KR20150099202A - 장수진흙버섯 자실체로부터 분리된 폴리페놀성분을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

장수진흙버섯 자실체 추출물로부터 분획된 분획물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 조성물은 인플루엔자 바이러스 표면에 존재하면서 바이러스 복제에 필수적인 기능을 하는 뉴라미니데이즈의 활성을 억제함으로써 인플루엔자 바이러스가 호흡기관 내 다른 세포로 확산되는 것을 차단하기 때문에 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있다.

Description

장수진흙버섯 자실체로부터 분리된 폴리페놀성분을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 및 치료용 조성물{[Composition comprising polyphenols from the fruiting bodies of Phellinus baumii for preventing or treating of influenza virus infection}

본 발명은 장수진흙버섯(Phellinus baumii) 자실체 용매 추출물로부터 분리된 인플루엔자 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인플루엔자 바이러스 뉴라미니데이즈 활성 억제 효과 및 MDCK 세포에서 바이러스에 의해 유도되는 CPE reduction을 억제하는 활성을 갖는 장수진흙버섯 (Phellinus baumii) 자실체 용매 추출물로부터 분리된 유효성분을 함유하는 장수진흙버섯 자실체로부터 분리된 폴리페놀성분을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 기도에 침입하여 바이러스 감염증을 일으키는 호흡기 질환으로 한기, 두통, 고열, 관절통, 근육통 및 비색, 콧물 등 호흡기 증세를 유발하는 것으로 알려져 있다(Hien, T. T. et al. N. Eng. J. Med., 350, 1179, 2004). 이런, 인플루엔자 바이러스는 크게 A, B, C의 3가지 형이 있으며 유행적으로 확산되는 형은 A, B형이다. 특히 A형 바이러스는 사람에게 주로 감염되며 B, C형에 비하여 돼지, 기타 포유류 및 다양한 야생조류에서 감염이 확인되고 있는 바이러스이다. 최근, 전 세계적으로 문제가 되고 있는 조류 인플루엔자(Avian influenza), 돼지 인플루엔자(Swine influenza) 및 신종플루(Novel flu) 등은 모두 A형 바이러스에 속한다.

인플루엔자 바이러스 표면에는 헤마글루티닌(hemagglutinin: HA)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase: NA)라는 표면 단백질이 존재하며, 이들의 종류에 따라 여러 종류의 바이러스가 존재한다. 이들 중 헤마글루티닌(hemagglutinin)은 숙주세포의 표면에 있는 말단 시알산 잔기와 결합하여 바이러스를 부착시키고 순차적으로 바이러스가 숙주세포로 침투할 수 있게 하며, 다른 단백질인 뉴라미니데이즈(neuraminidase)는 감염된 세포내에서 복제 및 증식된 바이러스가 세포표면의 올리고사카라이드 부분과 말단 뉴라민산(neuraminic acid) 잔기를 연결해주는 알파-케토사이딕 본드(ketosidic bond)를 절단하여 바이러스를 숙주세포 밖으로 배출하여 호흡기 점막세포로 침투하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Chandrasekaran, A. et al. Nature biotechnology 26, 107, 2008; Mark, V. I. Nature review 6, 967, 2007; Huberman, K. et al. Virology 214, 294, 1995). 따라서 바이러스 질병을 치료하기 위해서는 유전자의 전사 및 복제 저해, 단백질 합성 저해 등의 방법 이외에도 상피세포와의 흡착/침입 저해(헤마글루티닌 저해 활성) 및 세포로부터 방출의 억제(뉴라미니데이즈 활성 저해) 등을 생각할 수 있으며, 이들 각각은 항바이러스의 표적이 되고 있다.

