BR112015018397B1 - dispositivo de cultura e método de detecção de levedura e mofo em uma amostra - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO DE CULTURA E MÉTODO DE DETECÇÃO DE LEVEDURA E MOFO EM UMA AMOSTRA. Trata- se de um dispositivo de cultura filme fino para detectar micro-organismos de levedura e mofo em uma amostra. O dispositivo de cultura compreende um corpo que compreende um substrato autossuportado que tem uma primeira superfície principal e uma segunda superfície principal; uma primeira composição adesiva disposta sobre uma porção da primeira superfície principal do substrato; uma composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca aderida à primeira composição adesiva e uma pluralidade de agentes indicadores. A pluralidade de agentes indicadores compreende três agentes indicadores par a detectar distintas atividades da enzima glicosidase, um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase e um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase, em que cada um dentre a pluralidade de agentes indicadores compreende um grupo-repórter detectável. Um método de uso do dispositivo de cultura também é fornecido.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção refere-se a um dispositivo de cultura e método de detecção de levedura e mofo em uma amostra.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Leveduras e mofos são micro-organismos eucarióticos. Eles são onipresentes nos ambientes naturais, a saber, solo, ar, água e superfícies de plantas. Devido à sua natureza heterotrófica e capacidade de se adaptar a uma ampla gama de condições ambientais, esses micróbios são frequentemente encontrados como uma praga cara dentro e sobre vários bens consumíveis, incluindo ingredientes de alimentos, alimentos processados, bebidas, equipamento de processamento de alimento limpos de forma inadequada e instalações de armazenamento de alimento. Além disso, algumas leveduras e mofos representam possível perigo à saúde humana e animal. Por exemplo, vários mofos produzem micotoxinas, e algumas leveduras e mofos são responsáveis por infecções humanas e animais.

[003] A contaminação por levedura ou mofo presente nos alimentos e outros produtos pode resultar em consideráveis perdas econômicas para o produtor, processador e consumidor. Determinações rápidas e precisas da contaminação por levedura e/ou mofo em um bem consumível (como, ingredientes de alimentos, alimentos processados e bebidas) são importantes para a produção de produtos alimentícios de alta qualidade presentes na indústria alimentícia.

[004] As práticas atuais para determinação de rotina de leveduras e mofos em um alimento dependem amplamente das técnicas de cultivo convencionas para enumerar as células fúngicas viáveis em meio semissólido de ágar. Esses métodos, embora amplamente aceitos, têm várias desvantagens no que eles são, em geral, trabalhosos e apresentam baixa reprodutibilidade. Além disso, um problema comum encontrado nos métodos tradicionais é que o tipo de espalhamento do crescimento micelial de certos mofos frequentemente se sobrepõe às colônias vizinhas e impede a contagem precisa de células viáveis em uma amostra.

[005] Mais importante, a maioria desses métodos exige um período de incubação de 5 dias a 25°C antes que os resultados quantitativos exatos possam ser obtidos. O longo período de incubação desses métodos pode exigir que os produtos alimentícios sejam armazenados durante vários dias, até que a presença ou concentração de leveduras e/ou mofos contaminantes seja conhecida. Dessa forma, existe uma necessidade de testes e materiais relacionados aprimorados. Se os procedimentos de teste pudessem ser simplificados, e os resultados dos testes obtidos em um período de tempo mais curto, os fabricantes poderiam liberar os produtos, reduzindo, assim, o custo de armazenamento sem sacrificar a qualidade e integridade do produto.

SUMÁRIO

[006] A presente revelação refere-se, de modo geral, a um dispositivo e método de cultura para a detecção de micro-organismos levedura ou mofo em uma amostra. Em particular, a presente revelação está relacionada à rápida detecção de micro-organismos de levedura e mofo em um dispositivo de cultura seco reconstituível que compreende uma pluralidade de agentes indicadores dispostos em concentrações altas em uma composição adesiva. A pluralidade de agentes indicadores inclui um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase, um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase e três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase. Vantajosamente, a pluralidade de agentes indicadores permite a detecção e contagem de uma ampla variedade de micro-organismos levedura e mofo de crescimento lento. Mais vantajosamente ainda, os agentes indicadores específicos, junto com as concentrações dos mesmos e os meios para fornecer os indicadores agentes aos micro-organismos, permitem a detecção e contagem de micro-organismos levedura e mofo em menos de 120 horas e, de preferência, em menos de 72 horas. Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode compreender extrato de malte. Vantajosamente, o extrato de malte age em colaboração com a pluralidade de indicadores para fornecer detecção mais rápida das colônias de levedura e/ou mofo que possível de outro modo.

[007] Em um aspecto, a presente descrição apresenta um dispositivo de cultura. O dispositivo de cultura pode compreender uma estrutura que compreende um substrato autossuportado tendo uma primeira superfície principal e uma segunda superfície principal, uma primeira composição adesiva disposta sobre uma porção da primeira superfície principal do substrato, uma composição substancialmente seca, uma primeira composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca aderida à primeira composição adesiva e uma pluralidade de agentes indicadores. A pluralidade de agentes indicadores compreende três agentes indicadores para detectar distintas atividades da enzima glicosidase, um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase e um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase, em que cada um dentre a pluralidade de agentes indicadores compreende um grupo-repórter detectável. Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente uma camada de cobertura fixada ao elemento de corpo.

[008] Em qualquer das modalidades acima, o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente uma camada de cobertura fixada ao elemento de corpo. Em qualquer modalidade, a camada de cobertura pode compreender uma primeira superfície principal voltada para o elemento de corpo; em que o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente uma segunda composição adesiva disposta sobre uma porção da primeira superfície principal da camada de cobertura e uma segunda composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca, aderida à segunda composição adesiva. Em qualquer das modalidades acima, os ao menos três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase podem incluir um composto para detectar a atividade enzimática da alfa-glucosidase, um composto para a atividade enzimática da betaglucosidase e um composto para a atividade enzimática da beta-galactosidase. Em qualquer das modalidades acima, o pelo menos um nutriente pode compreender extrato de malte. Em qualquer das modalidades acima, o dispositivo de cultura pode compreender adicionalmente um espaçador insolúvel em água tendo uma abertura, em que o espaçador é fixado ao elemento de corpo ou camada de cobertura, e a abertura inteira é posicionada entre o elemento de corpo e a camada de cobertura. Em qualquer das modalidades acima, ao menos um dentre uma pluralidade de agentes indicadores pode estar disposto na primeira composição adesiva, na segunda composição adesiva, na primeira composição formadora de hidrogel e/ou na segunda composição formadora de hidrogel. Em qualquer das modalidades acima, a primeira composição formadora de hidrogel ou a segunda composição formadora de hidrogel podem compreender ao menos um nutriente para cultivar micro-organismos de levedura ou mofo.

[009] Em outro aspecto, a presente descrição fornece um método de detecção de levedura e mofo em uma amostra. O método pode compreender colocar uma amostra e um líquido aquoso em contato com um agente gelificante de um dispositivo de cultura para formar um dispositivo de cultura inoculado, incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um período de tempo e detectar uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura. O dispositivo de cultura compreende um substrato autossuportado tendo uma primeira superfície principal e uma segunda superfície principal, uma primeira composição adesiva disposta sobre uma porção da primeira superfície principal do substrato, uma primeira composição formadora de hidrogel solúvel em água fria aderida à primeira composição adesiva e a pluralidade de agentes indicadores. A pluralidade de agentes indicadores compreende três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase, um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase e um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase, em que cada um dentre a pluralidade de agentes indicadores compreende um grupo-repórter detectável. Opcionalmente, o dispositivo de cultura compreende uma camada de cobertura que inclui uma segunda composição adesiva disposta sobre a mesma e uma segunda composição formadora de hidrogel solúvel em água fria aderia à segunda composição adesiva. A primeira composição formadora de hidrogel ou a segunda composição formadora de hidrogel, se presentes, podem compreender o agente gelificante e, opcionalmente, ao menos um nutriente para cultivar micro-organismos de levedura ou mofo. Cada um dentre a pluralidade de agentes indicadores pode estar disposto na primeira composição adesiva, na segunda composição adesiva, na primeira composição formadora de hidrogel ou na segunda composição formadora de hidrogel. Em qualquer modalidade, o método pode compreender adicionalmente contar as colônias de levedura ou mofo presentes no dispositivo de cultura inoculado após a incubação no dispositivo de cultura inoculado. Em qualquer modalidade, detectar uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura pode compreender detectar no dispositivo de cultura uma presença ou uma ausência de um grupo-repórter detectável de ao menos um de uma pluralidade de agentes indicadores, em que a detecção da presença do grupo-repórter detectável é indicativa de uma presença de uma colônia de micro-organismos de levedura ou mofo.

[010] O termo "pó", conforme usado aqui, refere-se a material particulado de um ou mais agentes gelificantes ou nutrientes com um diâmetro médio adequado para uso em dispositivo(s) de cultura de filme fino da presente invenção, de preferência, um diâmetro de cerca de 10 - 400 mícrons, com mais preferência, um diâmetro de cerca de 30 - 90 mícrons.

[011] Conforme usado aqui, "meio reconstituído" refere-se a uma solução ou gel formado da reconstituição de um pó solúvel em água fria com um líquido aquoso.

[012] O termo "pó solúvel em água fria", conforme usado aqui, refere-se ao pó que forma um gel em água à temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 18°C a 24°C) quando combinado com a amostra de teste aquosa.

[013] O termo "substancialmente impermeável a microorganismos e vapor d'água", conforme usado aqui, refere-se a uma camada de cobertura que impede a contaminação indesejada e hidratação das camadas subjacentes do pó solúvel em água fria durante o transporte, armazenamento e uso de dispositivo(s) de cultura de filme fino e evita a dessecação do meio reconstituído, de modo que o meio reconstituído seja adequado para sustentar o crescimento de micro-organismos durante um período de incubação.

[014] Conforme usado aqui, "agente seletivo" refere-se a qualquer elemento, composto ou composição que inibe o crescimento de um tipo de micro-organismo (por exemplo, uma bactéria) em relação a um outro tipo de micro-organismo (por exemplo, uma levedura ou mofo) facilitando assim o crescimento e/ou identificação de micro-organismos cultivados no(s) dispositivo(s) de cultura de filme fino de acordo com a presente revelação.

[015] O termo "levedura", conforme usado aqui, refere-se a um fungo tipicamente unicelular do filo Ascomycota que se reproduz assexualmente por fissão e/ou brotamento. Leveduras incluem uma ou mais espécie existentes ou coexistentes coletivamente em uma amostra de teste. O termo "leveduras" também se refere ao conjunto de leveduras encontradas, por exemplo, em uma amostra de teste. Os termos "levedura" ou "leveduras" não se limitam a significar qualquer dado número dessas espécies e não excluem espécies que ainda não foram descobertas, mas que podem ser identificadas posteriormente e incluídas nessa definição pelos versados na técnica.

[016] O termo "mofo", como usado aqui, refere-se a um fungo microscópico. O termo não se limita a significar qualquer dado número dessas espécies e não exclui espécies que ainda não foram descobertas, mas que podem ser identificadas posteriormente e incluídas nesse gênero pelos versados na técnica.

[017] O termo "amostra de teste", conforme usado aqui, refere-se a um componente ou porção obtida de um produto alimentício, um indivíduo de teste humano ou animal, um produto farmacêutico ou cosmético, do solo, água, ar ou outra fonte ambiental, ou de qualquer outra fonte da qual uma concentração de levedura e mofo será determinada. Uma amostra de teste pode ser obtida a partir de uma fonte com o uso de técnicas conhecidas pelo versado na técnica incluindo, por exemplo, verter, pipetar, esfregar, filtrar e colocar em contato. Além disso, a amostra de teste pode ser submetida a vários processos de preparação amostra conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, mistura, homogeneização com um Stomacher, enriquecimento, enriquecimento seletivo ou diluição.

