KR20150106985A - 세포투과성 ｐｒａｓ４０ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명자들은 PRAS40 융합단백질이 인비트로에서 산화 스트레스로 유도된 신경세포사멸에 대한 세포 보호효과와 인비보에서 뇌허혈 동물모델 보호효과가 있음을 밝혔다. PRAS40 융합단백질은 신경세포 내로 농도 및 시간 의존적으로 효과적으로 투과하였다. 세포 내로 투과된 PRAS40 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 PRAS40 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 PRAS40 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.

Description

세포투과성 ＰＲＡＳ４０ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for treating ischemia containing cell-transducible PRAS40 fusion protein}

본 발명은 세포투과성 PRAS40 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 세포 내로 투과된 PRAS40 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 PRAS40 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 PRAS40 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.

활성산소종 (reactive oxygen specific)은 산소를 이용하여 에너지를 얻는 모든 생명체에서 여러 세포 내 대사 과정의 부산물로 필연적으로 생성되며, 이러한 활성산소종의 유해 작용은 세포 내 단백질, 핵산 및 지방과 같은 생체 고분자의 손상과 깊은 관련이 있다. 거대분자들이 활성산소종에 일정하게 노출되면 최종적으로 세포사멸을 유도하게 되며, 특이적인 조직에서의 세포사멸은 결국 뇌허혈 (ischemia), 암 발생과정 (carcinogenesis), 염증 (inflammation), 면역 손상 (immune injury)등 다양한 인간의 질병에 기여하고 있다는 것을 알 수 있다 [1,2]. 뇌허혈 환자의 뇌 허혈성 재관류 (brain ischemia-reperfusion)가 진행되면서 자유라디칼의 생성이 증가할 뿐만 아니라 활성산소종이 증가하여 신경 세포사멸이 이루어진다 [3,4,5]. 그러나 어떤 메카니즘으로 허혈에 신경의 손상을 일으키는지는 명확하지 않다 [6,7,8].

AKT 신호 전달 경로의 다양한 경로 중 가장 밀접하게 관련된 mTOR 경로는 세포 사멸이 일어남에 따라 세포의 생장을 조절한다. PRAS40 단백질은 mTORC1의 구성요소로써, Raptor와 Deptor, mTOR과 함께 복합체를 형성하는데, 세포 성장인자에 의해 활성화된 PI3K가 Akt를 인산화시키고, 그로 인하여 mTORC1이 활성화된다 [9,10]. mTORC1을 억제하고 있던 PRAS40 단백질이 pAkt에 의하여 인산화가 되어 mTORC1과의 결합에서 떨어져 나와 mTORC1이 활성화 된다 [13,14]. 이렇게 활성화된 mTORC1은 S6 카이네이즈와 4EBP1을 조절함으로써 세포의 생장, 유전자 전사 및 번역을 조절하고, 단백질의 안정화 및 인슐린 신호에도 관여한다. 이러한 mTORC1은 세포의 생존과 매우 밀접하게 관련되어 있다 [11,12]. 최근에는 인산화된 PRAS40 단백질이 단순히 mTORC1 조절뿐만 아니라 다양한 기능을 한다고 알려졌다. 특히 PRAS40 단백질은 14-3-3 시그마 단백질과 결합하여 세포사멸을 억제하는 기능을 한다고 밝혀졌는데, 이런 PRAS40의 세포사멸 억제기능은 활성산소종의 대표적 질환인 뇌졸중 동물모델에서 보호효능이 있다는 연구결과가 나왔다 [15].

본 발명자들은 단백질 도입 기술을 이용하여 Tat-PRAS40 융합단백질 전체를 세포 안으로 침투시켰다. 단백질 수송 도메인 (protein transduction domain; PTDs)을 이용하여 살아 있는 세포 내에 단백질이 운반되도록 하였다 [16]. 본 발명자들은 전 연구에서 Tat-카탈레이즈를 다양한 세포에서 효과적으로 형질도입시켰으며, 성상교세포를 이용하여 실험한 결과 Tat-카탈레이즈가 증가하면 라디칼 제거제 (radical scavenger) 활성이 있는 것을 밝힌바 있다 [17]. 또한, 다양한 형질도입 융합단백질이 인비트로와 인비보 상에서 세포 사멸에 대하여 방어하는 기능을 한다는 것을 밝힌바 있다 [18,19,20].

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위와 같은 선행연구를 토대로 본 발명에서는 Tat-PRAS40 융합단백질을 인비트로와 인비보에 직접적으로 도입시켜서 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포사멸에 저항하여 세포를 보호한다는 것을 알았으며, 단백질이 전뇌 (forebrain)에서 일어나는 허혈의 치료제로 이용될 수 있을 것이라는 가능성을 보았다.

본 발명은 허혈손상 및 허혈손상에 의한 신경세포 손상과 사멸을 치료하기 위한 효과적인 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 PRAS40이 단백질 수송 도메인과 융합되면 허혈손상 및 허혈손상에 의한 신경세포 손상 및 사멸을 방지할 수 있는지를 연구하였다.

본 발명자들은 PRAS40 융합단백질이 인비트로에서 산화 스트레스에 의해 유도된 신경세포 사멸과 인비보 허혈동물모델에서 보호효과가 있는지를 밝히고자 하였다. 허혈성 신경세포 사멸에 대해 PRAS40 융합단백질의 잠재적인 효과를 연구하기 위해 본 발명자들은 세포 내로 투과할 수 있는 Tat-PRAS40 융합단백질을 제작하였다. Tat-PRAS40 융합단백질은 신경세포 내부로 농도 의존적 및 시간 의존적으로 효과적으로 투과하였다. 세포 내로 투과된 Tat-PRAS40 융합단백질은 과산화수소 독성에 대한 세포 생존율을 증가시켰고, 세포내 활성산소종 수준을 낮추었다. 그리고, 세포 내로 투과된 Tat-PRAS40 융합단백질은 과산화수소에 의해 유도된 DNA 조각화 현상도 저하시켰다. 동물모델에서 Tat-PRAS40 융합단백질은 전뇌의 해마 CA1 부분에서 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸로부터 세포를 보호하였다. 이러한 결과들은 Tat-PRAS40 융합단백질이 인비트로와 인비보에서 일어나는 세포사멸에 대해 보호효과를 나타내며, 산화 스트레스와 관련된 허혈손상에 대해 치료제로 이용될 수 있음을 말해준다.

본 발명자들은 PRAS40 단백질이 인비트로에서 산화 스트레스에 의해 유도된 신경세포 사멸과 인비보에서 허혈동물모델에서 보호 효과가 있는지 입증하였다. 허혈성 세포사멸에 대해 PRAS40 단백질의 잠재적인 효과를 연구하기 위해 우리는 세포 내로 투과할 수 있는 Tat-PRAS40 융합단백질을 제작하였다.

PRAS40 단백질은 원래 Akt 신호에 의해 활성화되는 mTORC1의 구성 요소로써 정상 상태에서 mTORC1과 결합하여 그 활성을 억제하는 역할로 알려져 있다. 하지만 최근 PRAS40 단백질의 인산화가 세포사멸에 대하여 보호효과를 가진다고 밝혀졌다. 특히 활성산소종에 의해 유도되는 대표적인 질환인 뇌졸중 동물모델에서 보호효능이 있다는 것이 밝혀졌다 [15]. 과산화수소나 MPP⁺와 같은 활성산소종 유도 물질로 인하여 Akt 신호가 활성화된다고 알려졌다 [33,34]. 이렇게 활성화된 pAkt에 의해 유도된 pPRAS40이 mTORC1과 결합이 풀리고 14-3-3 시그마 단백질과 결합하여 세포사멸을 억제한다는 연구들이 있다. 이 복합체가 정확히 어떠한 기작으로 세포사멸을 억제하는지는 밝혀지지 않았다 [25,35].

비록 PRAS40 단백질이 뇌 질환에 대한 치료용 단백질로의 가능성이 있는 것으로 생각되지만, 이러한 목적으로 사용하기에는 단백질이 세포 안으로 들어가기 힘들다. 그러므로 우리는 세포와 조직에 PRAS40 단백질을 이동시키기 위해 단백질 형질도입 수단을 연구하였다.

본 발명자들은 사람 PRAS40 유전자를 HIV-1 Tat 펩타이드와 미생물 발현 벡터를 함께 결합시킨 세포-침투성 PRAS40를 과대 발현시킬 수 있는 발현 시스템을 사용하여 Tat-PRAS40 융합단백질을 생산하였다. Tat-PRAS40 융합단백질은 세포의 모든 수용성 단백질들 중에 주요한 구성성분으로 높은 수준으로 발현되었다. 그리고 SDS-PAGE 분석으로 95% 이상 순수하고 거의 동질의 단백질임을 확인하였다. 이렇게 얻어낸 융합단백질을 이용하여 연구를 수행하였다.

사실, 몇몇 연구자들은 HIV-1 Tat과 (Arg)9 등의 단백질 수송 도메인 융합단백질의 형질도입이 살아있는 세포의 세포막을 통하여 될 순 없고, 세포 고정 때문에 세포막을 인위적으로 재분포시킨다고 설명한다. 하지만 세포 고정 기술은 세포막을 부수므로 막전위 단백질 (membrane-translocating proteins) 연구는 신뢰가 떨어진다. 이런 펩타이드와 융합단백질은 엔도시토시스로 세포 안으로 들어와 세포 자신의 것으로 받아들인다. 그래서 살아있는 세포 안으로의 단백질 형질도입 연구는 세포 고정을 피해야 한다 [36]. 그러나 본 발명에서 고정된 세포와 고정되지 않은 세포 안으로 형질도입된 Tat-PRAS40 융합단백질의 형광 분포를 통해 서로 다른 점을 찾지 못했다. 이 결과들은 파라포름알데하이드를 이용한 세포 고정은 Tat-PRAS40 형질도입에는 필요하지 않다는 것을 보여준다. 비슷한 연구 보고에서, 인위적인 단백질이 세포 안으로 형질도입되는데 파라포름알데하이드 고정을 유발하지 않는다고 지적했다 [37]. 또한 본 발명자들도 세포 안에 형질도입된 Tat-SOD (superoxide dismutase)와 PEP-1-SOD 융합단백질이 파라포름알데하이드 고정에 영향을 받지 않는다고 보고 했다 [18].

