KR20150104663A

KR20150104663A - 비올라세인을 생산하는 마실리아 속 신규 미생물 ｅｐ１５２２４

Info

Publication number: KR20150104663A
Application number: KR1020140025955A
Authority: KR
Inventors: 윤상홍; 이창묵; 권순우; 구본성; 백희진
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2014-03-05
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2015-09-16
Also published as: KR101602772B1

Abstract

본 발명은 비올라세인을 생산하는 기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 신규 미생물 EP15224에 관한 것으로, 구체적으로 비올라세인을 생산하는 마실리아(Massillia)속 신규 미생물인 EP15224를 이용하여 비올라세인을 효율적으로 생산하는 배양 조건을 확립하였으므로 생물소재로 유용하게 이용할 수 있을 것이다.

Description

비올라세인을 생산하는 마실리아 속 신규 미생물 ＥＰ１５２２４{Novel microorganism EP15224 producing violacein}

본 발명은 비올라세인을 생산하는 마실리아(Massillia) 속 신규 미생물인 EP15224 균주 및 이를 이용하여 비올라세인을 생산하는 효율적인 방법에 관한 것이다.

비올라세인은 1881년 아마존강에서 처음 발견된 Chromobacterium violaceum에 의해 생산된 청보라 색소 물질로 그 이후 수많은 산업적 가치가 있는 생리활성이 최근까지도 보고되고 있다.

그람양성균과 곰팡이에 대한 항균활성, 항 원생생물(anti-protozoan), 항-말라리아, 항암활성, 항-바이러스, 항 선충, 항-산화성, 항-설사, 진통제, 면역조절능 등과 같은 다양한 의약적 기능이 보고되고 있으며 천연 및 합성 직물의 청, 보라색 염색제, 또한 항산화성과 항균성 및 천연보라색소의 특성으로 인해 친환경적 화장품 성분으로 응용 가능하며(립스틱, 눈 화장 등), 이 외에도 식품의 기능성첨가제, 심지어 친환경적 장난감 제조 산업, 식물의 다양한 곰팡이 병이나 선충으로부터의 피해도 방제할 수 있는 농업적 응용이 타진되고 있다.

상기에서 언급한 바와 같이 비올라세인의 산업적가치가 높아짐에 따라 이를 생산하는 미생물에 대한 관심도 점증하고 있으며 현재 Chromobacterium , Collimonas, Duganella , Iodobacter , Janthinobacterium , Microbulbifer , Pseudoaltermonas 속에서 비올라세인을 생산하는 종이 다수 보고되어 있다. 따라서 비올라세인의 생산 증대를 위한 새로운 균주 개발 및 생산방법에 대한 특허가 이 분야에서 경쟁적으로 이루어지고 있다.

이에, 본 발명자들은 비올라세인을 생산하는 마실리아(Massilia sp .) 속 신규 균주인 EP15224을 선발하였고, 이 균주가 기존의 비올라세인 생산 미생물과는 전혀 다른 신종 미생물로써 비올라세인의 생산능이 매우 뛰어남을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 하기 화학식 1로 기재되는 비올라세인(violacein)을 생산하는 하는 마실리아(Massilia sp .) 속 균주 EP15224을 제공하는 것이다.

[화학식 1]

본 발명의 다른 목적은 기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 마실리아(Massilia sp.)속 EP15224 균주를 트립토판(tryptophane)을 첨가한 배지에 배양하여 상기 화학식 1로 기재되는 비올라세인을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 하기 화학식 1로 기재되는 비올라세인(violacein)을 생산하는 하는 마실리아(Massilia sp.)속 균주 EP15224을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 마실리아(Massilia sp.)속 EP15224 균주를 트립토판(tryptophane)을 첨가한 MM2 합성 배지에 배양하여 상기 화학식 1로 기재되는 비올라세인(violacein)을 생산하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 마실리아(Massilia sp.)속 EP15224 균주를 트립토판(tryptophane)을 첨가한 SBT-I 합성 배지에 배양하여 상기 화학식 1로 기재되는 비올라세인(violacein)을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 마실리아 EP15224 균주는 비올라세인을 생산하는 지금까지 보고된바 없는 신규한 균주이며, 상기 균주를 이용하여 보라색 색소물질인 비올라세인을 효율적으로 생산하는 배지조성 및 배양 조건을 확립함으로써 의약, 화장품, 식품, 농업 분야의 새로운 생물소재로 다양하게 응용될 수 있다.

