
[표 6]
Figure pct00007
[표 7]
Figure pct00008
[표 8]
Figure pct00009
[표 9]
Figure pct00010
[표 10]
Figure pct00011
[표 11]
Figure pct00012
접종 및 인큐베이션
S. 세레비시아에(S. cerevisiae), H. 아노말라(H. anomala), 및 C. 알비칸스(C. albicans)를 제외하고, 실시예에서 사용된 (그리고 표 12에 열거된) 효모 및 곰팡이 균주는 마이크로바이올로직스, 인크.(MicroBiologics, Inc.)(미국 미네소타주 세인트 클라우드 소재)로부터 동결건조된 디스크로 구매하였다. S . 세레비시아에 , H. 아노말라, 및 C. 알비칸스의 균주는 마이크로바이올로직스, 인크.로부터 퀵 스틱(KWIK STIK) 디바이스로서 구매하고, 제조자의 사용설명서에 따라 번식시켰다. 각각의 균주의 단일의 동결건조된 디스크를 개별적으로 10 내지 30 밀리리터의 0.1% 펩톤수(peptone water)(카탈로그 번호 D299; 미국 캘리포니아주 산타 마리아 소재의 하디 다이아그노스틱스(Hardy Diagnostics))에 첨가하여 동결건조된 디스크 재료로부터의 유기체를 재현탁시켰다. 이들 샘플 각각을 0.1% 펩톤수 중에 연속 희석시켜, 콜로니 형성 단위(colony forming unit, cfu)의 카운트를 박형 필름 배양 장치의 카운팅 범위(장치당 대략 15 내지 150 cfu) 내에 있도록 제공하는 농도들을 생성하였다.
다이클로란 로즈 벵갈 클로람페니콜(Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol, DRBC) 한천 페트리 디쉬 플레이트(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 딕킨슨 컴퍼니(Becton Dickinson Company))를 참조 배양 장치로서 준비하였다. 접종물의 100 마이크로리터 분취량을 DRBC 플레이트 상에 도말 평판배양(spread plate)하였으며, 플레이트를 5일 동안 25℃에서 인큐베이팅하였다. DRBC 참조 플레이트와 실험용 박형 필름 배양 플레이트에 첨가된 접종물 부피의 차이를 설명하기 위하여, DRBC 참조 플레이트에 대해 얻어진 카운트에 10의 희석 계수를 곱했다.
[표 12]
Figure pct00013
실시예 1
DMSO(5 내지15 mL) 중에서 5개의 발색성 기질 지시제들을 혼합하고, 이어서 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,635,367호의 실시예 1에 기재된 100 g의 비억제성 접착성 공중합체(에틸 아세테이트 및 헵탄 용액 중의 대략 24% 고형물)에 첨가함으로써 지시제 코팅 제형 B(표 5)를 제조하였다. 생성된 코팅 제형을 균질해질 때까지 교반하였다. 제형을 1.6 밀(mil) 두께의 이축 배향 폴리프로필렌(bi-axially oriented polypropylene, BOPP) 필름 기재(미국 테네시주 모리스타운 소재의 비판 컴퍼니(Vifan Company))의 한쪽 면 상에 나이프 코팅하였다(약 1 밀의 갭 세팅). 코팅된 필름을 10 내지 15분 동안 70 내지 80℃의 오븐 내에서 건조시켰다. 이어서, BOPP 필름의 코팅된 면을 잔탄 검과 로커스트 빈 검의 1:1 혼합물로 분말 코팅하였다. 과량의 분말을 진탕하여 털어버렸다.
구매가능한 쓰리엠 페트리필름 효모 및 곰팡이 카운트 플레이트(쓰리엠 컴퍼니)로부터 박형 필름 커버 시트를 제거하고, 그것을 전술된 코팅된 BOPP 필름으로 대체함으로써 실험용 박형 필름 배양 장치를 제조하였다. 코팅된 BOPP 필름을 하부 필름과 동일한 치수로 자르고, 그것을 필름의 코팅된 표면이 배양 배지와 대면하도록 배향시켰다. 5개의 지시제를 함유하는 새로운 박형 필름 커버 시트를 양면 테이프를 사용하여 하부 필름에 부착하였다.
