KR20150104672A - 미세담체를 사용한 혈관내피세포의 분리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내피세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 혈관의 내강에 주입하고 배양하는 단계를 포함하는 혈관내피세포의 분리방법 및 상기 방법에 사용되는 미세담체에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 혈관으로부터 내피세포를 높은 순도로 분리할 수 있으므로, 내피세포를 이용한 다양한 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

미세담체를 사용한 혈관내피세포의 분리방법{Methods for isolation of vascular endothelial cells using microcarriers}

본 발명은 미세담체를 사용한 혈관내피세포의 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 내피세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 혈관의 내강에 주입하고 배양하는 단계를 포함하는 혈관내피세포의 분리방법 및 상기 방법에 사용되는 미세담체에 관한 것이다.

혈관신생은 새로운 혈관이 발생 및 성장하는 현상을 의미하는 것으로서, 그 성장 과정은 주로 내피세포의 이동(locomotion), 증식 및 관 형성(tube formation)의 과정을 거치게 된다고 알려져 있다. 이러한 혈관신생은 조직의 재생 및 암세포의 증식과 관련되어 다양한 연구가 수행되고 있는데, 조직의 재생과 암세포의 증식은 모두 혈관신생이 필수적으로 수반된다는 점에서 공통점을 갖는다. 특히, 암세포의 경우, 혈관신생을 억제할 경우, 암의 증식이 억제될 뿐만 아니라 생성된 암조직을 붕괴시킬 수도 있다고 보고되었다. 뿐만 아니라, 조직공학적인 방법으로 이식용 장기를 개발하기 위하여 다양한 연구가 수행되고 있는데, 조직수준에서는 혈관형성이 요구되지 않지만, 장기수준에서는 혈관신생을 필요로 하는데, 이는 조직수준에서는 혈관없이도 산소를 공급할 수 있으나, 장기수준에서는 혈관조직이 없이 산소를 공급할 수 없기 때문이다. 이러한 혈관신생과 관련된 연구를 수행함에 있어서, 필수적으로 요구되는 것은 내피세포이다.

