KR20150083195A

KR20150083195A - Cage 유래 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 또는 항암용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20150083195A
Application number: KR1020140002655A
Authority: KR
Inventors: 정두일; 김영미; 김현아
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2014-01-09
Publication date: 2015-07-17
Also published as: KR101641111B1

Abstract

본 발명은 CAGE 유래 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 또는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 CAGE 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하여 암세포의 항암제 내성을 감소시키거나 또는 항암 효과를 나타내는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 항암제에 내성을 갖는 암세포 또는 암조직의 항암제 내성을 효과적으로 감소시킬 수 있어 항암제를 사용한 치료 효과를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 그 자체로도 우수한 항암활성이 있어 새로운 항암제로 사용할 수 있다.
본 발명 약제학적 조성물의 유효성분인 올리고펩티드는 항체와는 달리 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내에 침투가 용이하다는 장점이 있으며, 암세포 또는 암조직에 선택적으로 작용할 수 있어 기존 항암제의 부작용 문제를 효과적으로 개선할 수 있을 것이라 판단된다.

Description

CAGE 유래 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 또는 항암용 약제학적 조성물{Compositions for overcoming anti-cancer drug-resistance or compositions for anti-cancer activity employing CAGE-derived peptides}

본 발명은 CAGE 유래 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 또는 항암용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 CAGE 유래의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하여 암세포의 항암제 내성을 감소시키거나 또는 항암 효과를 나타내는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

현재 암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과가 향상되고 있음에도 불구하고, 암은 아직도 우리나라 사망 원인 중 제1, 2위를 다투는 중요한 질환이다. 현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의한 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료의 문제점으로 지적되고 있다. 기존의 항암제는 암세포 뿐 아니라 정상조직에도 침투하여 정상세포의 기능 및 활성에 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장장애, 탈모증 등의 부작용을 유발하기도 하고 장기간 화학 요법에 따른 항암제에 대한 다약제 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점을 보인다. 따라서 기존 항암제의 이러한 심각한 문제점을 해결할 수 있는 혁신적인 항암제의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.

1990년대 암 환자들이 자신의 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있음(Lloyd et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 5658-5662)이 처음 보고된 이후 종양 특이적 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 사용하여 종양 항원을 암호화하는 몇 개의 유전자를 분리하였다(Van den Eynde, B. J. et al., 1997, Curr. Opin. Immunol., 9, 684-693). 또한 암 환자의 혈청을 이용하여 각종 암조직에서 제조된 재조합 cDNA expression library와의 반응을 통해 암환자에 존재하는 자가 항원들을 발굴하였으며 이를 TAA(tumor associated antigen)라 명명하였다. 이들 중 MAGE(Melanoma Associated Antigen), GAGE 및 BAGE 등을 포함하는 암/정소 항원은 정소 생식세포 이외의 정상조직에서는 발현되지 않고 각기 다른 조직 기원의 다양한 종양에서 발현되는 유전자에 의해 암호화되는 항원이다.

암/정소 항원은 현재 암 진단 표지 단백질 및 항암 면역백신 개발의 주요 연구 대상이다. 일례로, MAGE 과(family) 종양항원 중의 6개, 즉 MAGE-1, 2, 3, 4, 6 및 12가 흑색종, 폐암, 방광암, 난소암 및 유방암을 포함하는 일차 종양 및 전이 종양의 상당한 부분에 의해 선택적으로 발현되는 것으로 보고된 바 있다.

본 발명자에 의해 최초로 발견된 암/정소 항원 CAGE(cancer associated gene)는 위암 세포주들과 정소조직 등에서 제작된 cDNA expression library에 대해 SEREX(serologiacal analysis of recombiant cDNA library expression) 기법을 이용하여 위암 환자의 혈청에 특이적으로 존재하는 신규 암/정소 항원으로 발견되었다(Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726). 그리고 이 CAGE 유전자의 메틸화 여부 연구를 통해 CAGE 유전자 프로모터 CpG 섬(CpG island)의 DNA 탈메틸화(DNA demethylation) 정도와 CAGE 발현의 연관성이 밝혀진 바 있다(Cho B., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 52-63). 이는 CAGE 유전자의 메틸화 패턴 분석을 통해 새로운 암 진단법 개발 가능성을 시사한다.

