KR20150056522A - 초음파 공동화에 의한 지방 조직으로부터 줄기 세포의 분리 및 이의 이용 방법 - Google Patents

초음파 공동화에 의한 지방 조직으로부터 줄기 세포의 분리 및 이의 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 일 구현예에서, 지방 조직에 초음파 공동화 처리를 수행하여 지방 조직을 파괴하고 성숙한 지방세포를 세포 분해함으로써, 생존가능한 기질/줄기 세포가 포함된 기질 혈관 분획을 수득하는 포함하는, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 비-효소적 방법에 관한 것이다.

Description

초음파 공동화에 의한 지방 조직으로부터 줄기 세포의 분리 및 이의 이용 방법 {ISOLATION OF STEM CELLS FROM ADIPOSE TISSUE BY ULTRASONIC CAVITATION, AND METHODS OF USE}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 6월 26일자 호주 가출원 번호 제 2012902720호에 대한 우선권을 주장하며, 이 특허 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 줄기 세포 생성물의 활용 방법들에 관한 것이다.
본 발명은 일차적으로 지방 조직으로부터 기질/줄기 세포를 비-효소적으로 분리하기 위해 개발되었으며, 이하 이러한 용도를 들어 설명될 것이다. 하지만, 본 발명이 이러한 특정 활용 분야로 한정되지 않음을 인지하여야 할 것이다.
명세서 전체에 걸쳐 기술된 종래 기술에 대한 모든 내용들은 어떠한 방식으로도 이러한 종래 기술이 당해 기술 분야에 통상적인 일반 지식으로 널리 인지되거나 또는 그러한 지식의 일부를 형성한다는 것을 용인하는 것으로 간주되어서는 안된다.
지방 조직은, 성숙한 지방세포를 함유할 뿐만 아니라, 아울러 다양한 세포 계통으로 분화될 수 있는 줄기 세포를 함유하고 있다 (Zuk et al. Tissue Eng. 2001; 7: 211- 228; Hicok et al. Tissue Eng. 2004; 10: 371-380; Erickson et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 290: 763-769; Cousin et al. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 301: 1016-1022; Safford et al. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 294: 371-379; Miranville et al. Circulation. 2004; 1 10: 349-355; Planat-Benard et al. Circ Res. 2004; 94: 223-229; Planat-Benard et al. Circulation. 2004; 1 09: 656-663). 이 줄기 세포는 부착성이며, 배양으로 증식시킬 수 있다. 따라서, 소량의 지방 조직으로부터 줄기 세포를 대량 수득할 수 있다.
현재, 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하기 위해, 전형적으로 콜라게나제 등의 효소들을 사용하여, 지방 조직을 이어주는 콜라겐에서 뼈를 분리한다 (예로, Zuk, et al. Mol Biol Cell. 2002; 13: 4279-4295; Zuk, et al. Tissue Eng. 2001; 7: 211-228을 참조함). 콜라게나제는 효과적이지만, 줄기 세포를 확보하는데에는 아래와 같이 적합하지 않을 수 있다:
- 효소 처리로 세포 사멸이 높은 수준으로 발생하여, 분리되는 줄기 세포의 수가 줄어들고, 더 많은 세포 파편이 생긴다;
- 효소가 고유 세포 타입에 손상을 입혀 파괴할 수 있다;
- 분리된 줄기 세포에 효소가 잔류하고 있어, 이식에 부적합한 요인이 될 수 있다;
- 규제 기관에서는, 줄기 세포 분리시 효소를 사용하면 약물 승인을 받아야 하는 세포 산물이 만들어진다고, 볼 수 있다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 하나 이상의 문제점을 해결 또는 완화하거나, 또는 유용한 대안을 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은, 지방 조직의 초음파 공동화 (ultrasonic cavitation) 처리가 지방 조직을 파괴하고 성숙한 지방세포를 세포 분해 (lysis)함으로써 생존가능한 줄기/기질 세포 및 세포외 매트릭스를 포함하는 기질 혈관 분획이 수득된다는 것을, 알게 되었다.
일 측면에서, 본 발명은, 지방 조직에, 초음파 공동화 처리를, 상기 조직을 파괴하고 성숙한 지방세포를 세포 분해하면서 동시에 기질/줄기 세포의 생존성은 유지하는데 충분한 시간, 진폭 및 사이클로 수행하는 단계를 포함하는, 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포 및 세포외 매트릭스를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다.
초음파 공동화의 진폭 및 사이클 설정은 가변적일 수 있으며, 세포 생존성을 유지하기 위한 프로세스의 타이밍과 지방 조직의 양에 따라 결정된다. 세포가 생존하는 온도 범위를 초과해서는 안된다.
다른 측면에서, 초음파 공동화 수행 시 지방 조직의 온도는 기질/줄기 세포의 생존성을 확보하는 온도로 유지된다.
다른 측면에서, 지방 조직의 온도는 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않는다.
다른 측면에서, 지방 조직은, 약 10초 - 약 10분의 기간 동안 진폭 약 20 - 약 75% 및 사이클 약 0.2 - 약 0.9로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여, 초음파 공동화로 처리된다.