통상적인 내피세포의 기능을 연구하기 위하여는 세포주 배양방법을 통해 증식된 내피세포를 사용할 수 있으나, 상기 내피세포는 혈관을 형성하는 능력이 결여되어 있기 때문에, 혈관신생에 대한 연구를 수행하기 위하여는 혈관조직으로부터 분리된 내피세포를 사용하고 있는 실정이다. 이러한 내피세포를 분리하는 방법으로는 혈관을 이용하여 외식배양하는 방법이 알려져 있다. 상기 외식배양 방법은 혈관을 절개하여 내피세포를 포함하는 내막 부위를 노출시키고, 상기 내막부위를 배양용기의 바닥면에 접촉시킨 상태로 배양하여, 혈관내막으로부터 내피세포의 이동을 유발시켜서, 내피세포를 분리하는 방법이다. 그러나, 상기 외식배양 방법을 통해 혈관으로부터 내피세포를 분리할 경우에는, 내피세포의 수율이 낮고, 내피세포 이외에도 다른 세포가 함께 분리되기 때문에, 내피세포의 순도가 낮다는 문제점이 지적되고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 다양한 연구가 수행되고 있는데, 예를 들어, 한국특허공개 제2012-0040864호에는 마트리겔을 이용하여 동물조직으로부터 혈관내피세포를 분리하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법을 사용할 경우, 내피세포의 수율은 증가되지만, 순도는 종래방법에 비하여 크게 향상되지 않는다는 문제점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 내피세포를 보다 효율적으로 분리하여 내피세포의 순도를 향상시킬 수 있는, 내피세포 분리방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 내피세포에 대한 결합 친화도가 높은 미세담체를 혈관의 내강에 주입하여 혈관의 내막으로부터 유래된 내피세포를 선별적으로 흡착시키고, 상기 내피세포가 흡착된 미세담체를 배양하는 방법을 사용할 경우, 내피세포의 순도를 극적으로 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 미세담체를 사용하여 혈관으로부터 혈관내피세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 사용되는 미세담체를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 내피세포를 보다 효율적으로 분리하여 내피세포의 순도를 향상시킬 수 있는, 내피세포 분리방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 내피세포에 특이적으로 결합하는 담체를 사용하는 방법에 주목하게 되었다. 종래의 내피세포를 분리하는 외식배양 방법은 배양용기에 결과적으로는 혈관전체가 접촉되기 때문에, 혈관의 내막에 포함된 내피세포 뿐만 아니라 중막에 존재하는 민무늬근 세포 및 외막에 존재하는 섬유아세포까지도 배양용기에 전이될 수 있다. 이로 인하여 외식배양된 세포에는 내피세포 뿐만 아니라, 민무늬근 세포 및 섬유아세포가 포함될 수 있는데, 배양시간이 경과할 수록 내피세포에 비하여 증식속도가 빠른 섬유아세포가 더 많이 증식하게 되므로, 결과적으로는 내피세포의 순도가 저하된다는 단점이 있다. 본 발명자들은 이러한 단점을 극복하는 방안으로서, 혈관전체를 배양용기에 접촉시키지 않고, 내피세포에 특이적으로 결합할 수 있는 담체를 사용하여 혈관으로부터 내피세포만을 추출한 다음, 이를 배양할 경우, 내피세포를 높은 순도로서 분리할 수 있을 것으로 예상하였다. 이에, 다른 세포에 비하여 내피세포에 대한 결합친화성이 높은 재료를 검색하여 PCL(Poly(e-caprolactone))을 선택하였다. 상기 선택된 PCL을 이용하여 직경 200-500㎛(평균직경 386㎛)의 미세담체를 제작하고, 상기 미세담체를 대동맥 내강에 주입하고 배양하여 내강의 내피세포를 상기 미세담체에 흡착시키고, 상기 내피세포가 흡착된 미세담체를 배양접시에서 배양하여 미세담체에 흡착된 내피세포를 배양용기로 전이시켰으며, 상기 배양용기에 전이된 내피세포를 더 넓은 배양용기에 전이시켜서 배양하였다. 그 결과, 동맥벽의 내막에 존재하던 내피세포가 미세담체를 경유하여 배양용기로 전이되었으므로, 상기 미세담체를 사용하여 혈관벽으로부터 내피세포를 분리할 수 있었다. 상기 분리된 내피세포를 대상으로 관형성 분석, 면역형광 염색 및 유세포 분석을 수행한 결과, 분리하여 배양된 세포의 약 93%가 내피세포임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 미세담체를 사용한 내피세포의 분리방법은 종래의 방법에 비하여 내피세포의 순도를 현저하게 향상시킨 새로운 방법임을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 내피세포에 대한 결합 친화도가 우수한 미세담체를 사용하여 혈관으로부터 혈관내피세포를 분리하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 혈관내피세포 분리방법은 (a) 내피세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 혈관의 내강에 주입하고 배양하는 단계; 및, (b) 상기 혈관의 내강으로부터 미세담체를 회수하고, 회수된 미세담체를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어 "내피세포(endothelial cells)"란, 동물의 혈관벽을 구성하는 내막에 존재하는 세포를 의미하는데, 상기 내피세포는 혈관조직을 형성하는 기본적인 세포로서 사용되고, 이후 혈관의 손상복구, 혈관재생 등에도 사용된다.

본 발명의 용어 "미세담체(microcarrier)"란, 직경 200-500㎛의 크기를 갖는 구형 입자를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 미세입자는 내피세포에 대한 결합친화성을 갖는 재질을 사용하여 구형으로 제작되어, 혈관의 내강에 주입될 경우, 혈관내막에 존재하는 내피세포와 선별적으로 결합 또는 흡착되어, 내피세포를 수집하는 수단으로서 사용된다.

상기 미세담체의 재질은 내피세포와 선별적으로 결합 또는 흡착될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 PCL(Poly(e-caprolactone)), PLA(polylactic acid), PGA(Poly-γ-glutamic acid), PHB(polyhydroxybutyrate), PHV(Poly(hydroxy valerate)), PDO(poly(P-dioxanone)) 또는 이들의 공중합체 등을 사용할 수 있다.

