KR101706824B1

KR101706824B1 - 미세담체를 사용한 지방줄기세포의 분리방법

Info

Publication number: KR101706824B1
Application number: KR1020140157935A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 김광진
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2014-11-13
Publication date: 2017-02-16
Also published as: KR20160058247A

Abstract

본 발명은 지방줄기세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 지방조직에 주입하고 배양한 다음, 회수하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 분리방법 및 상기 방법에 사용되는 미세담체에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 지방조직으로부터 지방전구세포를 높은 순도로 분리할 수 있으므로, 지방줄기세포를 이용한 다양한 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

미세담체를 사용한 지방줄기세포의 분리방법{Methods for isolation of adipose-derived stem cells using microcarriers}

본 발명은 미세담체를 사용한 지방줄기세포의 분리방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 지방줄기세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 포함하는 지방줄기세포 분리용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 지방줄기세포 분리용 키트 및 상기 미세담체를 지방조직에 주입하고 배양한 다음, 회수하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 분리방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cells)는 성체의 여러 조직 및 기관에서 발견되는 성체줄기세포(adult stem cells)와, 발달단계 중 배반포 단계의 세포 내괴에서 얻을 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cells)로 나누어진다.

배아줄기세포는 신경, 혈액세포, 췌장 등 다양한 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 갖고 있지만, 사람으로 성장할 수 있는 배아로부터 얻어야 하기 때문에 윤리적 문제점이 있다. 따라서, 윤리적인 문제를 배제할 수 있을 뿐만 아니라 분리 및 배양이 쉬우며 여러 가지 세포로 분화 가능한 성체줄기세포가 세포치료제의 재료로서 각광받고 있다. 성체줄기세포는 다양한 조직으로부터 분리할 수 있으며, 지방세포, 골세포, 연골세포, 심장세포, 간세포, 신경세포 등 다양한 조직세포로 분화할 수 있는 미분화 상태의 줄기세포로서, 골수유래 중간엽 줄기세포 등을 들 수 있다.