박형 필름 배양 장치에 파에실로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비시아에, 보트리티스 종, 한세누엘라 아노말라, 칸디다 알비칸스, 페니실리움 크리소게눔으로부터 선택된 단일의 효모 또는 곰팡이 샘플을 접종하였다. 이 장치의 상부 필름을 들어올리고, 1 mL의 접종물을 하부 필름 상의 배양 배지에 (피펫으로) 첨가하였다. 상부 필름을 내려놓고, 쓰리엠 페트리필름 플랫 스프레더(3M PETRIFILM Flat Spreader)(쓰리엠 컴퍼니)를 사용하여 원하는 영역(30 ㎟)까지 샘플을 균일하게 분포시켰다. 각각의 샘플에 대해 박형 필름 배양 장치를 중복해서 제조하였다. 접종된 장치들을 60 내지 72시간 동안 25℃에서 인큐베이팅하였다.
48시간째에 그리고 인큐베이션 기간의 종료시(60 내지 72시간의 시점)에 시각적 검사에 의해 각각의 장치 내의 콜로니를 카운팅하였다. 각각의 시점에서, 개별 장치들의 cfu 카운트를 평균내고 평균 카운트 값을 결정하였다. 참조 DRBC 플레이트 상의 콜로니를 박형 필름 배양 장치에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 카운팅하였다. 48시간의 시점에 대한 결과가, 비교예 1 내지 비교예 6 및 DRBC 참조 플레이트에 대해 얻어진 결과와 함께, 표 13 및 표 14에 제공되어 있다. DRBC 플레이트에 대한 cfu 카운트는 5일의 인큐베이션 후에 얻었다.
비교예 1
(5개의 지시제 대신에) 단일 지시제, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 아세테이트(접착제 100 g당 57.7 mg)만을 상부 필름 코팅 내에 포함시킨 것을 제외하고는, 실시예 1에서 기재된 것과 동일한 절차를 사용하였다. 각각의 효모 또는 곰팡이 샘플에 대하여, 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 샘플 조제물을 장치에 접종하였다. 결과가 표 13 및 표 14에 제공되어 있다.
비교예 2
(5개의 지시제 대신에) 단일 지시제, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토피라노사이드(접착제 100 g당 81.8 mg)만을 상부 필름 코팅 내에 포함시킨 것을 제외하고는, 실시예 1에서 기재된 것과 동일한 절차를 사용하였다. 각각의 효모 또는 곰팡이 샘플에 대하여, 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 샘플 조제물을 장치에 접종하였다. 결과가 표 13 및 표 14에 제공되어 있다.
비교예 3
(5개의 지시제 대신에) 단일 지시제, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-글루코피라노사이드(접착제 100 g당 81.8 mg)만을 상부 필름 코팅 내에 포함시킨 것을 제외하고는, 실시예 1에서 기재된 것과 동일한 절차를 사용하였다. 각각의 효모 또는 곰팡이 샘플에 대하여, 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 샘플 조제물을 장치에 접종하였다. 결과가 표 13 및 표 14에 제공되어 있다.
비교예 4
(5개의 지시제 대신에) 단일 지시제, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-알파-D-글루코피라노사이드(접착제 100 g당 81.8 mg)만을 상부 필름 코팅 내에 포함시킨 것을 제외하고는, 실시예 1에서 기재된 것과 동일한 절차를 사용하였다. 각각의 효모 또는 곰팡이 샘플에 대하여, 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 샘플 조제물을 장치에 접종하였다. 결과가 표 13 및 표 14에 제공되어 있다.
비교예 5
(5개의 지시제 대신에) 단일 지시제, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 파라-톨루이딘 염(접착제 100 g당 130 mg)만을 상부 필름 코팅 내에 포함시킨 것을 제외하고는, 실시예 1에서 기재된 것과 동일한 절차를 사용하였다. 각각의 효모 또는 곰팡이 샘플에 대하여, 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 샘플 조제물을 장치에 접종하였다. 결과가 표 13 및 표 14에 제공되어 있다.