한편, 내피세포의 수율을 향상시키기 위하여, 상기 미세담체를 배양한 배양물에서 내피세포를 회수하고, 이를 계대배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 각 배양시에 사용되는 배지는 내피세포의 손상을 억제하고 이를 증식시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 내피세포 증식제제가 포함된 혈관세포기초배지를 사용할 수 있는데, 상기 내피세포 증식제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, VEGF, EGF, bFGF, IGF-1, L-글루타민, 헤파린 설페이트, 하이드로코르티손, 아스코르빈산, 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 혈관세포기초배지 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, PCS-100-030(ATCC) 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 배양조건은 내피세포의 손상을 억제하고 이를 증식시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 30 내지 40℃에서 3 내지 20일 동안 배양할 수 있고, 보다 바람직하게는 33 내지 37℃에서 5 내지 10일 동안 배양할 수 있으며, 가장 바람직하게는 37℃에서 5 내지 10일 동안 배양할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 혈관의 내피세포를 분리하고자, 공지된 외식배양 방법을 사용하여, 랫트의 동맥유래 혈관내피세포를 수득하고, 이를 대상으로 CD31에 대한 항체를 이용한 유세포 분석을 수행하여, 수득한 세포에 포함된 내피세포의 함량을 측정한 결과, 약 60%가 내피세포임을 확인하여, 내피세포의 분리수율이 매우 낮음을 알 수 있었다(도 1a 내지 1c). 혈관으로부터 분리된 내피세포의 순도를 향상시키기 위하여, PCL(Poly(e-caprolactone)) 미세담체를 제작하였는데, 상기 미세담체는 대체로 구형을 나타내고(도 2의 A), 200 내지 600㎛의 직경을 갖도록 제조됨을 확인하였다(도 2의 B). 상기 제작된 미세담체 중에서 직경 200-500㎛(평균직경 386㎛)의 미세담체를 마우스로부터 적출되고 세척된 흉부 대동맥 단편의 내강에 주입하고, 10일 동안 1차 배양하였으며, 상기 내강으로부터 미세담체를 회수하고, 회수된 미세담체를 35mm 배양접시에서 10일 동안 2차 배양하였으며, 상기 2차 배양된 세포를 수득하고, 이를 60mm 배양접시에서 5일 동안 3차 배양하였다(도 3a 내지 3d 및 도 4).

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 본 발명의 방법을 수행하면서 대동맥 내강에 주입된 미세담체에 내피세포가 전이되는 지의 여부를 확인하기 위하여, 주입후 5일 및 10일이 경과된 시점에서 미세담체를 일부 회수하고, 이를 형광염색한 결과, 미세담체의 배양기간이 증가할 수록 미세담체로 전이되는 내피세포의 수가 증가함을 확인하였다(도 5). 또한, 상기 미세담체로 전이된 내피세포가 전이되는 지의 여부를 확인하기 위하여, 대동맥의 내강으로부터 회수한 미세담체를 35mm 배양접시에 접종하고, 2일, 6일 및 9일 동안 배양한 다음, 상기 배양접시를 대상으로 상대비 현미경 사진을 촬영한 결과, 배양시간이 경과함에 따라, 미세담체로부터 배양접시로 이동한 내피세포의 수가 증가함을 확인하였다(도 6a 내지 6c). 아울러, 상기 35mm 배양접시에서 배양된 내피세포를 분리하여 60mm 배양접시에 접종하고 배양한 다음, 상기 배양접시를 대상으로 상대비 현미경 사진을 촬영한 결과, 60mm 배양접시에 접종된 내피세포는 내피세포로 구성된 스트로마 형태의 단일층을 형성할 정도로 배양됨을 확인하였다(도 6d 및 6e). 끝으로, 배양단계에 따른 내피세포 증식수준을 비교하기 위하여, 상기 35mm 배양접시와 60mm 배양접시에서 배양된 각 내피세포의 수를 트리판블루 염색배제 테스트(trypan blue exclusion test)를 사용하여 측정하고 비교한 결과, 35mm 배양접시에서 배양된 내피세포의 수 보다는 60mm 배양접시에서 배양된 내피세포의 수가 증가함을 확인하였으므로(도 6f), 배양단계가 진행될 수록 내피세포의 수율이 증가함을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 본 발명의 방법을 수행하여 수득한 세포에 내피세포가 어느 수준으로 포함되어 있는지를 확인하기 위하여, 마트리겔과 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 이용한 관형성 분석을 수행한 결과, 상기 60mm 배양접시에서 배양된 세포는 마트리겔 상에서 관형상의 구조물을 형성함을 확인하였다(도 7a). 또한, 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 대상으로 내피세포의 마커로 알려진 vWF(von Willebrand factor)에 대한 면역형광 염색분석을 수행한 결과, 60mm 배양접시에서 배양된 세포에서는 내피세포의 마커로 알려진 vWF가 발현됨을 확인하였다(도 7b). 끝으로, 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 대상으로 내피세포의 마커로 알려진 CD31에 대한 항체를 사용한 유세포 분석을 수행한 결과, 60mm 배양접시에서 배양된 세포의 약 93%에 해당하는 세포에서 CD31이 발현됨을 확인하였다(도 7c).

따라서, 본 발명에서 제공하는 미세담체를 사용하여 내피세포를 분리하는 방법을 사용할 경우, 종래의 방법에 비하여 내피세포의 순도를 현저하게 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 방법에 사용되는 미세담체를 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 내피세포 분리방법을 이용하면, 미세담체를 혈관의 내강에 주입하여 배양함으로써, 혈관내막에 존재하는 내피세포를 상기 미세담체에 결합 또는 흡착시키고, 상기 내피세포가 결합 또는 흡착된 미세담체를 회수하여, 배양용기에 접종하여 배양함으로써 미세담체에 결합 또는 흡착된 내피세포를 배양용기로 이동시키고 증식시켜서, 최종적으로 분리된 내피세포를 수득하게 된다. 이때, 미세담체의 역할이 매우 중요한데, 상기 미세담체는 다른 세포가 아닌 내피세포에 대한 특이적인 친화성을 나타내어야 하면서도, 배양용기에 접종할 경우, 내피세포가 이동할 수 있도록 하여야 한다.