현재 조류 및 돼지 인플루엔자, 신종플루의 유일한 치료제는 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 선택적인 저해물질로 개발된 경구용 치료제인 타미플루(oseltamivir phosphate)와 흡입형인 리렌자(zanamivir) 등이다. 그러나 경구용 치료제로 사용하고 있는 타미플루의 경우 오심, 구토, 신경계나 정신계의 이상 등의 부작용을 가지고 있으며, 경구용 치료제로 사용되고 있는 타미플루에 대한 내성 바이러스가 발병할 경우를 대비하여야 한다. 최근에 이미 신종플루의 확산에 치명적인 타미플루에 대한 내성 바이러스의 출현이 보고되고 있으며, 타미플루 내성 바이러스의 인간 대 인간 전염조차도 발견되고 있다. 이와 같이 현재까지 개발된 항바이러스 제들은 심한 부작용을 나타내고 있으며 그 응용에 대한 많은 주의가 필요한 실정이다. 또한, 백신의 개발은 유행하는 바이러스의 형과 백신의 바이러스가 맞지 않으면 효과가 낮은 문제점이 있기 때문에 감염 억제 효과가 뛰어나고 안정성이 우수한 새로운 인플루엔자 바이러스제의 개발의 필요성이 증가하고 있다.

장수진흙버섯(Phellinus baumii)은 뽕나무, 느릅나무, 사시나무, 오리나무 등의 활엽수의 심재부에 자생하는 버섯으로 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae)의 진흙버섯속(Phellinus Ouel. Em.lmaz)에 속하는 백색부후 균이다. 진흙버섯은 옛날부터 자궁출혈, 월경불순 등의 부인병치료제로 사용되어 왔으며 최근에는 높은 항암 효과 때문에 각광을 받고 있다. 진흙버섯은 위암, 식도암, 십이지장암, 결장암, 직장암을 비롯한 간암 수술 후 화학요법을 병행할 때 면역기능을 활성화하는 것으로 알려져 있으며, 진흙버섯의 효능이 다당류 베타-글루칸(polysaccharide β-glucan)에 의한 것으로 밝혀진 이후 다당류에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다(한국특허출원 제 2001-0003264, 한국특허출원 제1998-0015617, 한국특허등록 제 10-0174433, 한국특허출원 제 2000-0054319호). 베타-글루칸은 인체의 면역력을 높임으로써 몸 안에 침입한 세균이나 이물질을 격퇴하고, 감염되어도 발병을 억제시키는 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 이외에도 진흙버섯 및 그 추출물을 이용한 의약품 및 건강식품들에 대한 많은 연구들이 국내외적으로 이루어지고 있으나, 장수진흙버섯의 추출물로부터 유효한 화합물을 분리하고,이를 통한 인플루엔자 활성 억제 효과 등을 연구한 기술은 개시되고 있지 못한 진흙이다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 다양한 생물 종에 존재하는 뉴라미니데이즈의 활성을 억제하여 그와 관계되는 질환의 예방 및 치료에 이용할 수 있는 장수진흙버섯 용매 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화학식 1-5의 폴리페놀 화합물을 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물 및 이를 이용한 억제방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 장수진흙버섯 자실체 추출물로부터 분획된 분획물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물은, 장수진흙버섯 자실체의 메탄올 또는 에탄올 추출물로부터 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올에 의하여 분획된 분획물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명은 또한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 제공한다.

[화학식 2]

본 발명은 하기 화학식 3로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 제공한다.

[화학식 3]

본 발명은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 제공한다.

[화학식 4]

본 발명은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 제공한다.

[화학식 5]

본 발명의 일 실시예에서, 상기 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물은, 장수진흙버섯(Phellinus baumii) 자실체 추출물로부터 분리된 것이다.

본 발명은 또한 상술한 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 또는 폐렴이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 독감은 조류독감, 돼지독감 또는 신종 플루이며, 상기 뉴라미니데이즈는 H5N1 인플루엔자 바이러스에서 유래한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 뉴라미니데이즈는 H3N2 인플루엔자 바이러스에서 유래한 것이다.