본 발명자들은 성상교세포 안에 정제된 Tat-PRAS40 융합단백질을 시간과 농도 의존적으로(time- and dose-dependent manner) 효과적으로 형질도입시켰다. 10분 안에 세포 안으로 융합단백질이 형질도입되었고, 120분까지 시간에 따라 형질도입 수준이 점차적으로 증가하였다. Tat-β-갈락토시다아제 융합단백질이 HepG2 세포 내 최대 농도로 형질도입되는데 15분 이내에 이루어진다고 보고된바 있다. 게다가 본 발명자들은 Tat-SOD와 Tat-카탈레이즈 융합단백질이 포유동물 세포와 조직에 1시간 이내에 형질도입되는 것을 보고하였다 [38,39,40]. 이러한 세포 내 투과 시간의 차이는 Tat 벡터와 융합할 때 단백질의 형태, 극성 및 분자 형태의 차이 때문으로 여겨진다. 또한 세포와 조직 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질이 최대 48시간까지 안정적으로 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 조직에서는 7일 동안 그 안정성을 확인할 수 있었다.

효과적으로 세포 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포에서 생물학적 역할을 하는지 측정해보았다. 산화적 스트레스 (Oxidative stress) 상태의 세포에서 Tat-PRAS40 융합단백질이 형질도입되었을 때 세포의 생존력을 실험하였다. 그 결과, 과산화수소를 처리하기 전에 Tat-PRAS40 융합단백질을 미리 처리했을 때 세포의 생존율이 상당히 증가하였다. Tat-PRAS40 융합단백질을 처리하지 않았고 과산화수소만 처리하였을 경우 세포의 생존율은 단지 40%였다. 그리고 과산화수소를 처리하여 활성산소종을 일으키고, 이 활성산소종에서 Tat-PRAS40 융합단백질이 형질도입 되었을 때와 그렇지 않을 때의 활성산소종이 감소하였는가를 중요하게 알아보았다. Tat-PRAS40 융합단백질을 형질도입한 세포가 과산화수소만 처리한 세포보다 활성산소종이 감소되었다. 또한 활성산소종으로 인한 세포 사멸에 대한 억제 효과도 세포사멸의 대표적인 표지자인 케스페이즈 3 활성과 미토콘드리아 단백질인 Bax와 Bcl-2 의 발현 정도, 그리고 세포사멸의 마지막 단계인 유전자 분쇄를 TUNEL 분석으로 확인하였다. 그 결과, 모두 동일하게 세포 내로 형질 도입된 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포사멸에 대한 억제 효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과들은 형질도입된 Tat-PRAS40 융합단백질이 산화적 스트레스 (oxidative stress)로 인한 세포 사멸에 대해 효과적으로 보호한다는 것을 말해준다. 또한 앞서 설명한 대로 활성산소종이 유도되면 이로 인하여 Akt 신호가 활성화되고, pAkt가 Tat-PRAS40 융합단백질을 인산화시킴으로써, 결과적으로 14-3-3 시그마와 복합체를 이루어 세포사멸을 억제한다는 기작을 확인할 수 있었다. 따라서 세포 내로 효과적으로 형질도입된 Tat-PRAS40 융합단백질이 활성화된 pAkt에 의해 인산화 작용을 거쳐 14-3-3 시그마 단백질과 정상적으로 결합한다는 다른 연구들과 일치하는 것을 확인했으며, 이 복합체에 의해 세포사멸에 대한 보호효과 또한 일치함을 확인하였다 [ 14,15 ].

본 발명자들은 이러한 결과를 토대로 인비보에서도 동일하게 효과가 있는지 확인해 보았다. 허혈성 손상에 대한 형질도입된 Tat-PRAS40 융합단백질의 보호능력을 알아보기 위해 저빌쥐 동물모델을 설계했다. 연속적으로 대뇌혈류 (cerebral blood flow)를 감소시켜 신경세포의 죽음으로 뇌의 저산소증과 허혈을 유도함으로써 많은 양의 독성 활성산소종을 형성하였다. 활성산소종 형성이 급성 뇌허혈의 손상 동안 피와 산소가 결국에는 재관류 (reperfusion)로 뇌에 되돌아오는 것은 이미 증명되었다 [41]. 이러한 저빌쥐를 이용하여 형광면역조직화학 염색을 함께 수행한 결과, 효과적으로 조직 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질을 확인할 수 있었고, 7일 동안 유지되는 안정성도 확인할 수 있었다. 나아가 신경세포의 표지자인 NeuN과 결합(merge)한 결과를 통하여 CA1 지역에서도 특히 신경세포로 침투했다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 동물모델에서도 Tat-PRAS40 융합단백질의 효과적인 침투성과 안정성, 그리고 활성산소종에 의해 유도된 세포사멸에 대한 보호효과를 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 조직 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질의 세포사멸에 대한 보호효과를 좀 더 자세히 확인해 보았다. 신경세포 사멸은 중추 신경 시스템의 손상을 야기하고, 때문에 미세아교세포 (microglia)를 활성화한다. 활성화된 미세아교세포는 몇몇 신경성 퇴화질병을 일으키는 자유 라디칼 (free radical), 염증성 프로스타글란딘과 사이토카인과 같은 생성물을 만든다고 보고되었다 [42,43,44]. Iba-1 (ionized calcium-binding adaptor molecule 1)은 새로운 Ca⁺⁺-결합 단백질이고, 특이하게 뇌의 미세아교세포에서만 발현된다. Iba-1의 중요한 역할은 미세아교세포의 기능을 조절하는 것이다. 여러 연구에서 뇌에 손상이 오면 미세아교세포에서 iba-1이 발현된다고 밝혀졌다. 그래서 iba-1은 이러한 연구에서 미세아교세포의 표시로 이용된다 [45]. 또한 중간 필라멘트를 이루는 구성요소이면서 성상교세포의 표지자인 GFAP (Glial fibrillary acidic protein)도 이용하였다. GFAP는 특히 신경세포에 손상을 받게 되면 성상교세포가 손상 받은 부위를 보충하기 위해 활성화될 때 발현되는 단백질이다 [46,47]. 본 발명자들은 iba-1, GFAP 면역반응성 세포를 허혈을 일으킨 해마 CA1 지역에서 관찰하였다. iba-1, GFAP-면역반응성 세포는 허혈성 손상을 준 해마 CA1 지역에서 현저히 증가하였다. 반면, Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 그룹은 iba-1-면역반응성 세포가 허혈성 손상을 준 것보다 해마 CA1 지역에서 현저히 감소하였다. 그리고, 동일한 실험 환경에서 F-JB(Fluoro-Jade B) 조직형광기법 (histofluorescent) 염색으로 세포 사멸을 관찰하였다. F-JB 염색은 신경세포 (neuron)에 손상이 있으면 해마 CA1 지역에서 세포들이 형광을 나타내므로 관찰 가능하다. 그러나, Tat-PRAS40 융합단백질이 형질도입된 손상된 신경세포에서는 해마 CA1 지역의 형광이 현저히 줄어들었다. 이 결과는 Tat-PRAS40 융합단백질이 허혈성 손상에서 해마 CA1 지역의 신경세포 사멸을 지연시키고, 허혈 손상에 대한 신경세포 손상을 감소시킴을 나타낸다. 이러한 결과들은 세포 실험과도 일치하며, 결론적으로 동물모델에서도 Tat-PRAS40 융한단백질의 침투 효과와 세포사멸 보호효과가 있다는 것을 말해준다.

요약하면, 본 발명자들은 사람 PRAS40와 HIV-1 Tat 펩타이드 (Tat-PRAS40)를 융합하여 인비트로와 인비보에서 효과적으로 형질도입할 수 있었다. 더욱이 Tat-PRAS40 융합단백질이 스트레스 유도 세포사멸과 허혈 손상에 대하여 상당한 보호효과가 있었다. 비록 자세한 메카니즘은 앞으로 더 밝혀야 하지만, 허혈성 손상을 일으키는 세포 파괴에 대하여 Tat-PRAS40 융합단백질의 형질도입을 통하여 세포를 보호하는 새로운 방법과 뇌졸중을 포함한 다양한 질병의 치료용 약제를 제공할 수 있을 것이다.

결론적으로, 본 발명자들은 Tat 단백질 수송도메인과 함께 사람 PRAS40 단백질을 융합하여 인비트로와 인비보에서 원활히 형질전환되도록 제작하였고, 산화 스트레스로 유도되는 세포사멸과 허혈성 외상에 대해 보호효과가 있음을 입증하였다. 세포 투과성 Tat-PRAS40 융합단백질은 허혈손상으로부터 세포를 보호하여 신경퇴행성 질환 치료제로 이용할 수 있다.

본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명하면, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 먼저 Tat-PRAS40 융합단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-PRAS40 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 PRAS40, Tat 형질도입 부위의 9개 아미노산 (Tat 49-57), 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.

이 발현벡터를 이용하여 Tat-PRAS40 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 Tat-PRAS40 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 Tat-PRAS40 융합단백질은 세포 내에서 최대 48시간 지속적으로 유지되었으며, 산화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하였다.

이러한 결과는 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 PRAS40의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 Tat-PRAS40 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세 또는 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 등의 뇌신경질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.

PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제 (예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제 (예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제 (예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제 (예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 천식에 적용하는 경우에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이 흡입 방식이나 스프레이 방식의 제제로 제형화할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌허혈 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 뇌허혈 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 PRAS40 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 PRAS40 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat을 비롯한 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 aa 49-57의 아홉 개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33과 같은 아미노산 서열로 이루어진 HIV Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 PRAS40 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 건강 기능성 식품 등에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"PRAS40 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 PRAS40을 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질 (즉, 본 발명에서는 PRAS40을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-PRAS40", "PRAS40 융합단백질" 등과 혼용하였다.

"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 PRAS40을 의미한다.

"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명의 PRAS40 융합단백질은 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 PRAS40 (Proline-rich Akt substrate 40)의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 PRAS40 융합단백질을 말한다. 또한, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, Pep-1 펩타이드, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고 (라이신,아르기닌) 중의 1종 이상을 말한다.