[018] As palavras "preferencial" e "de preferência" referem-se às modalidades da invenção que possam proporcionar certos benefícios, sob certas circunstâncias. Entretanto, outras modalidades podem também ser preferenciais, sob circunstâncias iguais ou diferentes. Ademais, a menção de uma ou mais modalidades preferenciais não sugere que outras modalidades não sejam úteis, e não pretende excluir outras modalidades do escopo da invenção.

[019] Para uso na presente invenção, "um", "uma", "o", "a", "ao menos um", "ao menos uma", "um ou mais" e "uma ou mais" são usados de maneira intercambiável. Dessa forma, por exemplo, um dispositivo de cultura que compreende "um" agente indicador pode ser interpretado para significar que o dispositivo de cultura pode compreender "um ou mais" agentes indicadores.

[020] O termo "e/ou" significa um ou todos os elementos mencionados ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos elementos listados.

[021] Para uso na presente invenção, as citações de intervalos numéricos com extremos incluem todos os números contidos nesta faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

[022] As características e vantagens da presente invenção serão entendidas na consideração da descrição detalhada da modalidade preferencial assim como das reivindicações em anexo. Essas e outras características e vantagens da presente invenção podem ser descritas a seguir em conexão com várias modalidades ilustrativas da invenção.

[023] O sumário anterior da presente invenção não se destina a descrever cada uma das modalidades apresentadas ou todas as implantações da presente invenção. As figuras e a descrição detalhada que seguem mais particularmente exemplificam as modalidades ilustrativas. Outras características, objetivos e vantagens se tornarão aparentes a partir da descrição e dos desenhos, e a partir das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[024] A Figura 1 uma vista em seção transversal de um dispositivo da presente revelação, em que certas características são mostradas.

[025] A Figura 2 é uma vista em perspectiva superior, parcialmente em seção, de uma modalidade de um dispositivo de cultura de acordo com a presente revelação.

[026] A Figura 3 é uma vista em perspectiva superior de uma modalidade alternativa de um dispositivo de cultura de acordo com a presente revelação.

[027] A Figura 4 é uma vista em seção transversal do dispositivo de cultura da Figura 2 adquirida ao longo da linha 4-4.

[028] A Figura 5 é uma vista superior do dispositivo de cultura da Figura 2 mostrando um padrão de grade estampado na membrana microporosa.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[029] Antes que quaisquer modalidades da presente descrição sejam explicadas em detalhe, deve-se compreender que a invenção não está limitada, em sua aplicação, aos detalhes de construção e à disposição de componentes demonstrada na descrição a seguir ou ilustrada nos desenhos a seguir. A invenção pode compreender outras modalidades e ser praticada ou realizada de várias maneiras. Deve-se entender também que as fraseologia e terminologia usadas na presente invenção têm o propósito de descrição, e não devem ser consideradas limitadoras. O uso de "incluindo", "compreendendo," ou "tendo" e as variações do mesmo da presente invenção tendem a abranger os itens mencionados depois deles e os equivalentes dos mesmos bem como itens adicionais. Exceto onde especificado ou limitado de outro modo, os termos "conectado" e "acoplado", bem como as variações dos mesmos, são amplamente usados e abrangem conexões e acoplamentos tanto diretos como indiretos. Adicionalmente, "conectado" e "acoplado" não estão restritos a conexões ou acoplamentos físicos ou mecânicos. Deve-se compreender que outras modalidades podem ser utilizadas e alterações estruturais ou lógicas podem ser feitas sem que se afaste do escopo da presente descrição. Além disso, os termos como "parte frontal", "parte traseira", "topo", "fundo" e similares são usados apenas para descrever a relação mútua entre os elementos, porém, não são destinados, de forma alguma, a se referir às orientações específicas do aparelho, indicar ou conferir orientações necessárias ou requeridas do aparelho ou especificar como a invenção aqui descrita será usada, montada, exibida ou posicionada em uso.

[030] Leveduras e mofos são micro-organismos eucarióticos onipresentes que permanecem viáveis em certos ambientes (por exemplo, baixa atividade de água, baixo pH) que são prejudiciais à maioria dos outros microorganismos unicelulares. Classificados como organismos indicadores de deterioração de alimento, os testes para leveduras e mofos constituem cerca de 14% de todos os testes de rotina conduzidos de organismos indicadores porque os micro-organismos de levedura e mofo são frequentemente encontrados como uma praga cara em vários produtos (por exemplo, ingredientes de alimentos, alimentos processados, bebidas), equipamentos de processamento de alimentos e instalações de armazenamento de alimentos limpos de forma inadequada. Além disso, algumas leveduras e mofos têm relevância clínica como agentes causadores de infecções humanas e animais.

[031] Testes tradicionais de levedura e mofos tipicamente envolvem o cultivo de micro-organismos em meio de ágar ou em dispositivos de cultura de filme fino, como uma placa de contagem de levedura e mofo PETRIFILM da 3M (disponível junto à 3M Company, St. Paul, MN, EUA). Os dispositivos de cultura de filme fino para detectar levedura e mofo em uma amostra são descritos, por exemplo, na patente US n° 5.089.413, que está aqui integralmente incorporada, por referência. Os métodos de teste tradicionais envolvem a incubação de placas de teste durante um período de 5 a 7 dias para obter contagens precisas. O tempo relativamente demorado até o resultado pode fazer com que os fabricantes segurem o produto alimentício até sete dias para determinar se o produto alimentício contém um micro-organismo de levedura ou mofo que pode afetar adversamente a qualidade e/ou segurança do produto alimentício durante as condições normais de armazenamento.

[032] Alguns meios de cultura, incluindo o meio de cultura usado nas placas de contagem de levedura e mofo PETRIFILM da 3M, incluem ao menos um reagente indicador (por exemplo, sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato sódio) que é convertido pelos micro-organismos de levedura ou mofo em um produto detectável (por exemplo, detectável por absorção, reflectância e ou fluorescência da luz). A patente US n° 6.387.650; que está aqui integralmente incorporada, por referência; revela composições para detectar levedura e fungos em uma amostra de teste, em que as composições compreendem três substratos de enzima que provocam ou produzem um tipo idêntico de sinal detectável (por exemplo, fluorescência) quando hidrolisados por uma atividade enzimática correspondente encontrada nos micro-organismos. Um substrato de enzima é hidrolisado por uma atividade enzimática da glicosidase, um segundo substrato de enzima é hidrolisado por uma atividade enzimática da peptidase e o terceiro substrato de enzima é hidrolisado por uma atividade enzimática da fosfatase. Na patente, Townsend e Chen descrevem adicionalmente o uso de meio contendo os reagentes indicadores em um dispositivo de cultura que permite o cálculo de um número mais provável (NMP) de micro-organismos na amostra de teste.

[033] Chen e Gu (patente US n° 5.854.011, que está aqui integralmente incorporada, por referência) descrevem um método e composições para detectar levedura e/ou mofos em uma amostra em que a composição inclui um substrato da enzima aminopeptidase e um inibidor da atividade enzimática da aminopeptidase em uma quantidade eficaz para inibir a atividade da aminopeptidase que é endógena à amostra de teste. No Exemplo 1, Chen e Gu concluem que, como foram usadas em <64% dos microorganismos testados, as enzimas fosfatase, β-glucosidase e α-glucosidase são inadequadas para serem usadas como enzima-alvo para detectar a quantidade total de leveduras e mofos em uma amostra.

[034] Conforme demonstrado por Chen e Gu, é difícil encontrar um substrato de enzima que pode detectar a ampla variedade de leveduras e mofos que são encontrados na natureza. O artigo da presente invenção e método da presente revelação fornecem detecção de uma variedade de leveduras e mofos. Além disso, o artigo da presente invenção e método podem fornecer detecção rápida de micro-organismos levedura e mofo. Em algumas modalidades, os investigadores descobriram uma composição que compreende uma combinação exclusiva de indicadores em um meio nutritivo que compreende extrato de malte. Em um dispositivo de cultura da presente revelação, a composição é adequada para a detecção rápida de uma variedade de micro-organismos levedura e mofo.

[035] Em um aspecto, a presente descrição apresenta um dispositivo de cultura para detectar micro-organismos de levedura e mofo em uma amostra. Os componentes do dispositivo de cultura, quando em contato com um líquido aquoso, podem agir em colaboração para formar um meio de cultura aquoso que é usado para cultivar micro-organismos de levedura e mofo (por exemplo, fungos filamentosos). Em qualquer modalidade, o meio de cultura da presente revelação pode ser uma mistura que compreende todos ou substancialmente todos os nutrientes necessários para sustentar o crescimento de leveduras e mofos. Em algumas modalidades, um ou mais nutrientes para sustentar o crescimento de micro-organismos de levedura e mofo podem ser fornecidos na amostra.

[036] O dispositivo de cultura da presente revelação fornece detecção aprimorada (isto é, tempo reduzido para detecção, detecção mais inclusiva de micro-organismos de levedura e mofo dentro de um período de incubação específico) em comparação com outros dispositivos e métodos conhecidos na técnica. Em alguns aspectos, um dispositivo de cultura da presente revelação é relacionado a dispositivos de cultura de filme fino revelados nas patentes US n°s 4.565.783; 5.089.413 e 5.681.712; que estão todos aqui incorporados, a título de referência, em sua totalidade.

[037] Amostras adequadas para uso com o dispositivo de cultura da invenção podem ser obtidas ou derivadas de uma variedade de fontes. O termo "fonte" é geralmente usado para se referir ao alimento ou não alimento que se deseja testar no que se refere a micro-organismos. A fonte pode ser um sólido, um líquido, um semissólido, um material gelatinoso, um gás (por exemplo, ar), e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a fonte pode ser fornecida por um elemento de captura (por exemplo, uma membrana filtro, chumaço de algodão, tecido ou esponja) que foi usado, por exemplo, para coletar a fonte de uma superfície de interesse ou do ar. Em algumas modalidades, a amostra líquida pode incluir o elemento de captura, o qual pode ser adicionalmente decomposto (por exemplo, durante um processo de agitação ou dissolução) para aprimorar a recuperação da fonte e de qualquer micro-organismo de interesse. A superfície de interesse pode incluir ao menos uma porção de uma variedade de superfícies, incluindo, mas não se limitando a, paredes (incluindo portas), pisos, tetos, drenos, sistemas de refrigeração, dutos (por exemplo, dutos de ar), saídas de ar, assentos de vasos sanitários, alças, maçanetas, corrimões, topos de balcões, topos de mesas, superfícies para consumo de alimentos (por exemplo, bandejas, pratos, etc.), superfícies de trabalho, superfícies de equipamentos, vestuários, etc., e combinações dos mesmos. Toda ou uma porção da fonte pode ser usada no método. Quando é usada uma porção da fonte, esta por vezes pode ser chamada de uma "amostra" da fonte. Entretanto, para a presente invenção, o termo "amostra" é usado genericamente como referência à porção de volume ou massa de material que é obtida a partir da fonte e é introduzida em um dispositivo de teste para a detecção de micro-organismos.

[038] O termo "alimento" é geralmente usado para se referir a um sólido, líquido (por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, soluções, dispersões, emulsões, suspensões, etc., e combinações das mesmas) e/ou composição comestível semissólida. Os exemplos de alimentos incluem, mas não se limitam a, carnes, aves, ovos, peixe, frutos do mar, vegetais, frutas, alimentos preparados (por exemplo, sopas, molhos, pastas), produtos em grão (por exemplo, farinha, cereais, pães), alimentos enlatados, queijo, leite, outros produtos laticínios (por exemplo, queijo, iogurte, creme azedo), gorduras, óleos, sobremesas, condimentos, especiarias, pastas, bebidas, água, rações, outros materiais comestíveis adequados e combinações dos mesmos.

