KR20150067517A

KR20150067517A - 녹내장 여과수술 후 흉터 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR20150067517A
Application number: KR1020130153012A
Authority: KR
Inventors: 양재욱; 김정림; 강미선
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2015-06-18
Also published as: WO2015088094A1

Abstract

본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(porcine chondrocyte derived extracellular membrane; PCDECM)을 유효성분으로 함유하여 녹내장 환자의 여과수술 후 흉터 형성을 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(porcine chondrocyte derived extracellular membrane; PCDECM)은 녹내장 환자의 여과수술 후 상처부위의 섬유화와 신생혈관형성을 억제하여 흉터 형성을 예방 또는 치료함으로써 흉터에 의한 여과 및 안압조절 실패와 같은 여과수술 실패에 의한 염증 및 시력손실 문제를 해결할 수 있다.

Description

녹내장 여과수술 후 흉터 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating of scarring after glaucoma filteration surgery}

본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질 막(porcine chondrocyte derived extracellular membrane; PCDECM)을 함유하여 녹내장 환자의 여과수술 후 흉터 형성 예방 또는 치료에 제공되는 약학조성물에 관한 것이다.

여과수술은 녹내장 환자의 안압(intraocular pressure; IOP)을 줄이는데 가장 효과적인 치료 방법이다. 그러나 수술 후 과도한 결막의 상처와 공막조공술(sclerostomy) 부위의 테논낭(Tenon's capsule)은 여과 및 수술 후 안압조절 실패와 결과적으로 진행되는 녹내장 시신경 유두함몰과 시력손실의 원인이 되며 이러한 여과실패의 증거로 여과수포 주위의 지속적인 염증반응이 일어난다.

이러한 녹내장 여과수술의 실패 여부는 여과수포 형성 부위에 수술 후 흉터 형성을 조절하는 것과 관련된다. 최근에는 흉터 형성을 줄이기 위해 섬유아세포의 복제와 기능을 억제하는 항증식제인 5-플루러유라실(5-FU)와 미토마이신-C(MMC)와 같은 물질을 항흉터물질로 사용하고 있으나 이러한 물질들은 각막 상피세포에 독성을 나타내며, 여과포 누출, 안구내염, 저안압 및 저안암관련 황반병증과 같은 심각한 부작용을 초래하기 때문에 흉터 형성을 예방하기 위한 보다 안전하고 효과적인 치료 방법의 개발이 필요한 실정이다.

상처 치유에 있어서, 섬유아세포 증식과 신생혈관형성은 중요한 구성요소이며 특히 신생혈관생성(Angiogenesis)은 상처 치유의 증식단계에 중요한 요소로 치유과정을 유도하는 세포의 빠른 성장을 위한 산소와 영양공급에 중요 역할을 하는데 이러한 신생혈관생성 차단은 섬유아세포의 이동과 증식을 감소시킬 수 있다.

최근 주로 황산 글리코사미노글리칸(GAGs)과 동물의 무릎연골에서 분비된 콜라겐 타입 Ⅱ를 포함하는 연골 매트릭스 분자로 구성된 세포-유래 ECM 골격에 대한 연구가 이루어졌으며 보고에 따르면, ECM 골격은 생체내 분해성과 생체에 거부감을 일으키지 않으며 다공성의 특징을 나타낸다. 또한 상기 ECM 유래의 연골 ECM 분자 또는 조각들은 항-혈관신생 활성을 나타낸다고 보고되어졌다.

또 다른 보고에 의하면, 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질 막(porcine chondrocyte derived extracellular membrane; PCDECM)은 in situ상의 중간엽 줄기세포를 이용하여 조직 강화 연골안의 낮은 비대성 변화와 혈관 침범을 나타내었다.