[표 13]
Figure pct00014
[표 14]
Figure pct00015
실시예 2
미국 특허 제4,565,783호 및 제5,089,413호에 기재된 일반적 절차를 사용하여 박형 필름 배양 장치들을 제조하였다. 메탄올(5 내지10 mL) 중에 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 파라-톨루이딘 염(86.7 mg), 클로로테트라사이클린(13.6 mg), 및 클로람페니콜(10.9 mg)을 함유하는 용액을 실시예 1에 기재된 100 g의 아크릴레이트 공중합체 접착제에 첨가함으로써 코팅 제형을 제조하였다. 생성된 코팅 제형을 균질해질 때까지 교반하였다. 코팅 기재는, 폴리실크지(polysilk paper)에 접착식으로 라미네이팅된 미세다공성 폴리올레핀 필름(트레데거 엑사이어 필름; 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 트레데거 필름 프로덕츠)이었다. 코팅 제형을 기재의 미세다공성 폴리올레핀 필름 면 상에 나이프 코팅하여(약 1 밀의 갭 세팅), 마스터 롤(master roll)을 생성하였다. 마스터 롤을 76 mm 폭 × 102 mm 길이 섹션들로 잘랐으며, 이들 섹션은 이 장치의 하부 층을 형성하였다. 원형 개구부(직경 61 mm)를 갖는 폼 층(76 mm 폭 × 102 mm 길이 × 0.57 mm 두께)을 하부 필름의 코팅된 면에 접착식으로 라미네이팅하였다. 원형 개구부는 폼 층의 중심에 위치시켰다.
잔탄 검과 로커스트 빈 검(중량 기준 1:1)의 혼합물을 사전블렌딩된 배양 배지 제형 E(표 6에 기재됨)에 3부의 검 혼합물 대 1부의 배양 배지 제형 E의 비로 첨가함으로써 배양 배지를 제조하였다. 배합된 혼합물을 블렌딩하여 혼합을 완성하였다. 대략 2 그램의 배합된 분말 혼합물을 골고루 적용하여, 박형 필름 배양 장치 내의 원형 개구부에 의해 노출된 접착제를 덮었다. 장치를 거꾸로 함으로써 과량의 분말을 제거하였다. 결과물은 장치의 접착제 층에 접합된, 배합된 분말 혼합물(배양 배지와 검)의 박층이었다.
실시예 1에 기재된 절차에 따라, 지시제 코팅 제형 B를 함유하는 박형 필름 커버 시트를 제조하였다. 코팅된 커버 시트를 하부 필름 섹션과 동일한 치수로 자르고, 그것을 커버 시트의 코팅된 표면이 배양 배지와 대면하도록 배향시켰다. 커버 시트를 양면 테이프를 사용하여 하부 필름에 부착하였다.
박형 필름 배양 장치에 칸디다 알비칸스, 트리코스포론 무코디데스, 칸디다 구일레르몬디이로부터 선택된 단일 효모 샘플을 접종하였다. 이 장치의 상부 필름을 들어올리고, 1 mL의 접종물을 하부 필름 상의 배양 배지에 (피펫으로) 첨가하였다. 상부 필름을 내려놓고, 쓰리엠 페트리필름 플랫 스프레더로 하향으로 압력을 가함으로써 원형 개구부의 에지들까지 샘플을 균일하게 확산시켰다. 각각의 샘플에 대해 박형 필름 배양 장치를 중복해서 제조하였다. 접종된 장치들을 60 내지 72시간 동안 25℃에서 인큐베이팅하였다.
48시간째에 그리고 인큐베이션 기간의 종료시(60 내지 72시간의 시점)에 시각적 검사에 의해 각각의 샘플로부터 콜로니를 카운팅하였다. 콜로니는 백색 또는 청색이었다. 각각의 시점에서, 개별 장치들의 cfu 카운트를 평균내고 평균 카운트 값을 사용하여, 원래의 희석되지 않은 샘플 내의 밀리리터당 콜로니 형성 단위(cfu/mL)의 수를 계산하였다. 48시간의 시점에서의 각각의 샘플에 대하여 계산된 cfu/mL 값 및 콜로니 색상(백색 또는 청색)이, 실시예 3 내지 실시예 6에 대해 얻어진 결과와 함께, 표 15에 기록되어 있다.