[039] Com referência à Figura 1, um dispositivo da presente revelação é mostrado como elemento de corpo 10 com três recursos evidentes: substrato à prova d'água 12, membrana permeável a ar 14 e primeira composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca 22. Embora elas possam ser dispostas em qualquer relação adequada, a Figura 1 ilustra uma disposição preferida desses componentes, em que a membrana permeável a ar 14 é fixada a e cobre ao menos a região de crescimento (não mostrada) da superfície superior do substrato 12. A primeira composição formadora de hidrogel 22 é fixada a e cobre ao menos a região de crescimento da superfície superior da membrana 14. O meio de cobertura (camada de cobertura 18) para cobrir a primeira composição formadora de hidrogel 22 durante o transporte, armazenamento e incubação é também mostrado na Figura 1 como sendo fixado de um modo similar a uma dobradiça ao longo de uma borda do elemento de corpo 10. Os meios de cobertura são opcionais mas preferidos em dispositivos da presente revelação. Substratos adequados, primeira composição formadora de hidrogel e meios de cobertura incluem os descritos na patente US n° 4.565.783, que está aqui integralmente incorporada, por referência.

[040] O substrato 12 pode ser um filme relativamente rígido (por exemplo, poliéster, polipropileno ou poliestireno) ou um papel relativamente rígido ou cartolina tendo um revestimento resistente à água sobre o mesmo, que não vai absorver ou de outro modo ser afetado pela água. Filmes de poliéster de aproximadamente 100 μ a 180 μ de espessura, filmes de polipropileno de aproximadamente 100 μ a 200 μ de espessura e filmes de poliestireno de aproximadamente 300 μ a 380 μ de espessura são alguns exemplos não limitadores de materiais adequados para o substrato 12. O substrato 12 pode ser transparente ou opaco, dependendo de se alguém deseja ver as colônias de micro-organismos pelo substrato. Para facilitar a contagem das colônias de microorganismos, o substrato 12 pode opcionalmente ter um padrão de grade (por exemplo, quadrados, não mostrado) estampado sobre o mesmo.

[041] A membrana permeável a ar 14 permite um suprimento adequado de ar para a primeira composição formadora de hidrogel 22 quando a camada de cobertura 18 está no lugar depois que o dispositivo é inoculado. Ao se fazer isso, a membrana 14 é útil para sustentar o crescimento de microorganismos aeróbicos no dispositivo. Em virtude da permeabilidade ao ar da membrana e da membrana ser substancialmente exposta nas suas bordas ao ar, o ar pode passar pelas bordas da membrana, horizontalmente através da membrana, e para dentro do meio. A passagem horizontal de ar para uma membrana específica é mais convenientemente estimada avaliando a permeabilidade ao ar vertical da membrana (isto é, a permeabilidade em uma direção normal das superfícies superior e inferior da membrana). Materiais adequados para membrana permeável ao ar 14, incluindo filmes microporosos e mantas não tecidas microporosas de materiais sintéticos ou naturais, são descritos na patente US n° 5.089.413, que está aqui integralmente incorporada, por referência. Um exemplo não limitador de um material de membrana preferido é um filme de poliolefina microporoso (filme TREDEGAR EXXAIRE, Tredegar Film Products, Richmond, VA, EUA).

[042] Em qualquer modalidade, a membrana 14 tem um padrão de grade quadrado visível estampado sobre a mesma, conforme mostrado na Figura 5, para facilitar a contagem das colônias de micro-organismo. Um dispositivo da presente revelação pode ser preparado com o uso de uma variedade de técnicas. De modo geral, um dispositivo pode ser produzido à mão ou com equipamento de laboratório comum, conforme descrito em detalhes abaixo.

[043] As Figuras 2 e 4 ilustram um dispositivo de acordo com a presente revelação. O dispositivo 28 inclui um elemento de corpo 10' tendo um substrato à prova d'água 12 com uma superfície superior e uma superfície inferior. A superfície inferior da membrana 14 é fixada a (por exemplo, fixada com um adesivo ou de outro modo presa) ao menos a região de crescimento (não mostrado) da superfície superior do substrato 12. De preferência, a superfície superior do substrato 12 é revestida com a camada adesiva 30, que é usada para fixar a membrana 14. A camada adesiva 30 é, de preferência, sensível à pressão, insolúvel em água, e substancialmente não inibidora do crescimento dos micro-organismos intencionados, conforme descrito aqui. Adesivos preferidos incluem aqueles discutidos abaixo em conjunto com a primeira composição adesiva 20 e a segunda composição adesiva 20'. Frequentemente, substratos adequados estão disponíveis já revestidos com um adesivo adequado. Se desejado, entretanto, um substrato adequado pode ser selecionado e revestido (por exemplo, com o uso de um revestidor de facas) com um adesivo adequado.

[044] O método de fixar a membrana 14 ao substrato 12 dependerá da natureza da camada adesiva 30. Se a camada adesiva 30 é sensível à pressão, por exemplo, a membrana 14 pode ser colocada sobre a camada adesiva 30, pressionada para baixo, e assim aderida no lugar.

[045] Com referência às Figuras 2 e 3, o substrato 12 é revestido em uma porção da sua primeira superfície com uma camada da primeira composição adesiva 20. Em qualquer modalidade, a primeira composição adesiva 20 pode compreender um ou mais agentes indicadores (não mostrado) e/ou um ou mais agentes seletivos (não mostrado), conforme descrito aqui. Aderida à primeira composição adesiva 20 está uma composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca 22 que, opcionalmente, inclui um nutriente em pó 16. Dessa forma, a espessura da primeira composição adesiva 20 de preferência deve ser menor que o diâmetro das partículas do agente gelificante em pó e/ou nutrientes que formam a primeira composição formadora de hidrogel solúvel em água fria 22. Uma camada única uniforme da primeira composição formadora de hidrogel solúvel em água fria 22 é desejada com área superficial suficiente exposta para hidratação.

[046] Um meio em pó aderido, ilustrado nas Figuras 2 e 3, é preparado e fixado primeiro formando uma camada da primeira composição adesiva 20 sobre ao menos a região de crescimento da superfície superior da membrana 14. O adesivo da primeira composição adesiva 20 é de preferência, sensível à pressão, insolúvel em água, e substancialmente não inibidor do crescimento dos micro-organismos intencionados. De preferência, a primeira composição adesiva 20 é também suficientemente transparente quando molhada para permitir a visualização das colônias microbianas.

[047] Fixada ao substrato 12 está a camada de cobertura opcional 18. Em qualquer modalidade, a camada de cobertura 18 pode ser afixada a uma borda do substrato 12 (por exemplo, por meio de termocolagem ou uma fita dupla face). A camada de cobertura 18 é translúcida ou de preferência transparente para facilitar a contagem das colônias de micro-organismos e é substancialmente impermeável a micro-organismos e vapor d'água. De modo geral, a camada de cobertura 18 terá propriedades iguais, como transparência e impermeabilidade preferida à água, às do substrato 12. Ademais, a camada de cobertura 18 pode ter padrões estampados sobre a mesma, como padrão de grade quadrada, ou uma borda de máscara (não mostrada) para auxiliar na contagem das colônias de micro-organismos, para fornecer um alvo para colocar a amostra de teste aquosa e/ou por motivos estéticos. A camada de cobertura 18 pode ser selecionada para fornecer uma quantidade de transmissão de oxigênio necessária para micro-organismos levedura e mofo, alguns dos quais exigem ambientes relativamente ricos em oxigênio para condições ideais de crescimento. Materiais adequados para a camada de cobertura são revelados na patente US n° 5.681.712.

[048] Os meios de cobertura (por exemplo, camada de cobertura 18) podem ser isentos de qualquer revestimento, ou podem ser revestidos, por exemplo, sobre a superfície voltada para o meio seco com uma camada de adesivo sensível à pressão, para facilitar a vedação dos meios de cobertura sobre o meio. Ademais, a camada de cobertura 18 pode, opcionalmente, ser revestida sobre a superfície voltada para a primeira composição formadora de hidrogel 22 com camadas da segunda composição adesiva 20' e segunda composição formadora de hidrogel 22', que são iguais ou diferentes da primeira composição adesiva 20 e da primeira composição formadora de hidrogel 22, respectivamente. Os revestimentos da camada de cobertura 18 podem cobrir toda a superfície voltada para a primeira composição formadora de hidrogel 22, mas de preferência cobrem ao menos a parte da superfície que se destina a cobrir a região de crescimento do dispositivo de cultura. Essas camadas de cobertura revestidas são particularmente preferidas quando se deseja fornecer um dispositivo com mais agente gelificante que pode ser incorporado apenas à primeira composição formadora de hidrogel.

[049] A camada de cobertura 18 é, de preferência, aderida de uma maneira similar a uma dobradiça ao longo de uma borda do espaçador 24 e é opcionalmente revestida com uma camada da segunda composição adesiva 20' e da segunda composição formadora de hidrogel 22'. Em qualquer modalidade, a segunda composição adesiva pode compreender um ou mais (por exemplo, todos) da pluralidade de agentes indicadores usados para detectar micro-organismos de levedura e/ou mofo. Alternativamente, a camada de cobertura 18 pode ser aderida diretamente ao substrato 12, conforme ilustrado na Figura 3.

[050] Se um dispositivo de cultura (não mostrado) da presente revelação não incluir uma camada de cobertura fixada ao substrato, o dispositivo de cultura deverá ser armazenado e incubado em um recipiente (por exemplo, uma placa de petri) para impedir a contaminação e/ou dessecação do dispositivo e da amostra antes e depois da inoculação.

[051] Também mostrado na Figura 2 está uma segunda composição adesiva opcional 20’ disposta sobre ao menos uma porção da camada de cobertura 18; uma segunda composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca 22’ disposta sobre a segunda composição adesiva 20’ e um espaçador opcional 24. Quando hidratado com um líquido aquoso (por exemplo, uma amostra líquida e/ou um meio de suspensão aquoso, como água ou um tampão), um agente gelificante presente na primeira composição formadora de hidrogel 22 e/ou segunda composição formadora de hidrogel 22’ forma um hidrogel.

[052] Conforme mostrado nas Figuras 2 e 4, o dispositivo de cultura pode incluir um espaçador 24 fixado (por exemplo, por meio de ligação a quente ou um adesivo sensível à pressão) a uma primeira superfície do substrato 12, à primeira composição adesiva 20 e ou à primeira composição formadora de hidrogel 22. O espaçador 24 compreende uma abertura (por exemplo, abertura circular 26) cortada no centro para expor a primeira composição formadora de hidrogel 22. As paredes da abertura 26 formam uma cavidade de tamanho e formato predeterminados para confinar o hidrogel após a hidratação da primeira composição formadora de hidrogel 22 com um líquido aquoso. A abertura 26 delineia genericamente a área de crescimento do dispositivo de cultura. O espaçador 24 deve ser espesso o suficiente para formar uma cavidade de volume desejado, por exemplo, 1, 2 ou 3 mililitros. A espuma de polietileno de célula fechada é o material preferido para o espaçador 24, mas qualquer material que seja hidrofóbico (não molhado), inerte para micro-organismos e capaz de suportar esterilização, pode ser usado. Em algumas modalidades (não mostrado), o espaçador pode compreender uma pluralidade de aberturas (por exemplo, aberturas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 ou 20), cada uma das quais pode ser inoculada como uma amostra líquida distinta.

[053] Materiais adequados para o elemento espaçador são qualquer substância sólida não inibitória natural ou sintética que está prontamente disponível na forma de lâmina, mas não é um local de crescimento de micro-organismo. Polietileno, polipropileno, politereftalato de etileno e poliestireno são alguns exemplos de materiais sintéticos adequados. Em particular, espumas de poliestireno e espumas de polietileno relativamente baratas comercialmente disponíveis são preferenciais.