이에 본 발명자는 PCDECM를 이용한 각막 신생혈관형성과 시력감소에 대한 연구를 진행하던 중 PCDECM이 각막 상피하 신생혈관 형성과 섬유화를 억제하는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한국 공개 특허 제10-2010-7006613호 공보

본 발명은 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(porcine chondrocyte derived extracellular membrane; PCDECM)을 포함하는 약학조성물을 이용하여 녹내장 환자의 여과수술 후 상처부위에 형성되는 흉터를 예방 또는 치료하여 여과수술 후 형성되는 흉터에 의한 여과 및 안압조절 실패에 따른 염증 및 시력손실을 예방 또는 치료하는 약학조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하여 녹내장 환자의 여과수술 후 상처부위의 흉터 형성을 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 동물의 무릎관절연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다.

또한 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 여과수술 후 상처 부위의 섬유화 및 신생혈관형성을 억제하여 흉터 형성을 억제할 수 있다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유되어질 수 있다.

구체 예로 상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로서 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 동물 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(porcine chondrocyte derived extracellular membrane; PCDECM)을 포함하는 약학조성물을 이용하면 녹내장 환자의 여과수술 후 여과수포 형성부위의 섬유화와 신생혈관형성을 억제하여 흉터 생성을 예방 또는 치료함으로써 시력손실로 이어지는 녹내장 환자의 여과수술 실패를 예방 또는 억제할 수 있다.

도 1은 수술 후 PCDECM군과 대조군인 생리 식염수군의 부종성 기질 안의 염증성 세포를 염색한 결과로 (A)는 PCDECM군의 헤마톡시리&에오신 염색결과이며, (B)는 PCDECM군의 메이슨 트리크롬 염색결과이다.
또한 (C)는 수술 후 생리 식염수군의 헤마톡시리&에오신 염색결과이며, (D)는 생리 식염수군의 메이슨 트리크롬 염색결과로 대조군인 생리 식염수군의 공막 피막의 섬유성 기질에서 심각한 염증성 침윤이 확인되었다.
도 2는 CD31 면역화학염색 분석결과로 (A)는 수술 후 PCDECM군의 공막 피막의 염색결과이며 (B)는 대조군의 공막 피막을 염색한 결과로 대조군에서 PCDECM군과 비교하여 많은 신생혈관형성이 확인되었다.

본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질을 유효성분으로 함유하여 녹내장 환자의 여과수술 수 상처부위의 흉터 형성 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 연골세포 유래 세포외 기질은 동물의 무릎 관절연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다.

보다 상세하게는 토끼의 안구를 이용한 여과수술 후 각각의 결막하 공간에 돼지 무릎연골 세포 유래의 세포외 기질(porcine chondrocyte derived extracellular membrane; PCDECM)를 주사한 실험군과 생리 식염수를 주사한 대조군의 각막 상처 부위의 결막하 공간의 염증, 섬유화와 신생혈관형성 정도를 조직염색과 면역화학염색 후 현미경 분석을 통하여 확인하였다.

상기 실험결과인 도 1과 표 1을 참고하면, PCDECM군의 섬유화 정도는 1.57±0.53이었으며 대조군은 3.00±0.00로 PCDECM군이 대조군에 비하여 섬유화가 억제된 것을 확인할 수 있었으며 또한 CD31 면역화학염색을 통한 신생혈관형성 역시, 도 2와 같이 여과수술 후 PCDECM군과 비교하여 대조군에 많은 신생혈관이 형성된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 PCDECM는 상처부위의 섬유화와 신생혈관형성을 억제하여 흉터 형성을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

또한 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.

상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로서 제공될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 PCDECM을 유효성분으로 포함하는 녹내장 여과 수술 후 흉터 예방 또는 치료용 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 점안제, 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, PCDECM을 유효성분으로 포함하는 녹내장 여과 수술 후 흉터 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 PCDECM의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 참조예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 적용되는 참조예를 제공하기 위한 것이다.

< 참조예 > 통계 분석

두 그룹의 염증, 섬유화 및 신생혈관형성을 수치화하여 비교하였다.

수술-PCDECM 그룹과 수술-생리 식염수 그룹 사이의 염증, 섬유화 및 신생혈관형성의 점수 비교는 the Wilcoxon signed rank test를 이용하여 분석하였으며 P < 0.05의 값을 유의한 값으로 보았으며 그 결과를 ± 평균의 표준 편차로 나타내었다.

