KR20150098446A - 선복화 추출물로부터 분리된 네페틴을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 선복화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증 또는 알러지 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화합물은 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO, PGE₂, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성을 억제하고 비만세포에서 분비되는 β-HEX, LTC₄ 및 COX-2 의존적인 PGD₂ 생성을 억제하며, 동물모델을 이용한 국소형 피부과민반응 실험에서 항히스타민 생성을 억제하는 항염 및 항알러지효과를 나타내므로 염증 또는 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물에 이용될 수 있다.

Description

선복화 추출물로부터 분리된 네페틴을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition comprising nepetin isolated from Inulae Flos extract having anti-inflammatory and anti-allergic activities}

본 발명은 선복화 추출물로부터 분리된 화합물인 네페틴(Nepetin)을 유효성분으로 포함하는 염증 및 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

대식세포(macrophages)는 미생물 및 바이러스 감염에 대한 특이적 및 비특이적 면역반응에 있어서 중요한 역할을 한다. 외부자극에 의하여 활성화된 대식세포는 NO(Nitric oxide), PGE₂(Prostaglandin E2), 그리고 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha), IL-1(Interleukin-1)과 IL-6(Interleukin-6)을 포함하는 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)과 같은 다양한 염증매개물질을 생성하여 방출한다(Ritchlin CT, et al., Mechanisms of TNF-alpha- and RANKL-mediated osteoclastogenesis and bone resorption in psoriatic arthritis. J Clin Invest, 2003, 111:821-31).

비만세포(mast cells)는 골수세포에서 유래되어 조직에서 성숙 분화된 후 항원-항체 및 각종 사이토카인 등에 의해 활성화되어 염증, 알러지반응에 관여한다(Puxeddu I, et al., Mast cells in allergy and beyond. Int J Biochem Cell B, 2003, 35:1601-1607). 활성화된 비만세포는 이미 만들어져 과립 내에 저장되어 있던 히스타민, 지질성 매개물질인 프로스타글란딘류(Prostaglandines) 및 류코트리엔류(Leukotriens)와 같은 에이코사노이드(Eicosanoids)를 생합성하여 알러지반응을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Prussin C, et al., IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117:S450-S456). 비만세포에서 분비되는 염증유발 매개물질들 중 히스타민은 즉시형 과민반응의 급성기에서 가장 강력한 혈관작용 매개물질(vasoactive mediator)이다(Cook EB et al, Mechanisms of antihistamines and mast cell stabilizers in ocular allergic inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2002, 1(2):167-180). PCA(Passive cutaneous anaphylaxis, 국소형 피부과민반응)는 IgE와 항원의 국부적 주입(local injection)에 의해 유도되는 국소적인 알러지 반응에서 즉시형 과민반응의 가장 중요한 동물모델 중 하나이다.

염증 및 알러지 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질인 프로스타글란딘류, 류코트리엔류, 혈소판활성화인자(Platelet activating factor, PAF) 등은 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂), 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다(Harizi H, et al., Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends Mol Med , 2008, 14(10):461-469).

류코트리엔은 생체에서 아라키돈산으로부터 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄(LTC₄), 류코트리엔 D₄(LTD₄) 및 류코트리엔 E₄(LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로 알려진 에폭사이드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환과 같은 폐동맥질환, 알러지성 비염, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염 등의 알러지 및 알러지반응, 관절염 또는 염증성 장질환, 통증, 아토피성 피부염 등의 염증반응에 관여하는 것으로 알려져 있다. 최근 알러지성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제 및 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다(Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy. Eur J Pharmacol, 2006, 533:40-56; Kitamura S, Leukotriene(B4, C4, D4, E4). Nippon Rinsho , 2005, Sl8:28-33).

프로스타글란딘류는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 cAMP(경우에 따라서는 cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. cAMP의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며, PGA₂와 PGB₂는 혈압을 강하시키고(Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta Physiol Lat Am 1981, 85-91; Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am J Physiol , 1994, 267:602-608), PGD₂와 PGE₁은 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다 (Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res , 1988, 449:281-293; Collins, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1). Neuroscience , 2002, 110:351-360).