[054] O espaçador 24 pode incluir designs relativamente espessos, como os descritos na patente US n° 5.681.712. Um propósito do espaçador com abertura 24 mais espessa (por exemplo, ao menos cerca de 0,5 mm de espessura, cerca de 1 mm de espessura, cerca de 1,5 mm de espessura e cerca de 2 mm de espessura) é localizar e proteger as membranas (por exemplo, membranas de filtro microporoso, não mostradas) colocadas na abertura 26 do espaçador 24. Outro propósito do espaçador mais espesso 24 é reduzir ou evitar contato pela membrana de cobertura 18 com as colônias de micro-organismos cultivadas (isto é, proporcionar um "espaço livre ("headspace")" entre a superfície de crescimento e a membrana de cobertura 18, que pode também proporcionar aumento da aeração nas colônias de micro-organismos cultivadas).

[055] A primeira composição adesiva 20 e, se estiver presente, a segunda composição adesiva 20’ de preferência é um adesivo sensível à pressão. Com mais preferência, o adesivo é um adesivo sensível à pressão como um adesivo insolúvel em água que compreende um copolímero de um monômero de acrilato de alquila e um monômero de alquil amida. De preferência, a razão entre o peso do monômero de acrilato de alquila e o monômero de alquil amida nesses copolímeros é de cerca de 90:10 para 99:1, com mais preferência, de 94:6 para 98:2. O monômero acrilato de alquila compreende um monômero alquila inferior (de C2 a C10) de ácido acrílico, incluindo, por exemplo, acrilato de isooctila (IOA), 2-acrilato de etil hexila, acrilato de butila, acrilato de etila, isoamila acrilato e misturas dos mesmos, enquanto o monômero de alquil amida pode compreender, mas não se limitando a, acrilamida (ACM), metacrilamida, N-vinil pirrolidona (NVP), N -vinil caprolactam (NVCL), N-vinil-2-piperidina, N-(mono- ou di-alquila inferior (de C2 a C5))(met)acrilamidas, N -metil(met)acrilamida, N,N -dimetil(met) acrilamidas, ou misturas dos mesmos.

[056] Em qualquer modalidade, a primeira composição adesiva 20 e/ou a segunda composição adesiva 20’ podem compreender um agente indicador (não mostrado) e/ou agente seletivo. Em qualquer modalidade, o agente indicador pode ser dissolvido em um solvente orgânico (por exemplo, metanol) e misturado com a composição adesiva antes de aplicar a composição ao substrato 12 e ou camada de cobertura 18. Em qualquer modalidade, a primeira composição adesiva 20 e/ou segunda composição adesiva 20’ podem incluir uma pluralidade de agentes indicadores. Em qualquer modalidade, a primeira composição adesiva 20 e a segunda composição adesiva 20’, cada uma, podem incluir um agente indicador idêntico. Em qualquer modalidade, a primeira composição adesiva 20 e a segunda composição adesiva 20’, cada uma, podem incluir um agente indicador ou seletivo que não está incluído na outra composição adesiva.

[057] Em qualquer modalidade, um ou mais agentes indicadores da presente revelação podem estar dispostos como um pó (ou um pó aglomerado) na primeira composição formadora de hidrogel 22 e/ou na segunda composição formadora de hidrogel 22’ aqui reveladas.

[058] Em qualquer modalidade, um dispositivo de cultura da presente revelação compreende uma pluralidade de agentes indicadores (por exemplo, substratos de enzima), sendo que cada agente indicador compreende um grupo-repórter (por exemplo, um grupo fluorogênico ou grupo cromogênico) que permite a detecção de uma reação entre o agente indicador e uma atividade biológica (isto é, uma atividade enzimática associada a micro-organismos de levedura ou mofo) e o agente indicador. Em qualquer modalidade, a pluralidade de agentes indicadores pode compreender cinco agentes indicadores. Em qualquer modalidade, os cinco agentes indicadores podem incluir três agentes para detectar três atividades enzimáticas distintas da glicosidase, um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da esterase (por exemplo, uma atividade enzimática da alquil esterase) e um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase. O meio de cultura compreende adicionalmente um agente gelificante. Em qualquer modalidade, uma pluralidade de agentes indicadores não inclui um agente indicador para detectar atividade enzimática da aminopeptidase.

[059] Os micro-organismos de levedura e mofo produzem uma ou mais de uma variedade de atividades enzimáticas da glicosidase, sendo cada atividade enzimática da glicosidase capaz de reagir com um reagente indicador para produzir um produto detectável. As Tabelas 1 e 2 listam alguns exemplos não limitadores de agentes indicadores que podem reagir com uma atividade enzimática correspondente, se presente, dentro ou adjacente a uma colônia de micro-organismos levedura ou mofo. TABELA 1. AGENTES INDICADORES PARA DETECTAR ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DA GLICOSIDASE.

[060] Os micro-organismos de levedura e mofo produzem uma variedade de atividades enzimáticas da esterase incluindo, por exemplo, atividades enzimáticas da alquil esterase (por exemplo, alquil esterase do ácido graxo) e atividades enzimáticas da fosfatase (por exemplo, hidrolase monoéster fosfórica). A Tabela 2 lista alguns exemplos não limitadores de agentes indicadores que podem reagir com uma atividade enzimática da esterase correspondente, se presente, dentro ou adjacente a uma colônia de microorganismos levedura ou mofo. TABELA 2. AGENTES INDICADORES PARA DETECTAR ATIVIDADES ENZIMÁTICAS DA ALQUIL ESTERASE E FOSFATASE.

[061] Em uma modalidade preferencial, o dispositivo de cultura da presente revelação compreende um agente indicador para detectar a atividade enzimática da α-glucosidase, um agente indicador para detectar a atividade enzimática da β-glucosidase e um agente indicador para detectar a atividade enzimática da β-galactosidase. Em qualquer modalidade, todos os três agentes indicadores supracitados compreendem grupos-repórter similares ou idênticos. Em uma modalidade particularmente preferencial, o dispositivo de cultura da presente revelação compreende 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D- glicopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glicopiranosideo e 5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo.

[062] De acordo com a presente revelação, os agentes indicadores podem ser fornecidos no dispositivo de cultura como um pó ou pó aglomerado (isto é, como um componente da primeira composição formadora de hidrogel solúvel em água fria e/ou a segunda composição formadora de hidrogel solúvel em água fria aqui descrita) ou como uma parte da primeira composição adesiva e/ou segunda composição adesiva aqui descritas. Vantajosamente, quando fornecida em ao menos uma dentre as composições adesivas, os agentes indicadores podem ser distribuídos uniformemente dentro da área de crescimento do dispositivo de cultura e podem ser fornecidos na composição adesiva a uma concentração muito alta. Sem se ater à teoria, considera-se que os agentes indicadores se separam de forma eficaz da composição adesiva relativamente hidrofóbica para o gel reconstituído relativamente hidrofóbico, fornecendo, assim, concentrações consistentes e uniformes dos agentes indicadores para reagir com micro-organismos levedura ou mofo, se estiverem presentes na amostra, no dispositivo de cultura.

[063] Em qualquer modalidade, a primeira e/ou segunda composição adesiva podem compreender cinco agentes indicadores. Os cinco agentes indicadores podem compreender 5-bromo-4-cloro-3-indolil acetato, 5- bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- glicopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-glicopiranosideo e sal de 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato p-toluidina. Conforme mostrado na Tabela 13 abaixo, os investigadores descobriram que essa combinação específica de agentes indicadores tem o efeito surpreendente de proporcionar a detecção de ao menos um organismo (por exemplo, um micro-organismo que pertence ao gênero Botrytis) que não poderia de outro modo ser detectado com o uso de um dispositivo de cultura similar que tem apenas um dos agentes indicadores supracitados, indicando um possível efeito sinérgico da combinação.

[064] Em qualquer modalidade, a primeira ou segunda composição adesiva pode compreender cerca de 0,05 a 1,0%, em peso, de 5- bromo-4-cloro-3-indolil acetato, cerca de 0,05 a 1,0%, em peso, de 5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, 0,05 a 1,0%, em peso, de 5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-D-glicopiranosideo, cerca de 0,05 a 1,0%, em peso, de 5-bromo- 4-cloro-3-indolil-α-D-glicopiranosideo e/ou cerca de 0,05 a 1,0%, em peso, de sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato p-toluidina.

[065] Em qualquer modalidade, a primeira ou segunda composição adesiva podem compreender cerca de 0,18 a 0,5%, em peso, de 5- bromo-4-cloro-3-indolil acetato. Em qualquer modalidade, a primeira ou segunda composição adesiva podem compreender cerca de 0,34 a 0,72%, em peso, de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo. Em qualquer modalidade, a primeira ou segunda composição adesiva podem compreender cerca de 0,34 a 0,72%, em peso, de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glicopiranosideo. Em qualquer modalidade, a primeira ou segunda composição adesiva podem compreender cerca de 0,34 a 0,72%, em peso, de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D- glicopiranosídeo. Em qualquer modalidade, a primeira ou segunda composição adesiva podem compreender cerca de 0,36 a 0,76%, em peso, de sal de 5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato p-toluidina.

[066] Em qualquer modalidade, a primeira ou segunda composição adesiva podem compreender cerca de 0,18-0,5%, em peso, de 5- bromo-4-cloro-3-indolil acetato, cerca de 0,34 a 0,72%, em peso, de 5-bromo-4- cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo, cerca de 0,34 a 0,72%, em peso, de 5- bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glicopiranosideo, cerca de 0,34 a 0,72%, em peso, de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-glicopiranosídeo e cerca de 0,36 a 0,76%, em peso, de sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato p-toluidina.

[067] Aderida à primeira composição adesiva 20 está uma primeira composição formadora de hidrogel solúvel em água fria 22. A primeira composição formadora de hidrogel 22 compreende ao menos um agente gelificante solúvel em água fria. Conforme indicado acima, o meio seco pode conter agente gelificante apenas, e nenhum nutriente. Opcionalmente, em qualquer modalidade, a primeira composição formadora de hidrogel 22 pode também compreender um nutriente para cultivar micro-organismos de levedura ou mofo. Agentes gelificantes adequados para uso na primeira composição formadora de hidrogel 22 incluem agentes gelificantes solúveis em água fria naturais e sintéticos. Exemplos não limitadores de agentes gelificantes adequados naturais incluem algina, carboximetilcelulose, hidróxi etil celulose, goma de alfarrobeira, goma de xantana. Agentes gelificantes sintéticos adequados incluem, por exemplo, poliacrilamida. Combinações de agentes gelificantes naturais e/ou sintéticos são contempladas. Agentes gelificantes preferenciais incluem goma de alfarrobeira e goma de xantana, sendo esses agentes gelificantes úteis individualmente ou, em qualquer modalidade, em combinação uns com os outros.

[068] A primeira composição formadora de hidrogel 22 pode conter os componentes discutidos acima em conjunto com meio seco. De preferência, quando o agente gelificante é incluído na primeira composição formadora de hidrogel 22, ele é incluído em uma quantidade de modo que uma quantidade predeterminada de água ou uma amostra aquosa, por exemplo, de 1 a 3 ml, colocada no meio formará um meio reconstituído que tem uma viscosidade adequada, por exemplo, cerca de 1.500 cps ou mais quando medido a 60 rpm por um viscosímetro Brookfield modelo L VF a 25°C. Os meios nessa viscosidade permitem o manuseio e empilhamento conveniente dos dispositivos durante a incubação e proporcionam formação de colônias distintas no meio. Por exemplo, de 0,025 g a 0,050 g de goma guar em pó espalhadas substancialmente uniformemente sobre uma área de superfície de 20,3 cm2 fornecem um meio suficientemente viscoso quando reconstituído com 1 a 3 ml de uma amostra aquosa. O tamanho das partículas de pó pode ser usado para controlar o peso de revestimento por unidade de área. Por exemplo, sob condições onde uma goma guar de malha 100 reveste a um peso de cerca de 0,05 g/20,3 cm2, a goma guar de malha 400 reveste a um peso de cerca de 0,025 g/20,3 cm2. A primeira composição formadora de hidrogel pode ser aplicada à primeira composição adesiva 20 com o uso de métodos descritos na patente US n° 5.089.413.