그러나 골수 유래 중간엽줄기세포는 제공자의 나이가 증가함에 따라 줄기세포의 수 및 증식 능력이 감소하며, 골수를 채취하기 위해서는 고통이 수반된다. 이에 따라 다른 조직에서부터 중간엽줄기세포를 분리하려는 시도를 하고 있으며, 대표적으로 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cells)가 그의 대안으로 대두되고 있다. 상기 지방유래 줄기세포는 지방줄기세포라고도 하며, 생체조직과 상대적으로 느슨하게 연결되고, 손쉽게 증식시킬 수 있는 지방조직에 포함된 줄기세포를 의미한다. 상기 지방줄기세포는 다른 조직유래 줄기세포에 비하여, 생체내에서 대량으로 적출하여도 생리적 문제가 발생되지 않고, 이후에도 체내에서 계속적으로 생성되며, 지방조직에서 지방줄기세포를 분리하기가 비교적 용이하다는 장점이 있는 반면, 상기 지방조직에 포함된 지방줄기세포의 함량이 낮다는 단점이 있어서, 상기 지방조직으로부터 분리수율이 낮다는 단점이 있었다. 그러나, 생체에 치명적인 손상을 유발시키지 않고서도 줄기세포를 추출할 수 있어, 상기 지방줄기세포를 보다 효과적으로 분리하는 방법을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2012-0117386호에는 인체로부터 얻은 지방조직에 콜라게네이즈 용액을 첨가하여 지방유래 줄기세포를 분리하는 단계 및 상기 분리된 지방유래 줄기세포에 혈구 용혈 용액을 첨가하여 혈구를 제거하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 분리방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0075469호에는 지방조직을 제 1세척하는 단계, 세척된 지방조직을 섬유성 단백질 분해효소와 반응시키는 단계, 상기 반응물을 제 2 세척하는 단계, 상기 세척물을 여과하는 단계 및 상기 여과물을 제 3 세척하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 분리방법이 개시되어 있다. 그러나, 이처럼 개발된 방법은 개체로부터 적출된 지방조직을 사용하므로, 상기 지방조직의 대부분을 차지하는 지방세포를 제거하는 과정이 필수적으로 포함되어 있어, 지방줄기세포의 분리에 많은 시간과 노력이 소모된다는 단점이 있었다. 만일, 생체에서 지방조직을 적출하지 않고, 지방줄기세포만을 분리할 수 있는 방법이 개발된다면, 보다 효과적으로 지방줄기세포를 분리할 수 있을 것으로 예상되고 있으나, 이러한 방법은 아직까지 개발되지 않고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 지방줄기세포를 보다 효율적으로 분리할 수 있는, 지방줄기세포 분리방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 지방줄기세포에 대한 결합 친화도가 높은 미세담체를 생체의 지방조직에 주입하여 지방조직으로부터 유래된 지방줄기세포를 선별적으로 흡착시키고, 상기 지방줄기세포가 흡착된 미세담체를 배양하는 방법을 사용할 경우, 보다 효과적으로 지방줄기세포를 분리할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 지방줄기세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 포함하는 지방줄기세포 분리용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 지방줄기세포 분리용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세담체를 지방조직에 주입하고 배양한 다음, 회수하는 단계를 포함하는 지방줄기세포의 분리방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 지방조직으로부터 보다 효과적으로 지방줄기세포를 분리할 수 있는 지방줄기세포의 분리방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 지방줄기세포에 특이적으로 결합하는 담체를 사용하는 방법에 주목하게 되었다. 종래의 지방줄기세포를 분리하는 지방조직 적출방법은 환자의 지방조직의 일부를 통째로 적출하기 때문에, 지방세포와 지방줄기세포를 별도로 분리하는 과정이 필요하므로, 지방줄기세포의 분리과정이 복잡하고, 이로부터 분리된 지방줄기세포의 수율이 낮을 수준을 나타낸다는 단점이 있다. 본 발명자들은 이러한 단점을 극복하는 방안으로서, 지방조직 전체를 적출하지 않고, 지방줄기세포에 특이적으로 결합할 수 있는 담체를 사용하여 지방조직으로부터 지방줄기세포만을 추출한 다음, 이를 배양할 경우, 지방줄기세포를 효과적으로 분리할 수 있을 것으로 예상하였다. 이에, 다른 세포에 비하여 지방줄기세포에 대한 결합친화성이 높은 재료를 검색하여 PCL(Poly(e-caprolactone))을 선택하였다. 상기 선택된 PCL을 이용하여 200-650㎛(평균직경 454㎛)의 직경을 갖고 직경 50 내지 100㎛의 거대공극이 형성된 구형 입자 형태의 미세담체를 제작하였으며, 상기 미세담체를 지방조직에 주입하고 배양하여 지방조직내의 지방줄기세포를 상기 미세담체에 흡착시키고, 상기 지방줄기세포가 흡착된 미세담체를 배양접시에서 배양하여 미세담체에 흡착된 지방줄기세포를 배양용기로 전이시켰으며, 상기 배양용기에 전이된 지방줄기세포를 더 넓은 배양용기에 전이시켜서 배양하였다(도 1). 그 결과, 지방조직에 존재하던 지방줄기세포가 미세담체를 경유하여 배양용기로 전이되었으므로, 상기 미세담체를 사용하여 지방조직으로부터 지방줄기세포를 분리할 수 있었다. 상기 분리된 지방줄기세포를 대상으로 마커분석 및 분화능 분석을 수행한 결과, 분리하여 배양된 세포가 지방줄기세포임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 미세담체를 사용한 지방줄기세포의 분리방법은 종래의 방법에 비하여 분리효율성을 현저하게 향상시킨 새로운 방법임을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 지방줄기세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 포함하는 지방줄기세포 분리용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "지방줄기세포(adipose-derived stem cells)"란, 동물의 성체의 지방조직에서 추출된 성체줄기세포의 일종을 의미한다. 상기 지방줄기세포는 배아줄기세포에 비하여 윤리적인 문제가 없고, 환자의 본인으로부터 추출이 가능하여 면역거부반응을 고려하지 않아도 된다는 장점이 있는 반면, 분화능력이 배아줄기세포 보다 낮고, 소량으로 존재한다는 단점이 있다.

본 발명의 용어 "미세담체(microcarrier)"란, 200-650㎛(평균직경 454㎛)의 직경을 갖고 직경 50 내지 100㎛의 거대공극이 형성된 구형 입자 형태의 미세담체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 미세입자는 지방줄기세포에 대한 결합친화성을 갖는 재질을 사용하여 거대공극이 형성된 구형으로 제작되어, 지방조직에 주입될 경우, 지방조직에 존재하는 지방줄기세포와 선별적으로 결합 또는 흡착되어, 지방줄기세포를 수집하는 수단으로서 사용된다.