본 발명의 실시예에서는 상기 미세담체로서, PCL 재질로 구성되고, 200-500㎛의 직경크기를 갖는 구형의 미세담체를 제작하고 이를 사용하였으나, 상술한 특성을 나타낼 수 있는 재질, 크기 및 형태라면, 모두 본 발명의 범주에 포함된다고 할 수 있다.

한편, 상기 미세담체의 제조방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 (a) 미세담체를 구성하는 재질을 비극성 용매에 용해시켜서 용해물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 용해물을 극성용매에 점적하면서 교반하여, 고형화시키는 단계를 포함한다. 이때, 상기 미세담체를 구성하는 재질은 PCL(Poly(e-caprolactone))을 사용할 수 있다. 아울러, 상기 비극성 용매로는 비극성 유기용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 극성용매로는 물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 미세담체의 고형화시간을 단축시키기 위하여 상기 극성용매를 냉온으로 유지할 수 있는 데, 바람직하게는 0 내지 15℃로 유지할 수 있다. 다음으로, 상기 미세담체의 크기는 혈관의 내강에 주입될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 200-500㎛의 직경크기를 갖을 수 있다. 끝으로, 상기 미세담체의 기계적 강도를 향상시키기 위하여, 고형화된 미세담체를 냉온의 극성용매에 침지하고 교반하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 극성용매 및 그의 온도는 상술한 바와 동일하고, 상기 침지시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 5 내지 20시간 동안 침지할 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하면, 혈관으로부터 내피세포를 높은 순도로 분리할 수 있으므로, 내피세포를 이용한 다양한 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 섬유아세포를 포함하는 외막, 혈관평활근 세포를 포함하는 중막 및 ECs 세포를 포함하는 내막의 3개 층으로 구성된 동맥벽의 구조를 나타내는 개략도이다.
도 1b는 대동맥 외식배양 방법의 개념을 나타내는 개략도이다.
도 1c는 대동맥 외식배양으로 얻어진 세포에서 CD31의 발현정도를 나타내는 유세포 분석결과를 나타내는 그래프이다. 4일 동안 추가로 배양하여 세포집단을 확장시킨 랫트의 대동맥 조직으로부터 외부로 성장된 세포는 59.6%(11.6%) 만이 ECs 마커인 CD31에 대하여 양성반응을 나타내었다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 미세담체의 특성을 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 미세담체의 형상을 나타내는 주사전자현미경 사진이고 크기 바는 500㎛를 나타내며, B는 미세담체의 직경 크기 분포를 나타내는 그래프로서, 이들 미세담체의 평균 직경은 386㎛이다.
도 3a는 본 발명에서 제공하는 방법을 수행하는데 사용되는 장비를 나타내는 사진이다.
도 3b는 본 발명에서 제공하는 방법에 사용되는 흉부 대동맥 단편을 나타내는 사진이다.
도 3c는 본 발명에서 제공하는 방법에 따라 대동맥 내에 미세담체가 주입된 상태를 나타내는 사진이다.
도 3d는 5일 또는 10일 동안 배양된 대동맥에서 200㎕ 파이펫 팁을 사용하여 회수된 미세담체에 존재하는 분리된 세포를 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 제공하는 방법의 전체 단계를 도식화 하여 나타낸 개략도이다.
도 5는 대동맥 내강에 미세담체를 주입하고 배양한지 5일이 경과된 시점과 10일이 경과된 시점에서 수득한 미세담체를 형광염색한 결과를 나타내는 현미경 사진으로서, A는 5일이 경과된 시점을 나타내고, B는 A를 부분확대한 것이며, C는 10일이 경과된 시점을 나타내고, D는 C를 부분확대한 것이다. 크기 바는 A 및 C에서는 200㎛를 나타내고 B 및 D에서는 100㎛를 나타낸다.
도 6a는 대동맥의 내강으로부터 회수한 미세담체를 35mm 배양접시에 접종하고, 2일 동안 배양한 다음, 상기 배양접시를 촬영한 상대비 현미경 사진(Phase contrast micrograph image)으로, 크기 바는 200㎛를 나타낸다.
도 6b는 대동맥의 내강으로부터 회수한 미세담체를 35mm 배양접시에 접종하고, 6일 동안 배양한 다음, 상기 배양접시를 촬영한 상대비 현미경 사진으로, 크기 바는 400㎛를 나타낸다.
도 6c는 대동맥의 내강으로부터 회수한 미세담체를 35mm 배양접시에 접종하고, 9일 동안 배양한 다음, 상기 배양접시를 촬영한 상대비 현미경 사진으로, 크기 바는 400㎛를 나타낸다.
도 6d는 35mm 배양접시에서 배양된 내피세포를 분리하여 60mm 배양접시에 접종하고 배양한 다음, 상기 배양접시를 촬영한 상대비 현미경 사진으로, 크기 바는 400㎛를 나타낸다.
도 6e는 상기 도 6d를 부분확대한 사진으로, 크기 바는 100㎛를 나타낸다.
도 6f는 35mm 배양접시와 60mm 배양접시에서 배양된 각 내피세포의 수를 트리판블루 염색배제 테스트를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 마트리겔상에 접종하고 배양하여 관형성 분석을 수행한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 7b는 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 대상으로, 내피세포의 마커로 알려진 vWF(von Willebrand factor)에 대한 면역형광 염색분석을 수행한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 7c는 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 대상으로, CD31에 대한 항체를 사용한 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 랫트의 동맥유래 혈관내피세포의 외식배양