[069] Conforme indicado acima, o meio seco pode conter um agente gelificante apenas sem nenhum nutriente. Antes da adição de uma amostra líquida aquosa (por exemplo, uma amostra líquida suspeita de conter micro-organismos de levedura ou mofo) ao dispositivo de cultura, o usuário pode adicionar nutrientes apropriados ao tipo de micro-organismos a serem cultivados. Por exemplo, os nutrientes em pó seco podem ser suspensos em um líquido de evaporação rápida, como etanol ou um clorofluorocarbono volátil. Em outras instâncias, os nutrientes em pó seco podem ser suspensos, por exemplo, dispersos ou dissolvidos, em soluções aquosas. Em qualquer caso, quando uma alíquota da suspensão ou solução de nutrientes é adicionada à superfície do meio, o líquido pode ser deixado evaporar, deixando vários nutrientes junto com o agente gelificante. Adicional ou alternativamente, em qualquer modalidade, um ou mais nutrientes para cultivar micro-organismos de levedura ou mofo podem ser depositados no dispositivo de cultura em um líquido aquoso (por exemplo, um meio de suspensão aquoso ou diluente) quando o dispositivo de cultura é inoculado.

[070] A primeira e/ou segunda composição formadora de hidrogel (22 e 22’, respectivamente) da presente revelação podem compreender adicionalmente ao menos um nutriente para facilitar o crescimento de um microorganismo de levedura ou mofo. Micro-organismos de levedura e mofo são metabolicamente e ecologicamente diversos e, dessa forma, podem usar uma variedade de nutrientes para sustentar seu crescimento e reprodução. A Tabela 3 mostra alguns exemplos não limitadores de gêneros que incluem micro-organismos de levedura e mofo de acordo com a presente revelação. TABELA 3. GÊNEROS EXEMPLIFICADORES DE LEVEDURA E MOFO.

[071] Meios de cultura (por exemplo, meio de cultura desidratado em pó) que compreendem nutrientes para facilitar o crescimento e reprodução de micro-organismos de levedura e mofo são conhecidos na técnica. Os componentes dos meios de cultura incluem, por exemplo, uma fonte de nitrogênio (por exemplo, extrato de levedura, digestões enzimáticas de carne ou outras proteínas, extrato de malte); uma fonte de carbono (por exemplo, vários açúcares, polissacarídeos, oligossacarídeos, extrato de malte); um ou mais vários sais inorgânicos (por exemplo, cloreto de cálcio, citrato férrico de amônio, sulfato de magnésio, cloreto de manganês, sulfato de zinco); opcionalmente, um agente tampão; e, opcionalmente, um antibiótico, como tetraciclina ou cloranfenicol, por exemplo, para inibir o crescimento de bactérias. Em vista da presente revelação, um versado comum na técnica reconhecerá uma variedade de composições nutrientes que podem ser usadas com a mistura de substrato da enzima da presente revelação para detectar micro-organismos de levedura e mofo, desde que um componente da composição de nutrientes não iniba substancialmente a hidrólise dos substratos da enzima na mistura do substrato da enzima e desde que um componente da composição de nutrientes não substancialmente mascare (por exemplo, por supressão por fluorescência) os produtos dos substratos da enzima na mistura do substrato da enzima.

[072] Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode compreender um nutriente que inclui proteínas, oligopeptídeos e/ou aminoácidos. Exemplos não limitadores de tais nutrientes incluem extrato de levedura (por exemplo, autolisado de levedura), extrato de malte e digestos pépticos de carne.

[073] Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode compreender um nutriente de carboidrato que compreende um monossacarídeo, um dissacarídeo, um trissacarídeo, um oligossacarídeo, ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos anteriormente mencionados. Os versados na técnica também reconhecerão que várias fontes de carboidratos podem ser usadas. Elas podem ser fontes naturais (por exemplo, extratos de batata ou vegetal), como misturas de fontes naturais, em formas puras (como oligossacarídeos ou monossacarídeos), em misturas de formas pura, ou como mistura de formas pura e natural. As misturas naturais podem conter quantidades diferentes de carboidratos. Dessa forma, carboidratos podem ser fornecidos de uma variedade de fontes. O extrato de malte é uma fonte exemplificadora de uma variedade de carboidratos. Além de compreender proteínas, oligopeptídeos e/ou aminoácidos que facilitam o crescimento e reprodução de micro-organismos de levedura e mofo, o extrato de malte compreende também nutrientes de carboidrato que facilitam o crescimento e a reprodução de micro-organismos de levedura e mofo.

[074] As misturas naturais podem conter diversos tipos e quantidades de carboidratos, como polissacarídeos, oligossacarídeos e monossacarídeos. Os polissacarídeos que podem ser assimilados por leveduras e mofos incluem amido ou inulina solúvel. Os oligossacarídeos que podem ser assimilados por leveduras e mofos são sacarose, maltose, celobiose, trealose, lactose, melibiose, rafinose e melezitose. Os monossacarídeos que podem ser metabolizados por leveduras e mofos incluem as hexoses (açúcares de seis carbonos): por exemplo, D-glicose, D-frutose, D-galactose, D-manose, L-ramnose e L-sorbose; assim como as pentoses (açúcares de cinco carbonos): por exemplo, D-xilose, D-ribose, L-arabinose e D-arabinose.

[075] Nem todos os carboidratos precisam ser fornecidos e a quantidade relativa de cada um deles pode variar. Os versados na técnica reconhecerão que várias combinações diferentes de monossacarídeos podem ser usadas no meio de cultura da presente revelação. Normalmente, apenas os açúcares que podem ser metabolizados por leveduras e mofos são fornecidos.

[076] Para orientação geral, as quantidades específicas de carboidratos são indicadas na presente invenção. Essas quantidades são para orientação geral apenas e são determinadas de acordo com as informações conhecidas dos versados na técnica, e não se destinam a limitar. Os versados na técnica reconhecerão que várias combinações diferentes de carboidratos podem ser usadas no dispositivo de cultura da presente revelação. Normalmente, apenas os açúcares que podem ser utilizados por quaisquer leveduras e mofos específicos a serem detectados devem ser fornecidos no meio de cultura. Os versados na técnica entenderão que outros carboidratos podem ser fornecidos sem se afastar da invenção.

[077] Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode compreender um agente tampão. O agente tampão pode ser fornecido na primeira e/ou segunda composição formadora de hidrogel. Alguns exemplos não limitadores de agentes tampões adequados incluem compostos fosfato (por exemplo, sódio di-hidrogênio fosfato, hidrogenofosfato dissódico, fosfato di- hidrogênio de potássio, hidrogenofosfato dipotássico), carbonato de sódio, MOPS (2-[N-morfolino]ácido etano sulfônico) ácido livre e MOPS sal de sódio.

[078] O dispositivo de cultura da presente revelação pode compreender um ou mais elementos inorgânicos para facilitar o crescimento de levedura e/ou mofos. Eles incluem qualquer um ou mais de (em nível ainda não fornecido nas fontes acima de vários componentes do meio de cultura): cálcio, cloro, cobalto, ferro, manganês, fósforo, potássio, enxofre, sódio, estanho e zinco. Os sais podem ser fornecidos como uma fonte de íons. Os sais podem incluir (quantidades por litro de meio): fosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, ácido bórico, sulfato de cobre, iodeto de potássio, cloreto férrico, sulfato de manganês, molibdato de sódio e sulfato de zinco. O(s) elemento(s) inorgânico(s) e/ou sal(is) podem ser fornecidos no primeiro pó e/ou segundo pó, se estiver presente.

[079] Em qualquer modalidade, um dispositivo de cultura da presente revelação pode compreender adicionalmente um agente seletivo. Para cultivar uma amostra de levedura ou mofo sem interferência de bactérias, agentes seletivos bacteriostáticos ou bacteriocidas, como cloranfenicol, clorotetraciclina, ácido tartárico ou penicilina adequada, por exemplo, podem ser incluídos. O agente seletivo pode ser fornecido na primeira composição formadora de hidrogel e/ou segunda composição formadora de hidrogel, se estiver presente. Alternativa ou adicionalmente, um agente seletivo pode ser fornecido na primeira composição adesiva e/ou segunda composição adesiva, se estiver presente.

[080] Em um outro aspecto, a presente descrição apresenta um método para detectar um micro-organismo levedura ou mofo. O método compreende colocar uma amostra e um líquido aquoso em contato com o agente gelificante disposto na primeira ou segunda composição adesiva de qualquer modalidade do dispositivo de cultura aqui revelado. Em qualquer modalidade, a amostra pode compreender o líquido aquoso. Em geral, as quantidades do agente gelificante, agentes indicadores e nutriente (se estiver presente) no dispositivo de cultura são selecionadas para fornecer uma concentração eficaz para detectar micro-organismos de levedura ou mofo quando são reconstituídos com um volume predeterminado (por exemplo, 1 mililitro, 2 mililitros, 5 mililitros) de líquido aquoso. O líquido aquoso pode ser adicionado com os materiais da amostra (por exemplo, o material da amostra pode ser dissolvido, homogeneizado, suspenso e/ou diluído em um líquido aquoso como água estéril, um tampão aquoso ou um meio nutritivo aquoso, por exemplo). Em qualquer modalidade em que a amostra compreende materiais sólidos (por exemplo, uma membrana filtrante tendo material retido sobre ou dentro da mesma) ou materiais semissólidos, o volume predeterminado de líquido (por exemplo, água estéril, um meio nutritivo aquoso) pode ser usado para reconstituir o dispositivo de cultura antes ou depois que a amostra sólida ou semissólida é usada para inocular o dispositivo.

[081] A amostra pode ser colocada em contato com o agente gelificante com o uso de métodos que são conhecidos na técnica (por exemplo, vertendo ou pipetando uma amostra líquida no agente gelificante). Em uma modalidade onde o dispositivo de cultura compreende uma camada de cobertura, a camada de cobertura é tipicamente levantada para permitir a deposição da amostra entre a camada de cobertura e o substrato; de preferência, para dentro da abertura de um espaçador, se estiver presente, no dispositivo de cultura. Em qualquer modalidade, colocar uma amostra e um líquido aquoso em contato com o agente gelificante forma um dispositivo de cultura inoculado. Depois de formar o dispositivo de cultura inoculado, a camada de cobertura, se estiver presente, é rebaixada para formar uma barreira protetora contra contaminação e/ou excesso de evaporação do líquido aquoso durante a incubação. Em qualquer modalidade, a amostra pode ser espalhada uniformemente sobre a região de crescimento, por exemplo, colocando uma placa com peso sobre o dispositivo coberto. Se a camada de cobertura não estiver presente, de preferência, o dispositivo de cultura inoculado é colocado em um recipiente estéril para impedir a contaminação e/ou evaporação excessiva do líquido aquoso durante a incubação.

[082] A modalidade do dispositivo 11 ilustrado na Figura 3 é idêntica à da Figura 2 exceto que o espaçador 24 não está presente na Figura 3. Para usar essa modalidade, um molde (por exemplo, um anel circular com um peso definindo a região de crescimento) pode ser aplicado temporariamente sobre a camada de cobertura 18, depois de fechado, para confinar a reconstituição do meio à região de crescimento do meio.