CAGE와 관련된 연구 결과들을 살펴보면, CAGE 유전자의 과잉 발현이 세포 이동성을 증가시키며 ERK, p38 MAPK, FAK 등의 인산화가 CAGE에 의한 세포 이동성을 증가시키는 것으로 나타났고(Shim H., 2006, Mol Cells, 21, 367-375), 셀라스트롤(Celastrol) 기반 내성 쥐 흑색종 세포주에서 CAGE가 cFLIP(c-Flice inhibiory proein)과 snail 발현을 유도하여 세포 이동성 및 항암제에 대한 내성을 증가시키는 것으로 나타났으며(Kim Y., 2009, Biotechnol Lett., 31, 945-952), CAGE가 NF-kB / AP-1의 활성을 통하여 MMP-2의 발현을 유도하는 것으로 나타났고(Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763), 셀라스트롤 기반 항암제 내성 세포주(간암 SNU387^R, 흑색종 Malme3M^R)에서 CAGE가 HDAC2와 상호 작용을 통해 p53의 발현을 억제함으로써 항암제에 대한 내성을 부여하는 것으로 나타났으며(Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968), CAGE 단백질에서 유래된 펩티드들이 세포독성 T 림프구의 활성을 증가시켜 항암 활성을 보이는 것으로 나타났다(Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett . 28, 515-522).

한편, 본 발병자들은 앞서 특허출원을 통해 CAGE가 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase-3 beta) ser9 잔기 인산화와 이를 통해 Cyclin D1이 핵 내 축적됨에 따라 항암제 내성을 유발하는 것을 밝힌 바 있다(대한민국 공개특허 제10-2013-0030080호).

종양 세포의 특이적 종양 항원을 표적으로 하는 항체의 개발이 이루어지고 있으나, 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제점이 있다. 반면 펩티드의 경우 분자량이 작아 항체와는 다르게 면역반응 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 장점이 있을 것이라 판단되며, 종양 항원을 표적으로 하는 펩티드 기반 항암제는 종양에 선택적으로 작용할 수 있기 때문에 정상세포에 손상을 입히는 등의 부작용이 거의 없을 것이라 판단되었다.

본 발명자들은 종래의 여러 가지 연구를 통해 CAGE가 새로운 발암원으로 항암제에 대한 내성을 부여함을 보고하였고, 이러한 배경 하에 암/정소 항원 CAGE를 표적으로 하는 신규 항암 펩티드에 관한 연구를 수행하였다. 이의 결과, CAGE 단백질의 ATP 결합 영역에 해당하는 GTGKT(269-273) 기반 올리고펩티드가 항암제 내성 세포주에서 CAGE의 종양 생성력 및 항암제 내성을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0030080호

Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726. Cho B., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 52-63. Shim H., 2006, Mol Cells, 21, 367-375. Kim Y., 2009, Biotechnol Lett., 31, 945- 952. Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763. Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968. Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett. 28, 515-522.

본 발명의 주된 목적은 암세포에 특이적으로 작용하며 항암활성이 우수한 새로운 항암제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항암제에 대한 내성을 갖는 암세포의 항암제 내성을 감소시켜 항암제 치료 효과를 높일 수 있는 항암 치료 보조제를 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1(GTGKT)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드(oligopeptide)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2(GTGKA)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드(oligopeptide)를 유효성분으로 함유하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1(GTGKT)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2(GTGKA)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 올리고펩티드는 특히 피부암, 간암, 위암 세포 주에서 탁월한 항암 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 올리고펩티드는 특히 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포에서 우수한 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 따른 올리고펩티드는 CAGE 단백질에 결합하여 CAGE와 GSK3β의 상호 결합을 저해함으로써 암세포의 항암제에 대한 다약제 내성을 억제할 수 있다. CAGE(cancer associated gene)는 암/정소 항원으로 이의 아미노산 서열 및 유전자 염기서열 정보는 GenBank 데이터베이스 상에 AY039237.1로 등록되어 있다. GSK3β(Glycogen Synthase Kinase-3 beta)는 글리코겐 합성 키나아제 3 베타로 GeneCards 데이터베이스 상에 GCID: GC03M119540으로 등록되어 있다.