실시예 1-1: 혈관내피세포의 외식배양

통상적으로, 대동맥과 같은 혈관의 벽은 외측으로부터 섬유아세포를 포함하는 외막(adventitis), 민무늬근 세포를 포함하는 중간막(media) 및 내피세포를 포함하는 내막(intima)으로 구성된다(도 1a). 상기 혈관의 내막에 존재하는 내피세포를 배양하는 방법의 하나로서 외식배양(explant culture) 방법이 알려져 있는데, 이는 혈관의 내막부위를 내피세포 증식제제를 포함하는 배지가 담겨진 배양용기의 바닥에 직접 접촉시키고 배양함으로써, 내피세포가 내막으로부터 배양용기로 이동하게 하고, 배양용기로 이동된 내피세포를 추가로 배양하여 내피세포를 수득하는 방법이다(도 1b). 본 발명자들은 웅성 스프라그-다울리 랫트의 동맥조직으로부터 유래된 혈관내피세포를 외식배양하여, 배양된 세포내에 포함된 내피세포의 함량을 측정하고자 하였다. 상기 실험은 단국대학교 동물실험윤리위원회에서 정한 지침 및 실험동물 사육 및 이용에 관한 지침에 따라 수행하였다.

우선, 실험동물(190 내지 250 g)로 부터 흉부 대동맥을 적출하고, 즉시 냉온 HBSS(Hanks' balanced salt solution)에 침지하였다. 10배율의 해부현미경 하에서 상기 대동맥의 외막으로부터 혈병과 결합조직을 제거하고, 소량의 HBSS를 대동맥의 내강에 주입하여 잔류하는 혈액성분을 제거한 다음, 대동맥의 혈관벽을 절개하여 대동맥의 내강에 위치한 내막을 노출시켰다. 그런 다음, 상기 대동맥의 내막부위를 내피세포 증식제제(ATCC, cat # PCS-100-041)가 포함된 혈관세포기초배지(ATCC, cat # PCS-100-030)가 담겨진 배양접시의 바닥에 접촉시키고, 이러한 상태를 유지하면서 9일 동안 외식배양을 수행하여, 혈관내피세포가 배양용기로 이동하여 증식하도록 하였다. 배양이 종료된 후, 상기 배양접시로부터 대동맥을 제거하고 다시 14일 동안 배양하였다.

실시예 1-2: 유세포 분석을 통한 내피세포의 수율확인

상기 실시예 1-1에서 배양된 세포를 대상으로, 내피세포의 마커로서 알려진 CD31에 대한 항체(PECAM)를 사용한 유세포 분석을 수행하였다.

대략적으로, 상기 배양용기에 트립신을 처리하여 배양된 세포 현탁액을 수득하고, 상기 현탁액에 1㎍/mg의 PECAM(cat# sc-80913; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)을 가하여 상온에서 30분동안 반응시킨 다음, 1㎍/㎖의 플루오세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocynate)가 결합된 이차항체(cat# sc2010; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 처리하고 상온에서 30분동안 반응시켜서, 상기 세포를 상기 항체로 표지하였다. 상기 표지된 세포를 유세포 분석기(Flow Cytometer, FACS Calibur: Becton Dickinson)과 프로그램(Cell Quest software, Becton Dickinson)에 적용하여 분석하였다(도 1c). 도 1c에서 보듯이, 총 배양된 세포중의 60%에 해당하는 세포에서 내피세포의 마커로서 알려진 CD31가 발현됨을 확인하였다.