국화과에 속하는 다년생인 금불초 (Inula japonica Thunberg)는 꽃만 약재로 삼아 선복화(Inulae Flos)라 불린다. 금불초 지상부에는 세스퀴테르페노이드 락톤(sesquiterpenoid lactone), 브리타닌(britanin) 및 이눌린(inulin)이 함유되어 있으며, 꽃인 선복화에는 퀘르세틴(quercetin), 이소퀘르세틴(isoquercetin), 카페인산(caffeic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid), 이눌린(inulin) 및 타락스테롤(taraxasterol) 등 다량의 스테롤(sterol) 성분이 함유된 것으로 알려져 있다(정보섭 및 신민교 저, 도해향약 (생약)대사전. 영림사, 1998, 1054-1056).

선복화 추출물에 대한 과학적인 연구결과로서는 항당뇨병 및 항천식 효능이 보고되어 있다(Shan JJ et al., Anti-diabetic and hypolipidemic effects of aqueous-extract from the flower of Inula japonica in alloxan-induced diabetic mice. Biol Pharm Bull 2006, 29:455-459; Choi JH et al., Flowers of Inula japonica attenuate inflammatory response. Immune Network 2010, 10(5):145-152).

또한 대한민국특허등록 제10-0999598호는 선복화 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증, 알러지 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 조성물을 개시하고 있고, 대한민국특허등록 제10-1150643호는 선복화 추출물로부터 분리된 화합물인 토만토신(Tomantosin), 브리타닌(Britanin), 퀘르세타게틴(Quercetagetin)을 유효성분으로 함유하는 염증 또는 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물을 개시하고 있다.

대한민국특허등록 제10-0999598호. 대한민국특허등록 제10-1150643호. 대한민국특허공개 제10-2013-0127090호.

Ritchlin CT, et al., Mechanisms of TNF-alpha- and RANKL-mediated osteoclastogenesis and bone resorption in psoriatic arthritis. J Clin Invest, 2003, 111:821-31. Puxeddu I, et al., Mast cells in allergy and beyond. Int J Biochem Cell B, 2003, 35:1601-1607. Prussin C, et al., IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117:S450-S456. Cook EB et al, Mechanisms of antihistamines and mast cell stabilizers in ocular allergic inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2002, 1(2):167-180. Harizi H, et al., Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends Mol Med, 2008, 14(10):461-469. Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy. Eur J Pharmacol, 2006, 533:40-56. Kitamura S, Leukotriene(B4, C4, D4, E4). Nippon Rinsho, 2005, Sl8:28-33. Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta Physiol Lat Am 1981, 85-91. Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am J Physiol, 1994, 267:602-608. Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res, 1988, 449:281-293. Collins, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1). Neuroscience, 2002, 110:351-360. Shan JJ et al., Anti-diabetic and hypolipidemic effects of aqueous-extract from the flower of Inula japonica in alloxan-induced diabetic mice. Biol Pharm Bull 2006, 29:455-459. Choi JH et al., Flowers of Inula japonica attenuate inflammatory response. Immune Network 2010, 10(5):145-152. 정보섭 및 신민교 저, 도해향약 (생약)대사전. 영림사, 1998, 1054-1056.

본 발명자들은 선복화 추출물로부터 분리된 화합물 네페틴(Nepetin)이 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO, PGE₂, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성과 비만세포에서 분비되는 β-HEX, LTC₄ 및 COX-2 의존적인 PGD₂ 생성을 억제하며, 동물모델을 이용한 국소형 피부과민반응 실험에서 항히스타민 생성을 억제하여 항염 및 항알러지 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 선복화 추출물로부터 분리된 네페틴(Nepetin)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물에서 네페틴은 조성물 총 중량 중 0.05 내지 50 중량%로 포함되는 것이 바람직하다

본 발명의 약학조성물은 급성 또는 만성 염증 질환, 만성 기관지염, 상기도염, 비염, 관절염, 염증성 장질환을 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료에 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학조성물은 천식, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염을 포함하는 알러지 질환의 예방 및 치료에 사용되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 선복화 추출물로부터 분리된 네페틴을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인 것이 바람직하다.