상기 미세담체는 다른 세포가 아닌 지방줄기세포에 대한 특이적인 친화성을 나타내어야 하면서도, 배양용기에 접종할 경우, 지방줄기세포가 이동할 수 있도록 하는 특성을 나타내야 하므로, 상기 미세담체의 재질은 지방줄기세포와 선별적으로 결합 또는 흡착될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 PCL(Poly(e-caprolactone)), PLA(polylactic acid), PGA(Poly-γ-glutamic acid), PHB(polyhydroxybutyrate), PHV(Poly(hydroxy valerate)), PDO(poly(P-dioxanone)) 또는 이들의 공중합체 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 상기 미세담체로서, PCL 재질로 구성되고, 200-650㎛의 직경크기와 직경 50 내지 100㎛의 거대공극이 형성된 구형의 미세담체를 제작하고 이를 사용하였으나, 상술한 특성을 나타낼 수 있는 재질, 크기 및 형태라면, 모두 본 발명의 범주에 포함된다고 할 수 있다.

한편, 상기 미세담체의 제조방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 (a) 미세담체를 구성하는 재질과 공극형성 물질을 비극성 용매에 용해시켜서 용해물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 용해물을 극성용매에 점적하면서 교반하여, 고형화시키는 단계를 포함한다. 이때, 상기 미세담체를 구성하는 재질은 PCL(Poly(e-caprolactone)), PLA(polylactic acid), PGA(Poly-γ-glutamic acid), PHB(polyhydroxybutyrate), PHV(Poly(hydroxy valerate)), PDO(poly(P-dioxanone)), 이들의 공중합체 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고, 상기 공극형성 물질로는 캠펜(camphene)을 사용할 수 있다. 아울러, 상기 비극성 용매로는 비극성 유기용매를 사용할 수 있고, 바람직하게는 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 극성용매로는 물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 미세담체의 고형화시간을 단축시키기 위하여 상기 극성용매를 냉온으로 유지할 수 있는 데, 바람직하게는 0 내지 15℃로 유지할 수 있다. 다음으로, 상기 미세담체의 크기는 지방조직에 주입될 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 200-650㎛의 직경크기와 직경 50 내지 100㎛의 거대공극이 형성된 구형의 형태를 갖을 수 있다. 끝으로, 상기 미세담체의 기계적 강도를 향상시키기 위하여, 고형화된 미세담체를 냉온의 극성용매에 침지하고 교반하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 극성용매 및 그의 온도는 상술한 바와 동일하고, 상기 침지시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 5 내지 20시간 동안 침지할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 PCL(Poly(e-caprolactone), Mw = 80 000)과 캠펜(camphene)을 이용하여 거대공극을 포함하는 구형의 미세담체를 제작하고, 이의 형상을 분석한 결과, 상기 미세담체는 전체적으로 구형이고, 내부에 거대공극이 형성되었으며, 200 내지 650㎛의 직경을 나타내고, 평균직경은 454㎛임을 확인하였다(도 2).

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 지방줄기세포 분리용 조성물을 포함하는 지방줄기세포 분리용 키트를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 지방줄기세포 분리용 키트는 상기 지방줄기세포 분리용 조성물 뿐만 아니라, 상기 지방줄기세포를 분리하기에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 예를 들어, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 지방줄기세포 배양액, 멸균수 등을 추가로 포함할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 상기 미세담체를 사용하여 지방조직으로부터 지방줄기세포를 분리하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 지방줄기세포 분리방법은 (a) 지방줄기세포에 대한 결합친화성이 우수한 재질의 미세담체를 지방조직에 주입하고 배양하는 단계; 및, (b) 상기 지방조직으로부터 미세담체를 회수하고, 회수된 미세담체를 배양하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 (a) 단계의 배양시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 체내의 지방조직 내에서 4 내지 10일이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 6 내지 8일이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 7일이 될 수 있다. 또한, (b) 단계의 배양은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 30 내지 40℃에서 7 내지 15일 동안 배양할 수 있고, 보다 바람직하게는 33 내지 37℃에서 10 내지 13일 동안 배양할 수 있으며, 가장 바람직하게는 37℃에서 12일 동안 배양할 수 있다.

한편, 지방줄기세포의 수율을 향상시키기 위하여, 상기 미세담체를 배양한 배양물에서 지방줄기세포를 회수하고, 이를 계대배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 각 배양시에 사용되는 배지는 지방줄기세포의 손상을 억제하고 이를 증식시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 통상적인 줄기세포 배양용 배지를 사용할 수 있다.