따라서, 대동맥의 내막을 사용한 외식배양을 수행할 경우, 내피세포의 수율이 높지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2: 미세담체의 제작

PCL(Poly(e-caprolactone), Mw = 80 000)을 사용하여 구형의 미세담체를 제작하였다.

구체적으로, 클로로포름에 PCL을 가하여 10중량%의 농도로 맞추고, 이를 3시간 동안 교반하여, PCL이 클로로포름에 용해된 PCL 용액을 수득하였다.

상기 PCL 용액을 1중량%의 PVA(polyvinyl alcohol)를 포함하는 물에 점적하여 구형의 미세담체를 생성시켰다. 이때, 상기 물은 4℃를 유지하면서 600rpm으로 교반하였고, 점적된 상기 PCL 용액의 부피가 물의 부피의 30%(v/v)가 될 때까지 반응을 수행하였다. 상기 미세담체를 생성시킨 후, 6시간 동안 추가로 교반하여 생성된 미세구체의 강도를 증가시켰다. 끝으로, 상기 반응물로부터 액상성분을 제거하고, 미세담체를 냉온의 증류수로 5회 이상 세척하였으며, 여과지(Millipore filter paper)를 사용하여 여과한 후, 동결건조시켜서, 미세담체를 제작하였으며, 제작된 미세담체는 4℃에서 보관하였다.

실시예 3: 미세담체의 특성분석

상기 실시예 2에서 제작된 미세담체의 형태를 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 분석하였다(도 2). 도 2의 A는 본 발명에서 제공하는 미세담체의 형태를 나타내는 전자현미경 사진이고, 도 2의 B는 상기 미세담체의 직경크기의 분포를 나타내는 그래프이다. 도 2의 A에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 미세담체는 대체로 구형을 형성하고, 도 2의 B에서 보듯이, 상기 미세담체는 약 200 내지 600㎛의 직경을 갖도록 제조되었음을 확인하였다. 본 발명자들은 상기 제조된 미세담체 중에서 직경 200-500㎛(평균직경 386㎛)의 미세담체를를 선별하여 이후의 실시예에서 사용하였다.

실시예 4: 미세담체를 이용한 내피세포의 배양

실시예 4-1: 미세담체를 이용한 내피세포의 수득

대동맥을 추출하고, 미세담체를 이용하여 대동맥으로부터 내피세포를 수득하기 위하여 다양한 크기의 가위, 겸자, 파이펫 팁 및 주사기를 사용하였다(도 3a).

먼저, 실시예 1에서와 같이, 실험동물(190 내지 250 g)로 부터 흉부 대동맥을 적출하고, 즉시 냉온 HBSS(Hanks' balanced salt solution)에 침지하였다. 10배율의 해부현미경 하에서 상기 대동맥의 외막으로부터 혈병과 결합조직을 제거하고, 소량의 HBSS를 대동맥의 내강에 주입하여 잔류하는 혈액성분을 제거하여, 22 내지 25mm 길이의 대동맥을 수득하였다(도 3b).

한편, 상기 실시예 2에서 제작된 미세담체를 2시간 동안 70% 에탄올에 침지하여 살균하고, PBS로 3회 세척한 다음, 혈관세포기초배지에 12시간 동안 침지하여 전처리 하였다.

다음으로, 상기 상기 수득한 대동맥을 내피세포 증식제제가 포함된 혈관세포기초배지에 침지하고, 주사기를 사용하여 상기 대동맥의 내강에 상기 전처리된 미세담체를 주입한 다음(도 3c), 10일 동안 1차 배양을 수행하였다(도 3d). 도 3d에서 보듯이, 대동맥 내에서 1차 배양된 시간이 경과할 수록 세포의 이동성이 향상됨을 알 수 있었다.

상기 1차 배양이 종료된 후, 상기 대동맥의 내강에 위치한 미세담체를 파이펫 팁을 사용하여 회수하고, 상기 회수된 미세담체를 동일한 배지가 담겨진 35mm 배양접시로 이동시킨 다음, 다시 10일 동안 2차 배양을 수행하였다.

상기 2차 배양이 종료된 후, 상기 배양접시에 트립신을 처리하여, 세포를 분리하고, 분리된 세포를 동일한 배지가 담겨진 60mm 배양접시로 이동시킨 다음, 다시 5일 동안 3차 배양을 수행하였다.

상기 방법의 전체적인 흐름을 도 4에 도식화하여 나타내었다.