본 발명은, 장수진흙버섯 용매 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화합물 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 인플루엔자 바이러스 표면에 존재하면서 바이러스 복제에 필수적인 기능을 하는 뉴라미니데이즈의 활성을 억제함으로써 인플루엔자 바이러스가 호흡기관 내 다른 세포로 확산되는 것을 차단하기 때문에 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있다.

도 1은 장수진흙버섯 용매 추출물 및 분획물의 뉴라미니데이즈 효소 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 2은 장수진흙버섯 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제된 화학식 1 내지 2 화합물의 H1N1 뉴라미니데이즈 효소 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 장수진흙버섯 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제된 화학식 1 내지 5의 H5N1 및 H3N2 뉴라미니데이즈 효소 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 4은 장수진흙버섯 에틸아세테이트 분획물로부터 분리 정제된 화학식 1 내지 5의 MDCK 세포 주에서의 인플루엔자 바이러스 A 억제능과 세포독성능을 나타낸 도이다.
도 5은 장수진흙버섯 에틸아세테이트 분획물로부터 화학식 1 내지 5의 MDCK 세포 주에서의 인플루엔자 바이러스 A 억제능과 세포독성능에 대한 현미경 사진을 나타낸 도이다.

본 발명과 본 발명의 동작상의 이점 및 본 발명의 실시에 의하여 달성되는 목적을 충분히 이해하기 위해서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 첨부 도면 및 첨부 도면에 기재된 내용을 참조하여야만 한다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명함으로서, 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 설명하는 실시예에 한정되는 것이 아니다. 그리고, 본 발명을 명확하게 설명하기 위하여 설명과 관계없는 부분은 생략되며, 도면의 동일한 참조부호는 동일한 부재임을 나타낸다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 포함한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라, 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 상술한 기술적 필요성을 해결하고자, 장수진흙버섯의 자실체로부터 추출된 후 분획된 물질을 제공하며, 특히 하기 상기 분획된 분획물 중 하기의 화학식 1 내지 5의 화합물 및 이러한 구조를 포함하는 폴리페놀 화합물이 뉴라미니데이즈 활성 억제에 효과적이며, 이로써 인플루엔자 바이러스가 호흡기관 내 다른 세포로 확산되는 것을 차단하기 때문에 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용으로 사용될 수 있는 점을 발견하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4}

[화학식 5}

더 나아가, 본 발명에 따른 상기 화학식 1-5의 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물 및 용매화물이 포함된다.

염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼 화성유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 화학식 1-5로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1-5의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명에 따른 상기 화학식 1-5 중 어느 하나로 표시되는 화합물은 장수진흙버섯 (Phellinus baumii) 자실체로부터 추출 분리된 것으로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1-5 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 장수진흙버섯 자실체로부터 분리하여 사용하는 경우, 상기 화합물을 분리하기 위한 방법은 하기와 같이 수행될 수 있다.

진흙버섯은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 또는 탄소수 5 내지 10의 지방족 탄화수소 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 감압 농축하여 용매 추출물을 얻는다. 상기 사용되는 용매로는 바람직하게 메탄올, 에탄올, 아세톤, 프로판올, 에틸아세테이트 등이 적합하다.

장수진흙버섯 추출물을 얻는 단계는 건조된 진흙버섯을 음건 세절하여 추출용기에 넣고 적당한 양의 알코올을 첨가하고, 이를 상온에서 7일 동안 방치한 후 거름종이 등으로 여과하여 수행될 수 있다. 이러한 추출 과정은 수회 반복될 수 있으며, 이후에 농축 또는 동결건조 등의 방법이 추가적으로 수행될 수 있다.

상기 단계에서 얻은 진흙버섯 추출물에 물을 가하여 현탁 시키고, 헥산, 클로로포름 및 에틸아세테이트를 사용하여 순차적으로 분획하여 진흙버섯 분획물을 얻는다. 이때, 통상의 분별 추출 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 분별 깔때기를 사용할 수 있다. 진흙버섯 분획물은 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물로 얻을 수 있다.