또한, 본 발명의 상기 PRAS40 융합단백질 아미노산 서열은 서열번호 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33 등을 포함한다. PRAS40 융합단백질 제조에서 제한부위 서열의 선택 등에 따라 다양한 서열의 융합단백질을 얻을 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 사람에게 자명하다. 위 아미노산 서열은 예시적인 것일 뿐 PRAS40 융합단백질 아미노산 서열이 위에 나열된 서열로 한정되는 것이 아님은 자명하다.

또한, 본 발명은 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 뇌허혈의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하며, 뇌허혈의 예방 및 개선 효과가 있는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 9~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 PRAS40 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성 (cell-transducing) PRAS40 융합단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.

예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명은 PRAS40 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합단백질을 코딩하는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.

본 발명의 세포 투과성 Tat-PRAS40 융합단백질은 세포 및 동물 조직 내로 효과적으로 침투하여 활성을 나타내므로, 허혈손상으로부터 세포를 보호하여 신경퇴행성 질환 치료 용도로 이용할 수 있다.

도 1은 PRAS40 및 Tat-PRAS40 융합단백질 정제를 나타낸다. (A) 12% SDS-PAGE와 항-토끼 폴리히스티딘 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석을 통해 Tat-PRAS40 융합단백질, PRAS40 단백질의 발현 및 정제를 확인하였다. (B) HT22 세포에서 Tat-PRAS40 융합단백질, PRAS40 단백질의 형질도입을 나타내는 그래프와 데이타이다. Tat-PRAS40 융합단백질, PRAS40 단백질 (3 μM)을 10~120분 동안 배양배지에 투과시키고, Tat-PRAS40 융합단백질 및 PRAS40 단백질 (0.5 μM)을 2시간 동안 배양배지에 투과시켰다. (C) 3 μM Tat-PRAS40 융합단백질을 세포에 미리 처리한 후 1~72시간 동안 배양하여 웨스턴블랏 분석을 하였고 강도는 농도계로 측정하였다. 각 막대는 세번 실험의 평균±측정표준오차를 나타낸다.
도 2는 HT22 세포 내부로 Tat-PRAS40 융합단백질의 침투. Tat-PRAS40 융합단백질의 침투를 공초점현미경에 의해 관찰하였다. Tat-PRAS40 융합단백질의 형질 도입 후, 세포 는DAPI 및 Alexa 염색에 의해 조사하였다. 크기막대 = 20　μm.
도 3은 Tat-PRAS40 융합단백질의 세포 생존 효과. HT22 세포에 Tat-PRAS40 융합단백질을 0.5~3 μM 농도로 처리해주고 과산화수소를 0.8 mM이 되게 배양액에 처리해주고 10시간 동안 배양하였다. 세포 생존률은 MTT 분석을 이용하여 확인하였다. * P <0.05 ** P <0.01 과산화수소 처리된 세포와 비교하였다. 각 막대는 세번 실험의 평균±측정표준오차를 나타낸다.
도 4는 HT22 세포에서 과산화수소로 유도된 활성산소종 생성에 Tat-PRAS40 융합단백질의 효과. HT22 세포에 과산화수소 (0.8 mM)을 4시간 동안 처리한 후 Tat-PRAS40 융합단백질 (3 μM)을 2시간 동안 처리하였다. DCF-DA 염색으로 활성산소종을 측정하였다. ** P <0.01 과산화수소 처리된 세포와 비교하였다. 각 막대는 세번 실험의 평균±측정표준오차를 나타낸다.
도 5는 HT22 세포에서 과산화수소 의한 DNA 단편화에 대한 Tat-PRAS40 융합단백질의 효과. HT22 세포를 2시간 동안 Tat-PRAS40 융합단백질 (3 μM)로 처리하고, 8시간 동안 과산화수소 (0.8 ㎜)에 노출 한 후 DNA 단편화를 TUNEL 염색법으로으로 검출하였다. 크기막대 = 50 μm. 각 막대는 세번 실험의 평균±측정표준오차를 나타낸다. ** P <0.01 과산화수소 처리된 세포와 비교하였다.
도 6은 Tat-PRAS40 융합단백질은 HT22 세포에서 과산화수소로 유도된 BCL-2, Bax 및 케스페이즈 3의 활동을 억제한다. (A) 과산화수소를 처리한 군에서 PRAS40 단백질과 14-3-3 시그마가 더 많이 결합한다는 것을 확인할 수 있었다. 세포를 2시간 동안 Tat-PRAS40 융합단백질 (3 μM)로 처리하고 6시간 동안 과산화수소 (0.8 mM)에 노출하였다. BCL-2, Bax 및 케스페이즈 3의 발현 수준은 웨스턴블랏 분석 및 농도계에 의해 결합강도를 측정하였다. (B) Co-IP는 PRAS40 단백질 및 14-3-3 시그마 단백질의 사이이다.
도 7은 과산화수소로 유도된 산화적 스트레스로부터 Akt의 인산화, PRAS40 및 14-3-3 시그마 단백질의 양과 AKT 저해에 대한 Tat-PRAS40 융합단백질의 영향을 나타낸다. TAT-PRAS40의 산화스트레스 (A) 및 Akt의 저해제 (B) 인산화에 미치는 영향은 웨스턴블랏 분석 및 결합강도를 측정하였다. 각 막대는 세번 실험의 평균±측정표준오차를 나타낸다. * P <0.05 및 ** P <0.01 MG-와 과산화수소로 처리된 세포와 비교하였다.
도 8은 저빌쥐의 뇌에서 Tat-PRAS40 융합단백질의 형질전환 및 보호. 저빌쥐Tat-PRAS40 (2 ㎎/㎏)을 단일 주입하고 7일후에 사망 시켰다. 그 다음 형질전환된 Tat-PRAS40 융합단백질은 항 PRAS40 단백질, DAPI 및 Alexa 염색을 이용하여 면역 조직화학염색에 의해 분석하였다. 크기막대 = 280 μm.
도 9는 허혈손상에 대한 신경 세포 생존에 Tat-PRAS40의 효과를 크레실 바이올렛, F-JB, Iba-1 및 GFAP 면역염색으로 확인하였다. (A) 샴군, 담체처리군, Tat 펩타이드 처리군, PRAS40 단백질 처리군 및 Tat-PRAS40 융합단백질 처리군에 대해 허혈 재관류 이후 7일째 허혈 동물모델들의 해마를 크레실 바이올렛으로 염색하였다. (B) CA1 지역에서 크레실 바이올렛 (CV)-, F-JB-, Iba-1 및 GFAP 양성 신경 세포의 상대적 양을 분석하였다. 크기막대 = 50 ㎛. 크레실 바이올렛 양성 뉴런 값의 상대적인 numberic 분석은 담체 처리군과는 현저하게 다르다. ** P <0.01

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 각 실험예의 결과로서 구체적인 실시예에서 제조한 여러 가지 융합단백질 중 Tat-PRAS40 융합단백질을 시료로 한 데이터를 기재하였으나, 그 외의 융합단백질들 또한 Tat-PRAS40 융합단백질을 시료로 한 결과와 유사한 결과를 나타내었음을 밝힌다.

재료

제한효소와 T4 DNA 연결효소는 promega (USA)에서 구입하였고, Tat-올리고뉴클레오타이드는 Gibco BRL (USA)에서 합성하였다. IPTG는 Duchefa (Netherland)에서 구입하였다. pET15b 벡터와 BL21 (DE3) 플라스미드는 Novagen (USA)에서 구입하였으며, Ni^{2 +}-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼은 Qiagen (Germary)에서 구입하였다. HT22 세포는 서울대학교 성상현 박사가 제공하였다. 항-히스티딘 항체, 항-PRAS40 항체 및 pPRAS40, 항-14-3-3- 시그마 항체는 Santa Cruz(CA, USA)에서 구입하였고, 항-pAkt 일차 항체는 Cell Signaling Technology, MA, USA에서 구입하였다. Tat-펩타이드 합성은 PEPTRON (Deajeon, Korea)에서 주문 제작하였다. 이외의 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

실험방법

Tat - PRAS40 융합단백질의 발현과 정제

PRAS40 단백질 및 Tat-PRAS40 융합단백질 발현 벡터를 구축하였다. 센스 프라이머 서열은 5'-CTCGAGCGCAGCCCC-3' (서열번호 6)이고 XhoI 제한부위를 포함하며, 안티센스 프라이머 서열은 5'-GGATCCTCAATATTTCCGCTTCAG-3' (서열번호 7)이고 BamHI 제한부위를 포함한다. PRAS40 프라이머들과 cDNA 주형을 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였으며, PCR 산물은 TA 클로닝 벡터에 삽입되었다. PRAS40 cDNA를 포함하는 TA 벡터는 XhoI 및 BamHI으로 절단하여 절단된 PRAS40 cDNA와 함께 두 종류의 pET-15b 벡터에 연결시켰다. 한 벡터는 Tat-PRAS40 발현 벡터로서 Tat 서열과 6개의 연속 히스티딘 서열을 포함한다. 다른 벡터는 PRAS40 발현 벡터로서 여섯 개의 연속 히스티딘 서열만을 포함한다.

PRAS40과 Tat-PRAS40 융합단백질을 생산하기 위하여 각 벡터 구축물로 E. coli BL21 (DE3) 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세균은 100 ㎖의 LB 배지에서 37 ℃로 600 ㎚의 광학밀도가 0.5가 될 때까지 배양한 다음 0.5 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 가하여 37 ℃에서 4시간 동안 유도하였다. 세포를 모으고 결합완충액 (10 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 내에서 4 ℃ 조건으로 초음파분해하여 용균시키고 원심분리하였다. 상층액을 2.0 ㎖ Ni^{2 +}-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼에 가하였다. 컬럼을 10배의 결합완충액 및 7배의 세척완충액 (60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척하였다. PRAS40과 Tat-PRAS40 융합단백질은 용출완충액 (250 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 용출시켰다. 정제된 단백질에 포함된 염은 PD-10 탈염 컬럼 크로마토그래피 (Amersham, Braunschweig, Germany)로 제거하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 결정하였다.

Tat - PRAS40 융합단백질의 HT22 세포 내 투과

해마 신경세포 HT22는 37℃, 95% 공기 및 5% CO₂의 조건을 유지해주며, 10% 우태혈청 (FBS) 및 5 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES/NaOH (pH 7.4)으로 구성이 된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이용하여 배양하였다.