본 발명의 선복화로부터 분리된 화합물 네페틴은 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO, PGE₂, IL-1β 및 IL-6 사이토카인 생성을 억제하고 비만세포에서 분비되는 β-HEX, LTC₄ 및 COX-2 의존적인 PGD₂ 생성을 억제하며, 동물모델을 이용한 국소형 피부과민반응 실험에서 항히스타민 생성을 억제하는 항염 및 항알러지효과를 나타내므로 염증 및 알러지 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 선복화 추출물로부터 네페틴을 분리하는 분리과정을 나타낸 것이다.
도 2는 선복화 추출물로부터 분리된 화합물의 구조를 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 데이터와 비교하여 결정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 화합물의 MTS 어세이법에 의한 대식세포 생존율에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 화합물의 MTS 어세이법에 의한 비만세포 생존율에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 화합물의 NO 생성량에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 화합물의 PGE₂ 생성량에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 화합물의 IL-1β 생성량에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 화합물의 IL-6 생성량에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 화합물의 β-HEX 생성량에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 화합물의 LTC₄ 생성량에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 화합물의 PGD₂ 생성량에 대한 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 화합물의 국소형 피부과민반응에 대한 효과를 나타낸 그래프와 사진이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 선복화 추출물로부터 네페틴의 분리

네페틴을 분리하기 위한 원료로는 선복화 추출물을 사용한다.

세척 및 건조된 선복화에 극성추출용매를 건조된 선복화 중량의 1~5배, 바람직하게는 2~4배를 가하여, 5~100℃, 바람직하게는 20~90℃에서, 2~48시간, 바람직하게는 24시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출 또는 가열추출하며, 환류냉각추출하는 것이 보다 바람직하다. 추출 후 여과 및 감압 농축하여 선복화 조추출물을 얻는다. 이때 극성추출용매로는 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 또는 이들의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하다. 물과 에탄올의 혼합용매를 사용하는 것이 보다 바람직하며, 50 내지 80% 에탄올용액을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

상기 선복화 조추출물을 조추출물 중량에 대해 1~10배(v/w), 바람직하게는 2~5배(v/w) 부피의 물에 현탁시키고, 상기 현탁물 부피의 1~10배(v/v), 바람직하게는 2~5배(v/v) 부피의 헥산을 가하고 분획을 수행하여 헥산 가용분획물을 얻는다.

상기 분획과정에서 헥산 가용분획물을 분리하고 남은 수용성 분획물을 에틸아세테이트를 용매로 사용하여 상기와 동일한 방법으로 추출하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는다.

상기 에틸아세테이트 분획물을 크로마토그래피를 통해 소분획물로 분리한다. 이때 전개용매로는 헥산:에틸아세테이트:메탄올의 혼합용매를 사용하는 것이 바람직하며, 이들의 극성비를 변화시켜 전개용매의 극성을 순차적으로 올리면서 유출시켜 18개의 소분획물을 얻는다. 크로마토그래피는 순상 칼럼 크로마토그래피, 역상 칼럼 크로마토그래피, HPLC 등 당업계에서 공지된 방법을 사용할 수 있다.

상기 소분획물 중 10번째 소분획물을 크로마토그래피를 통해 분리하여 본 발명의 화합물 네페틴을 얻는다. 크로마토그래피는 당업계에서 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 분자체 칼럼 크로마토그래피를 이용하는 것이 바람직하며, 전개용매로는 메탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 분리된 화합물은 재결정 등의 추가 정제공정을 거칠 수 있다.

본 발명의 선복화로부터 분리된 네페틴의 화학구조는 다음과 같으며, 염증 및 알러지 질환에 대하여 우수한 효과를 나타낸다.

2. 네페틴을 함유하는 약학조성물

본 발명은 선복화 추출물로부터 분리된 네페틴을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제조한다.