본 발명이 특징으로 하는 진흙버섯으로부터 활성물질을 분리하기 위해서는 자실체 메탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 등의 유기용매에 의하여 추출, 물의 분배, 칼럼 크로마토그래피 등 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수 있다.

본 발명에서는 진흙버섯 자실체를 사용한다. 본 발명에 따른 장수진흙버섯 용매 추출물로부터 화합물 1-5의 분리 및 정제방법은 구체적으로 다음과 같다.

상기 장수진흙버섯 에틸아세테이트 분획물은 메탄올을 사용하여 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피를 수행하고 다시 70% 메탄올 수용액으로 Sephadex LH-20칼럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 얻은 후, 활성분획은 0.04% trifluoroacetic acid가 들어있는 60% 메탄올을 사용하여 semi-prep. HPLC를 행하여 상기 화학식 1-5의 히스피딘(hispidin), 하이폴로민 B(hypholomine B), 이노스카빈 A(inoscavin A), 다발리아락톤(davallialactone) 및 펠리그리딘 D(phelligridin D)를 분리한다.

본 발명의 뉴라미니데이즈 효소 활성을 억제함으로써 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 장수진흙버섯 자실체로부터 분리된 화학식 1-5 를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형 화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제 화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1-5 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인플루엔자 바이러스 표면에 존재하면서 바이러스 복제에 필수적인 기능을 하는 뉴라미니데이즈의 활성을 억제함으로써 인플루엔자 바이러스가 호흡기관 내 다른 세포로 확산되는 것을 차단하기 때문에 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 상기 인플루엔자 바이러스는 A, B, C형 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 H1N1, H5N1 또는 H3N2 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 또한, 상기 인플루엔자 바이러스는 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴을 일으킬 수 있으며, 특히 조류독감, 돼지독감 또는 신종플루를 야기할 수 있다.

본 발명의 뉴라미니데이즈의 활성을 억제에 의해 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료 유도되는 질환의 예방 및 치료용 조성물은 사람 및 동물용 식료품, 제약학상 제품, 수의학용 제품, 개인위생 제품 및 가정용품을 포함하는 다양한 제품에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 조성물은 식료품으로 사용할 수 있으며, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예: 장수진흙버섯 자실체 용매 추출물로부터 화학식 1-5의 분리정제

1. 장수진흙버섯 용매추출물 제조

장수진흙버섯(Phellinus baumii) 자실체는 메탄올을 추출 용매로 상온에서 7일간 추출하였다. 이를 상온에서 7일 동안 방치한 후 거름종이 등으로 여과, 농축하여 추출물을 얻었다. 상기 추출물은 물에 희석한 후 동량의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 추출하고 감압 농축하여 각각의 용매 분획물을 얻었다.

2. 화학식 1 내지 5 화합물의 분리정제 및 구조 동정

상기 1에서 얻은 진흙버섯 에틸아세테이트 분획물을, 메탄올을 사용하여 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 1차 활성 분획물 1과 2를 얻었다. 이후 1차 활성 분획물 1과 2를, 70% 메탄올 수용액으로 Sephadex LH-20 칼럼 크로마토그래피 실시하여 제 2차 활성 분획물을 얻은 후, 상기 제 2 차 활성분획물을 0.04% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)이 들어있는 60% 메탄올을 사용하여 semi-prep. HPLC를 행하여 상기 화학식 1 내지 5의 순수한 화합물을 얻었다.