Tat-PRAS40 융합 단백질의 세포 내 투과를 관찰하기 위해 배양세포를 6-웰 플레이트에서 4~6시간 정도 자라도록 하였고, FBS가 포함되지 않은 1 ㎖의 신선한 미디어로 교체하고 여러 농도의 Tat-PRAS40 융합단백질을 배지에 처리하였다. 한 시간 뒤에 세포를 트립신-EDTA (Gibco Grand Island, NY, USA)로 처리하고 PBS(phosphate-buffered saline)로 충분히 세척한 다음 세포 내로 투과된 융합단백질의 양과 활성은 웨스턴블랏을 통해 분석하고 측정하였다[22].

형광현미경 분석

커버슬립 상에서 HT-22 세포를 배양하고 3 uM Tat-PRAS40 융합 단백질을 처리하였다. 그 후에 37 ℃로 2시간 동안 배양하고 PBS를 이용하여 2번 정도 씻어주고, 4% 파라포름알데하이드를 5분간 처리하여 세포를 상온에서 고정시켰다. 세포는 투과 가능하도록 만든 후 3% 우혈청 알부민, 0.1% Triton X-100 함유 PBS (PBS-BT)로 40분간 블로킹한 다음 PBS-BT로 세척하였다. 일차 항체 (His-probe, Santa Cruze Biotechnology)는 1:2000으로 희석하고, 4 ℃에서 오버나잇 배양하였다. 2차 항체 (Alexa flour 488, Invitrogen)는 1:15000으로 희석하고 어두운 곳에서 상온으로 한 시간 배양하였다. 핵은 1 ㎍/㎖ DAPI (Roche)로 2분간 염색하였다. 형광 분포는 공촛점 레이저 스캐닝 시스템 (Bio-Rad MRC-1024ES)로 분석하였다 [23].

MTT 분석

Tat-PRAS40 융합단백질의 생물학적 활성은 과산화수소를 세포에 처리한 후 생존 세포 수를 알아봄으로써 측정할 수 있다. HT22 세포를 96웰 플에이트에 80% 되게 깔아주고 여기에 먼저 Tat-PRAS40 융합단백질을 0.5~3 uM 농도로 처리하였다. 그리고 과산화수소 0.8 mM를 처리하고 10시간 동안 배양하였다. 세포 생존율은 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide}를 이용하여 비색분석법으로 확인하였다 [24].

세포 내 활성산소종 측정

DCF-DA (2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 이용하여 세포 안의 활성산소종 수준을 측정하였다. DCF-DA는 활성산소종에 의해 세포 안에서 DCF로 전환되어 형광을 발한다. HT22 세포에 Tat-PRAS40 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때의 활성산소종 수준을 비교해 보았다. Tat-PRAS40 융합단백질은 1시간 동안 처리하였고 후에 과산화수소를 0.8 mM의 농도로 2시간 동안 처리해 주었다. 그리고 PBS로 두 번 씻어주고 DCF-DA를 20 uM의 농도로 1시간 처리해 주었다. 형광 영상은 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)을 이용하여 얻었다 [25].

TUNEL 분석

HT22 세포에 Tat-PRAS4 융합단백질을 처리하지 않은 군과 3 uM의 농도로 1시간 동안 처리한 군의 배양액에 과산화수소 (0.8 mM)를 가하여 8시간 동안 처리하였다. 세포사멸을 측정하기 위해 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated dUTP nick end labeling staining) 기법은 세포사멸 탐지 킷트 (Roche Applied Science)를 사용하여 수행하였다. 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)을 이용하여 결과를 분석하였다 [26].

공동 면역침전 분석

HT22 세포에 Tat-PRAS40 융합단백질 (3 uM)을 1시간 동안 처리하고, 과산화수소 처리군과 미처리군에 대하여 각각 항-pPRAS40 항체(Cell signaling, USA)와 항 14-3-3 시그마 항체(Santacruze, USA)를 사용하여 공동 면역침전을 수행했다. 단백질 G (GE Healthcare bio-sciences AB)를 이용하여 제조사의 지시대로 웨스턴블랏 분석을 수행했다. 이 시료에 항-pPRAS40, 항 PRAS40 및 항-14-3-3 시그마 항체를 사용하였다 [27].

동물 실험에서의 전뇌 허혈 유도

한림대학교 실험동물센터에서 제공되는 저빌쥐 (Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus)를 사용하였다. 23 ℃, 습도 60% 그리고 고정적으로 12시간의 빛과 음식물이 제공되는 곳에서 사육하였다. 이것은 세계에서 현재 통용되고 있는 동물보호법에 따른 것이다. 수컷 저빌쥐의 무게가 65~75 g일 때 일반적으로 2.5% 아이소플루란 (Abbott Laboratories Ill. USA)에 33% 산소 그리고 67% 아산화질소 (nitrous oxide)를 섞은 것으로 마취했다. 그 후 Tat-PRAS40 융합단백질을 5 mg/kg의 농도로 복강주사를 하고, 30분 뒤에 저빌쥐의 온목동맥 (common carotid arteries)을 30분간 폐색 (occlusion)시켰다. 이것은 목의 정중앙을 절개하고 그 안에 존재하는 혈관을 폐색한 것이다. 온목동맥을 신경 섬유들로부터 격리시켜 폐색하고, 외상이 크게 남지 않게 하기 위해 동맥류 클립 (aneurysm clips)을 이용하였다. 혈류를 폐색 시켰을 때, 검안경 (ophthalmoscope)을 이용하여 혈압을 주의 깊게 관찰하였다. 그 후 5분 동안 폐색하고 동맥류 클립을 제거하였다. 그리고 폐색에 대해 혈압이 회복되는 것을 검안경으로 확인하였다. 또한 샴 수술로 정상 경동맥을 폐색하지 않고, 외과적인 절차를 제외하고 얼마나 영향을 받는지 확인해 보았다. 외과적인 수술 후 국소 마취로부터 완전히 회복될 때까지 직장내 온도 (rectal temperature)를 37 ℃ ± 0.5 ℃로 유지 및 관찰하였다. 7일 후 허혈 재관류 (ischemia-reperfusion)하고 샴 수술군, 담체 처리군, Tat-PRAS40 융합단백질 처리군, PRAS40 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군으로 나눠, 안락사시켜 실험을 수행했다.

Tat - PRAS40 융합단백질의 조직 내 효과적인 침투 확인과 허혈 손상에서의 세포 생존 효과

샴 수술군, 담체 처리군, Tat-PRAS40 융합단백질 처리군, PRAS40 단백질 처리군 및 Tat 펩타이드 처리군을 7일 후에 마취를 수행하고, PBS (pH 7.4)와 0.1 M PB (pH 7.4) 안에 4% 파라포름알데하이드로 심장관통 관류 (transcardially perfusion)하여 뇌 조직을 적출했다.

적출한 뇌를 고정액으로 4시간 동안 고정시켰다. 뇌 조직에 동결 방지를 위해 30% 수크로오스를 하루 동안 침투시켰고, 그 후 조직을 얼려 절편화한 것 (50 ㎛)을 저온유지장치에 두어 저온을 유지하였다. 연속적으로 절편화한 것을 PBS가 포함된 6-웰 플레이트에 수집하였으며 자유롭게 떠다니는 형태의 절편들을 슬라이드 글라스 위에 공기건조시켜 크레실 바이올렛 아세테이트로 염색하였다. 또한 신경세포의 표지자 (marker)로 항 NueN 항체와 항 PRAS40 항체로 인큐베이션 후 2차 항체를 각각 Alexa 488과 Alexa 594로 형광 표지하였다. DAPI 염색을 함께 합병시켜 조직의 신경세포로 효과적으로 침투하는지 형광현미경 (Carl Zeiss, EL-Einsatz, Germany)을 이용하여 확인하였다.

F- JB ( Fluoro - Jade B) 조직형광기법 ( histofluorescence ) 염색

신경퇴화시킨 절편을 F-JB (Fluoro-Jade B)로 염색하여 허혈 손상에서 Tat-PRAS40 융합단백질의 효과를 확인하였다 [23]. 먼저 절편을 80% 알코올 안에 1% 수산화나트륨을 넣은 용액에 담그고 70% 알코올의 용액에 담갔다. 그 후 0.06% 과망간산칼륨에 옮기고 0.0004% F-JB (Fluoro-Jade B) (Histochem, Jefferson, AR, USA)의 염색 용액을 스며들게 하였다. 그리고 절편을 씻어서 따뜻한 슬라이드 위에 올려놓고 Epi-fluorescent 현미경 (Carl Zeiss, Germany)으로 염색에 따라 신경퇴화된 것을 확인하였다.

면역조직염색

Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 후에 신경교증 반응과 신경보호효과를 면역조직염색 방법으로 확인하였다 [24]. 절편을 Iba-1 항체 또는 GFAP 항체와 함께 각각 배양하고 염소 항-토끼 IgG와 스트렙타비딘 퍼옥시다제 복합제 (1:200으로 희석, Vector)로 바이오틴화시켰다. 그리고 이들을 3,3'-DAB (diaminobenzidine)으로 염색하여 확인하였다.

정량분석

동물 한 마리당 10개의 절편에서 살아남은 뉴런 수를 세었다. 같은 레벨의 선택된 해마에서 위와 같은 방법으로 측정하였다. 각각 섹션의 조직에서 모든 층에 해마 CA1 지역의 중간 부분이 포함된 것을 선택하였다. 조직의 이미지는 Axiophot 광학현미경 (Carl Zeiss, Jena, Germnay)의 CCD 카메라를 통하여 PC 모니터로 얻었다. 크레실 바이올렛으로 염색된 양성 뉴런의 이미지는 애플스캐너로 얻었다. 뉴런 수를 컴퓨터-기반 CCD 카메라 (software: Optimas 6.5, CyberMetrics, USA)를 갖춘 이미지 분석 시스템으로 측정하였다. 세포 수의 계산은 각각의 동물에서 70개의 섹션 수의 평균값으로 하였다. 마지막으로 ANOVA 분석으로 Tat-PRAS40 융합단백질의 보호효과를 조사하였다.