본 발명에서의 염증 질환은 급성 또는 만성 염증 질환, 만성 기관지염, 상기도염, 비염, 관절염, 염증성 장질환 등을 포함한다. 또한, 알러지 질환은 천식, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염 등을 포함한다.

본 발명의 화합물을 함유하는 약학조성물은 조성물 총 중량 중 상기 추출 화합물을 0.05 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 함량을 조절할 수 있다.

본 발명의 화합물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방목적으로 장기간 복용을 하는 경우에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 경구투여용 고형제제, 경구투여용 액상제제, 비경구투여용 제제 등으로 제형화하여 사용할 수 있다. 제형화할 경우에는 통상 사용되는 담체, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 제형화에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.

경구투여용 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함된다. 경구투여용 고형제제는 본 발명의 네페틴에 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등의 부형제를 하나 이상 혼합하여 제조하며, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 등의 윤활제들도 사용될 수 있다.

경구투여용 액상제제에는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 포함된다. 경구투여용 액상제제에는 통상 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에도 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등의 여러 가지 부형제를 포함할 수 있다.

비경구투여용 제제에는 멸균수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 외용제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제나 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에, 경구, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사 등 다양한 경로와 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.01~1g/kg을 투여하는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 투여량을 1일 1회 투여할 수도 있고, 1일에 수회 나누어 투여할 수도 있다.

3. 네페틴을 함유하는 건강기능식품

본 발명은 선복화 추출물로부터 분리된 네페틴을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품으로는 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 포함되고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 제조할 수 있다.

상기 건강기능식품 중 네페틴은 건강식품 조성물 총 중량 중 0.1~1중량%로 함유되는 것이 바람직하며, 건강음료 조성물의 경우에는 조성물 100㎖를 기준으로 0.01~1g, 바람직하게는 0.03~1g의 비율로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 본 발명의 네페틴을 함유하는 것을 제외하고는 액체성분에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 슈크로스 등의 이당류, 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있다. 천연 탄수화물은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 1~20g으로 포함되는 것이 바람직하며, 5~12g 포함되는 것이 보다 바람직하다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물, 글리시르히진 등의 천연 향미제와 사카린, 아스파탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 통상 본 발명의 조성물 100중량부 당 0~20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나 이에 한정되지는 않는다.

[ 실시예 ]

이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것으로서, 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

네페틴의 분리

건조된 선복화{(주)휴먼허브 구입, www.humanherb.com} 1.2㎏에 4ℓ의 70% 에탄올(EtOH)을 가하여 약 60℃에서 24시간 동안 침지 추출하는 추출과정을 3일 반복하고, 얻어진 추출물을 여과지로 여과한 후 여액을 합하여 감압농축기(Vaccum rotary evaporator; VR-205C, Nihon Seiko Co. Japan)로 감압 농축하고, 동결건조기(Labconco, Kansas City, MO, USA)로 건조하여 건조상태의 에탄올 추출물 177.6g(수율:14.8%)을 얻었다.

상기 얻어진 에탄올 추출물 150g을 증류수 1.5ℓ에 용해시킨 후, 4.5ℓ의 헥산(n-Hexane)을 가하여 분획을 수행하여 헥산 가용 분획물 6.7g(수율:4.6%)을 얻었다. 남은 수용액에 6.5ℓ의 에틸아세테이트를 가하여 분획을 수행하여 에틸아세테이트(EtOAc) 가용 분획물 28g(수율:18.6%)을 얻었다.

수득한 에틸아세테이트 가용 분획물 15g을 순상 컬럼 크로마토그래피(normal phase column chromatography)로 분리하였다. 먼저 컬럼(50×500mm)에 실리카겔(No.7734, 70-230mesh, Merck, Darmstadt, Hessen, Germany)을 헥산-에틸아세테이트용매 3ℓ로 유출(elution)시켜 고정상(stationary phase)을 균일한 상태로 만든 후에 에틸아세테이트 분획물 15g을 실리카겔(Merck) 30g에 흡착시켜 컬럼에 적재(loading)하였다. 적재 후 전개용매인 헥산-에틸아세테이트, 에틸아세테이트-메탄올의 극성비를 변화시켜 전개용매의 극성을 순차적으로 올리면서 유출시켜 18개의 소분획물들(fraction; EF1~18)을 얻었다.