실험예 1: 장수진흙버섯 용매 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화학식 1-5의 H1N1 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 저해활성 측정

H1N1 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성을 측정하기 위하여, 1918년 스페인 독감으로부터 분리된 바이러스(A/Bervig_Mission/1/18)의 재조합 뉴라미니데이즈인 rvH1N1 인플루엔자 A바이러스의 뉴라미니데이즈 (R&D system, 4858)를 사용하였고 기질은 4-Methylumbelliferyl--D-N-acetylneuraminic acid (SIGMA M8639)를 사용하였다. 진흙버섯 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화학식 1-5의 화합물은 MeOH에 녹여 각각 10 L씩 첨가하고, 기질 최종농도 200 M을 50 L 넣고, 5 mM CaCl₂와 200 mM NaCl이 첨가된 Tris 완충용액(pH 7.5) 90 L와 혼합하였으며 효소원인 뉴라미니데이즈(효소 최종농도 50 ng/mL) 50 L를 첨가하여 반응시키고 형광분광기로 365 nm에서의 흡광과 445 nm에서의 발광을 측정함으로써 뉴라미니데이즈의 저해 활성을 측정하였다. 저해 활성(%)은 다음의 식으로 나타내었고, 50%의 저해율을 나타내는 농도를 IC₅₀으로 기술하였다.

저해활성(%) = ((control의 RFU 시료의 RFU) / controldml RFU) 100

control: 시료를 넣지 않은 실험군

본 발명의 장수진흙버섯 메탄올 추출물은 H1N1 뉴라미니데이즈 효소 활성을 50 g/mL 농도에서 76.1% 저해하는 효과를 나타냈으며, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물들은 뉴라미니데이즈 효소 활성을 50 g/mL 농도에서 각각 22.5, 49.3, 79.5 그리고 74.5% 저해하는 효과를 나타냈다(도 1).

또한, 본 발명의 장수진흙버섯 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화학식 1-5의 히스피딘(hispidin), 하이폴로민 B(hypholomine B), 이노스카빈 A(inoscavin A), 다발리아락톤(davallialactone) 및 펠리그리딘 D(phelligridin D) 화합물들은 H1N1 뉴라미니데이즈 효소 활성을 농도 의존적으로 감소하였으며, IC₅₀ 값은 각각 50.9 μM (1), 22.9 μM (2), 20.0 μM (3), 14.2 μM (4) 그리고 8.8 μM (5)로 측정되었다(도 2).

또한, 본 발명의 화학식 1-5의 히스피딘(hispidin), 하이폴로민 B(hypholomine B), 이노스카빈 A(inoscavin A), 다발리아락톤(davallialactone) 및 펠리그리딘 D(phelligridin D) 화합물들의 뉴라미니데이즈 효소에 대한 저해 경향을 실험한 결과, Ki 값은 각각 43.0 μM (1), 20.9 μM (2), 24.5 μM (3), 17.6 μM (4) 그리고 15.9 μM (5)로 측정되었으며, 비경쟁적으로 효소의 활성을 억제하는 것으로 확인되었다 (도 2).

실험예 2: 장수진흙버섯으로부터 분리된 화학식 1-5의 H3N2 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 저해활성 측정

rvH3N2 인플루엔자 A바이러스의 뉴라마니데이즈 (R&D system, 6875) 와 기질인 4-Methylumbelliferyl--D-N-acetylneuraminic acid (SIGMA M8639)를 사용하여 다른 유형의 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성을 측정하였다. 진흙버섯 및 이의 분획물을 MeOH에 녹여 각각 10L씩 첨가하고 기질은 최종농도 200 M을 50 L 넣고, 5 mM CaCl₂와 500 mM NaCl이 첨가된 25mM MES 완충용액(pH 6.5) 90 L와 혼합하였으며 효소원인 뉴라미니데이즈(효소 최종농도 50 ng/mL) 50 L를 첨가하여 반응시키고 형광분광기로 365 nm에서의 흡광과 445 nm에서의 발광을 측정함으로써 뉴라미니데이즈의 저해 활성을 측정하였다. 저해 활성(%)은 다음의 식으로 나타내었고, 50%의 저해율을 나타내는 농도를 IC₅₀으로 기술하였다.