결과 1: Tat - PRAS40 융합단백질의 과대발현 및 정제와 HT22 세포로의 투과

Tat-PRAS40 융합단백질을 과대발현시키기 위해 사람 PRAS40 cDNA, HIV-1 Tat 단백질 및 6개의 히스티딘이 연속적으로 포함되어 있는 Tat-PRAS40 발현 벡터를 개발하였다 (도 1A). 과대발현을 유도한 다음에 Tat-PRAS40 융합단백질을 Ni²⁺-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼 크로마토그래피와 PD-10 크로마토그래피를 수행하여 정제했다. SDS-PAGE와 웨스턴블랏 분석법으로 정제된 Tat-PRAS40 융합단백질을 확인했고, Tat-PRAS40 융합단백질이 대조군 PRAS40 단백질보다 Tat-펩타이드 크기만큼 큰 것을 확인하였다 (도 1A).

자연상태에서 정제한 Tat-PRAS40 융합단백질이 HT22 세포 내로 투과가 되는지 웨스턴블랏 분석과 형광분석으로 확인하였다. Tat-PRAS40 융합단백질은 시간 의존적 그리고 농도 의존적으로 세포 내로 침투하는 것을 확인하였고 (도 1B), 이렇게 세포 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질이 약 48시간까지 세포 내에서 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다 (도 1C).

세포 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포질로 효과적으로 침투되었는지 형광분석을 통해 알아보았다. 공촛점현미경을 이용하였고, 대조군 PRAS40 단백질을 처리한 세포에서는 전혀 보이지 않는 형광 신호가 Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 세포에서 강하게 나타났으며, 세포 내부의 세포질에 효과적으로 침투하였음을 확인하였다 (도 2).

결과 2: Tat - PRAS40 융합단백질 침투에 의한 산화적 스트레스에서 세포의 생존 능력에 미치는 영향

세포 내에 Tat-PRAS40 융합단백질의 침투시 산화적 스트레스에 대하여 세포에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. 세포 내에 Tat-PRAS40 융합단백질을 먼저 처리하고 과산화수소를 처리하여 세포의 생존 능력을 알아보았다. 0.8 mM 과산화수소를 10시간 동안 처리한 세포는 처리 전 세포의 약 40%만 생존하였다. 그러나 과산화수소 처리 전 Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 세포는 농도의존적으로 세포의 생존율이 증가하였고, 최대 78%까지 생존하는 것을 확인하였다 (도 3).

다음으로 DCF-DA를 이용하여 과산화수소로 인하여 유도된 활성산소종을 측정하였다. 과산화수소로 유도된 세포는 DCF-DA로 인하여 형광을 나타냈고, 대조군 PRAS40 단백질과 Tat 펩타이드도 큰 차이 없이 형광을 나타냈다. 반면, Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 세포에서는 형광도가 현저히 감소하였다 (도 4A). 형광리더기로 측정한 결과도 마찬가지로 과산화수소로 유도되어 약 200% 형광도가 증가한 것에 비해 약 150%로 감소함을 확인하였다 (도 4B). 그 결과, 과산화수소에 의해 유도된 활성산소종이 세포 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질로 인하여 억제된다는 것을 확인하였다.

결과 3: 산화적 스트레스에 의해 유도된 활성산소종으로 인한 세포사멸에 대한 세포 내로 침투한 Tat - PRAS40 융합단백질의 보호효과 및 작용 기작

산화적 스트레스로 생긴 활성산소종이 유도하는 세포사멸에 대해 세포 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질이 어떤 효과가 있는지 확인해 보았다. 세포사멸의 가장 마지막 단계인 DNA 조각화 현상을 TUNEL 분석을 통하여 확인했다. 과산화수소를 처리한 세포에서는 DNA가 조각나서 형광을 나타냈다. 반면 Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 세포에서는 형광이 거의 나타나지 않았다 (도 5A). 이를 형광측정기로 측정하여 수치로 나타낸 결과도 마찬가지로 증가했던 형광도가 약 150%로 줄어든 것을 확인하였다 (도 5B). 나아가 세포사멸의 일반적인 표지자인 케스페이즈 3 (caspase 3)와 미토콘드리아의 세포사멸 표지자인 Bax와 Bcl2의 발현 양을 확인해 보았다. Tat-PRAS40 융합단백질을 먼저 처리한 후 과산화수소를 처리하여 세포사멸을 유도한 세포에서는 과산화수소만 처리한 세포와는 달리 세포사멸이 유도되면 나타나는 절단 케스페이즈 3와 Bax는 발현이 감소하는 반면, 생존에 관련된 Bcl2는 증가하는 것을 확인하였다 (도 6A). 따라서 세포 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포사멸에 대하여 보호효과가 있음을 알 수 있었다.

이러한 세포사멸 효과가 단순히 활성산소종에 대한 보호효과로 인한 것은 아닌 것으로 이미 밝혀졌다 [25,26]. 앞선 연구에서 PRAS40 단백질이 인산화되어 14-3-3 시그마 단백질과 결합을 하게 되면 세포사멸에 대한 억제 효과가 있다고 밝혀졌다 [27,28]. Tat-PRAS40 융합단백질 또한 이러한 기능을 하는지 확인해 보았다. 세포 내로 침투한 Tat-PRAS40 융합단백질을 Co-IP를 이용하여 확인한 결과 14-3-3 시그마 단백질과 결합하는 것을 확인했고, pPRAS40이 14-3-3 시그마 단백질과 결합되는 것을 확인하였다 (도 6B). 결과를 보면 과산화수소를 처리한 군에서 PRAS40 단백질과 14-3-3 시그마가 더 많이 결합한다는 것을 확인할 수 있었다. 과산화수소를 세포에 처리하면 생성된 활성산소종으로 인하여 Akt가 인산화된다 [29,30,31]. pAkt는 다양한 세포 보호 작용을 하는 중간자 역할을 하며, 다양한 기능 중에 PRAS40 단백질을 인산화시킨다 [32]. 따라서 우리가 제조한 Tat-PRAS40 융합단백질 또한 같은 작용을 받는지 확인해보았다 (도 7). 과산화수소를 세포에 처리한 결과 pAkt가 증가하였고, 그에 따라 침투시킨 Tat-PRAS40 융합단백질의 인산화도 증가함을 확인했다. 여기에 Akt 저해제를 처리하여 Akt를 억제하였을 때는 반대로 pAkt와 Tat-PRAS40 융합단백질의 인산화가 감소하는 것을 확인했다. 이로써 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포 내로 침투하여 산화적 스트레스로 인한 pAkt의 증가로 인한 인산화 작용을 거쳐 14-3-3 시그마 단백질과 결합하여 세포사멸에 대한 보호효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

결과 4: 해마 CA1 지역으로의 Tat - PRAS40 의 효과적인 형질도입과 안정성

저빌쥐에 전뇌 허혈을 일으키기 30분 전에 Tat-PRAS40 융합단백질을 주사하였다. 7일 동안 허혈 손상 (ischemic insult)을 일으킨 Tat-PRAS40 융합단백질 처리군, PRAS40 단백질 처리군, Tat 펩타이드 처리군, 담체 처리군 및 샴 수술 대조군 동물들을 죽여 형광을 이용한 조직면역염색을 수행했다. 그 결과 Tat-PRAS40 융합단백질이 저빌쥐의 해마 CA1 지역에 매우 효과적으로 침투함을 확인하였고, 7일 동안 그 안정성을 유지하는 것도 확인하였다 (도 8). 또한 Tat-PRAS40 융합단백질 (그린)은 신경세포의 표지자인 NeuN (붉은 색으로 염색됨)과 같은 위치에 존재하는 것을 확인하였고, Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 군에서는 다른 군보다 신경세포가 많이 생존한 것도 확인할 수 있었다. 그러므로 Tat-PRAS40 융합단백질은 주로 신경세포로 형질도입이 되고, 허혈 손상에 대하여 보호효과가 있다는 것을 확인하였다.

결과 5: Tat - PRAS40 융합단백질의 형질도입에 의한 뇌 허혈 손상에 대한 보호

Tat-PRAS40 융합단백질의 형질도입이 생체 안에 (in vivo) 미치는 생물학적 역할을 알아보기 위해 Tat-PRAS40 융합단백질을 신경세포에 형질도입한 후 일시적 전뇌 허혈 (transient forebrain ischemia)을 저빌쥐 (gerbil model)에 일으켰다. 허혈을 일으키기 30분 전 Tat-PRAS40 융합단백질을 주사했다. 7일 동안 허혈 손상을 일으킨 Tat-PRAS40 융합단백질 처리군, PRAS40 단백질 처리군, Tat 펩타이드 처리군, 담체 처리군, 샴 수술 대조군 동물들을 희생시켜 크레실 바이올렛 염색을 하였다. Tat-PRAS40 융합단백질의 허혈성 손상에 대한 보호 효과를 크레실 바이올렛 조직화학으로 확인했다 (도 9A). 담체 처리군에서는 샴 수술 대조군의 약 600개 이상의 신경세포보다 눈에 띄게 적은 약 120개의 신경세포가 관찰되었다. Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 후 허혈 손상이 된 군에는 담체 처리군보다 훨씬 많은 약 500개 이상의 양성의 뉴런이 있다 (도 9B). 이 결과는 Tat-PRAS40 융합단백질의 효과적인 형질도입과 허혈 손상에 의한 신경 세포의 손상에 대한 효과적인 보호 능력이 있음을 나타낸다.

또한, 샴 수술 대조군에서 iba-1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1)-면역반응성 (immunoreactive)의 세포를 CA1 지역의 모든 층에서 확인하였다. 7일 후에 허혈 손상을 준 iba-1-면역반응성 세포는 거대한 지질층이 집합을 이루고, 면역반응이 매우 강했다. 그러나 Tat-PRAS40 융합단백질 처리군에서는 iba-1 면역반응성 세포와 그들의 iba-1 면역반응이 CA1 지역에서 현저히 감소하였다 (도 9). 또한 GFAP (Glial fibrillary acidic protein) 면역조직화학 결과에서도 허혈 손상을 받아 활성화된 성상교세포 (astrocyte)들의 수가 Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 그룹에서 눈에 띄게 감소함을 확인할 수 있었다 (도 9A).

위와 동일한 실험적 상태에서, F-JB (Fluoro-Jade B) 조직형광 (histofluorescence) 염색으로 실험하였다. 샴 수술 대조군에서 F-JB 양성 뉴런은 해마의 CA1 지역에서 관찰되지 않았다 (도 9A). 7일 후에 허혈 손상을 일으킨 경우 해마 CA1 지역에서 신경세포의 죽음 (neuronal death) 때문에 F-JB 양성 뉴런이 매우 풍부했다. 그러나 Tat-PRAS40 융합단백질을 처리한 그룹의 F-JB 양성 뉴런은 해마 CA1 지역에서 상당히 감소하였다.