본 발명에 따른 올리고펩티드는 CAGE가 핵으로 이동하는 것을 억제하여 CAGE 단백질에 의한 Cyclin D1의 발현을 억제하는 것을 나타났다.

본 발명에 따른 올리고펩티드는 종양 특이적 펩티드로 정상조직이 아닌 CAGE 발현이 높은 종양조직으로의 특이적 침투가 우수하다.

본 발명에 따른 올리고펩티드는 CAGE에 의한 종양 생성력을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 올리고펩티드는 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.

본 발명의 올리고펩티드는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있을 것이다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있을 것이다.

그리고 본 발명의 약제학적 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 올리고펩티드를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조할 수 있을 것이다. 다만, 이때 담체가 상기와 같은 종류의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 본 발명의 올리고펩티드를 체중 1㎏ 당 약 1㎎ 정도를 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 항암제에 내성을 갖는 암세포 또는 암조직의 항암제 내성을 효과적으로 감소시킬 수 있어 항암제를 사용한 치료 효과를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 그 자체로도 우수한 항암활성이 있어 새로운 항암제로 사용할 수 있다.

본 발명 약제학적 조성물의 유효성분인 올리고펩티드는 항체와는 달리 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내에 침투가 용이하다는 장점이 있으며, 암세포 또는 암조직에 선택적으로 작용할 수 있어 기존 항암제의 부작용 문제를 효과적으로 개선할 수 있을 것이라 판단된다.