도 1은 비올라세인(보라색소)을 생산하는 저영양세균 균주 EP15224의 배양 온도별 보라색 색소 생산을 보여주는 도이다: 비올라세인 정량을 위해 배양액 기준 4배의 메탄올로 희석, 추출한 액을 585nm 흡광도로 표시.
도 2는 마실리아(Massilia sp.) EP15224 균주의 여러 가지 배지 성분조성과 함량에 따라 비올라세인 생산능 조사결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비올라세인을 생산하는 마실리아 EP15224 균주의 다른 마실리아 종 및 이와 가까운 비올라세인 생산 종간의 근연 계통 분석도를 나타낸 도이다.
도 4는 마실리아(Massilia sp.) EP15224 균주와 비올라세인 생산 균으로 처음 보고된 (2011년) 마실리아속의 BS-1균주간의 16S rDNA 염기서열의 상동성 비교 분석 도이다.
도 5는 마실리아(Massilia sp.) EP15224 배양액에서 추출 후 분리된 보라색 색소의 LC/MS/MS 스펙트라 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 하기 화학식 1로 기재되는 비올라세인(violacein)을 생산하는 하는 마실리아(Massilia sp.)속 균주 EP15224을 제공한다.

상기 MM2 합성 배지는 글루코즈(Glucose), 암모늄설페이트((NH₄)2SO₄), Na₂HPO₄·7H₂O, KH₂PO₄ 및 MgSO₄·7H₂O를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

상기 SBT-I 배지는 녹말, 육추출물(beef extract), KNO₃,(NH₄)₂FeSO₄, K₂HPO₄및MgSO₄·7H₂O를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

< 실시예 1> 비올라세인 보라색 색소 생산균주 EP15224 선발

한국의 삼림 토양에서 분리한 800여 주의 저 영양미생물 자원으로부터 R2A 고체배지(Difco사) 상에서 보라색 집락을 형성하는 EP15224 균주를 육안으로 우선 선발 분리하였다.

< 실시예 2> 비올라세인 보라색 색소 생산 균주 EP15224 의 최적 생산 배지 및 배양조건 조사

본 발명자는 EP15224 균주가 플라스크 배양 수준에서 경제적으로 보라색의 색소물질인 비올라세인을 잘 생산할 수 있는 최적의 배지 조성 및 배양 조건을 조사하였다.

구체적으로, 배양조건 설정을 위해 2 종류의 기본 배지를 선택하여 균 접종량, 온도, 진탕 속도 등에 따라 때 가장 효과적인 생산조건을 분석하였다. 2 종류의 기본배지는 SBT 기본배지(SBT-I: 리터당 수용성 녹말(soluble starch) 0.2g, 육추출물(beef extract) 1g, KNO₃ 1g, (NH4)₂FeSO₄ 0.1g, K₂HPO₄ 0.25g, MgSO₄ _·7H₂O 0.75g, 트립토판 0.74g; pH 6.8)와 MM2 합성 기본배지(MM2-B: 리터당 글루코즈 2g, 암모늄설페이트 1g, Na₂HPO₄·7H₂O 4g, KH₂PO₄ 2g, MgSO₄·7H₂O 0.1g, 트립토판 0.74g; pH 6.8)이다. 이들 기본 액체배지에 주요 배지 성분의 함량을 달리하여 최적 조건(접종량 10%, 배양온도 25℃, 진탕속도 250rpm)으로 3일간 배양하면서 주기적으로 배양액을 채취하여 비올라세인을 정량하여 가장 경제적인 생산의 최적 조건을 조사하였다(표 1). 비올라세인의 정량은 배양액을 1 ㎖ 취하고 메탄올 3 ㎖을 부가하여 30분간 진탕시키고 원심분리하여 그 상층을 585 nm로 정량하였다(OD_585nm = 0.12일 때 2.1 ㎍/㎖으로 추정 계산; J. Appl. Microbiol. 2007, 102: 992-999). 그리고 이 균주의 색소 생산능에 대한 최적온도를 조사하였다.

그 결과, 25℃ ~ 28℃에 걸쳐 비교적 우수한 생산능을 보이나 그 중 25℃가 가장 우수하였다(도 1). 특히 균의 접종량도 중요한 요인 중 하나인데 1% 보다는 10%로 접종하면 배양기간을 1% 접종보다 크게 단축할 수 있음은 물론, 생산량도 현저히 높았다.