< 실시예 1> PCDECM 제조

이미 보고되어진 방법(Jin CZ, Park SR, Choi BH, Park KD, Min BH (2007) In vivo cartilage tissue engineering using a cell-derived extracellular matrix (ECM) scaffold. Artif Organs 31:183-92)으로 ECM 골격을 돼지 연골세포로 제조하였다. 먼저 돼지의 무릎 관절연골 유래의 초대 연골세포를 3주간 단층 배양하여 확장시킨 후 3차원 펠렛으로 3주간 추가배양하였다. 3차원 연골과 같은 조직의 세포 구성물질을 제거하기 위하여 48시간 동안 - 56℃, 5 m 토르(Torr)하에서 동결건조하여 다공성의 스펀지형 골격을 제조하였다.

상기 방법으로 만들어진 막에 200U/mL DNaseⅠ을 처리하고 포스페이트 버퍼 살린(PBS; Gibco, Carlsbad, CA)으로 3번 세척하였다.

< 실시예 2> 동물모델의 여과수술

2-3 kg의 12-14 주령 수컷 뉴질랜드 토끼 12마리에 케타민 하이드로클로라이드(30 mg/kg body weight, Huons, Jecheon, Korea)와 자일라진 클로라이드(2. 5 mg/kg, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea) 혼합물을 토끼의 근육 내로 주사하여 전신마취하였으며 알카인 프로파라카인 안약(Alcon Inc., Seoul, Korea)으로 국소마취하였다. 마취된 토끼에 변형된 방법의 섬유주절제술을 수행하였다.

윤부로 부터 5mm 윤부 기반의 결막 피판을 형성시키고 윤부 기반의 직사각형 공막 피판에 삼각형 철 날로 윤곽을 나타내고 부분 두께의 공막 피판을 윤부 뒤 2mm부분에서 시작하여 전방 각막 기질에 칼 날이 보일 때까지 조심스럽게 절제하였다.

또한 테논낭을 단속 봉합하여 폐쇄하고 물이 들어오는 것을 방지하기 위하여 결막 절개된 부분을 8-0 폴리글락틴(Vicryl^®, Ethicon, Somerville, NJ, USA)봉합물질로 각각 폐쇄하였다.

상기 방법으로 모든 토끼의 오른쪽 눈을 여과 수술하고 무작위로 2 그룹으로 나누어 대조군으로 6개의 눈에 수술 직후 0.9% NaCl을 주입한 수술-생리 식염수 그룹과 또 다른 6개 눈에 수술 직후 25 mg/mL PCDECM을 인산화 완충용액(PBS; 10mL)에 용해하여 주입한 수술-PCDECM군으로 나누었다.

< 실시예 3> 병리학적 분석

3-1. 조직염색 확인

토끼 안구의 병리학적 연구를 통하여 PCDECM의 수술 후 상처 부위 주변의 염증, 섬유화 및 신생혈관 형성 억제 효과를 확인하였다.

수술 6주 후 토끼에 펜토바르비탈 염 250 mg을 귀 정맥을 통하여 빠르게 관류시켜 희생시키고 전체 12마리 토끼에서 12개 안구의 결막과 결막하 조직을 적출한 후 안구를 포르말린 용액으로 24시간 동안 고정시킨 후 건조하고 파라핀 왁스에 내장하였다.

각막, 공막, 결막 및 공막 판을 포함한 안구 전면부를 4μm 두께로 수직 절편한 후 건조시키고 염증에 대한 병리학적 분석을 위하여 4μm 두께의 조직에 헤마톡실린-에오신을 염색하였다. 또한 그 시료에 콜라겐 섬유를 나타내고 흉터 조직형성량을 등급화하기 위하여 메이슨 트리크롬 염색을 수행하고 염증과 섬유화을 보고되어진 방법(Ozkan et al)에 따라 0 내지 4 등급으로 분류하였다.