도 1의 A는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 간암 및 흑색종 피부암 세포주에 anti-sense CAGE(CAGE-AS clone)를 안정적으로 형질 주입하여 CAGE 발현을 억제할 경우 GSK3β Ser9 잔기의 인산화, Cyclin D1 Thr286 잔기의 탈인산화 및 cyclin D1 단백질 축적이 저해됨을 보여주는 결과이다.
도 1의 B는 면역 결핍 쥐에서 흑색종 피부암 세포주에서 CAGE 발현을 억제할 경우 종양생성력 및 택솔에 대한 항암제 내성이 저해됨을 보여주는 결과이다.
도 2는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 간암 및 흑색종 피부암 세포주에 의한 종양 크기가 CAGE siRNA에 의해 감소되는 것을 보여주며 그 조직으로부터 유전자 발현 양상을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 3의 A 좌측 패널(panel)은 GSK3β Ser9 잔기를 포함하는 펩티드 RTSSFAE 서열로 CAGE에 의한 GSK3β Ser9 잔기의 인산화를 확인하는 kinase assay의 기질로 사용한다. 우측 패널은 CAGE 단백질의 아미노산 서열 231 ~ 428번에 해당하는 DEADc 도메인 중 ATP 결합 부위를 포함하는 GTGKT 펩티드 서열을 나타낸다.
도 3의 B는 ATP 결합 부위 GTGKT 펩티드가 CAGE에 의한 GSK3β Ser9 잔기의 인산화를 특이적으로 저해하는 것을 보여주는 결과로, 좌측 패널은 GSK3β 특이적 펩티드 RTSSFAE를 기질로 하여 재조합 CAGE 단백질이 GSK3β Ser9 잔기를 인산화 한다는 것을 나타내는 kinase assay 결과이며, 우측 패널은 GTGKT가 재조합 CAGE 단백질에 의한 GSK3β Ser9 잔기 인산화를 저해함을 보여주는 결과이다.
도 4의 A는 택솔 기반 항암제 내성 흑색종 피부암 세포주에서 CAGE 기반 GTGKT 펩티드가 GSK3β Ser9 잔기의 인산화와 Cyclin D1 단백질의 축적 및 CAGE와 인산화된 GSK3β의 상호 결합을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 4의 B는 택솔 기반 항암제 내성 흑색종 피부암 세포주에서 GTGKT가 CAGE 단백질과의 결합을 통해 GSK3β Ser9 잔기의 인산화와 Cyclin D1 단백질의 축적 및 CAGE와 인산화된 GSK3β의 상호결합을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 4의 C는 CAGE 유래 GTGKT 펩티드 서열 중 특정 아미노산 잔기를 결실 또는 변이시킨 결과 273번 Thr 잔기를 Ala으로 치환시킨 GTGKA가 GTGKT와 동일한 효과를 보인다는 것을 나타내는 결과이다.
도 5의 A는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 암세포주에서 상기 도 4의 C와 동일한 양상을 보이는 결과이다.
도 5의 B는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 흑색종 암세포주에서 GTGKA의 항암 활성을 세포사멸 인자인 PARP, FAK의 cleavage로 확인한 결과이다.
도 6은 CAGE 유래 GTGKT 펩티드의 특정 아미노산 잔기 결실 및 변이를 유도한 펩티드들의 세포사멸 및 항암 활성 여부를 표로 정리한 것이다.
도 7의 A는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 암세포주에서 GTGKT가 항암제에 대한 내성을 억제함을 보여주는 MTT assay 결과이다.
도 7의 B는 재조합 CAGE 단백질이 GSK3β의 Ser9 잔기를 특이적으로 인산화 시키며 GTGKT가 이를 저해함을 보여주는 kinase assay 결과이다.
도 7의 C는 상기 도 7의 A의 결과를 세포 사멸 인자인 PARP와 FAK의 cleavage로 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 8의 A는 면역 결핍 쥐에서 GTGKT가 셀라스트롤 기반 항암제 내성 암세포주에 의한 종양 크기를 감소시킴을 보여주는 xenograft 결과이다.
도 8의 B는 상기 도 8의 A 실험을 마친 종양 조직으로부터 유전자 발현 양상을 보여주는 결과이다.
도 8의 C는 도 8의 A 실험을 마친 종양 조직으로부터 GTGKT가 CAGE와 인산화 된 GSK3β의 상호결합을 억제함을 보여주는 결과이다.
도 9의 A는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 암세포주에서 GTGKT 기반 펩티드가 항암제 내성에 미치는 영향을 보여주는 MTT assay 결과이다.
도 9의 B는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 암세포주에서 GTGKT 기반 펩티드가 GSK3β Ser9 잔기의 인산화와 Cyclin D1 단백질의 축적 및 CAGE와 인산화된 GSK3β의 상호결합에 미치는 영향을 보여주는 결과이다.
도 10의 A는 형광물질로 표지된 FITC-GTGKT를 셀라스트롤 기반 항암제 내성 세포 내로의 이동을 보여주는 결과이다.
도 10의 B는 FITC-GTGKT가 종양 조직 특이적으로 침투하는 것을 보여주는 결과이다.
도 10의 C는 셀라스트롤 기반 항암제 내성 흑색종 암세포주에서 GTGKT가 CAGE 단백질과 결합하는 것을 보여주는 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

< 암/정소 항원 CAGE의 종양 생성력 >

종양 생성력에 미치는 CAGE의 영향을 조사하고자 하였다.

이를 위해 anti-sense CAGE cDNA를 발현하는 간암 세포주(SNU387^R-AS CAGE)와 흑색종 세포주(Malme3M^R-AS CAGE)를 기지의 방법(Kim Y, Park D, Kim H, Choi M, Lee H, Lee YS, Choe J, Kim YM, Jeoung D., 2013, J. Biol. Chem., 288(51), 36502-18.)을 통해 확립하였으며, 이들 세포주와 면역 결핍 쥐를 이용하여 CAGE의 기능 및 종양 생성력에 미치는 영향을 조사하였다.