또한, 상기 배양조건은 지방줄기세포의 손상을 억제하고 이를 증식시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 30 내지 40℃에서 5 내지 15일 동안 배양할 수 있고, 보다 바람직하게는 33 내지 37℃에서 7 내지 10일 동안 배양할 수 있으며, 가장 바람직하게는 37℃에서 7일 동안 배양할 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용되는 지방조직은 지방줄기세포의 원천으로 사용할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 생체 내외에 존재하는 지방조직이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 인간을 제외한 동물의 지방조직 또는 분리된 지방조직이 될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 지방줄기세포 분리방법을 이용하면, 미세담체를 지방조직에 주입하여 배양함으로써, 지방조직에 존재하는 지방줄기세포를 상기 미세담체에 결합 또는 흡착시키고, 상기 지방줄기세포가 결합 또는 흡착된 미세담체를 회수하여, 배양용기에 접종하여 배양함으로써 미세담체에 결합 또는 흡착된 지방줄기세포를 배양용기로 이동시키고 증식시켜서, 최종적으로 분리된 지방줄기세포를 수득할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 상기 제작된 미세담체를 랫트의 등지방 조직에 이식하고 7일 후, 이식물을 회수한 다음, 상기 이식물에 포함된 세포를 Oil Red O 및 Alexa Fluor 488 phalloidin으로 염색한 결과, 상기 세포는 지방줄기세포일 가능성이 높은 것으로 확인되었다(도 3). 이를 확인하기 위하여, 상기 세포를 포함하는 미세담체를 60mm 배양용기에 접종하고, 12일 동안 배양한 결과, 배양시간이 경과함에 따라 상기 미세담체로부터 배양용기로 지방줄기세포의 이동수준이 증가함을 확인하였다(도 4). 상기 12일 동안 배양된 지방줄기세포를 7일마다 2회 계대배양하면서 세포수를 계수한 결과, 배양시간의 경과에 따라, 지방줄기세포의 수가 현저하게 증가함을 알 수 있었다(도 5). 또한, 지방줄기세포의 세포표면 마커를 분석한 결과, CD29 및 CD44H에 대하여는 강한 양성반응을 나타낸 반면, CD11b 및 CD45에 대하여는 음성반응을 나타내었으므로, 상기 배양된 세포가 지방줄기세포임을 확인하였다(도 6). 끝으로, 상기 지방줄기세포의 분화능을 확인하기 위하여, 상기 지방줄기세포를 골세포(도 6a), 연골세포(도 6b) 또는 지방세포(도 6c)로 분화시킨 결과, 모든 세포로 분화될 수 있음을 확인하였으므로, 상기 미세담체를 이용하여 수득한 세포는 지방줄기세포임을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 미세담체를 사용하여 지방줄기세포를 분리하는 방법을 사용할 경우, 종래의 방법에 비하여 지방조직을 적출하는 과정을 수행하지 않고서도 보다 효과적으로 지방줄기세포를 분리할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 방법을 이용하면, 지방조직으로부터 지방전구세포를 높은 순도로 분리할 수 있으므로, 지방줄기세포를 이용한 다양한 연구에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에서 제공하는 지방줄기세포에 대한 결합 친화도가 우수한 미세담체를 사용하여 지방조직으로부터 지방줄기세포를 분리하는 방법의 흐름을 나타내는 개략도이다.
도 2는 본 발명에서 제공하는 거대공극이 형성된 구형의 미세담체의 형상을 나타내는 전자현미경 사진(A 및 B) 및 이의 직경을 측정한 결과를 나타내는 그래프(C)이다.
도 3은 지방조직 세포가 결합된 미세담체를 다양한 염료를 사용하여 염색한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 Oil Red O로 염색된 미세담체를 나타내고, B는 A의 확대도이며, C는 Alexa Fluor 488 phalloidin으로 염색된 미세담체를 나타내고, D는 DAPI로 염색된 미세담체를 나타낸다.
도 4는 랫트의 지방조직에 이식된 미세담체를 배양하면서, 시간의 경과(A: 1일, B: 3일, C: 7일 및 D: 12일)에 따른 지방줄기세포의 이동수준을 비교한 결과를 나타내는 현미경사진이다.
도 5는 T75 플라스크에서 1일(A) 또는 7일(B) 동안 배양된 지방줄기세포 및 T150 플라스크에서 1일(C) 또는 7일(D) 동안 배양된 지방줄기세포를 나타내는 현미경사진 및 상기 60mm 배양용기에서 12일 동안 배양된 지방줄기세포, T75 플라스크에서 7일 동안 배양된 지방줄기세포 및 T150 플라스크에서 배양된 지방줄기세포의 수를 비교한 결과를 나타내는 그래프(E)이다.
도 6의 A는 T150 플라스크에서 배양된 세포를 대상으로 비멘틴 항체를 이용한 면역염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6의 B는 T150 플라스크에서 배양된 지방줄기세포를 대상으로 DAPI 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6의 C는 CD11b에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 6의 D는 CD29에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 6의 E는 CD44H에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 6의 F는 CD45에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 7a는 본 발명에서 제공하는 미세담체를 이용하여 배양된 지방줄기세포를 골세포로 분화유도한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 7b는 본 발명에서 제공하는 미세담체를 이용하여 배양된 지방줄기세포를 연골세포로 분화유도한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 7c는 본 발명에서 제공하는 미세담체를 이용하여 배양된 지방줄기세포를 지방세포로 분화유도한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 거대공극이 형성된 구형의 미세담체의 제작