저해활성(%) = ((control의 RFU 시료의 RFU) / controldml RFU) 100

control: 시료를 넣지 않은 실험군

본 발명의 장수진흙버섯 에틸아세테이◎ 분획물로부터 분리된 화학식 1-5의 히스피딘(hispidin), 하이폴로민 B(hypholomine B), 이노스카빈 A(inoscavin A), 다발리아락톤(davallialactone) 및 펠리그리딘 D(phelligridin D) 화합물들은 H3N2 뉴라미니데이즈 효소 활성을 농도 의존적으로 감소하였으며, IC₅₀ 값은 각각 45.2 μM (1), 14.6 μM (2), 18.5 μM (3), 21.1 μM (4) 그리고 10.3 μM (5)로 측정되었다(도 3).

실험예 3: 장수진흙버섯으로부터 분리된 화학식 1-5의 H5N1 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 저해활성 측정

rvH5N1 인플루엔자 A바이러스의 뉴라마니데이즈 (R&D system, 7597) 와 기질인 4-Methylumbelliferyl--D-N-acetylneuraminic acid (SIGMA M8639)를 사용하여 다른 유형의 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성을 측정하였다. 진흙버섯 및 이의 분획물을 MeOH에 녹여 각각 10L씩 첨가하고 기질은 최종농도 200 M을 50 L 넣고, 5 mM CaCl₂와 500 mM NaCl이 첨가된 50mM MES 완충용액(pH 6.5) 90 L와 혼합하였으며 효소원인 뉴라미니데이즈는 30 mM CaCl₂와 500 mM NaCl이 첨가된 50mM MES 완충용액(pH 6.5)으로 37, 24시간 동안 활성화시킨 후 사용하였다. 효소원인 뉴라미니데이즈(효소 최종농도 50 ng/mL) 50 L를 첨가하여 반응시키고 형광분광기로 365 nm에서의 흡광과 445 nm에서의 발광을 측정함으로써 뉴라미니데이즈의 저해 활성을 측정하였다. 저해 활성(%)은 다음의 식으로 나타내었고, 50%의 저해율을 나타내는 농도를 IC₅₀으로 기술하였다.

저해활성(%) = ((control의 RFU 시료의 RFU) / controldml RFU) 100

control: 시료를 넣지 않은 실험군

본 발명의 장수진흙버섯 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 화학식 1-5의 히스피딘(hispidin), 하이폴로민 B(hypholomine B), 이노스카빈 A(inoscavin A), 다발리아락톤(davallialactone) 및 펠리그리딘 D(phelligridin D) 화합물들은 H5N1 뉴라미니데이즈 효소 활성을 농도 의존적으로 감소하였으며, IC₅₀ 값은 각각 16.9 μM (1), 12.3 μM (2), 28.5 μM (3), 21.8 μM (4) 그리고 10.9 μM (5)로 측정되었다 (도 3).

실험예 4. 장수진흙버섯 용매 추출물로부터 분리된 화학식 1-5의 인플루엔자 바이러스에 대한 저해 효과 측정

1. 바이러스의 배양

본 실험에 사용된 인플루엔자바이러스는 인플루엔자바이러스 A 형(A/WS/33)를 대상으로 하였으며, 인플루엔자바이러스는 MDCK 세포에 감염시켜서 증식하였다. MDCK 세포는 10% FBS가 포함된 MEM 배지를 사용하여 37 배양기에서 배양하였으며 바이러스 증식배양 및 항바이러스능 측정에 사용된 배지는 혈청이 없는 배지에 트립신의 농도가 1 g/mL로 조정된 배양배지를 사용하였다.