염증 반응은 림프구, 혈장세포, 조직구 및 다핵백혈구로 구성되었으며 염증 등급에 따라, 등급 0은 염증반응 없음; 등급 1은 상피세포 아래 약간의 림프구와 혈장세포; 2는 상피세포 아래 밀집되어있을 뿐만 아니라 가벼운 염증으로 림프구, 혈장세포 및 다핵백혈구 침투; 등급 3은 등급 2에 추가로 상피세포 안에 호중구; 등급 4는 상피내 뿐만 아니라 상피하에 궤양과 높은 농도의 림프구, 혈장세포, 다핵백혈구 및 조직구의 정도로 등급화하였다.

또한 섬유화는 콜라겐 형성량을 기초로하여 0 내지 4 등급으로 분류하였으며, 등급 0은 섬유화 없음; 등급 1은 가벼운 근육주변의 섬유화 반응(콜라겐 염색을 통해서만 발견가능한 근육 바로 옆 얇은 밴드); 등급 2는 쉽게 확인되는 두꺼운 밴드; 등급 3은 잘 발달 되고 밀집한 콜라겐 밴드; 등급 4는 대부분의 영역을 대체한 심각한 섬유화 정도로 분류하였다.

3-2. 면역조직화학 분석

또한 4μm 두께의 조직을 이용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다.

먼저, 조직을 3.5% 파라포름알데하이드로 고정시키고 0.1% 트리톤 X-100을 투과시킨 후 2% 소 혈청 알부민(BSA; all from Sigma, St. Louis, MO)으로 불활성화시켜 1차 항체인 항-CD31(1:1,000; Bioss Antibodis, Woburn, MA)을 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

3-3. 신생혈관 생성확인

신생혈관형성은 고 전력 확대하(×200)에서 수행한 미세혈관 카운트(MVC)로 평가하였는데 0.74 mm² 당 미세혈관의 절대 수를 나타낸 MVD를 통하여 선별한 다섯 개의 최대 혈관지역의 평균미세혈관 수를 얻었다.

3-4. 결과

모든 토끼는 병리학적 분석을 위한 희생전까지 살려두었다.

토끼의 수술부위를 현미경 확인 결과 수술-생리 식염수 그룹의 결막하 부드러운 조직이 거의 완전히 섬유 증식에 의해 대체된 것이 확인된 반면, 결막하공간에 PCDECM을 주입한 수술-PCDECM 그룹은 결막하의 부드러운 조직이 보존되어 있는 것이 확인되었으며 전체 검사 결과, 모든 토끼의 수술 부위에서 염증반응은 없었다.

두 그룹의 현미경 분석결과, 표 1과 같이 염증, 섬유화 및 미세혈관 수의 평균 값을 나타내었다.

공막 피판과 결막하 연결 조직의 병리학적 조사결과 표 1과 도 1을 참고하면 실험 6주 후 수술-PCDECM 그룹은 대조군인 수술-생리 식염수 그룹과 염증 점수(P=0.19)에서는 유의한 차이를 보이지 않았으나, 표 1, 도 1 및 도 2와 같이 수술-PCDECM 그룹은 대조군보다 적은 섬유 형성(P=0.002)과 신생혈관생성(P=0.036)을 나타내었다.

병리학적 평가에 의한 염증과 섬유화 비교

	수술-PCDECM 그룹	수술-생리식염수 그룹 (대조군)	P 값
염증	2.00±1.00	2.25±0.50	0.19＊
섬유화	1.57±0.53	3.00±0.00	0.002＊
혈관	18.67±5.24	31.33±4.93	0.002†

(* wilcoxon signed rank test. 유의값 P < 0.05, † independent t-test. 유의값 P<0.05)

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서,본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

연골세포 유래 세포의 기질을 유효성분으로 함유하여 녹내장 환자의 여과수술 후 상처부위의 흉터 형성 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 동물의 무릎 관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 여과수술 후 상처 부위의 섬유화 및 신생혈관형성을 억제하여 흉터 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 점안제 형태의 안약이나 주사제, 또는 젤 형태의 안연고나 주사제로서 제공되는 것을 특징으로 하는 약학조성물.