[083] Em qualquer modalidade, colocar uma amostra em contato com o agente gelificante disposto na primeira ou segunda composição adesiva do dispositivo de cultura compreende colocar a amostra em comunicação fluida com o pelo menos um nutriente. Isso pode ser obtido por meio da suspensão ou diluição da amostra em um líquido (por exemplo, um líquido aquoso) que compreende um nutriente ou colocando a amostra e um líquido aquoso em contato com uma primeira composição formadora de hidrogel ou uma segunda composição formadora de hidrogel, aqui descrita, que compreende o pelo menos um nutriente.

[084] Em qualquer modalidade, o método compreende adicionalmente incubar (por exemplo, em uma câmara ambiental com temperatura controlada) o dispositivo de cultura inoculado durante um período de tempo. As condições de incubação (por exemplo, a temperatura de incubação) podem afetar a taxa de crescimento de micro-organismos de levedura e mofo presentes na amostra. Um versado comum na técnica reconhecerá as temperaturas de incubação adequadas para detectar micro-organismos de levedura e mofo específicos. Um dispositivo de cultura inoculado da presente revelação pode ser incubado, por exemplo, a temperaturas entre cerca de 20°C a cerca de 32°C, inclusive. Em qualquer modalidade, o dispositivo de cultura pode ser incubado sob condições aeróbicas.

[085] O dispositivo de cultura inoculado é incubado durante um período de tempo suficiente para permitir o crescimento de um micro-organismo de levedura ou mofo. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser cerca de 36 horas a cerca de 120 horas, inclusive. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser cerca de 48 horas a cerca de 120 horas, inclusive. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser cerca de 48 horas a cerca de 96 horas, inclusive. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser cerca de 48 horas a cerca de 72 horas, inclusive. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser cerca de 48 horas a cerca de 48 horas, inclusive. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser de até cerca de 72 horas. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser de até cerca de 60 horas. Em qualquer modalidade, o período de tempo pode ser de até cerca de 48 horas.

[086] O método da presente revelação compreende adicionalmente a detecção de uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura (por exemplo, observando uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura). Em qualquer modalidade, detectar uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura pode compreender detectar no dispositivo de cultura uma presença ou uma ausência do grupo-repórter detectável de ao menos um dos agentes indicadores, em que a detecção da presença do grupo-repórter detectável é indicativa de uma presença de uma colônia de micro-organismos de levedura ou mofo. À medida que uma colônia de levedura ou mofo cresce no dispositivo de cultura da presente revelação, as células na colônia reagem com um ou mais dos agentes indicadores para ativar (por exemplo, por hidrólise de um substrato de enzima cromogênico ou fluorogênico) o grupo-repórter tornando, assim, direta ou indiretamente o grupo- repórter detectável. No caso de agentes indicadores cromogênicos, o grupo- repórter pode ser detectado pelos comprimentos de onda de luz característicos que ele absorve ou reflete. Por exemplo, os agentes indicadores que compreendem um grupo-repórter indolil podem dimerizar para formar índigo ou derivados dos mesmos. Dessa forma, a presença de uma colônia tendo uma cor (por exemplo, ou a colônia tendo a cor ou o hidrogel adjacente à colônia tendo a cor) que é associada a um grupo-repórter específico é indicativa de uma colônia de micro-organismos de levedura ou mofo.

[087] No caso de agentes indicadores fluorogênicos, o grupo- repórter detectável pode ser observado iluminando-se o dispositivo de cultura com um comprimento de onda adequado de luz (por exemplo, cerca de 365 nm para detectar um grupo-repórter que compreende 4-metil umbeliferona) e observando-se a luz emitida pelo grupo-repórter. Um versado comum na técnica reconhecerá comprimentos de onda de luz adequados necessários respectivamente para iluminar o dispositivo de cultura e para detectar um grupo- repórter associado a um agente indicador fluorogênico específico. Uma colônia tendo a cor do grupo-repórter fluorescente ou a presença do grupo-repórter fluorescente no hidrogel adjacente à colônia é uma indicação de que a colônia é uma colônia de levedura ou uma colônia de mofo.

[088] Em qualquer modalidade, a detecção do grupo-repórter pode compreender observar o dispositivo de cultura visualmente. Em qualquer modalidade, detectar o grupo-repórter pode compreender obter uma imagem do dispositivo de cultura e observar a imagem visualmente ou analisar a imagem com o uso de técnicas de análise de imagem automatizadas. Métodos e dispositivos para detecção automatizada de colônias microbianas em um dispositivo de cultura são descritos, por exemplo, nas patentes US n°s 5.448.652; 6.058.209; 6.243.486; 6.271.022; 7.298.885 e 7.319.031; que estão todas aqui incorporadas, a título de referência em sua totalidade.

[089] Em qualquer modalidade, o método da presente revelação compreende adicionalmente contar as colônias de levedura ou mofo presentes no dispositivo de cultura inoculado após a incubação no dispositivo de cultura inoculado. Dessa forma, depois que as colônias de levedura ou mofo são detectadas, conforme descrito aqui, o número de colônias detectadas é determinado manualmente ou usando processos automatizados conhecidos na técnica.

MODALIDADES

[090] A modalidade A é um dispositivo de cultura que compreende: um elemento de corpo que compreende um substrato autossuportado tendo uma primeira superfície principal e uma segunda superfície principal; uma primeira composição adesiva disposta sobre uma porção da primeira superfície principal do substrato; uma composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca aderida à primeira composição adesiva; e uma pluralidade de agentes indicadores, pluralidade de agentes indicadores que compreende: três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase; um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase; um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase; em que cada um dentre a pluralidade de agentes indicadores compreende um grupo-repórter detectável.

[091] A modalidade B é o dispositivo de cultura da modalidade A, que compreende adicionalmente uma camada de cobertura fixada ao elemento de corpo.

[092] A modalidade C é o dispositivo de cultura da modalidade B, em que a camada de cobertura compreende uma primeira superfície principal voltada para a elemento de corpo; em que o dispositivo de cultura compreende adicionalmente uma segunda composição adesiva disposta sobre uma porção da primeira superfície principal da camada de cobertura e uma segunda composição formadora de hidrogel solúvel em água fria substancialmente seca, aderida à segunda composição adesiva.

[093] A modalidade D é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que ao menos um dentre uma pluralidade de agentes indicadores está disposto na primeira composição adesiva, na segunda composição adesiva, na primeira composição formadora de hidrogel e/ou na segunda composição formadora de hidrogel.

[094] A modalidade E é o dispositivo de cultura da modalidade D, em que ao menos três da pluralidade de agentes indicadores estão dispostos na primeira composição adesiva e/ou na segunda composição adesiva.

[095] A modalidade F é o dispositivo de cultura da modalidade E, em que ao menos cinco da pluralidade de agentes indicadores estão dispostos na primeira composição adesiva e/ou na segunda composição adesiva.

[096] A modalidade G é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende adicionalmente uma membrana permeável a ar disposta entre o substrato e a primeira composição formadora de hidrogel.

[097] A modalidade H é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que ao menos três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase incluem um composto para detectar a atividade enzimática da alfa-glucosidase, um composto para detectar a atividade enzimática da beta-glucosidase e um composto para detectar a atividade enzimática da beta-galactosidase.

[098] A modalidade I é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que ao menos um dentre uma pluralidade de agentes indicadores é um substrato de enzima cromogênico ou um substrato de enzima fluorogênico.

[099] A modalidade J é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que cada um dentre a pluralidade de agentes indicadores é um substrato de enzima cromogênico ou um substrato de enzima fluorogênico.

[0100] A modalidade K é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que ao menos três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase compreendem 5-bromo- 4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-alfa-D- glicopiranosídeo e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glicopiranosídeo.

[0101] A modalidade L é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase compreende 3-indolil-acetato.

[0102] A modalidade M é o dispositivo de cultura da Modalidade L, em que o agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase compreende 5-bromo-4-cloro-3-indolil-acetato.

[0103] A modalidade N é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase compreende 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato.

[0104] A modalidade O é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores que compreende adicionalmente um espaçador insolúvel em água tendo uma abertura, sendo o espaçador fixado ao elemento de corpo ou camada de cobertura e a abertura inteira é posicionada entre o elemento de corpo e a camada de cobertura.

[0105] A modalidade P é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende adicionalmente um volume predefinido de líquido aquoso disposto entre o elemento de corpo e a camada de cobertura, em que o líquido aquoso e o agente gelificante formam um hidrogel.

[0106] A modalidade Q é o dispositivo de cultura da modalidade P, em que ao menos um nutriente compreende extrato de malte.

[0107] A modalidade R é o dispositivo de cultura da modalidade P ou modalidade Q, em que o pelo menos um nutriente é selecionado do grupo consistindo em um digesto péptico de carne, extrato de levedura, dextrose, fosfato de potássio, citrato férrico de amônio, sulfato de magnésio, cloreto de manganês, carbonato de sódio, sulfato de zinco ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dos nutrientes anteriormente mencionados.

[0108] A modalidade S é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a primeira composição formadora de hidrogel ou a segunda composição formadora de hidrogel compreendem substancialmente pós secos aglomerados.

[0109] A modalidade T é o dispositivo de cultura da modalidade S, em que ao menos um dentre a pluralidade de agentes indicadores está disposto na segunda composição adesiva.

[0110] A modalidade U é o dispositivo de cultura da modalidade O, como dependente da modalidade N, em que o espaçador compreende um perímetro que define uma área de crescimento e uma dimensão de espessura, em que a dimensão de espessura é selecionada para impedir o contato entre o hidrogel e a camada de cobertura na área de crescimento.

[0111] A modalidade V é o dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende adicionalmente um agente seletivo disposto na primeira composição adesiva ou na segunda composição adesiva.

[0112] A modalidade W é um método de detecção de levedura e mofo em uma amostra, que compreende: colocar uma amostra e um líquido aquoso em contato com o agente gelificante disposto na primeira ou na segunda composição adesiva do dispositivo de cultura de qualquer uma das modalidades de A a V para formar um dispositivo de cultura inoculado; incubar o dispositivo de cultura inoculado durante um primeiro período de tempo e detectar uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura. A modalidade X é o método da modalidade W, em que detectar uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura compreende detectar no dispositivo de cultura uma presença ou uma ausência do grupo-repórter detectável de ao menos um dos agentes indicadores, em que a detecção da presença do grupo-repórter detectável é indicativa de uma presença de uma colônia de micro-organismos de levedura ou mofo.

[0113] A modalidade Y é o método da modalidade W ou da modalidade X, em que colocar uma amostra em contato com o agente gelificante disposto na primeira ou segunda composição adesiva do dispositivo de cultura compreende colocar a amostra em comunicação fluida com o pelo menos um nutriente.

[0114] A modalidade Z é o método de qualquer uma das modalidades de W a Y, em que incubar o dispositivo de cultura inoculado compreende incubar o dispositivo de cultura inoculado a uma temperatura entre cerca de 20°C e cerca de 32°C, inclusive.

[0115] A modalidade AA é o método de qualquer uma das modalidades de W a Z, em que a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo compreende a incubação do dispositivo de cultura inoculado durante até cerca de 72 horas.

[0116] A modalidade BB é o método da modalidade AA, em que a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo compreende a incubação do dispositivo de cultura inoculado durante até cerca de 60 horas.

[0117] A modalidade CC é o método da modalidade BB, em que a incubação do dispositivo de cultura inoculado por um primeiro período de tempo compreende a incubação do dispositivo de cultura inoculado durante até cerca de 48 horas.

[0118] A modalidade DD é o método de qualquer uma das modalidades de W a CC, que compreende adicionalmente a contagem de colônias de levedura ou mofo presentes no dispositivo de cultura inoculado após a incubação do dispositivo de cultura.