도 1의 A에서와 같이 anti-sense CAGE cDNA가 발현되어 CAGE 발현이 안정적으로 감소된 세포주들에서는 Cyclin D1의 발현이 감소하였고, Cyclin D1의 인산화(Thr286) 수준이 감소하였으며, GSK3β의 인산화(ser9) 수준이 감소하였다. 이상의 결과들로 볼 때 CAGE 발현 감소는 cyclin D1, GSK3β 등의 인산화 수준을 조절하여 cyclin D1의 발현 수준을 조절하는 것으로 보인다.

CAGE 발현이 안정적으로 감소된 흑색종 세포주(Malme3M^R-AS CAGE) 1×10⁶개를 누드마우스의 측 복부에 주사하고, 측정 가능할 정도로 종양이 자라면 일정 간격으로 디지털 측정기(digital gauge)를 사용하여 종양의 크기를 측정하였으며, 종양의 크기를 기지의 수식(가장 넓은 길이 × 가장 짧은 길이² × 0.5)을 이용하여 계산하였다. 동일한 방법으로 종양을 유도한 후 택솔(taxol)을 꼬리정맥 주사하여 종양 생성력 및 항암제 내성을 조사하였다. 이의 결과, 도 1의 B에서와 같이 CAGE의 발현 감소는 Malme3M^R 세포주에 의한 종양생성력을 감소시키고 택솔에 대한 민감성을 증가시키는 것으로 나타났다.

동일한 방법으로 각각의 암세포주를 주사하여 종양을 유도한 후 siCAGE(3㎍)(CAGE의 mRNA에 대한 siRNA)를 2주 동안 3일마다 총 4번 꼬리정맥으로 주사하였고, 이후 종양조직에서 단백질 발현을 확인하기 위하여 종양조직 적출 후 종래의 방법에 따라 조직을 액체질소로 분쇄하여 용해버퍼와 얼음에서 30분간 반응시킨 다음 13000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 단백질 샘플로 수거하였다. 이하 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현 및 활성화 양상을 확인하였다. 이의 결과는 도 2와 같다.

상기 실험결과를 통하여 CAGE가 과잉 발현된 내성 세포주에 의한 종양 형성 및 GSK3β Ser9 잔기의 인산화, Cyclin D1 Thr286 잔기의 탈 인산화를 통해 Cyclin D1의 단백질 축적이 CAGE에 의해 유도된다는 것을 확인하였다.

< GTGKT 기반 올리고펩티드의 CAGE 기능 억제 >

CAGE 유래 올리고펩티드가 CAGE의 GSK3β ser9 인산화 및 상호 결합에 미치는 영향을 확인하기 위해 GTGKT(서열번호 1) 펩티드 및 이를 기반으로 하는 특정 잔기 결실 및 변이 펩티드를 제작하고, 각 암세포주에 형질 주사한 후 기지의 방법에 따라 단백질을 수거한 다음 웨스턴 블롯과 면역 침강을 수행하여 CAGE의 항암제 내성 유도 기작을 조사하였다. GTGKT는 CAGE의 ATP 결합영역을 포함한다(도 3의 A 우측 패널).

기질로 사용하기 위해 GSK3β의 ser9 잔기를 포함하는 GSK3β 유래 기질 펩티드 RTTSFAE를 제작하였으며(도 3의 A 좌측 패널), 이 RTTSFAE 펩티드를 기질로 하여 재조합 CAGE 단백질에 의한 GSK3β ser9 잔기의 인산화를 in vitro kinase assay를 통해 확인하였다(도 3의 B 좌측 패널). 여기에 GTGKT 펩티드를 처리한 결과 재조합 CAGE 단백질에 의한 GSK3β ser9 잔기 인산화를 억제하는 것으로 나타났다(도 3의 B 우측 패널).