상기 분획 중 소분획(Subfraction) EF10을 분자체 컬럼(Molecular sieve column; 30×400mm, lipophilic sephadex-LH20, No.LH20100, 25-100㎛, Sigma)에서 전개용매로 메탄올 100%를 사용하여 화합물 네페틴 47mg을 얻었다. 그 과정을 도 1에 나타내었다.

분리된 화합물의 구조는 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 데이터와 비교하여 결정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

[ 실험예 ]

1. 실험재료

세포 배양액인 RPMI-1640, MEM 비필수 아미노산 용액(Modifed Eagle Medium non-essential amino acids solution), FBS(fetal bovine serum), 스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린(penicillin) 등의 세포배양용 시약들은 Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 SCF(Stem cell factor)는 STEMCELL사(Vancouver, Canada), LPS(Lipopolysaccharides)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA), IL-10(Recombinant Mouse IL-10)는 BD Pharmingen^TM사(San Jose, CA, USA)에서 구입하여 사용하였고, PGE₂, LTC₄ 및 PGD₂의 측정 키트는 Cayman사(Ann Arbor, MI, USA), IL 측정용 키트는 R&D System사(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.

2. 세포배양

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

쥐 골수 유래의 비만세포(BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)는 BALB/C 마우스의 대퇴골에서 골수세포를 분리하여, 10% FBS, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640 배지에 IL-3 공급원으로 PWM-SCM(containing pokeweed mitogen-stimulated spleen cell-conditioned medium)을 최종 농도 20%가 되도록 넣은 배양액으로 약 3주 정도 배양하여 90% 이상의 균질한 BMMC을 얻어 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였고, BMMC를 96-웰 플레이트(96-well plate)에 일정한 수의 세포를 분주하여 실험하였다.

< 실험예 1>

세포 생존수 측정( MTS assay )

상기 실시예 1에서 얻어진 네페틴의 시료의 MTS 어세이법에 의한 세포 생존율에 대한 효과를 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

2×10⁵ cells/㎖ 농도의 대식세포(RAW 264.7 cells)에 실시예 1에서 얻어진 네페틴을 6.25μM, 12.5μM, 25μM 및 50μM의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포에 MTS용액(Promega, WI, USA)을 처리하여 1시간 뒤 490nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다..

또한, 1×10⁶ cells/㎖ 농도의 비만세포(BMMC)에 실시예 1에서 얻어진 네페틴을 0.78μM, 1.56μM, 3.13μM 및 6.25μM의 농도로 처리하여 8시간 동안 배양한 후 세포에 MTS용액(Promega, WI, USA)을 처리하여 1시간 뒤 490nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3과 도 4의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 네페틴은 처리한 농도에서 세포에 독성을 나타내지 않았다.

< 실험예 2>

NO , PGE ₂ 및 전염증성 사이토카인 생성량 측정

상기 실시예 1에서 얻어진 네페틴의 NO, PGE₂ 및 전염증성 사이토카인(IL-1β와 IL-6) 생성량에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Yang JH et al., Anti-inflammatory activity of ethylacetate fraction of Cliona celata. Immunopharmacol Immunotoxicol 2011, 33(2):373-379).

RAW 264.7 세포(1.5×10⁵ cells/well)를 24-웰 플레이트(24-well plate)에 전 배양한 후 DMEM 배지로 교체하고 본 발명의 네페틴을 농도별로 1시간 동안 전 처리하였다. 그 다음 LPS 200ng/㎖을 각 웰에 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후 상층액을 수거하여 100㎕에 동량의 그리스(Griess) 시약(G4410, Sigma)을 섞어 반응시킨 후 ELISA 판독기(Sunrise-Basic Tecan, Tecan System, San Jose, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하고 아질산나트륨(sodium nitrite)의 농도별 표준곡선을 이용하여 NO의 생성량을 그래프로 나타내었다. 또한 수거한 상층액에서 ELISA 키트(R&D System, USA)를 이용하여 IL-1β와 IL-6 사이토카인을 측정하였다. 그 결과를 도 5 내지 8에 나타내었다.