실시예 3
배양 배지 제형 E(표 6에 기재됨) 대신에 배양 배지 제형 F(표 7에 기재됨)를 사용하여 박형 필름 배양 장치들을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 실험 조건 및 절차를 따랐다.
실시예 4
배양 배지 제형 E(표 6에 기재됨) 대신에 배양 배지 제형 G(표 8에 기재됨)를 사용하여 박형 필름 배양 장치들을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 실험 조건 및 절차를 따랐다.
실시예 5
배양 배지 제형 E(표 6에 기재됨) 대신에 배양 배지 제형 H(표 9에 기재됨)를 사용하여 박형 필름 배양 장치들을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 실험 조건 및 절차를 따랐다.
실시예 6
배양 배지 제형 E(표 6에 기재됨) 대신에 배양 배지 제형 I(표 10에 기재됨)를 사용하여 박형 필름 배양 장치들을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 실험 조건 및 절차를 따랐다.
실시예 7
배양 배지 제형 E(표 6에 기재됨) 대신에 배양 배지 제형 J(표 11에 기재됨)를 사용하여 박형 필름 배양 장치들을 제조한 것을 제외하고는, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 실험 조건 및 절차를 따랐다.
[표 15]
Figure pct00016
실시예 8
2가지를 제외하고, 실시예 2에 기재된 바와 같은 박형 필름 배양 장치를 제조하였다. 첫째, 배양 배지 제형 E(표 6에 기재됨) 대신에 배양 배지 제형 H(표 9에 기재됨)를 사용하여 박형 필름 배양 장치들을 제조하였다. 둘째, 지시제 코팅 제형 B 대신에 지시제 코팅 제형 A로 장치의 박형 필름 커버 시트를 코팅하였다.
박형 필름 배양 장치에 파에실로마이세스 종, 사카로마이세스 세레비시아에, 보트리티스 종, 한세누엘라 아노말라, 칸디다 알비칸스, 페니실리움 크리소게눔, 아스페르길루스 니게르로부터 선택된 단일의 효모 또는 곰팡이 샘플을 접종하였다. 이 장치의 상부 필름을 들어올리고, 1 mL의 접종물을 하부 필름 상의 배양 배지에 (피펫으로) 첨가하였다. 상부 필름을 내려놓고, 쓰리엠 페트리필름 플랫 스프레더로 하향으로 압력을 가함으로써 원형 개구부의 에지들까지 샘플을 균일하게 확산시켰다. 각각의 샘플에 대해 박형 필름 배양 장치를 중복해서 제조하였다. 접종된 장치들을 48 내지 60시간 동안 25℃에서 인큐베이팅하였다.
각각의 샘플로부터의 콜로니를 48시간 또는 60시간의 시점에서 시각적 검사에 의해 카운팅하였다. 개별 장치들의 cfu 카운트를 평균내고 평균 카운트 값을 사용하여 원래의 희석되지 않은 샘플 내의 밀리리터당 콜로니 형성 단위(cfu/mL)의 수를 계산하였다. 표 16 및 표 17에는, 48시간 또는 60시간의 시점에서의 각각의 샘플에 대하여 계산된 cfu/mL 값이 제공되어 있다.
실시예 9
장치의 박형 필름 커버 시트를 지시제 코팅 제형 A 대신에 지시제 코팅 제형 B로 코팅한 것을 제외하고는, 실시예 8에 기재된 것과 동일한 실험 조건 및 절차를 따랐다. 결과가 표 16 및 표 17에 제공되어 있다.
실시예 10
장치의 박형 필름 커버 시트를 지시제 코팅 제형 A 대신에 지시제 코팅 제형 C로 코팅한 것을 제외하고는, 실시예 8에 기재된 것과 동일한 실험 조건 및 절차를 따랐다. 결과가 표 16 및 표 17에 제공되어 있다.
[표 16]
Figure pct00017
[표 17]
Figure pct00018
실시예 11
장치의 박형 필름 커버 시트를 지시제 코팅 제형 A 대신에 지시제 코팅 제형 D로 코팅한 것을 제외하고는, 실시예 8에 기재된 것과 동일한 박형 필름 배양 장치를 제조하였다.