PCL(Poly(e-caprolactone), Mw = 80 000)을 사용하여 구형의 미세담체를 제작하였다.

구체적으로, 클로로포름에 PCL을 가하여 수득한 5중량%의 PCL을 포함하는 용액과, 20%(w/v)의 캠펜(camphene)을 포함하는 용액을 각각 수득하고, 상기 수득한 각 용액을 혼합한 다음, 4시간 동안 교반하면서 반응시켜서, 반응액을 수득하였다. 상기 수득한 반응액을 2중량%의 PVA(polyvinyl alcohol)를 포함하는 물에 점적하여, 거대공극이 형성된 구형의 미세담체를 제조하였다. 이때, 상기 물은 4℃를 유지하면서 430rpm으로 교반하였고, 점적된 상기 PCL 용액의 부피가 물의 부피의 30%(v/v)가 될 때까지 반응을 수행하였다. 상기 미세담체를 생성시킨 후, 6시간 동안 추가로 교반하여 생성된 미세담체의 강도를 증가시켰다. 끝으로, 상기 반응물로부터 액상성분을 제거하고, 미세담체를 냉온의 증류수로 5회 이상 세척하였으며, 여과지(Millipore filter paper)를 사용하여 여과한 후, 동결건조시켜서, 거대공극이 형성된 구형의 미세담체를 제작하였으며, 제작된 상기 미세담체는 4℃에서 보관하였다.

한편, 상기 제작된 거대공극이 형성된 구형의 미세담체의 형상을 확인하기 위하여, 15-20kV의 전압조건하에서 SEM으로 확인하고, 상기 미세담체의 직경을 측정하였다(도 2).

도 2는 본 발명에서 제공하는 거대공극이 형성된 구형의 미세담체의 형상을 나타내는 전자현미경 사진(A 및 B) 및 이의 직경을 측정한 결과를 나타내는 그래프(C)이다. 도 2에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 미세담체는 전체적으로 구형이고, 내부에 거대공극이 형성되었으며, 200 내지 650㎛의 직경을 나타내고, 평균직경은 454㎛임을 확인하였다. 또한, 큰 공극(~100 ㎛)과 상기 큰 공극사이의 작은 공극(~50 ㎛)이 미세구체에 생성되었는데, 이는 세포의 침습 및 성장에 적합한 공극구조인 것으로 분석되었다.

실시예 2: 미세담체를 이용한 지방줄기세포의 배양

실시예 2-1: 미세담체의 이식 및 회수

웅성 스프라그-다울리 랫트에 케타민(80 mg/kg; Ketara®, Yuhan Corp., Seoul, Korea)과 자일라진(10 mg/kg; Rompun®, Bayer Korea, Ltd., Seoul, Korea)을 처리하여 마취시키고, 마취된 랫트의 등을 절개하여 지방조직에 미세담체를 이식할 수 있는 2개 부위의 공간(좌측공간 및 우측공간)을 형성하였으며, 상기 형성된 각 공간에 상기 실시예 1에서 제작된 미세담체를 이식하고 절개부위를 봉합하였다. 7일 동안 사육한 다음, 상기 각각의 봉합된 부위를 다시 절개하여 미세담체를 회수하였다. 상기 회수된 각 미세담체에는 랫트의 지방조직 세포의 일부가 결합되었음을 확인하였다.