도 5의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 네페틴은 6.3μM, 12.5μM, 25μM의 농도에서 아질산염(nitrite)의 생성량이 각각 8.4μM, 7.1μM, 3.7μM의 농도로 나타나 NO 생성을 저해하는 효과를 나타내었으며, NO 생성에 대한 IC₅₀는 15.8μM이었다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 네페틴은 3.1μM, 6.3μM, 12.5μM의 농도에서 PGE₂ 생성량이 각각 3786pg/㎖, 1172pg/㎖, 129pg/㎖로서 PGE₂ 생성은 네페틴에 의해 농도의존적으로 감소하였다.

또한 도 7과 도 8에 나타난 바와 같이, LPS를 처리한 세포 상층액에서는 IL-1β가 51pg/㎖, IL-6가 4751pg/㎖으로 생성량이 크게 증가된 반면, 본 발명의 네페틴을 6.3μM, 12.5μM, 25μM의 농도로 전처리한 세포 상층액의 경우, IL-1β의 생성량은 23pg/㎖, 11pg/㎖, 4pg/㎖, IL-6 생성량은 1708pg/㎖, 828pg/㎖, 197pg/㎖로 나타나 IL-1β 및 IL-6 사이토카인의 생성량은 네페틴에 의해 농도의존적으로 억제되었다.

< 실험예 3>

β- HEX ( Beta - hexaminidase ) 방출 억제 측정

상기 실시예 1에서 얻어진 네페틴의 BMMC의 탈과립 지표(marker)물질인 β-HEX 효소 활성 측정을 통해 탈과립의 정도를 확인하기 위하여, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다(Son JK et al, Ginkgetin, a Biflavone from Ginko biloba leaves, inhibits cyclooxygenases-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Biol Pharm Bull 2005, 28(12):2181-84).

2×10⁵ cells/well의 BMMC에 본 발명의 네페틴을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 30분 동안 전배양한 후에 KL(100ng/㎖)(c-kit ligand, STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 β-HEX 기질[100mM citrate buffer(citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/㎖ p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide]과 1:2(w/v)의 혼합비로 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후에 0.2M 글리신(glycine)(pH 10.7. Sigma)으로 반응을 정지시켜 ELISA 판독기(Tecan System)를 사용하여 405nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 분비율(release %)로 환산하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

본 발명의 네페틴은 0.03μM, 0.13μM, 0.63μM의 농도에서 β-HEX의 활성을 각각 10%, 58%, 77% 저해하였으며, β-HEX에 대한 IC₅₀는 0.14μM이었다.

< 실험예 4>

류코트리엔 ( Leukotriene , LT ) 생성량 측정

상기 실시예 1에서 얻어진 네페틴의 류코트리엔(Leukotriene, LT) 생성량에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3-buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2008, 31:617-621).

LT 생성을 확인하기 위해 1×10⁶ cells/㎖ BMMC에 시료를 농도 별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 1시간 동안 배양하고 SCF를 50ng/㎖ 농도로 15분간 자극하여 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리기(Centrifuge 5415R, Eppendorf)로 상층액을 분리하였다. 그 상층액 중 LTC₄ 함량을 LTC₄-EIA 키트(Cayman)를 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 알 수 있는 바와 같이, SCF에 의해 자극된 세포에서는 LTC₄의 생성량이 급격히 증가(63ng/㎖)하였다. 반면 본 발명의 네페틴을 전처리한 결과, 31nM, 63nM, 125nM 세 농도에서 LTC₄ 생성량이 각각 38ng/㎖, 19ng/㎖, 8ng/㎖로 농도 의존적으로 저해되었으며, LTC₄의 생성에 대한 IC₅₀는 40nM이었다.