Iba-1, GFAP 및 F-JB 조직 염색 결과 모두에서 Tat-PRAS40 융합단백질이 허혈 손상에 대한 보호효과가 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<제형예 1: 정제의 제조>

Tat-PRAS40 융합단백질 10 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제형예 2: 캡슐제의 제조>

Tat-PRAS40 융합단백질 5 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제형예 3: 주사제의 제조>

Tat-PRAS40 융합단백질 1 ㎎

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<제형예 4: 액제의 제조>

Tat-PRAS40 융합단백질 0.5 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition for treating ischemia containing cell-transducible PRAS40 fusion protein <130> hallym-PRAS40-ischemia <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 taggaagaag cggagacagc gacgaagac 29 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 tcgagtcttc gtcgctgtct ccgcttcttc c 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagatgg cagaaccgca gcccccgtcc 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgagatga aggtagaggt gctgcctgcc 30 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagcgca gcccc 15 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatcctcaa 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PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala 35 40 45 His Gly Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp 50 55 60 Ile Ala Leu Ala His Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro 65 70 75 80 Pro Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro 85 90 95 Thr Leu Ala Arg Glu Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu 100 105 110 Thr Glu Thr Ser Gly Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu 115 120 125 Phe Val Met Asp Glu Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys 130 135 140 Glu Ser Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr 145 150 155 160 Pro Ala Gly Pro Pro Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro 165 170 175 Thr Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly 180 185 190 Phe Lys Glu Lys Arg Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly 195 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ggcagcctga gcgaggagac ccccgccggc ccccccacct gctcagtgcc cccagcctca 600 gccctaccca cacagcagta cgccaagtcc ctgcctgtgt ctgtgcccgt ctggggcttc 660 aaggagaaga ggacagaggc gcggtcatca gatgaggaga atgggccgcc ctcttcgccc 720 gacctggacc gcatcgcggc gagcatgcgc gcgctggtgc tgcgagaggc cgaggacacc 780 caggtcttcg gggacctgcc acggccgcgg cttaacacca gcgacttcca gaagctgaag 840 cggaaatatt gaggatcc 858 <210> 11 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-PRAS40 fusion protein <400> 11 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Ala Ser Gly Arg 1 5 10 15 Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala Ala Glu Arg Phe Arg 20 25 30 Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr Ala Ala Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala His Gly Arg Gly Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp Ile Ala Leu Ala His 65 70 75 80 Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gln 85 90 95 Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro Thr Leu Ala Arg Glu 100 105 110 Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu Thr Glu Thr Ser Gly 115 120 125 Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu Phe Val Met Asp Glu 130 135 140 Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys Glu Ser Asp Pro Glu 145 150 155 160 Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Pro Ala Gly Pro Pro 165 170 175 Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro Thr Gln Gln Tyr Ala 180 185 190 Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly Phe Lys Glu Lys Arg 195 200 205 Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly Pro Pro Ser Ser Pro 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala Leu Val Leu Arg Glu 225 230 235 240 Ala Glu Asp Thr Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro Arg Pro Arg Leu Asn 245 250 255 Thr Ser Asp Phe Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr 260 265 <210> 12 <211> 857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding PRAS40-Tat fusion protein <400> 12 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccggcgg cagccactcg agatggcgtc 60 ggggcgcccc gaggagctgt gggaggccgt ggtgggggcc gctgagcgct tccgggcccg 120 gactggcacg gagctggtgc tgctgaccgc ggccccgccg ccaccacccc gcccgggccc 180 ctgtgcctat gctgcccatg gtcgaggagc cctggcggag gcagcgcgcc gttgcctcca 240 cgacatcgca ctggcccaca gggctgccac tgctgctcgg cctcctgcgc ccccaccagc 300 accacagcca cccagtccca cacccagccc accccggcct accctggcca gagaggacaa 360 cgaggaggac gaggatgagc ccacagagac agagacctcc ggggagcagc tgggcattag 420 tgataatgga gggctctttg tgatggatga ggacgccacc ctccaggacc ttcccccctt 480 ctgtgagtca gaccccgaga gtacagatga tggcagcctg agcgaggaga cccccgccgg 540 cccccccacc tgctcagtgc ccccagcctc agccctaccc acacagcagt acgccaagtc 600 cctgcctgtg tctgtgcccg tctggggctt caaggagaag aggacagagg cgcggtcatc 660 agatgaggag aatgggccgc cctcttcgcc cgacctggac cgcatcgcgg cgagcatgcg 720 cgcgctggtg ctgcgagagg ccgaggacac ccaggtcttc ggggacctgc cacggccgcg 780 gcttaacacc agcgacttcc agaagctgaa gcggaaatat ggatcctagg aagaagcgga 840 gacagcgacg aagatag 857 <210> 13 <211> 265 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAS40-Tat fusion protein <400> 13 Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala 35 40 45 His Gly Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp 50 55 60 Ile Ala Leu Ala His Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro 65 70 75 80 Pro Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro 85 90 95 Thr Leu Ala Arg Glu Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu 100 105 110 Thr Glu Thr Ser Gly Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu 115 120 125 Phe Val Met Asp Glu Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys 130 135 140 Glu Ser Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr 145 150 155 160 Pro Ala Gly Pro Pro Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro 165 170 175 Thr Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly 180 185 190 Phe Lys Glu Lys Arg Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly 195 200 205 Pro Pro Ser Ser Pro Asp Leu Asp Arg Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala 210 215 220 Leu Val Leu Arg Glu Ala Glu Asp Thr Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro 225 230 235 240 Arg Pro Arg Leu Asn Thr Ser Asp Phe Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr 245 250 255 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 260 265 <210> 14 <211> 886 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding Tat-PRAS40-Tat fusion protein <400> 14 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccatag gaagaagcgg 60 agacagcgac gaagactcga gatggcgtcg gggcgccccg aggagctgtg ggaggccgtg 120 gtgggggccg ctgagcgctt ccgggcccgg actggcacgg agctggtgct gctgaccgcg 180 gccccgccgc caccaccccg cccgggcccc tgtgcctatg ctgcccatgg tcgaggagcc 240 ctggcggagg cagcgcgccg ttgcctccac gacatcgcac tggcccacag ggctgccact 300 gctgctcggc ctcctgcgcc cccaccagca ccacagccac ccagtcccac acccagccca 360 ccccggccta ccctggccag agaggacaac gaggaggacg aggatgagcc cacagagaca 420 gagacctccg gggagcagct gggcattagt gataatggag ggctctttgt gatggatgag 480 gacgccaccc tccaggacct tccccccttc tgtgagtcag accccgagag tacagatgat 540 ggcagcctga gcgaggagac ccccgccggc ccccccacct gctcagtgcc cccagcctca 600 gccctaccca cacagcagta cgccaagtcc ctgcctgtgt ctgtgcccgt ctggggcttc 660 aaggagaaga ggacagaggc gcggtcatca gatgaggaga atgggccgcc ctcttcgccc 720 gacctggacc gcatcgcggc gagcatgcgc gcgctggtgc tgcgagaggc cgaggacacc 780 caggtcttcg gggacctgcc acggccgcgg cttaacacca gcgacttcca gaagctgaag 840 cggaaatatg gatcctagga agaagcggag acagcgacga agatag 886 <210> 15 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-PRAS40-Tat fusion protein <400> 15 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met Ala Ser Gly Arg 1 5 10 15 Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala Ala Glu Arg Phe Arg 20 25 30 Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr Ala Ala Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala His Gly Arg Gly Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp Ile Ala Leu Ala His 65 70 75 80 Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gln 85 90 95 Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro Thr Leu Ala Arg Glu 100 105 110 Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu Thr Glu Thr Ser Gly 115 120 125 Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu Phe Val Met Asp Glu 130 135 140 Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys Glu Ser Asp Pro Glu 145 150 155 160 Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Pro Ala Gly Pro Pro 165 170 175 Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro Thr Gln Gln Tyr Ala 180 185 190 Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly Phe Lys Glu Lys Arg 195 200 205 Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly Pro Pro Ser Ser Pro 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala Leu Val Leu Arg Glu 225 230 235 240 Ala Glu Asp Thr Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro Arg Pro Arg Leu Asn 245 250 255 Thr Ser Asp Phe Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Arg Lys Lys 260 265 270 Arg Arg Gln Arg Arg Arg 275 <210> 16 <211> 895 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding Pep-PRAS40 fusion protein <400> 16 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccataa 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Pro Ala Ser Ala Leu Pro Thr Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Leu Pro 195 200 205 Val Ser Val Pro Val Trp Gly Phe Lys Glu Lys Arg Thr Glu Ala Arg 210 215 220 Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly Pro Pro Ser Ser Pro Asp Leu Asp Arg 225 230 235 240 Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala Leu Val Leu Arg Glu Ala Glu Asp Thr 245 250 255 Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro Arg Pro Arg Leu Asn Thr Ser Asp Phe 260 265 270 Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr 275 <210> 18 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding PRAS40-Pep fusion protein <400> 18 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccggcgg cagccactcg agatggcgtc 60 ggggcgcccc gaggagctgt gggaggccgt ggtgggggcc gctgagcgct tccgggcccg 120 gactggcacg gagctggtgc tgctgaccgc ggccccgccg ccaccacccc gcccgggccc 180 ctgtgcctat gctgcccatg gtcgaggagc cctggcggag gcagcgcgcc gttgcctcca 240 cgacatcgca ctggcccaca gggctgccac tgctgctcgg cctcctgcgc ccccaccagc 300 accacagcca cccagtccca cacccagccc accccggcct accctggcca gagaggacaa 360 cgaggaggac gaggatgagc ccacagagac agagacctcc ggggagcagc tgggcattag 420 tgataatgga gggctctttg tgatggatga ggacgccacc ctccaggacc ttcccccctt 480 ctgtgagtca gaccccgaga gtacagatga tggcagcctg agcgaggaga cccccgccgg 540 cccccccacc tgctcagtgc ccccagcctc agccctaccc acacagcagt acgccaagtc 600 cctgcctgtg tctgtgcccg tctggggctt caaggagaag aggacagagg cgcggtcatc 660 agatgaggag aatgggccgc cctcttcgcc cgacctggac cgcatcgcgg cgagcatgcg 720 cgcgctggtg ctgcgagagg ccgaggacac ccaggtcttc ggggacctgc cacggccgcg 780 gcttaacacc agcgacttcc agaagctgaa gcggaaatat ggatcctaaa agaaacctgg 840 tgggaaacct ggtggaccga atggtctcag ccgaaaaaaa aacgtaaagt gtag 894 <210> 19 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAS40-Pep fusion protein <400> 19 Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala 35 40 45 His Gly Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp 50 55 60 Ile Ala Leu Ala His Arg 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<210> 20 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding Pep1-PRAS40-Pep1 fusion protein <400> 20 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccataa aagaaacctg 60 gtgggaaacc tggtggaccg aatggtctca gccgaaaaaa aaacgtaaag tgctcgagat 120 ggcgtcgggg cgccccgagg agctgtggga ggccgtggtg ggggccgctg agcgcttccg 180 ggcccggact ggcacggagc tggtgctgct gaccgcggcc ccgccgccac caccccgccc 240 gggcccctgt gcctatgctg cccatggtcg aggagccctg gcggaggcag cgcgccgttg 300 cctccacgac atcgcactgg cccacagggc tgccactgct gctcggcctc ctgcgccccc 360 accagcacca cagccaccca gtcccacacc cagcccaccc cggcctaccc tggccagaga 420 ggacaacgag gaggacgagg atgagcccac agagacagag acctccgggg agcagctggg 480 cattagtgat aatggagggc tctttgtgat ggatgaggac gccaccctcc aggaccttcc 540 ccccttctgt gagtcagacc ccgagagtac agatgatggc agcctgagcg aggagacccc 600 cgccggcccc cccacctgct cagtgccccc agcctcagcc ctacccacac agcagtacgc 660 caagtccctg cctgtgtctg tgcccgtctg gggcttcaag gagaagagga cagaggcgcg 720 gtcatcagat gaggagaatg ggccgccctc ttcgcccgac ctggaccgca tcgcggcgag 780 catgcgcgcg ctggtgctgc gagaggccga ggacacccag gtcttcgggg acctgccacg 840 gccgcggctt aacaccagcg acttccagaa gctgaagcgg aaatatggat cctaaaagaa 900 acctggtggg aaacctggtg gaccgaatgg tctcagccga aaaaaaaacg taaagtgtag 960 960 <210> 21 <211> 302 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pep1-PRAS40-Pep1 fusion protein <400> 21 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu 20 25 30 Trp Glu Ala Val Val Gly Ala Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly 35 40 45 Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro 50 55 60 Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala His Gly Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala 65 70 75 80 Ala Arg Arg Cys Leu His Asp Ile Ala Leu Ala His Arg Ala Ala Thr 85 90 95 Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ser Pro 100 105 110 Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro Thr Leu Ala Arg Glu Asp Asn Glu Glu 115 120 125 Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu Thr Glu Thr Ser Gly Glu Gln Leu Gly 130 135 140 Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu Phe Val Met Asp Glu Asp Ala Thr Leu 145 150 155 160 Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys Glu Ser Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asp 165 170 175 Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Pro Ala Gly Pro Pro Thr Cys Ser Val 180 185 190 Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro Thr Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Leu Pro 195 200 205 Val Ser Val Pro Val Trp Gly Phe Lys Glu Lys Arg Thr Glu Ala Arg 210 215 220 Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly Pro Pro Ser Ser Pro Asp Leu Asp Arg 225 230 235 240 Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala Leu Val Leu Arg Glu Ala Glu Asp Thr 245 250 255 Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro Arg Pro Arg Leu Asn Thr Ser Asp Phe 260 265 270 Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr 275 280 285 Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 290 295 300 <210> 22 <211> 857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding 9lys-PRAS40 fusion protein <400> 22 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaactcgag atggcgtcgg ggcgccccga ggagctgtgg gaggccgtgg 120 tgggggccgc tgagcgcttc cgggcccgga ctggcacgga gctggtgctg ctgaccgcgg 180 ccccgccgcc accaccccgc ccgggcccct gtgcctatgc tgcccatggt cgaggagccc 240 tggcggaggc agcgcgccgt tgcctccacg acatcgcact ggcccacagg gctgccactg 300 ctgctcggcc tcctgcgccc ccaccagcac cacagccacc cagtcccaca cccagcccac 360 cccggcctac cctggccaga gaggacaacg aggaggacga ggatgagccc acagagacag 420 agacctccgg ggagcagctg ggcattagtg ataatggagg gctctttgtg atggatgagg 480 acgccaccct ccaggacctt ccccccttct gtgagtcaga ccccgagagt acagatgatg 540 gcagcctgag cgaggagacc cccgccggcc cccccacctg ctcagtgccc ccagcctcag 600 ccctacccac acagcagtac gccaagtccc tgcctgtgtc tgtgcccgtc tggggcttca 660 aggagaagag gacagaggcg cggtcatcag atgaggagaa tgggccgccc tcttcgcccg 720 acctggaccg catcgcggcg agcatgcgcg cgctggtgct gcgagaggcc gaggacaccc 780 aggtcttcgg ggacctgcca cggccgcggc ttaacaccag cgacttccag aagctgaagc 840 ggaaatattg aggatcc 857 <210> 23 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Lys-PRAS40 fusion protein <400> 23 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu Met Ala Ser Gly Arg 1 5 10 15 Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala Ala Glu Arg Phe Arg 20 25 30 Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr Ala Ala Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala His Gly Arg Gly Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp Ile Ala Leu Ala His 65 70 75 80 Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gln 85 90 95 Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro Thr Leu Ala Arg Glu 100 105 110 Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu Thr Glu Thr Ser Gly 115 120 125 Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu Phe Val Met Asp Glu 130 135 140 Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys Glu Ser Asp Pro Glu 145 150 155 160 Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Pro Ala Gly Pro Pro 165 170 175 Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro Thr Gln Gln Tyr Ala 180 185 190 Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly Phe Lys Glu Lys Arg 195 200 205 Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly Pro Pro Ser Ser Pro 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala Leu Val Leu Arg Glu 225 230 235 240 Ala Glu Asp Thr Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro Arg Pro Arg Leu Asn 245 250 255 Thr Ser Asp Phe Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr 260 265 <210> 24 <211> 857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding PRAS40-9Lys fusion protein <400> 24 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccactc gagatggcgt 60 cggggcgccc cgaggagctg tgggaggccg tggtgggggc cgctgagcgc ttccgggccc 120 ggactggcac ggagctggtg ctgctgaccg cggccccgcc gccaccaccc cgcccgggcc 180 cctgtgccta tgctgcccat ggtcgaggag ccctggcgga ggcagcgcgc cgttgcctcc 240 acgacatcgc actggcccac agggctgcca ctgctgctcg gcctcctgcg cccccaccag 300 caccacagcc acccagtccc acacccagcc caccccggcc taccctggcc agagaggaca 360 acgaggagga cgaggatgag cccacagaga cagagacctc cggggagcag ctgggcatta 420 gtgataatgg agggctcttt gtgatggatg aggacgccac cctccaggac cttcccccct 480 tctgtgagtc agaccccgag agtacagatg atggcagcct gagcgaggag acccccgccg 540 gcccccccac ctgctcagtg cccccagcct cagccctacc cacacagcag tacgccaagt 600 ccctgcctgt gtctgtgccc gtctggggct tcaaggagaa gaggacagag gcgcggtcat 660 cagatgagga gaatgggccg ccctcttcgc ccgacctgga ccgcatcgcg gcgagcatgc 720 gcgcgctggt gctgcgagag gccgaggaca cccaggtctt cggggacctg ccacggccgc 780 ggcttaacac cagcgacttc cagaagctga agcggaaata tggatccaaa aaaaaaaaaa 840 aaaaaaaaaa aaaatag 857 <210> 25 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAS40-9Lys fusion protein <400> 25 Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala 35 40 45 His Gly Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp 50 55 60 Ile Ala Leu Ala His Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro 65 70 75 80 Pro Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro 85 90 95 Thr Leu Ala Arg Glu Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu 100 105 110 Thr Glu Thr Ser Gly Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu 115 120 125 Phe Val Met Asp Glu Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys 130 135 140 Glu Ser Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr 145 150 155 160 Pro Ala Gly Pro Pro Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro 165 170 175 Thr Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly 180 185 190 Phe Lys Glu Lys Arg Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly 195 200 205 Pro Pro Ser Ser Pro Asp Leu Asp Arg Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala 210 215 220 Leu Val Leu Arg Glu Ala Glu Asp Thr Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro 225 230 235 240 Arg Pro Arg Leu Asn Thr Ser Asp Phe Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr 245 250 255 Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 260 265 <210> 26 <211> 884 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding 9Lys-PRAS40-9Lys fusion protein <400> 26 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaactcgag atggcgtcgg ggcgccccga ggagctgtgg gaggccgtgg 120 tgggggccgc tgagcgcttc cgggcccgga ctggcacgga gctggtgctg ctgaccgcgg 180 ccccgccgcc