[0119] As vantagens e modalidades desta descrição são mais bem ilustradas pelos exemplos apresentados a seguir, mas os materiais e quantidades específicos das mesmas, citados nesses exemplos, bem como outras condições e detalhes, não devem ser interpretados de maneira que haja limitação indevida à presente descrição. Todos os materiais encontram-se disponíveis comercialmente ou são conhecidos pelos elementos versados na técnica a menos que afirmado ou que seja aparente de outro modo.

EXEMPLOS INDICADORES

[0120] Os indicadores de substrato cromogênico que foram usados nos exemplos são listados na Tabela 4 e foram adquiridos junto à Biosynth International, Inc. (Itasca, IL, EUA). TABELA 4.

[0121] Cada das formulações do indicador no revestimento A-D (Tabela 5) foi preparada a partir de cinco indicadores de substrato cromogênico nas quantidades especificadas na Tabela 5 e 100 g de um copolímero adesivo não inibitório de acrilato de isooctila e acrilamida (descrito a seguir). TABELA 5.

FORMULAÇÕES DE MEIO DE CULTURA

[0122] Seis formulações separadas de meio de cultura foram preparadas como misturas homogêneas misturando os ingredientes da formulação. As composições das formulações de meio de cultura E-J são descritas nas Tabelas 6-11. TABELA 6. FORMULAÇÃO DE MEIO DE CULTURA E

TABELA 7. FORMULAÇÃO DE MEIO DE CULTURA F

TABELA 8. FORMULAÇÃO DE MEIO DE CULTURA G

TABELA 9. FORMULAÇÃO DE MEIO DE CULTURA H

TABELA 10. FORMULAÇÃO DE MEIO DE CULTURA I

TABELA 11. FORMULAÇÃO DE MEIO DE CULTURA J

INOCULAÇÃO E INCUBAÇÃO

[0123] Com exceção de S. cerevisiae, H. anomala e C. albicans, as cepas de levedura e mofo que foram usadas nos exemplos (e listadas na Tabela 12) foram adquiridas como discos liofilizados junto à MicroBiologics, Inc. (St. Cloud, MN, EUA). As cepas de S. cerevisiae, H. anomala e C. albicans foram adquiridas como dispositivos KWIK STIK junto à MicroBiologics, Inc., e foram propagadas de acordo com as instruções do fabricante. Um único disco liofilizado de cada cepa foi adicionado separadamente a 10 a 30 mililitros de 0,1% de água peptonada (n° de catálogo D299, Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA, EUA) para ressuspender os organismos do material do disco liofilizado. As amostras foram, cada uma, diluídas em série em 0,1% de água peptonada para produzir concentrações que forneceram contagens de unidades de formação de colônia (ufc) dentro da faixa de contagem do dispositivo de cultura de filme fino (aproximadamente de 15 a 150 ufc por dispositivo).

[0124] Placas de petri com ágar dicloran rosa de bengala e cloranfenicol (DRBC) foram preparadas como dispositivos de cultura de referência (Becton Dickinson Company, Franklin Lakes, NJ, EUA). Uma alíquota de inóculo de 100 microlitros foi espalhada na placa com DRBC e a placa foi incubada a 25°C durante 5 dias. As contagens obtidas com a placa DRBC de referência foram multiplicadas por um fator de diluição de 10 para considerar as diferenças no volume do inóculo adicionado às placas DRBC de referência e as placas de cultura de filme fino experimentais. TABELA 12. CEPAS DE LEVEDURA E MOFO

EXEMPLO 1

[0125] A formulação do indicador no revestimento B (Tabela 5) foi preparada misturando os cinco indicadores de substrato cromogênico em DMSO (5-15 ml) e, então, adicionando a 100 g de copolímero adesivo não inibidor (aproximadamente 24% de sólidos em uma solução em acetato de etila e heptanos) descrito no Exemplo 1 da patente US n° 5.635.367, que está aqui integralmente incorporada, por referência. A formulação de revestimento resultante foi agitada até ficar homogênea. A formulação foi revestida com um revestidor de facas (configuração de vão de cerca de 0,03 milímetros (cerca de 1 mil)) em um lado de um substrato de filme de polipropileno orientado biaxialmente (BOPP) com 0,04 milímetros (1,6 mil) de espessura (Vifan Company, Morristown, TN, EUA). O filme revestido foi submetido à secagem em um forno a 70 a 80°C durante 10 a 15 minutos. O lado revestido do filme BOPP foi, então, revestido com pó com uma mistura a 1:1 de goma de xantana e goma de alfarrobeira. O excesso de pó foi removido.

[0126] O dispositivo de cultura de filme fino do experimento foi preparado por meio da remoção da camada de cobertura de filme fino de uma placa de contagem de levedura e mofo PETRIFILM da 3M (3M Company) comercialmente disponível que foi substituída com o filme BOPP revestido descrito acima. O filme BOPP revestido foi cortado nas mesmas dimensões do filme inferior e foi disposto com a superfície revestida do filme voltada para o meio de cultura. A nova camada de cobertura de filme fino contendo os cinco indicadores foi fixada ao filme inferior com o uso de fita dupla face.

[0127] Os dispositivos de cultura de filme fino foram inoculados com uma única amostra de levedura ou mofo selecionada dentre Paecilomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Botrytis spp., Hansenuela anomala, Candida albicans, Penicillium chrysogenum. O filme superior do dispositivo foi retirado e 1 ml do inóculo foi adicionado (por pipeta) ao meio de cultura no filme inferior. O filme superior foi substituído, e a amostra foi uniformemente distribuída na área desejada (30 mm2) com o uso de um espalhador horizontal PETRIFILM da 3M (3M Company). Dispositivos de cultura de filme fino duplicados foram preparados para cada amostra. Os dispositivos inoculados foram incubados a 25°C de 60 a 72 horas.

[0128] As colônias em cada dispositivo foram contadas por exame visual em 48 horas e no final do período de incubação (ponto de tempo 60 a 72 horas). Em cada ponto de tempo, foram obtidas médias das contagens de ufc dos dispositivos individuais e o valor média de contagem foi determinado. As colônias nas placas DRBC de referência foram contadas das mesma maneira descrita para os dispositivos de cultura de filme fino. Os resultados do ponto de tempo de 48 horas são apresentados nas Tabelas 13 e 14 junto com os resultados obtidos para os Exemplos Comparativos 1-6 e para as placas DRBC de referência. A contagem de ufc das placas DRBC foi feita após 5 dias de incubação. EXEMPLO COMPARATIVO 1

[0129] O mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 1 foi usado com exceção de que apenas um único agente indicador, 5-bromo-4- cloro-3-indolil acetato (57,7 mg por 100 g de adesivo), foi incluído no revestimento do filme superior (em vez de cinco agentes indicadores). Para cada amostra de levedura ou mofo, o dispositivo foi inoculado com a mesma preparação de amostra usada no Exemplo 1. Os resultados são apresentados nas Tabelas 13 e 14. EXEMPLO COMPARATIVO 2

[0130] O mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 1 foi usado com exceção de que apenas um único agente indicador, 5-bromo-4- cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosídeo (81,8 mg por 100 g de adesivo), foi incluído no revestimento do filme superior (em vez de cinco agentes indicadores). Para cada amostra de levedura ou mofo, o dispositivo foi inoculado com a mesma preparação de amostra usada no Exemplo 1. Os resultados são apresentados nas Tabelas 13 e 14. EXEMPLO COMPARATIVO 3

[0131] O mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 1 foi usado com exceção de que apenas um único agente indicador, 5-bromo-4- cloro-3-indolil-beta-D-glicopiranosídeo (81,8 mg por 100 g de adesivo), foi incluído no revestimento do filme superior (em vez de cinco agentes indicadores). Para cada amostra de levedura ou mofo, o dispositivo foi inoculado com a mesma preparação de amostra usada no Exemplo 1. Os resultados são apresentados nas Tabelas 13 e 14. EXEMPLO COMPARATIVO 4

[0132] O mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 1 foi usado com exceção de que apenas um único agente indicador, 5-bromo-4- cloro-3-indolil-alfa-D-glicopiranosídeo (81,8 mg por 100 g de adesivo), foi incluído no revestimento do filme superior (em vez de cinco agentes indicadores). Para cada amostra de levedura ou mofo, o dispositivo foi inoculado com a mesma preparação de amostra usada no Exemplo 1. Os resultados são apresentados nas Tabelas 13 e 14. EXEMPLO COMPARATIVO 5

[0133] O mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 1 foi usado com exceção de que apenas um único agente indicador, sal de 5- bromo-4-cloro-3-indolila fosfato para-toluidina (130 mg por 100 g de adesivo), foi incluído no revestimento do filme superior (em vez de cinco agentes indicadores). Para cada amostra de levedura ou mofo, o dispositivo foi inoculado com a mesma preparação de amostra usada no Exemplo 1. Os resulta são apresentados nas Tabelas 13 e 14. TABELA 13.

TABELA 14.

EXEMPLO 2

[0134] Os dispositivos de cultura de filme fino foram preparados com o uso dos procedimentos gerais descritos nas patentes US n°s 4.565.783 e 5.089.413. A formulação do revestimento foi preparada pela adição de uma solução contendo sal de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato para-toluidina (86,7 mg), clorotetraciclina (13,6 mg) e cloranfenicol (10,9 mg) em metanol (5 a 10 ml) a 100 g do copolímero de acrilato adesivo descrito no Exemplo 1. A formulação de revestimento resultante foi agitada até ficar homogênea. O substrato do revestimento era um filme de poliolefina microporoso (filme Tredegar EXXAIRE, Tredegar Film Products, Richmond, VA, EUA) adesivamente laminado para papel de Polysilk. A formulação do revestimento foi revestida com um revestidor de facas (configuração de vão de cerca de 0,03 milímetros (cerca de 1 mil)) no lado do substrato do filme de polipropileno para criar um cilindro mestre. O cilindro mestre foi cortado em seções de 76 mm de largura por 102 mm de comprimento que formaram a camada inferior do dispositivo. Uma camada de espuma (76 mm de largura por 102 mm de comprimento por 0,57 mm de espessura) com uma abertura circular (61 mm de diâmetro) foi laminada adesivamente ao lado revestido do filme inferior. A abertura circular foi posicionada no centro da camada de espuma.

[0135] O meio de cultura foi preparado pela adição de uma mistura de goma de xantana e goma de alfarrobeira (1:1, em peso) à formulação do meio de cultura pré-misturada E (descrita na Tabela 6) em uma razão de três partes de mistura de goma para uma parte de formulação de meio de cultura E. A mistura combinada foi mesclada para concluir a mistura. Aproximadamente dois gramas da mistura de pó combinada foram aplicadas uniformemente para cobrir o adesivo exposto pela abertura circular no dispositivo de cultura de filme fino. O excesso de pó foi removido invertendo o dispositivo. O resultado foi uma camada fina da mistura de pó combinada (meio de cultura e goma) ligada à camada adesiva do dispositivo.

[0136] A camada de cobertura de filme fino contendo a formulação do indicador no revestimento B foi preparada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1. A camada de cobertura revestida foi cortada nas mesmas dimensões da seção do filme inferior e foi disposta com a superfície revestida da camada de cobertura voltada para o meio de cultura. A camada de cobertura foi fixada ao filme inferior com o uso de fita dupla face.

[0137] Os dispositivos de cultura de filme fino foram inoculados com uma única amostra de levedura selecionada dentre Candida albicans, Trichosporon mucoides, Candida guillermondii. O filme superior do dispositivo foi retirado e 1 ml do inóculo foi adicionado (por pipeta) ao meio de cultura no filme inferior. O filme superior foi substituído e a amostra foi espalhada de maneira uniforme nas bordas da abertura circular aplicando pressão para baixo com um espalhador horizontal PETRIFILM da 3M. Dispositivos de cultura de filme fino duplicados foram preparados para cada amostra. Os dispositivos inoculados foram incubados a 25°C de 60 a 72 horas.