2. 바이러스 억제 능과 세포독성능 분석

인플루엔자바이러스에 대한 바이러스 증식 억제 능을 측정하기 위해서, MDCK 세포를 210⁴ 개의 세포를 96 웰 플레이트(well plates) 의 각 웰에 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후에 각 웰의 배양 상등 액을 제거하고 인플루엔자바이러스 감염용액을 각 웰에 넣은 다음, 각 장수진흙 버섯 자실체로부터 분리된 화합물 1-5를 50 μg/mL의 농도 또는 0.1, 1, 10, 100 μL 의 농도가 되도록 각 웰에 투여하였다. 48-72 시간 후에 바이러스 감염반응을 중지시키고 각 추출물의 바이러스 증식 억제능 측정과 세포독성능 측정방법은 한국특허 출원 10-2004-0111298에 따라 실시하였다. 각 웰의 배양 상등 액을 제거하고 웰에 남아있는 세포를 70% 아세톤 용액 100 μL로 고정하고 SRB (sulforhodamine B) 용액 100 μL을 각 웰에 가하여 세포단백질을 염색시켰다. 세포단백질과 결합하지 않은 SRB 염색제를 세척하여 제거한 후 10 mM 트리스 용액(pH 10.5) 100 μL를 각 웰에 가하여 세포와 결합되어 있는 염색제를 용해시켜서 565 nm에서 ELISA reader로 각 웰의 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다.

각 처리군은 바이러스를 처리하지 않은 군(A), 추출물만을 처리한 군(B), 바이러스만을 처리한 군(C), 바이러스와 추출물을 같이 처리한 군(D)으로 표기하였고 각각 추출물 및 화합물의 비교세포성장률(%)과 화합물 1-3의 바이러스에 대한 증식 억제능을 감염 후 세포 생존율(%)으로 계산하였다. 결과에 대한 통계는 동일한 조건에서 수행한 3번의 실험결과 수치에 대한 평균값과 표준편차로 계산한 값을 제시하였다.

실험결과 본 발명의 화학식 1-5의 히스피딘(hispidin), 하이폴로민 B(hypholomine B), 이노스카빈 A(inoscavin A), 다발리아락톤(davallialactone) 및 펠리그리딘 D(phelligridin D) 화합물들은 농도 의존적으로 MDCK 세포에서 바이러스에 의한 CPE reduction 억제 효과를 나타냈으며, IC₅₀ 값은 각각 57.9 μM (1), 72.8 μM (2), 42.8 μM (3), 24.6 μM (4) 그리고 22.6 μM (5)로 측정되었다(도 3, 4).

제제예 1: 시럽제의 제조

장수진흙버섯 자실체 용매 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화학식 1-5의 항바이러스 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 2%(중량/부피) 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

장수진흙버섯 자실체 용매 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화학식 1-5의 항바이러스 화합물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 mL이 되게 하였다. 상기 부가 염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 : 2 g

사카린 : 0.8 g

당 : 25.4 g

글리세린 : 8.0 g

향미료 : 0.04 g

에탄올 : 4.0 g

소르브산 : 0.4 g

증류수 정량

제제예 2: 정제의 제조

장수진흙버섯 자실체 용매 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화학식 1-5의 항바이러스 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

유효성분 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 3: 주사액제의 제조

장수진흙버섯 자실체 용매 추출물, 분획물 및 그로부터 분리된 화학식 1-5의 항바이러스 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 주사액 제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

유효성분 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 mL을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 120에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 등록청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims (13)

1. 장수진흙버섯 자실체 추출물로부터 분획된 분획물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물은,
   장수진흙버섯 자실체의 메탄올 또는 에탄올 추출물로부터 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올에 의하여 분획된 분획물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징을 하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
   
3. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   
4. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
   [화학식 2]
   

   

   
   
5. 하기 화학식 3로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
   

   

   
   
6. 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
   

   

   
   
7. 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
   

   

   
   
8. 제 3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물은, 장수진흙버섯(Phellinus baumii) 자실체 추출물로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물.
9. 제 8항에 따른 뉴라미니데이즈 활성 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 인플루엔자 바이러스 감염으로 인한 질환은 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 또는 폐렴인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 독감은 조류독감, 돼지독감 또는 신종 플루인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물.
12. 제 9항에 있어서, 상기 뉴라미니데이즈는 H5N1 인플루엔자 바이러스에서 유래한 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물.
13. 제 9항에 있어서, 상기 뉴라미니데이즈는 H3N2 인플루엔자 바이러스에서 유래한 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물.

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