실시예 2-2: 지방줄기세포의 확인

상기 실시예 2-1에서 회수된 각 미세담체에 결합된 지방조직 세포에 지방줄기세포가 포함되어 있는지를 확인하기 위하여, 상기 지방조직 세포가 결합된 미세담체에 4% 포르말린을 가하여 세포를 고정시키고, 0.2% Triton X-100을 처리하여 각 세포의 세포벽을 천공한 다음, 중성지방에 특이적으로 염색되는 Oil Red O(0.3% in isopropanol; Sigma), Alexa Fluor 488 phalloidin (A12379; Invitrogen) 및 DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole) 염색을 수행하였다(도 3).

도 3은 지방조직 세포가 결합된 미세담체를 다양한 염료를 사용하여 염색한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 Oil Red O로 염색된 미세담체를 나타내고, B는 A의 확대도이며, C는 Alexa Fluor 488 phalloidin으로 염색된 미세담체를 나타내고, D는 DAPI로 염색된 미세담체를 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 상기 미세담체에 결합된 세포에는 지방성분이 다량으로 포함되고(A 및 B), 상기 결합된 세포에는 세포질(C)과 핵(D)이 존재하므로, 상기 미세담체에 결합된 세포는 지방세포임을 알 수 있었다.

실시예 2-3: 미세담체에 결합된 세포의 배양

상기 실시예 2-1에서 회수된 미세담체를 60mm 배양용기에 접종하고, 10% FBS 및 페니실린(100 U/㎖)/스트렙토마이신(100 ㎍/㎖)을 포함하는 DMEM 배지를 가한 다음, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 12일 동안 배양한 다음, 1, 3, 7 및 12일째에 역상현미경으로, 배양물을 관찰하여, 지방줄기세포의 이동여부를 확인하였다(도 4).

도 4는 랫트의 지방조직에 이식된 미세담체를 배양하면서, 시간의 경과에 따른 지방줄기세포의 이동수준을 비교한 결과를 나타내는 현미경사진이다. 도 4에서 보듯이, 배양시간이 경과할 수록 미세담체로부터 배양용기로 이동하는 지방줄기세포의 수준이 증가함을 확인하였다.

상기 60MM 배양용기에서 상기 지방줄기세포를 배양하고, 13일이 되는 시점에서 상기 배양된 세포에 트립신을 처리하여 세포를 분리하였으며, 분리된 세포를 T75 플라스크에 접종하고, 동일한 배지를 가한 다음, 80 내지 90%의 포화도에 이르도록 7일 동안 배양하였다. 상기 T75 플라스크에서 지방줄기세포를 배양하고 8일이 되는 시점에서 상기 배양된 세포에 트립신을 처리하여 세포를 분리하였으며, 분리된 세포를 T150 플라스크에 접종하고, 동일한 배지를 가한 다음, 다시 7일 동안 배양하였다. 이어, 상기 T75 플라스크에서 1일 또는 7일 동안 배양된 지방줄기세포 및 T150 플라스크에서 1일 또는 7일 동안 배양된 지방줄기세포를 DP-72 디지털 카메라가 장착된 Olympus IX 71 역상현미경을 사용하여 촬영하였다. 또한, 상기 60mm 배양용기에서 12일 동안 배양된 지방줄기세포, T75 플라스크에서 7일 동안 배양된 지방줄기세포 및 T150 플라스크에서 배양된 지방줄기세포를 계수하고 비교하였다(도 5). 이때, 상기 지방줄기세포의 세포수는, 상기 세포를 포함하는 균일한 현탁액에 동일부피의 trypan blue 염료를 가하고, 상기 염료에 의해 염색된 생존세포의 수를 헤모사이토메터에 포함된 4개의 1 × 1 ㎟ 격자를 사용하여 계수한 다음, 이의 평균값을 산출함으로써 측정하였다.

도 5는 T75 플라스크에서 1일(A) 또는 7일(B) 동안 배양된 지방줄기세포 및 T150 플라스크에서 1일(C) 또는 7일(D) 동안 배양된 지방줄기세포를 나타내는 현미경사진 및 상기 60mm 배양용기에서 12일 동안 배양된 지방줄기세포, T75 플라스크에서 7일 동안 배양된 지방줄기세포 및 T150 플라스크에서 배양된 지방줄기세포의 수를 비교한 결과를 나타내는 그래프(E)이다. 도 5에서 보듯이, 2개 부위의 공간에서 유래된 줄기세포간의 차이는 유의하지 않았고, 배양시간의 경과에 따라, 지방줄기세포의 수가 현저하게 증가함을 알 수 있었다.