또한, 상기 표 1의 배지 조성에 따라 비올라세인 생산량을 3일간 경시적으로 조사한 결과를 도 2에 나타내었다. 본 발명의 균주는 다양한 배지 조성에서도 SBT-I와 MM2-I 배지가 가장 우수하며 이들은 보라색소인 비올라세인을 리터당 최대 280 mg까지 생산하였다. 특히, SBT-I 배지는 2일, MM2-I 배지는 3일에서 최대량을 생산하였다. 그러나 배지 구성분의 함량을 시약기준으로 대략 원가를 계산하면 MM2-I 배지가 SBT-I 배지보다 60% 저렴한 것으로 추정된다.

따라서, 본 발명의 균주가 비올라세인을 최대로 생산하기 위해서는 MM2-I 합성 배지(리터당 글루코즈 2g, 암모늄설페이트 2g, Na₂HPO₄·7H₂O 2g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄·7H₂O 0.1g, 트립토판 0.2g; pH 7.0)와 SBT-I배지(리터당 용해성 녹말 2g, beef extract 1g, KNO₃ 1g, (NH₄)₂FeSO₄ 0.1g, K₂HPO₄ 0.25g, MgSO₄·7H₂O 0.75g, 트립토판 0.74g; pH 7.0)를 사용한다. 배양을 위해서는 삼각플라스크 양의 1/5수준으로 상기의 액체 배지를 넣은 뒤 R2A 배지에 하룻밤 배양된 EP15224 균주를 10%(v/v)로 접종하여 25℃에서 진탕속도 250 rpm으로 2-3일간 배양하였을 때 가장 생산성이 높았다. 본 발명의 EP15224 균주는 삼각플라스크 배양 수준에서도 비올라세인 생산성이 리터 당 약 280 mg으로 기존 보고된 비올라세인 생산 우수 균주들과 비교해도 전혀 손색이 없다.

< 실시예 3> 비올라세인 보라색 색소 생산 균주의 분자생물학적 동정 및 16S rDNA 에 의한 근연 관계 분석

본 발명에서 선발된 EP14224 균주를 동정하기 위해 분자생물학적 방법과 생

화학적 분석을 병행하여 실시하였다.

구체적으로, 우선 분자생물학적 분류, 동정을 위해 선발 균주의 총 DNA를 분리하였으며, 이로부터 16S rDNA 유전자를 증폭하기 위하여 fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3': 서열번호 1) 및 rP2(5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3': 서열번호 2) 프라이머를 이용하여(Zhu et al. 1993, Nucleic Acids Res 21: 5279-5280) 94℃에서 5분간 변성시킨 뒤 94℃에서 1분, 30℃에서 1분 30초, 72℃에서 2분간, 34 사이클로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭산물 중 1.5 ~ 1.6 kb에 해당하는 단편을 0.8% 아가로즈겔, 0.5×TAE 버퍼에서 100V로 30분간 전기영동 후 EtBr(ethidium bromide)용액에서 15분간 염색하여 UV 램프에서 확인하고 Qiagen PCR Purification Kit(Qiagen Inc.)로 정제하였다. 분리된 DNA는 사용자 설명서에 따라 PCR 2.1 Topo TA Vector system(Invitrogen)에 서브클로닝(subcloning)하였다. 염기서열 분석은 ABI 3700(Perkin Elmer, Co.) 기기를 이용하였는데, 준비된 클론(clone)을 주형벡터(template vector) 내부에 포함된 M13 정방향(5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3': 서열번호 3) 및 M13 역방향 프라이머(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3': 서열번호 4)를 제작한 뒤, Big Dye 2 ㎕, 5x 완충액 1 ㎕, 프라이머(1.6 pmol/㎕) 1 ㎕, 주형 (250~500 ng) 6㎕를 PCR 튜브에 넣고 혼합한 후 PCR (ABI9700)하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분간 정치 후, 96℃ 10초간 변성(denaturation), 50℃ 5초간 어닐링(annealing), 60℃ 4분간 연장(extension)하는 조건으로 25 사이클을 수행하고, 72℃에서 10분간 추가 연장 후, 4℃에 보관하였다. 상기 반응물 중 10 ㎕를 1.5 EP 튜브에 옮기고 3M 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 7.6) 1 ㎕와 얼음냉각 한 100% 에탄올 25 ㎕를 넣고 얼음에 20분간 방치 후, 13,000 rpm에서 15분 원심분리하여 DNA를 침전시켰다. 상등액을 버리고 70% 냉 에탄올 100 ㎕로 두 번 세척한 후 상온에서 건조시켰다. 이후 TSR(template suppression reagent) 20 ~ 25 ㎕로 재현탁하여 95℃에서 2분간 반응시키고 얼음에서 식힌 뒤, 자동염기서열분석을 수행하였다. 염기서열의 상동성은 DDBJ/NCBI/GenBank DB의 Blast 프로그램을 이용하여 비교하였으며, 각 염기서열의 alignment는 DNA Plus version 3.0 sequence alignment 프로그램 (Scientific and Educational Software)을 이용하여 병렬로 정렬하였고, MEGA version 3.0의 근린결합법(Saitou et al. 1987 Mol Biol Evol 4: 406-425)에 의거하여 본 발명 균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다(도 3). 상기 내용을 종합하면 본 발명의 균주는 마실리아 속이지만 이전에 보고된 마실리아의 다른 종과는 뚜렷이 구분된다. 특히 2011년 일본 아키다 국립 기술대 응용화학과 히루아끼 츄야 박사팀(Biosci. Biotechnol. Biochem. 75:2008-2010)이 비마실리아 속에서 비올라세인 생산을 처음 보고한 BS-1 균주의 16S rDNA 염기서열 비교분석시 도 4에 나타난 바와 같이 97%의 상동성만 보이고 계통 수(Phylogenetic tree)상 뚜렷이 구분되고 있음을 확인할 수 있으므로 이와도 별개인 새로운 신종임이 확실하다. 따라서 이를 국립농업과학원 농용미생물보존센터(KACC)에 2013년 11월 2일자로 기탁하고 기탁번호 KACC91872P를 부여받았다.