accaccccgc ccgggcccct gtgcctatgc tgcccatggt cgaggagccc 240 tggcggaggc agcgcgccgt tgcctccacg acatcgcact ggcccacagg gctgccactg 300 ctgctcggcc tcctgcgccc ccaccagcac cacagccacc cagtcccaca cccagcccac 360 cccggcctac cctggccaga gaggacaacg aggaggacga ggatgagccc acagagacag 420 agacctccgg ggagcagctg ggcattagtg ataatggagg gctctttgtg atggatgagg 480 acgccaccct ccaggacctt ccccccttct gtgagtcaga ccccgagagt acagatgatg 540 gcagcctgag cgaggagacc cccgccggcc cccccacctg ctcagtgccc ccagcctcag 600 ccctacccac acagcagtac gccaagtccc tgcctgtgtc tgtgcccgtc tggggcttca 660 aggagaagag gacagaggcg cggtcatcag atgaggagaa tgggccgccc tcttcgcccg 720 acctggaccg catcgcggcg agcatgcgcg cgctggtgct gcgagaggcc gaggacaccc 780 aggtcttcgg ggacctgcca cggccgcggc ttaacaccag cgacttccag aagctgaagc 840 ggaaatatgg atccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atag 884 <210> 27 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Lys-PRAS40-9Lys fusion protein <400> 27 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ser His Leu Glu Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu Trp Glu 20 25 30 Ala Val Val Gly Ala Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly Thr Glu 35 40 45 Leu Val Leu Leu Thr Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Pro 50 55 60 Cys Ala Tyr Ala Ala His Gly Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala Ala Arg 65 70 75 80 Arg Cys Leu His Asp Ile Ala Leu Ala His Arg Ala Ala Thr Ala Ala 85 90 95 Arg Pro Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ser Pro Thr Pro 100 105 110 Ser Pro Pro Arg Pro Thr Leu Ala Arg Glu Asp Asn Glu Glu Asp Glu 115 120 125 Asp Glu Pro Thr Glu Thr Glu Thr Ser Gly Glu Gln Leu Gly Ile Ser 130 135 140 Asp Asn Gly Gly Leu Phe Val Met Asp Glu Asp Ala Thr Leu Gln Asp 145 150 155 160 Leu Pro Pro Phe Cys Glu Ser Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asp Gly Ser 165 170 175 Leu Ser Glu Glu Thr Pro Ala Gly Pro Pro Thr Cys Ser Val Pro Pro 180 185 190 Ala Ser Ala Leu Pro Thr Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Leu Pro Val Ser 195 200 205 Val Pro Val Trp Gly Phe Lys Glu Lys Arg Thr Glu Ala Arg Ser Ser 210 215 220 Asp Glu Glu Asn Gly Pro Pro Ser Ser Pro Asp Leu Asp Arg Ile Ala 225 230 235 240 Ala Ser Met Arg Ala Leu Val Leu Arg Glu Ala Glu Asp Thr Gln Val 245 250 255 Phe Gly Asp Leu Pro Arg Pro Arg Leu Asn Thr Ser Asp Phe Gln Lys 260 265 270 Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 275 280 285 <210> 28 <211> 857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding 9Arg-PRAS40 fusion protein <400> 28 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccaaga agaagaagaa 60 gaagaagaag aagactcgag atggcgtcgg ggcgccccga ggagctgtgg gaggccgtgg 120 tgggggccgc tgagcgcttc cgggcccgga ctggcacgga gctggtgctg ctgaccgcgg 180 ccccgccgcc accaccccgc ccgggcccct gtgcctatgc tgcccatggt cgaggagccc 240 tggcggaggc agcgcgccgt tgcctccacg acatcgcact ggcccacagg gctgccactg 300 ctgctcggcc tcctgcgccc ccaccagcac cacagccacc cagtcccaca cccagcccac 360 cccggcctac cctggccaga gaggacaacg aggaggacga ggatgagccc acagagacag 420 agacctccgg ggagcagctg ggcattagtg ataatggagg gctctttgtg atggatgagg 480 acgccaccct ccaggacctt ccccccttct gtgagtcaga ccccgagagt acagatgatg 540 gcagcctgag cgaggagacc cccgccggcc cccccacctg ctcagtgccc ccagcctcag 600 ccctacccac acagcagtac gccaagtccc tgcctgtgtc tgtgcccgtc tggggcttca 660 aggagaagag gacagaggcg cggtcatcag atgaggagaa tgggccgccc tcttcgcccg 720 acctggaccg catcgcggcg agcatgcgcg cgctggtgct gcgagaggcc gaggacaccc 780 aggtcttcgg ggacctgcca cggccgcggc ttaacaccag cgacttccag aagctgaagc 840 ggaaatattg aggatcc 857 <210> 29 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Arg-PRAS40 fusion protein <400> 29 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Glu Met Ala Ser Gly Arg 1 5 10 15 Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala Ala Glu Arg Phe Arg 20 25 30 Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr Ala Ala Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala His Gly Arg Gly Ala 50 55 60 Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp Ile Ala Leu Ala His 65 70 75 80 Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Gln 85 90 95 Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro Thr Leu Ala Arg Glu 100 105 110 Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu Thr Glu Thr Ser Gly 115 120 125 Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu Phe Val Met Asp Glu 130 135 140 Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys Glu Ser Asp Pro Glu 145 150 155 160 Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Pro Ala Gly Pro Pro 165 170 175 Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro Thr Gln Gln Tyr Ala 180 185 190 Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly Phe Lys Glu Lys Arg 195 200 205 Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly Pro Pro Ser Ser Pro 210 215 220 Asp Leu Asp Arg Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala Leu Val Leu Arg Glu 225 230 235 240 Ala Glu Asp Thr Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro Arg Pro Arg Leu Asn 245 250 255 Thr Ser Asp Phe Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr 260 265 <210> 30 <211> 857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding PRAS40-9Arg fusion protein <400> 30 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccactc gagatggcgt 60 cggggcgccc cgaggagctg tgggaggccg tggtgggggc cgctgagcgc ttccgggccc 120 ggactggcac ggagctggtg ctgctgaccg cggccccgcc gccaccaccc cgcccgggcc 180 cctgtgccta tgctgcccat ggtcgaggag ccctggcgga ggcagcgcgc cgttgcctcc 240 acgacatcgc actggcccac agggctgcca ctgctgctcg gcctcctgcg cccccaccag 300 caccacagcc acccagtccc acacccagcc caccccggcc taccctggcc agagaggaca 360 acgaggagga cgaggatgag cccacagaga cagagacctc cggggagcag ctgggcatta 420 gtgataatgg agggctcttt gtgatggatg aggacgccac cctccaggac cttcccccct 480 tctgtgagtc agaccccgag agtacagatg atggcagcct gagcgaggag acccccgccg 540 gcccccccac ctgctcagtg cccccagcct cagccctacc cacacagcag tacgccaagt 600 ccctgcctgt gtctgtgccc gtctggggct tcaaggagaa gaggacagag gcgcggtcat 660 cagatgagga gaatgggccg ccctcttcgc ccgacctgga ccgcatcgcg gcgagcatgc 720 gcgcgctggt gctgcgagag gccgaggaca cccaggtctt cggggacctg ccacggccgc 780 ggcttaacac cagcgacttc cagaagctga agcggaaata tggatccaga agaagaagaa 840 gaagaagaag aagatag 857 <210> 31 <211> 267 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PRAS40-9Arg fusion protein <400> 31 Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu Trp Glu Ala Val Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly Thr Glu Leu Val Leu Leu Thr 20 25 30 Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Pro Cys Ala Tyr Ala Ala 35 40 45 His Gly Arg Gly Ala Leu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Cys Leu His Asp 50 55 60 Ile Ala Leu Ala His Arg Ala Ala Thr Ala Ala Arg Pro Pro Ala Pro 65 70 75 80 Pro Pro Ala Pro Gln Pro Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Pro Arg Pro 85 90 95 Thr Leu Ala Arg Glu Asp Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Pro Thr Glu 100 105 110 Thr Glu Thr Ser Gly Glu Gln Leu Gly Ile Ser Asp Asn Gly Gly Leu 115 120 125 Phe Val Met Asp Glu Asp Ala Thr Leu Gln Asp Leu Pro Pro Phe Cys 130 135 140 Glu Ser Asp Pro Glu Ser Thr Asp Asp Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr 145 150 155 160 Pro Ala Gly Pro Pro Thr Cys Ser Val Pro Pro Ala Ser Ala Leu Pro 165 170 175 Thr Gln Gln Tyr Ala Lys Ser Leu Pro Val Ser Val Pro Val Trp Gly 180 185 190 Phe Lys Glu Lys Arg Thr Glu Ala Arg Ser Ser Asp Glu Glu Asn Gly 195 200 205 Pro Pro Ser Ser Pro Asp Leu Asp Arg Ile Ala Ala Ser Met Arg Ala 210 215 220 Leu Val Leu Arg Glu Ala Glu Asp Thr Gln Val Phe Gly Asp Leu Pro 225 230 235 240 Arg Pro Arg Leu Asn Thr Ser Asp Phe Gln Lys Leu Lys Arg Lys Tyr 245 250 255 Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 260 265 <210> 32 <211> 884 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide coding 9Arg-PRAS40-9Arg fusion protein <400> 32 catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagccaaga agaagaagaa 60 gaagaagaag aagactcgag atggcgtcgg ggcgccccga ggagctgtgg gaggccgtgg 120 tgggggccgc tgagcgcttc cgggcccgga ctggcacgga gctggtgctg ctgaccgcgg 180 ccccgccgcc accaccccgc ccgggcccct gtgcctatgc tgcccatggt cgaggagccc 240 tggcggaggc agcgcgccgt tgcctccacg acatcgcact ggcccacagg gctgccactg 300 ctgctcggcc tcctgcgccc ccaccagcac cacagccacc cagtcccaca cccagcccac 360 cccggcctac cctggccaga gaggacaacg aggaggacga ggatgagccc acagagacag 420 agacctccgg ggagcagctg ggcattagtg ataatggagg gctctttgtg atggatgagg 480 acgccaccct ccaggacctt ccccccttct gtgagtcaga ccccgagagt acagatgatg 540 gcagcctgag cgaggagacc cccgccggcc cccccacctg ctcagtgccc ccagcctcag 600 ccctacccac acagcagtac gccaagtccc tgcctgtgtc tgtgcccgtc tggggcttca 660 aggagaagag gacagaggcg cggtcatcag atgaggagaa tgggccgccc tcttcgcccg 720 acctggaccg catcgcggcg agcatgcgcg cgctggtgct gcgagaggcc gaggacaccc 780 aggtcttcgg ggacctgcca cggccgcggc ttaacaccag cgacttccag aagctgaagc 840 ggaaatatgg atccagaaga agaagaagaa gaagaagaag atag 884 <210> 33 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 9Arg-PRAS40-9Arg fusion protein <400> 33 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg 1 5 10 15 Gly Ser His Leu Glu Met Ala Ser Gly Arg Pro Glu Glu Leu Trp Glu 20 25 30 Ala Val Val Gly Ala Ala Glu Arg Phe Arg Ala Arg Thr Gly Thr Glu 35 40 45 Leu Val Leu Leu Thr Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Gly Pro 50 55 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Lys Arg Lys Tyr Gly Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 275 280 285

Claims (3)

1. 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 PRAS40 (Proline-rich Akt substrate 40)의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 PRAS40 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는, PRAS40 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 PRAS40 융합단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33과 같은 것을 특징으로 하는, PRAS40 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

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