실시예 3: 미세담체를 이용하여 배양된 지방줄기세포의 특성분석

실시예 3-1: 지방줄기세포 마커 분석

상기 실시예 2-3에서 배양된 지방줄기세포의 마커를 비멘틴(vimentin)을 이용한 면역형광염색과 유세포분석을 통해 분석하였다.

먼저, 비멘틴을 이용한 면역형광염색은, T150 플라스크에서 배양된 1 × 10⁴ 세포수의 지방줄기세포에 1 ㎖의 4% 포르말린을 가하여 고정시키고, 이에 0.1% Triton X-100을 5분동안 처리하여 고정된 지방줄기세포의 세포막을 천공하였다. 이어, 상기 천공된 세포에 비멘틴 항체를 가하여 암조건, 실온 및 2시간의 조건으로 1차 반응을 수행한 다음, FITC(fluorescein isothiocynate)가 결합된 2차 항체용액을 가하고, 암조건, 실온 및 30분의 조건으로 2차 반응을 수행하였다. 또한, 핵은 0.5 mg/㎖의 DAPI를 사용하여 염색하였다. 상기 염색된 지방줄기세포를 DP-72 디지털 카메라가 장착된 Olympus IX 71 역상현미경에 적용하여 형광사진을 촬영하였다(도 6의 A 및 B).

도 6의 A는 T150 플라스크에서 배양된 세포를 대상으로 비멘틴 항체를 이용한 면역염색을 수행한 결과를 나타내고, 도 6의 B는 T150 플라스크에서 배양된 지방줄기세포를 대상으로 DAPI 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 6의 A 및 B에서 보듯이, T150 플라스크에서 배양된 세포는 지방줄기세포임을 확인할 수 있었다.

다음으로, 상기 지방줄기세포를 1 × 10⁶ 세포수/㎖의 농도로 포함하는 현탁액을 수득하고, 지방줄기세포의 표면항체를 분석하기 위하여, CD11b, CD29, CD44H 또는 CD45에 대한 항체를 1 ㎍/㎖의 농도로 가한 다음, 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 세포에 FITC가 결합된 2차 항체를 가하여 다시 반응시켜서, FITC로 표지된 지방줄기세포를 수득하고, 이를 유세포분석기(FACS Calibur: Becton Dickinson)에 적용하여 측정데이터를 수득하고, 이를 Cell Quest software (Becton Dickinson)에 적용하여 분석하였다(도 6의 C 내지 F).

도 6의 C는 CD11b에 대한 유세포 분석결과를 나타내고, 도 6의 D는 CD29에 대한 유세포 분석결과를 나타내며, 도 6의 E는 CD44H에 대한 유세포 분석결과를 나타내고, 도 6의 F는 CD45에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다. 도 7의 C 내지 F에서 보듯이, 상기 배양된 세포는 CD29 및 CD44H에 대하여는 강한 양성반응을 나타낸 반면, CD11b 및 CD45에 대하여는 음성반응을 나타내었으므로, 상기 배양된 세포가 지방줄기세포임을 확인하였다.

실시예 3-2: 골세포 분화능 분석

상기 실시예 2-3에서 배양된 지방줄기세포를 24웰 플레이트에 웰당 20,000 세포수의 농도로 접종하고, 골세포 분화유도배지(10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 nM 덱사메타손, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 50 ㎍ L-아스코르브산을 포함하는 α-MEM 배지)를 가하여, 1주일에 2회씩 배지를 교체하면서 3주동안 배양하여 상기 줄기세포로부터 골세포의 분화를 유도하였다. 배양이 종료된 세포를 4% 포르말린으로 고정시키고, 1% Alizarin Red S 용액을 가하고 30분 동안 반응시킨 다음, 적색으로 염색된 석회화 영역을 역상 현미경으로 촬영하였다(도 7a).

도 7a는 본 발명에서 제공하는 미세담체를 이용하여 배양된 지방줄기세포를 골세포로 분화유도한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 7a에서 보듯이, 상기 미세담체를 사용하여 배양된 지방줄기세포는 골세포로 분화될 수 있음을 확인하였다.