실시예 4-2: 미세담체에 결합된 내피세포의 확인

상기 실시예 4-1에 개시된 방법을 사용하여, 혈관의 내핏세포가 미세담체로 이동하여 결합할 것으로 예상하였는 바, 이러한 예상대로 진행되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 대동맥 내강에 미세담체를 주입하고 배양한지 5일이 경과된 시점과 10일이 경과된 시점에서 각각의 미세담체를 수득하고, 상기 미세담체에 결합된 내피세포의 수준을 확인하기 위하여, 형광염색을 수행하였다.

대략적으로, 상기 수득한 각각의 미세담체를 4% 포름알데히드용액에 침지하여 고정시키고, 고정된 미세담체에 0.2% 계면활성제(Triton X-100)를 처리하였으며, 1% (w/v) BSA를 포함하는 PBS를 30분 동안 처리하여 비특이적 단백질 결합을 방지한 다음, PBS에 20 nM의 농도로 용해시킨 형광염료(Alexa Fluor 546-conjugated Phalloidin)를 가하여 30분 동안 염색하였다. 염색이 종료된 후, DP-72 디지털 카메라가 구비된 역상현미경을 사용하여 형광사진을 촬영하였다(도 5). 도 5에서 A 및 B는 5일 동안 배양한 미세담체를 나타내고, C 및 D는 10일 동안 배양한 미세담체를 나타내며, B는 A를 부분확대한 사진이고, D는 C를 부분확대한 사진이다. 상기 도 5에서 보듯이, 배양시간이 경과함에 따라, 미세담체에 결합된 내피세포의 수준이 증가함을 확인하였으므로, 상기 미세담체를 사용할 경우, 혈관의 내피세포를 선별적으로 수득할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4-3: 미세담체에 결합된 내피세포의 전이여부 확인

상기 실시예 4-1에 개시된 방법을 사용하여, 미세담체에 결합된 내피세포가 배양용기로 이동할 것으로 예상하였는 바, 이러한 예상대로 진행되었는지의 여부를 확인하고자 하였다.

대략적으로, 대동맥의 내강으로부터 회수한 미세담체를 35mm 배양접시에 접종하고, 2일, 6일 및 9일 동안 배양한 다음, 상기 배양접시를 대상으로 상대비 현미경 사진(Phase contrast micrograph image)를 촬영하여 비교하였다(도 6a 내지 6c). 도 6a 내지 6c에서 보듯이, 배양시간이 경과함에 따라, 미세담체로부터 배양접시로 이동한 내피세포의 수가 증가함을 확인하였다.

한편, 상기 35mm 배양접시에서 배양된 내피세포를 분리하여 60mm 배양접시에 접종하고 배양한 다음, 상기 배양접시를 대상으로 상대비 현미경 사진을 촬영하였다(도 6d 및 6e). 상기 도 6d 및 6e에서 보듯이, 60mm 배양접시에 접종된 내피세포는 내피세포로 구성된 스트로마 형태의 단일층을 형성할 정도로 배양됨을 확인하였다.

실시예 4-4: 배양단계에 따른 내피세포 증식수준의 비교

상기 35mm 배양접시와 60mm 배양접시에서 배양된 각 내피세포의 수를 트리판블루 염색배제 테스트(trypan blue exclusion test)를 사용하여 계수하고, 상호 비교하였다.

대략적으로, 상기 각 배양접시에 트립신을 처리하여 각각의 배양된 세포를 포함하는 현탁액을 수득하였다. 상기 수득한 각 현탁액에 동일 부피의 트리판블루 염료를 가하여 혼합하여 생존하지 않는 세포를 염색하였다. 상기 염색을 수행한 현탁액을 헤마토사이토메터의 4개의 1 x 1㎟ 격자에 가하여 염색되지 않은 세포의 수를 계수하고, 이의 평균값을 산출한 다음, 이로부터 총 세포의 수를 산출하였다(도 6f). 도 6f에서 보듯이, 35mm 배양접시에서 배양된 내피세포의 수 보다는 60mm 배양접시에서 배양된 내피세포의 수가 증가함을 확인하였다. 따라서, 배양단계가 진행될 수록 내피세포의 수율이 증가함을 알 수 있었다.

실시예 5: 내피세포의 특성 확인

실시예 5-1: 관형성 분석

내피세포는 특정조건이 갖춰진 마트리겔상에서 배양할 경우, 관형상의 구조물을 형성한다고 알려져 있으므로, 상기 실시예 4-1에서 수득한, 60mm 배양접시에서 배양된 세포가 내피세포인지의 여부를 관형성 분석을 통해 확인하고자 하였다.