GTGKT 펩티드가 CAGE에 의한 단백질 발현 양상 및 인산화에 미치는 영향을 택솔(taxol) 저항성 흑색종 세포주(Malme3M^R-Taxol)에서 웨스턴 블롯 및 면역 침강을 이용하여 조사한 결과, 도 4의 A에서와 같이 GTGKT가 CAGE-GSK3β의 상호 결합을 저해함으로써 GSK3β Ser9 잔기의 인산화 및 Cyclin D1의 단백질 축적을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 Biotin-GTGKT 펩티드를 제작하여 사용한 경우에도 동일한 결과가 나타났다(도 4의 B).

GTGKT 펩티드의 항암 활성에 필요한 잔기를 규명하기 위해 CAGE에서 273번 Thr 잔기를 결실(GTGK) 또는 Ala으로 치환(GTGKA)(서열번호 2)한 펩티드와 272번 Ala 잔기를 Arg으로 치환(GTGRT)한 펩티드를 제작하고 이를 사용하여 동일한 방법으로 조사한 결과, 도 4의 C에서와 같이 GTGKA 펩티드가 CAGE와 GSK3β의 단백질 간 상호 결합을 억제하여 Cyclin D1의 발현 수준을 조절하는 것으로 나타났다.

셀라스트롤(celastrol)에 내성을 보이는 흑색종, 간암, 위암 세포주 (Malme3M^R, SNU38M^R, AGS^R)에서 상기 GTGKT 기반 결실 및 변이 펩티드를 사용하여 동일한 방법으로 조사한 결과, 도 5의 A에서와 같이 GTGKT 펩티드와 GTGKA 펩티드가 CAGE와 GSK3β의 단백질 간 상호 결합을 억제하여 Cyclin D1의 발현 수준을 조절하는 것으로 나타났다.

또한 GTGKA 펩티드가 흑색종 및 간암 세포주(Malme3M^R, SNU38M^R)에서 항암제에 대한 세포 사멸을 유도한다는 것을 세포사멸 유도 인자 FAK와 PARP cleavage를 통해 확인하였다(도 5의 B).

상기의 결과들을 정리하여 도 6에 나타내었다.

< GTGKT 기반 올리고펩티드의 항암제 내성 및 종양 생성력 억제 >

GTGKT 기반 올리고펩티드의 항암 활성을 확인하기 위해 기지의 방법에 따라 MTT assay와 웨스턴 블롯을 수행하였으며 면역 결핍 쥐를 이용하여 종양 생성력에 미치는 영향을 확인하였다.

셀라스트롤에 내성을 보이는 흑색종, 간암, 위암 세포주(Malme3M^R, SNU38M^R, AGS^R)에 GTGKT 펩티드를 농도별로 형질 주입한 후 항암제에 대한 내성을 MTT assay로 분석한 결과, 도 7의 A에서와 같이 GTGKT 펩티드가 각 암세포주의 항암제 내성을 억제하는 것으로 나타났다.

또한 GTGKT 펩티드가 재조합 CAGE 단백질에 의한 GSK3β ser9 잔기의 인산화를 억제한다는 것을 in vitro kinase assay를 통해 확인하였고(도 7의 B), 흑색종 및 간암 세포주(Malme3M^R, SNU38M^R)에서 항암제에 대한 세포 사멸을 유도한다는 것을 세포사멸 유도 인자 FAK와 PARP cleavage를 통해 확인하였다(도 7의 C).

GTGKT 펩티드가 종양 생성력에 미치는 영향을 조사하기 위해 CAGE 발현이 높은 흑색종 및 간암 세포주(Malme3M^R, SNU38M^R)를 기지의 방법에 따라 면역결핍 쥐 측 복부에 주사하여 종양을 유도한 후 GTGKT 펩티드를 2주 동안 3일마다 총 5번 꼬리정맥 주사하여 종양의 크기 변화를 조사하였다. 이의 결과 도 8의 A에서와 같이 GTGKT 펩티드가 암세포주에 의한 종양 크기를 감소시키는 것으로 나타났다.