실시예 3-3: 연골세포 분화능 분석

상기 실시예 2-3에서 배양된 지방줄기세포를 24웰 플레이트에 웰당 20,000 세포수의 농도로 접종하고, 연골세포 분화유도배지(10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 nM 덱사메타손, 1% ITS(insulin-transferrin-selenium) 및 50 ㎍ L-아스코르브산을 포함하는 α-MEM 배지)를 가하여, 1주일에 2회씩 배지를 교체하면서 3주동안 배양하여 상기 줄기세포로부터 연골세포의 분화를 유도하였다. 배양이 종료된 세포를 4% 포르말린으로 고정시키고, Alcian Blue 용액을 가하고 30분 동안 반응시킨 다음, 청색으로 염색된 세포외 글리코사미노글리칸을 역상 현미경으로 촬영하였다(도 7b).

도 7b는 본 발명에서 제공하는 미세담체를 이용하여 배양된 지방줄기세포를 연골세포로 분화유도한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 7b에서 보듯이, 상기 미세담체를 사용하여 배양된 지방줄기세포는 연골세포로 분화될 수 있음을 확인하였다.

실시예 3-4: 지방세포 분화능 분석

상기 실시예 2-3에서 배양된 지방줄기세포를 24웰 플레이트에 웰당 20,000 세포수의 농도로 접종하고, 지방세포 분화유도배지(10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 μM 덱사메타손, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴, 100 μM 인도메타신 및 1% ITS를 포함하는 DMEM 배지)를 가하여 72시간 동안 배양한 다음, 지방세포 유지배지(10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 1% ITS를 포함하는 DMEM 배지)를 가하고 24시간 동안 배양하여, 상기 줄기세포로부터 지방세포의 분화를 유도하였다. 배양이 종료된 세포를 4% 포르말린으로 고정시키고, Oil Red O 용액을 가하고 50분 동안 반응시킨 다음, 적색으로 염색된 지방구를 역상 현미경으로 촬영하였다(도 7c).

도 7c는 본 발명에서 제공하는 미세담체를 이용하여 배양된 지방줄기세포를 지방세포로 분화유도한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 7c에서 보듯이, 상기 미세담체를 사용하여 배양된 지방줄기세포는 지방세포로 분화될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

지방줄기세포에 대한 결합친화성을 갖는 PCL(Poly(e-caprolactone)) 재질의 미세담체를 포함하는 지방조직으로부터의 지방줄기세포 분리용 조성물로서,
상기 미세담체는 직경 50 내지 100㎛의 공극이 형성된 구형 입자인 것인, 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 미세담체는 200 내지 650㎛의 직경을 갖는 것인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미세담체는 (a) PCL(Poly(e-caprolactone))과 공극형성 물질을 비극성 용매에 용해시켜서 용해물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 용해물을 극성용매에 점적하면서 교반하여, 고형화시키는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제작된 것인 조성물.
제4항에 있어서,
상기 공극형성 물질은 캠펜(camphene)인 것인 조성물.
제4항에 있어서,
상기 비극성 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 아세톤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 용매인 것인 조성물.
제4항에 있어서,
상기 극성용매는 물인 것인 조성물.
제4항에 있어서,
고형화된 미세담체를 0 내지 15℃의 물에 5 내지 20시간 동안 침지하고 교반하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 지방조직으로부터의 지방줄기세포 분리용 키트.
(a) 지방줄기세포에 대한 결합친화성을 갖는 PCL(Poly(e-caprolactone)) 재질의 미세담체를 지방조직에 주입하고 배양하는 단계; 및,
(b) 상기 지방조직으로부터 미세담체를 회수하고, 회수된 미세담체를 배양하는 단계를 포함하는, 지방줄기세포 분리방법으로서,
상기 미세담체는 직경 50 내지 100㎛의 공극이 형성된 구형 입자인 것인, 지방줄기세포 분리방법.
제10항에 있어서,
(a) 단계의 배양은 4 내지 10일 동안 수행하는 것인 방법
제10항에 있어서,
(b) 단계의 배양은 30 내지 40℃에서 7 내지 15일 동안 수행하는 것인 방법.
제10항에 있어서,
(b) 단계에서 배양된 지방줄기세포를 회수하고, 이를 계대배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서,
상기 계대배양은 30 내지 40℃에서 5 내지 15일 동안 수행하는 것인 방법.