[0138] As colônias de cada amostra foram contadas por exame visual em 48 horas e no final do período de incubação (ponto de tempo 60 a 72 horas). As colônias eram de cor branca ou azul. Em cada ponto de tempo, foram obtidas médias das contagens de ufc dos dispositivos individuais e o valor médio de contagem foi usado para calcular o número de unidades de formação de colônia por mililitro (ufc/ml) na amostra original não diluída. Os valores calculado de cfu/ml e cor da colônia (branca ou azul) para cada amostra no ponto de tempo de 48 horas são mostrados na Tabela 15 junto com os resultados obtidos dos Exemplos 3-6. EXEMPLO 3

[0139] As mesmas condições experimentais e procedimentos conforme descrito no Exemplo 2 foram seguidos com exceção de que os dispositivos de cultura de filme fino foram preparados com o uso da formulação de meio de cultura F (descrito na Tabela 7), em vez da formulação de meio de cultura E (descrito na Tabela 6). EXEMPLO 4

[0140] As mesmas condições experimentais e procedimentos conforme descrito no Exemplo 2 foram seguidos com exceção de que os dispositivos de cultura de filme fino foram preparados com o uso da formulação de meio de cultura G (descrito na Tabela 8), em vez da formulação de meio de cultura E (descrito na Tabela 6). EXEMPLO 5

[0141] As mesmas condições experimentais e procedimentos conforme descrito no Exemplo 2 foram seguidos com exceção de que os dispositivos de cultura de filme fino foram preparados com o uso da formulação de meio de cultura H (descrito na Tabela 9), em vez da formulação de meio de cultura E (descrito na Tabela 6). EXEMPLO 6

[0142] As mesmas condições experimentais e procedimentos conforme descrito no Exemplo 2 foram seguidos com exceção de que os dispositivos de cultura de filme fino foram preparados com o uso da formulação de meio de cultura I (descrito na Tabela 10), em vez da formulação de meio de cultura E (descrito na Tabela 6). EXEMPLO 7

[0143] As mesmas condições experimentais e procedimentos conforme descrito no Exemplo 2 foram seguidos com exceção de que os dispositivos de cultura de filme fino foram preparados com o uso da formulação de meio de cultura J (descrito na Tabela 11), em vez da formulação de meio de cultura E (descrito na Tabela 6). TABELA 15.

EXEMPLO 8

[0144] Os dispositivos de cultura de filme fino conforme descrito no Exemplo 2 foram preparado com duas exceções. Primeiro, os dispositivos de cultura de filme fino foram preparados com o uso da formulação de meio de cultura H (descrito na Tabela 9), em vez da formulação de meio de cultura E (descrito na Tabela 6). Segundo, a camada de cobertura de filme fino do dispositivo foi revestida com a formulação do indicador no revestimento A, em vez da formulação do indicador no revestimento B.

[0145] Os dispositivos de cultura de filme fino foram inoculados com uma única amostra de levedura ou mofo selecionada dentre Paecilomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Botrytis spp., Hansenuela anomala, Can dida albicans, Penicillium chrysogenum , Aspergillus niger. O filme superior do dispositivo foi retirado e 1 ml do inóculo foi adicionado (por pipeta) ao meio de cultura no filme inferior. O filme superior foi substituído e a amostra foi espalhada de maneira uniforme nas bordas da abertura circular aplicando pressão para baixo com um espalhador horizontal PETRIFILM da 3M. Dispositivos de cultura de filme fino duplicados foram preparados para cada amostra. Os dispositivos inoculados foram incubados a 25°C de 48 a 60 horas.

[0146] As colônias de cada amostra foram contadas por exame visual no ponto de tempo de 48 horas ou 60 horas. Foram obtidas as médias das contagens de ufc dos dispositivos individuais e o valor médio da contagem foi usado para calcular o número de unidades de formação de colônia por mililitro (ufc/ml) na amostra original não diluída. Nas Tabelas 16 e 17, os valores de cfu/ml calculados para cada amostra no ponto de tempo de 48 horas ou 60 horas são apresentados. EXEMPLO 9

[0147] As mesmas condições experimentais e procedimentos conforme descritos no Exemplo 8 foram seguidas com exceção de que a camada de cobertura de filme fino do dispositivo foi revestida com a formulação do indicador no revestimento B, em vez da formulação do indicador no revestimento A. Os resultados são apresentados nas Tabelas 16 e 17. EXEMPLO 10

[0148] As mesmas condições experimentais e procedimentos conforme descritos no Exemplo 8 foram seguidas com exceção de que a camada de cobertura de filme fino do dispositivo foi revestida com a formulação do indicador no revestimento C, em vez da formulação do indicador no revestimento A. Os resultados são apresentados nas Tabelas 16 e 17. TABELA 16. CONTAGENS DE COLÔNIAS APÓS 48 HORAS DE INCUBAÇÃO

TABELA 17. CONTAGENS DE COLÔNIA APÓS 48 OU 60 HORAS DE INCUBAÇÃO (COMO DESIGNADO).

EXEMPLO 11

[0149] Os mesmos dispositivos de cultura de filme fino conforme descrito no Exemplo 8 foram preparados com exceção de que a camada de cobertura de filme fino do dispositivo foi revestida com a formulação do indicador no revestimento D, em vez da formulação do indicador no revestimento A.

[0150] Seis itens de alimento foram selecionados para o teste (grãos de milho, cenouras cortadas, pasta de tomate, purê de pimenta verde, massa com molho à bolonhesa e tempero para frango). Cada item de alimento foi testado separadamente. Uma porção de 11 g da amostra de alimento foi adicionada a uma bolsa plástica de enriquecimento contendo 99 ml de 0,1% de água peptonada e a bolsa foi agitada. As amostras de alimentos foram diluídas em série com 0,1% de água peptonada para produzir concentrações que forneceram contagens de unidades de formação de colônia (ufc) dentro da faixa de contagem do dispositivo de cultura de filme fino (aproximadamente de 15 a 100 ufc por dispositivo). Os dispositivos de filme fino foram inoculados levantando a camada de cobertura de filme transparente, pipetando 1 ml da amostra diluída no centro do filme inferior revestido e substituindo a camada de cobertura. A amostra foi espalhada de maneira uniforme nas bordas da abertura circular aplicando pressão para baixo com um espalhador horizontal PETRIFILM da 3M. Dispositivos de cultura de filme fino duplicados foram preparados para cada amostra. Os dispositivos inoculados foram incubados a 25°C de 60 a 72 horas.

[0151] O número total de colônias de levedura e mofo de cada amostra foi contado por exame visual em 48 horas e no final do período de incubação (ponto de tempo de 60 a 72 horas). Em cada ponto de tempo, foram obtidas médias das contagens de ufc dos dispositivos individuais e o valor médio de contagem foi usado para calcular o número de unidades de formação de colônia por mililitro (ufc/ml) na amostra original não diluída. As colônias nas placas DRBC de referência foram contadas das mesma maneira descrita para os dispositivos de cultura de filme fino. Os valores de cfu/ml calculados para cada amostra no ponto de tempo de 48 horas são apresentadas na Tabela 18. A contagem de ufc das placas DRBC de referência foi feita após 5 dias de incubação. TABELA 18.

[0152] A descrição completa de todas as patentes, pedidos de patente, publicações e materiais disponíveis na forma eletrônica citados na presente invenção, está aqui incorporada a título de referência. Caso qualquer inconsistência exista entre a descrição do presente pedido e a(s) descrição(ões) de qualquer documento aqui incorporado, a título de referência, a descrição do presente pedido deve prevalecer. A descrição detalhada e os exemplos apresentados anteriormente foram fornecidos apenas por uma questão de clareza. Nenhuma limitação desnecessária deve ficar implícita a partir disso. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos, visto que variações óbvias aos versados na técnica estarão incluídas na invenção definida pelas reivindicações.

[0153] Todos os cabeçalhos são para a comodidade do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue os cabeçalhos, a menos que esteja especificado.

[0154] Várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Essas e outras modalidades estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (11)

1. DISPOSITIVO DE CULTURA (28), caracterizado por compreender: um corpo (10) que compreende um substrato (12) autossuportado tendo uma primeira superfície principal e uma segunda superfície principal; uma primeira composição adesiva (20) disposta sobre uma porção da primeira superfície principal do substrato (12); uma composição formadora de hidrogel solúvel em água fria seca (22) aderida à primeira composição adesiva (20); e uma pluralidade de agentes indicadores, sendo que a pluralidade de agentes indicadores que compreende: três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase, os três agentes indicadores para detectar atividades enzimáticas distintas da glicosidase compreendem 5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-glicopiranosideo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-glicopiranosideo e 5- bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosideo; um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase, em que o agente indicador para detectar uma atividade enzimática da alquil esterase compreende 3-indolil-acetato; um agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase, em que o agente indicador para detectar uma atividade enzimática da fosfatase compreende 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato; sendo que ao menos um dentre uma pluralidade de agentes indicadores está disposto na primeira composição adesiva (20) ou na primeira composição formadora de hidrogel (22), em que cada um dentre a pluralidade de agentes indicadores compreende um grupo-repórter detectável.

2. DISPOSITIVO DE CULTURA (28), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente uma camada de cobertura (18) fixada ao elemento de corpo (10).

3. DISPOSITIVO DE CULTURA (28), de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela camada de cobertura (18) compreender uma primeira superfície principal da camada de cobertura (18) voltada para o elemento de corpo (10); em que o dispositivo de cultura (28) compreende adicionalmente uma segunda composição adesiva (20’) disposta sobre uma porção da primeira superfície principal da camada de cobertura (18) e uma segunda composição formadora de hidrogel solúvel em água fria seca (2), aderida à segunda composição adesiva (20’).

4. DISPOSITIVO DE CULTURA (28), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender adicionalmente uma membrana permeável ao ar (14) disposta entre o substrato (12) e a primeira composição formadora de hidrogel (22).

5. DISPOSITIVO DE CULTURA (28), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender adicionalmente um espaçador insolúvel em água (24) tendo uma abertura (26), em que o espaçador (24) é fixado ao elemento de corpo (10) ou camada de cobertura (18), e a abertura (26) inteira é posicionada entre o elemento de corpo (10) e a camada de cobertura (18).

6. DISPOSITIVO DE CULTURA (28), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreende adicionalmente um volume predefinido de líquido aquoso disposto entre o elemento de corpo (10) e a camada de cobertura (18), em que o líquido aquoso e agente gelificante formam um hidrogel.

7. DISPOSITIVO DE CULTURA (28), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela primeira composição formadora de hidrogel (22) ou pela segunda composição formadora de hidrogel (22’) compreenderem ao menos um nutriente para cultivar micro-organismos de levedura ou mofo.

8. MÉTODO DE DETECÇÃO DE LEVEDURA E MOFO EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender: colocar uma amostra e um líquido aquoso em contato com o agente gelificante disposto na primeira ou na segunda composição adesiva (20, 20’) do dispositivo de cultura (28), conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, para formar um dispositivo de cultura inoculado (28); incubar o dispositivo de cultura inoculado (28) durante um primeiro período de tempo; e detectar uma colônia de levedura ou mofo no dispositivo de cultura (28).

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por colocar uma amostra em contato com o agente gelificante disposto na primeira ou na segunda composição adesiva (20, 20’) do dispositivo de cultura (28) compreender colocar a amostra em comunicação fluida com o pelo menos um nutriente.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado por incubar o dispositivo de cultura inoculado (28) durante um período de tempo compreende incubar o dispositivo de cultura inoculado (28) por até 72 horas.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por compreender adicionalmente a contagem de colônias de levedura ou mofo presentes no dispositivo de cultura inoculado (28) após a incubação do dispositivo de cultura (28).

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