< 실험예 5>

COX -2 의존적인 프로스타글란딘 PGD ₂ 생성 억제 측정

상기 실시예 1에서 얻어진 네페틴의 COX-2 의존적인 프로스타글란딘 PGD₂ 생성에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3-buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2008, 31:617-621).

COX-2 의존적인 PGD₂ 생성량을 측정하기 위하여, BMMC에 1mg/㎖ 아스피린(aspirin)을 2시간 처리하여 COX-1을 불활성화시킨 후에 1×10⁶ cells/㎖에 시료를 농도별로 1시간 동안 처리한 후 LPS, IL-10, SCF 세가지를 각각 100㎍/㎖, 100ng/㎖, 10ng/㎖ 농도로 처리하여 6시간 동안 배양하고, 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리기(Centrifuge 5415R, Eppendorf, Hauppauge, NY, USA)로 분리하여 상층액을 취하여 유리된 PGD₂를 PGD₂-MOX-EIA 키트(Cayman)를 이용하여 측정하였다.

실험 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, LPS, IL-10 및 SCF에 의해 자극된 세포에서는 PGD₂의 생성량이 급격히 증가(3742pg/㎖)하였으며, 본 발명의 네페틴으로 전처리한 결과, 0.78μM, 1.57μM, 3.13μM 세 농도에서 PGD₂ 생성량이 2376pg/㎖, 2224pg/㎖, 330pg/㎖로 농도 의존적으로 저해되었으며, PGD₂ 생성량에 대한 IC₅₀는 1.2μM이었다.

< 실험예 6>

국소형 피부과민반응( Passive cutaneous anaphylaxis , PCA )의 효능검증

상기 실시예 1에서 얻어진 네페틴의 국소형 피부과민반응에 대한 효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Lu Y et al., Inula japonica extract inhibits mast cell-mediated allergic reaction and mast cell activation. J Ethnopharmacol 2012, 143:151-157).

8주령 ICR 마우스 수컷을 사용하여 마우스 항-디니트로페닐{mouse anti-dinitrophenyl(DNP)} IgE(Sigma)를 20㎕(80ng)씩 양쪽 귀에 피내 주입(intra-dermal injection)한 후, 시료를 2.5mg/kg, 5mg/kg 및 10mg/kg의 농도로 24시간 후 경구 투여하였으며 1시간 후에 1% 에반스블루(Evans blue)(w/v)가 포함된 DNP-HSA(human serum albumin) IgE(Sigma) 200㎕(10mg in 1㎖ of PBS)를 꼬리정맥(tail vein)으로 정맥주입(intravenous injection)하여 유도 1시간 후에 희생시켜 마우스 양쪽 귀를 잘라내어 400㎕ 포름아미드(formamide)에 63℃에서 24시간 용해시킨 후 상층액을 96-웰 플레이트에 250㎕ 옮겨 ELISA 판독기(Tecan System)로 630nm에서 판독하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

에반스블루 분비량을 측정한 결과, 양성대조구(positive control, PC)인 IgE/DNP-HSA 투여군에서는 12.1㎍/㎖ 이었으나, 네페틴 2.5mg/kg, 5mg/kg, 10mg/kg 투여군에서는 각각 8.8㎍/㎖, 7.1㎍/㎖, 6.8㎍/㎖로 농도 의존적인 감소(27.3%, 41.3%, 43.8%)를 나타내었다. 대조 약물인 펙소페나딘(fexofenadine, fexo, Korea Pharma, Korea) 투여군(50mg/kg)에서는 4.2㎍/㎖의 분비량을 나타내었다.

Claims (6)

1. 선복화 추출물로부터 분리된 네페틴(Nepetin)을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 및 알러지 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 네페틴은 조성물 총 중량 중 0.05 내지 50 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 염증 질환은 급성 또는 만성 염증 질환, 만성 기관지염, 상기도염, 비염, 관절염, 염증성 장질환을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 알러지 질환은 천식, 접촉성 피부염, 알러지성 결막염, 아토피성 피부염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
5. 선복화 추출물로부터 분리된 네페틴을 유효성분으로 함유하는 염증 및 알러지 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
   

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