실험 종료 후 기지의 방법에 따라 종양 조직으로부터 단백질을 수거하여 단백질 발현과 활성화 및 상호 결합 여부를 웨스턴 블롯과 면역침강을 이용하여 확인하였다. 이의 결과, 도 8의 B에서와 같이 GTGKT 펩티드가 CAGE와 GSK3β의 단백질 간 상호 결합을 억제하여 GSK3β ser9의 탈 인산화 및 Cyclin D Thr286 잔기의 인산화를 통해 Cyclin D1의 단백질 발현 감소를 유도하며, 항암제 내성 유전자인 MDR1의 발현 역시 감소시키는 것으로 나타났다.

GTGKT 펩티드의 항암 활성을 확인하기 위해 항암제에 대한 내성 여부를 MTT assay로 조사한 결과, 도 9의 A에서와 같이 GTGKT 펩티드가 항암제에 대한 내성을 억제하는 것으로 나타났다.

GTGKT 펩티드를 CAGE 발현이 높은 흑색종 및 간암 세포주(Malme3M^R, SNU38M^R)에 처리한 결과, 도 9의 B에서와 같이 GTGKT 펩티드가 GSK3β ser9의 탈 인산화 및 Cyclin D1의 발현을 억제하며, CAGE-GSK3β의 단백질간 상호결합을 저해하는 것으로 나타났다.

< GTGKT 기반 올리고펩티드의 종양 특이성 >

항암 활성을 보이는 GTGKT 기반 올리고펩티드가 종양 특이적 펩티드인지 확인하기 위해 FITC-GTGKT를 제작하고 기지의 방법에 따라 항암제 저항성 세포주와 면역 결핍 쥐를 이용하여 조사하였다.

CAGE 발현이 높은 흑색종, 간암 세포주(Malme3M^R, SNU38M^R)에 FITC-GTGKT를 형질 주입하고 24시간 후에 형광현미경을 이용하여 조사한 결과, 도 10의 A에서와 같이 FITC-GTGKT가 세포 내로 이동하는 것을 확인하였다.

면역 결핍 쥐에 기지의 방법에 따라 종양을 유도하고 FITC-GTGKT를 꼬리정맥 주사 한 다음 24시간 후 정상 조직(뇌, 심장, 비장, 간, 폐 등)과 종양 조직을 적출하여 small in vivo imaging system을 이용하여 조사한 결과, 도 10의 B에서와 같이 종양 조직 특이적으로 FITC-GTGKT가 이동하는 것을 확인하였다.

또한 도 10의 C에서와 같이 실험에 사용한 항암제 내성 세포주에서 GTGKT 펩티드가 CAGE에 특이적으로 결합하는 것을 면역 침강을 이용하여 확인하였다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Compositions for overcoming anti-cancer drug-resistance or compositions for anti-cancer activity employing CAGE-derived peptides <130> PA131122-C01 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAGE-derived peptide <400> 1 Gly Thr Gly Lys Thr 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAGE-derived peptide <400> 2 Gly Thr Gly Lys Ala 1 5

Claims

서열번호 1(GTGKT)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 항암용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은
피부암, 간암 또는 위암의 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포의 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
서열번호 2(GTGKA)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 항암용 약제학적 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은
피부암, 간암 또는 위암의 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포의 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
서열번호 1(GTGKT)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 암세포는
피부암세포, 간암세포 또는 위암세포인 것을 특징으로 하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 항암제는 셀라스트롤 또는 택솔인 것을 특징으로 하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물.
서열번호 2(GTGKA)의 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드를 유효성분으로 함유하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 암세포는
피부암세포, 간암세포 또는 위암세포인 것을 특징으로 하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 항암제는 셀라스트롤 또는 택솔인 것을 특징으로 하는 암세포의 항암제 내성 감소용 약제학적 조성물.