검사를 위해 6개의 식품 항목을 선택하였다(옥수수 알, 자른 당근, 토마토 페이스트, 그린 칠리 퓨레, 미트 소스 파스타, 및 치킨 시즈닝). 각각의 식품 항목을 개별적으로 검사하였다. 식품 샘플의 11 g의 분량을 99 mL의 0.1% 펩톤수를 함유하는 플라스틱 농축 백(plastic enrichment bag)에 첨가하고, 백을 진탕하였다. 이들 식품 샘플을 0.1% 펩톤수로 연속 희석시켜, 콜로니 형성 단위(cfu)의 카운트를 박형 필름 배양 장치의 카운팅 범위(장치당 대략 15 내지 100 cfu) 내에 있도록 제공하는 농도들을 생성하였다. 투명한 필름 커버 시트를 들어올리고, 1 mL의 희석된 샘플을 코팅된 하부 필름의 중심에 피펫팅하고, 커버 시트를 내려놓음으로써, 박형 필름 장치들에 접종하였다. 쓰리엠 페트리필름 플랫 스프레더로 하향으로 압력을 가함으로써 원형 개구부의 에지들까지 샘플을 균일하게 확산시켰다. 각각의 샘플에 대해 박형 필름 배양 장치를 중복해서 제조하였다. 접종된 장치들을 60 내지 72시간 동안 25℃에서 인큐베이팅하였다.
48시간째에 그리고 인큐베이션 기간의 종료시(60 내지 72시간의 시점)에 시각적 검사에 의해 각각의 샘플로부터 효모 및 곰팡이 콜로니의 총수를 카운팅하였다. 각각의 시점에서, 개별 장치들의 cfu 카운트를 평균내고 평균 카운트 값을 사용하여, 원래의 희석되지 않은 샘플 내의 밀리리터당 콜로니 형성 단위(cfu/mL)의 수를 계산하였다. 참조 DRBC 플레이트 상의 콜로니를 박형 필름 배양 장치에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 카운팅하였다. 48시간의 시점에서의 각각의 샘플에 대하여 계산된 cfu/mL 값이 표 18에 제공되어 있다. DRBC 참조 플레이트에 대한 cfu 카운트는 5일의 인큐베이션 후에 얻었다.
[표 18]
Figure pct00019
모든 특허, 특허 출원, 및 공보, 그리고 전자적으로 입수가능한 본 명세서에서 언급된 자료의 완전한 개시가 참고로 포함되었다. 본 출원의 개시 내용과 본 명세서에 참고로 포함된 임의의 문서의 개시 내용(들) 사이에 임의의 모순이 존재하는 경우, 본 출원의 개시 내용이 좌우할 것이다. 상기 상세한 설명 및 예들은 단지 명확한 이해를 위해 주어졌다. 이로부터 어떠한 불필요한 제한 사항도 이해되지 않을 것이다. 당업자에게 자명한 변화가 청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주 내에 포함될 것이므로, 본 발명은 도시되고 설명된 정확한 상세 사항으로 제한되지 않는다.
모든 표제는 독자의 편리함을 위한 것이며, 그렇게 특정되지 않는 한 표제 이후의 본문의 의미를 한정하기 위하여 사용되어서는 안 된다.
본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들 및 다른 실시 형태는 하기의 청구범위의 범주 내에 있게 된다.

Claims (20)

  1. 배양 장치로서,
    제1 주 표면 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 기재(self-supporting substrate)를 포함하는 본체;
    상기 기재의 상기 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제1 접착제 조성물;
    상기 제1 접착제 조성물에 접착된 실질적으로 건성인(substantially dry) 냉수-가용성 제1 하이드로겔-형성 조성물; 및
    복수의 지시제들을 포함하며, 상기 복수의 지시제들은
    서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 3개의 지시제;
    알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제;
    포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 지시제를 포함하며,
    상기 복수의 지시제들의 각각은 검출가능한 리포터 기(reporter group)를 포함하는, 배양 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 본체 부재에 부착되는 커버 시트를 추가로 포함하는, 배양 장치.