< 실시예 4> 비올라세인의 분리 및 동정

마실리아 EP15224 균주를 상기에서 기술한 보라색소 생산 200 ml 액체배지(1리터 삼각플라스크)에 25℃, 300 r.p.m으로 2일간 진탕 배양한 뒤 원심분리하여 (8,000g, 10분) 배양액을 버리고 남은 보라색 균체에 200 ml 메탄올을 첨가하여 진탕 혼합하고 균체에서 보라색이 빠져 나올때까지 울트라소니케이션(ultrasonication) 처리하였다. 메탄올 추출액은 다시 원심분리하여(8,000g, 10분) 메탄올 추출액을 진공감압 농축하여 메탄올 20 ml로 최종 용해하여 실리카겔 칼럼(직경 25 mm × 길이 500 mm)에 로딩하고 메탄올로 용출시켜 보라색소물질이 용출되는 분획만을 모아 다시 진공 감압한 뒤 5 ml의 메탄올로 농축하여 이를 Water사의 LC/MS/MS로 분석하였다.

그 결과, positive MS 분석 스펙트라이기 때문에 분자량이 343.34인 비올라세인이 344.1029의 (m/z)에 확인되었으므로 이 보라색소물질이 비올라세인임을 동정하였다(도 5).

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91872P

20131108

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> Novel microorganism EP15224 producing violacein <130> P131631 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fD1 primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rP2 primer <400> 2 ggctaccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 forward primer <400> 3 gttttcccag tcacgac 17 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 reverse primer <400> 4 caggaaacag ctatga 16

Claims

기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 하기 화학식 1로 기재되는 비올라세인(violacein)을 생산하는 하는 마실리아(Massilia sp.)속 균주 EP15224:
[화학식 1]

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기탁번호 KACC91872P로 수탁된, 마실리아(Massilia sp.)속 EP15224 균주를 트립토판(tryptophane)을 첨가한 배지에 배양하여 하기 화학식 1로 기재되는 비올라세인(violacein)을 생산하는 방법:

[화학식 1]

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제 2항에 있어서, 상기 배지는 MM2 합성 배지인 것을 특징으로 하는 비올라세인을 생산하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 MM2 합성 배지는 글루코즈(Glucose), 암모늄설페이트((NH₄)2SO₄), Na₂HPO₄·7H₂O, KH₂PO₄ 및 MgSO₄·7H₂O를 포함하는 것을 특징으로 하는 비올라세인을 생산하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 배지는 SBT-I 배지인 것을 특징으로 하는 비올라세인을 생산하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 SBT-I 배지는 녹말, 육추출물(beef extract), KNO₃,(NH₄)₂FeSO₄,K₂HPO₄ 및MgSO₄·7H₂O를 포함하는 것을 특징으로 하는 비올라세인을 생산하는 방법.