대략적으로, 용해된 Matrigel™ 용액 50㎕를 4웰 플레이트의 각 웰에 코팅하고, 37℃에서 30분동안 방치하여 Matrigel™ 용액이 겔을 형성하도록 하였다. 그런 다음, 상기 마트리겔상에 상기 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 2×10^4 세포수로 접종하고, 내피세포 증식제제가 포함된 혈관세포기초배지를 가한 다음 1일 동안 배양하였다(도 7a). 도 7a에서 보듯이, 상기 60mm 배양접시에서 배양된 세포는 마트리겔 상에서 관형상의 구조물을 형성함을 확인하였다.

실시예 5-2: 면역염색 분석

내피세포의 마커로 알려진 vWF(von Willebrand factor)에 대한 면역형광 염색분석을 사용하여 상기 실시예 4-1에서 수득한, 60mm 배양접시에서 배양된 세포가 내피세포인지의 여부를 확인하고자 하였다.

대략적으로, 60mm 배양접시에서 배양된 3×10^4개의 세포를 커버글라스와 함께 12웰 플레이트의 각 웰에 직접 접종하고 3일 동안 배양하고, 배양된 세포에 4% 포름알데히드를 10분동안 처리하여 고정시켰다. 그런 다음, 상기 고정된 세포에 블로킹 완충액(1% BSA를 포함하는 PBS)을 가하고 상온에서 30분 동안 반응시켰으며, 계면활성제(0.1% Triton X-100)를 5분동안 처리하여 투과시켰다. 이어, 상기 세포에 vWF의 1차 항체(1:200 dilution, cat # ab6322, Abcam)를 가하고 60분 동안 반응시켰으며, 염소의 항-토끼 Alexa Fluor 555 이차항체(1:150 dilution, cat # A21428 Invitrogen)를 가하고 30분 동안 반응시켰다. 이때, 핵은 0.5 mg/㎖ DAPI(0.5 mg/㎖ 4',6-Diamidino-2-phenylindole)를 사용하여 대조염색하였다. 상기 염색된 세포를 대상으로, DP-72 디지털 카메라가 구비된 역상현미경을 사용하여 형광사진을 촬영하였다(도 7b). 도 7b에서 보듯이, 60mm 배양접시에서 배양된 세포에서는 내피세포의 마커로 알려진 vWF가 발현됨을 확인하였다.

실시예 5-3: 유세포 분석

상기 60mm 배양접시에서 배양된 세포를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-2의 방법을 사용하여, 유세포 분석을 수행하였다(도 7c). 도 7c에서 보듯이, 60mm 배양접시에서 배양된 세포의 약 93%에 해당하는 세포에서 CD31이 발현됨을 확인하였다.

따라서, 실시예 5-1 내지 5-3의 결과를 종합하면, 상기 실시예 4-1의 방법을 통해 수득한 세포는 내피세포임을 알 수 있었다.

Claims (13)

1. (a) 내피세포에 대한 결합친화성을 갖는 재질의 미세담체를 혈관의 내강에 주입하고 배양하는 단계; 및,
   (b) 상기 혈관의 내강으로부터 미세담체를 회수하고, 회수된 미세담체를 배양하는 단계를 포함하는, 혈관내피세포 분리방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 재질은 PCL(Poly(e-caprolactone)), PLA(polylactic acid), PGA(Poly-γ-glutamic acid), PHB(polyhydroxybutyrate), PHV(Poly(hydroxy valerate)), PDO(poly(P-dioxanone)), 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 미세담체는 200 내지 500㎛의 직경을 갖는 구형 입자인 것인 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   (a) 및 (b) 단계의 배양은 30 내지 40℃에서 3 내지 20일 동안 수행하는 것인 방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   (b) 단계에서 배양된 내피세포를 회수하고, 이를 계대배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 계대배양은 30 내지 40℃에서 3 내지 20일 동안 수행하는 것인 방법.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 사용되고, 내피세포에 대한 결합친화성을 갖는 재질의 미세담체.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 재질은 PCL(Poly(e-caprolactone)), PLA(polylactic acid), PGA(Poly-γ-glutamic acid), PHB(polyhydroxybutyrate), PHV(Poly(hydroxy valerate)), PDO(poly(P-dioxanone)), 이들의 공중합체 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 미세담체.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 미세담체는 200 내지 500㎛의 직경을 갖는 구형 입자인 것인 미세담체.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 미세담체는 (a) 미세담체를 구성하는 재질을 비극성 용매에 용해시켜서 용해물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 용해물을 극성용매에 점적하면서 교반하여, 고형화시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제작된 것인 미세담체.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 비극성 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 용매인 것인 미세담체.
    
12. 제10항에 있어서,
    상기 극성용매는 물인 것인 미세담체.
    
13. 제10항에 있어서,
    고형화된 미세담체를 0 내지 15℃의 물에 5 내지 20시간 동안 침지하고 교반하는 단계를 추가로 포함하는 것인 미세담체.
    

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