  3. 제2항에 있어서, 상기 커버 시트는 상기 본체 부재와 대면하는 제1 주 표면을 포함하고; 상기 배양 장치는 상기 커버 시트의 상기 제1 주 표면의 일부분 상에 배치된 제2 접착제 조성물 및 상기 제2 접착제 조성물에 접착된 실질적으로 건성인 냉수-가용성 제2 하이드로겔-형성 조성물을 추가로 포함하는, 배양 장치.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 지시제들 중 적어도 하나는 상기 제1 접착제 조성물, 상기 제2 접착제 조성물, 상기 제1 하이드로겔-형성 조성물, 및/또는 상기 제2 하이드로겔-형성 조성물 내에 배치되는, 배양 장치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 복수의 지시제들 중 적어도 3개는 상기 제1 접착제 조성물 및/또는 상기 제2 접착제 조성물 내에 배치되는, 배양 장치.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재와 상기 제1 하이드로겔-형성 조성물 사이에 배치되는 공기-투과성 막을 추가로 포함하는, 배양 장치.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 상기 적어도 3개의 지시제는 알파-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물, 베타-글루코시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물, 및 베타-갈락토시다제 효소 활성을 검출하기 위한 화합물을 포함하는, 배양 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 서로 상이한 글리코시다제 효소 활성들을 검출하기 위한 상기 적어도 3개의 지시제는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-알파-D-글루코피라노사이드, 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-글루코피라노사이드를 포함하는, 배양 장치.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬 에스테라제 효소 활성을 검출하기 위한 상기 지시제는 3-인돌릴-아세테이트를 포함하는, 배양 장치.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 포스파타제 효소 활성을 검출하기 위한 상기 지시제는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트를 포함하는, 배양 장치.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 개구부(aperture)를 갖는 수-불용성 스페이서(spacer)를 추가로 포함하며, 상기 스페이서는 상기 본체 부재 또는 상기 커버 시트에 부착되고, 상기 개구부 전체는 상기 본체 부재와 상기 커버 시트 사이에 위치되는, 배양 장치.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 본체 부재와 상기 커버 시트 사이에 배치된 미리 정해진(predefined) 부피의 수성 액체를 추가로 포함하며, 상기 수성 액체와 겔화제는 하이드로겔을 형성하는, 배양 장치.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 하이드로겔-형성 조성물 또는 제2 하이드로겔-형성 조성물은 효모 또는 곰팡이 미생물을 성장시키기 위한 적어도 하나의 영양소를 추가로 포함하는, 배양 장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 적어도 하나의 영양소는 맥아 추출물을 포함하는, 배양 장치.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 영양소는 육류의 펩신 분해물(peptic digest), 효모 추출물, 덱스트로스, 인산칼륨, 시트르산암모늄제2철, 황산마그네슘, 염화망간, 탄산나트륨, 황산아연, 또는 이들 영양소 중 임의의 둘 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 배양 장치.
  16. 제10항의 종속항으로서의 제11항에 있어서, 상기 스페이서는 성장 영역 및 두께 치수를 한정하는 주연부를 포함하며, 상기 두께 치수는 상기 성장 영역 내에서의 상기 커버 시트와 하이드로겔 사이의 접촉을 방지하도록 선택되는, 배양 장치.
  17. 샘플 내의 효모 및 곰팡이의 검출 방법으로서,
    샘플 및 수성 액체를 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 배양 장치의 제1 또는 제2 접착제 조성물 상에 배치된 겔화제와 접촉시켜, 접종된 배양 장치를 형성하는 단계;
    상기 접종된 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계; 및
    상기 배양 장치 내의 효모 또는 곰팡이 콜로니를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 샘플을 상기 배양 장치의 상기 제1 또는 제2 접착제 조성물 상에 배치된 상기 겔화제와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 적어도 하나의 영양소와 유체 연통 상태에 두는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 접종된 배양 장치를 일정 기간 동안 인큐베이팅하는 단계는 상기 접종된 배양 장치를 최대 약 72시간 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접종된 배양 장치를 인큐베이팅한 후에, 상기 접종된 배양 장치 내에 존재하는 효모 또는 곰팡이 콜로니를 계수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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