다른 측면에서, 초음파 공동화 디바이스의 탐침은 지방 조직에 위치하여, 진폭은 약 50%로 설정하고, 사이클은 약 0.4 - 약 0.5로 설정하며, 탐침을 1분 30초 - 약 1분 40초 - 동안 지방 조직 속에서 상향 및 하향시키며; 이때 지방 조직의 온도는 약 43℃ - 약 45℃ 보다 낮은 온도로 유지된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 분리된 생존가능한 줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획에 관한 것이다.
다른 측면에서, 기질 혈관 분획은 줄기 세포 외에 다른 생존가능한 세포를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 분리된 지방 조직-유래 줄기 세포에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 지방 조직-유래 기질/줄기 세포 생성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애의 치료 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 지방 조직-유래 기질/줄기 세포 생성물의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 지방 조직-유래 기질/줄기 세포 생성물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않게 하는 진폭과 사이클로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여 지방 조직에 초음파 공동화를 약 1분 30초 - 약 1분 40초간 처리하는 단계를 포함하는, 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 진폭이 약 50%로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여 지방 조직을 처리하는 단계를 포함하는, 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법에 관한 것으로서, 상기 디바이스는 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않도록 하는 사이클 및 시간으로 설정되고 적용된다.
다른 측면에서, 본 발명은 사이클이 약 0.4 - 약 0.5로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여 지방 조직을 처리하는 단계를 포함하는 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법에 관한 것으로, 상기 디바이스는 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않도록 하는 사이클 및 시간으로 설정되고 적용된다.
다른 측면에서, 본 발명은 진폭이 약 50% 및 사이클이 약 0.4 - 약 0.5로 설정된 초음파 탐침을 이용하여 지방 조직에 초음파 공동화를 약 1분 30초 - 약 1분 40초간 처리하는 단계를 포함하는, 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 초음파 공동화의 시간, 진폭 및 사이클이 세포 배양 48시간 후 기질/줄기 세포가 생존하도록 선택된, 초음파 공동화에 의해 지방 조직으로부터 분리되는 기질 혈관 분획에서 기질/줄기 세포의 생존성을 유지시키는 방법에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "지방 조직"은 임의의 지질 조직 (fat tissue)을 지칭한다. 지방 조직은 갈색 또는 백색 지방 조직일 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 피하 백색 지방 조직이다. 지방 조직은 지질 조직을 가지고 있는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 지방 조직은 포유류의 것이며, 가장 바람직하게는 지방 조직은 인간의 것이다. 인간 지방 조직의 용이한 소스는 지질흡입술 또는 그외 수술로부터 유래된 것이다. 그러나, 지방 조직의 소스 또는 지방 조직의 분리 방법은 본 발명에 결정적인 사항이 아니다.
본원에서 용어 "기질 혈관 분획"은 지방 조직에서 확인되는 혈관 및 주변 조직으로부터 유래되는, 세포를 포함하는, 분획을 지칭한다. 분획은 예를 들어, 간엽 줄기 세포, 초기 간엽/기질 전구 세포, 지방 조직-유래 줄기 세포, Muse-AT 세포, 조혈 세포, 조혈 줄기 세포, 혈소판, 쿠퍼 세포, 파골 세포, 거핵구, 과립구, NK 세포, 내피 전구 세포 (precursor cell) 또는 선조 세포 (progenitor cell), 만능성 세포, CD34+ 세포, Stro-1+ 세포, Stro-3+ 세포, CD29+ 세포, CD166+ 세포, Thy-1+ 또는 CD90+ 줄기 세포, CD44+ 세포, 면역 세포, 예로, 단핵세포, 백혈구, 림프구, B 세포, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 백혈구, 호중구, 호중구 과립구 등을 비롯한 여러가지 세포 타입들을 포함할 수 있다. 기질 혈관 분획은 또한 본원에 기술된 임의의 마커 또는 이들의 임의 조합을 발현하는 세포를 포함한다. 본원에서, 용어 "기질 혈관 분획"은 "간엽 혈관 분획", "간엽 분획", "기질 분획" 등과 같은 용어에 포함된다.
본원에서, 용어 "간엽 줄기 세포"는, 다능성인, 간질 또는 간엽 세포, 또는 초기 간엽/기질 전구 세포 또는 지방 조직-유래 기질/줄기 세포를 지칭하며, 이는 비제한적인 예로, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육 및 신경/신경교 세포 계통 등의 여러가지 다양한 세포 타입에 대한 줄기 세포-유사 전구체로서 이용될 수 있다.
간엽 줄기 세포는 예를 들어 지방 조직 및 골수로부터 유래가능한 아집단을 만든다. 본원에서, 용어 "간엽 줄기 세포"는 "기질 줄기 세포", "골수 기질 세포", "다능성 기질 세포", "간엽 전구 세포", "Muse-AT", 지방 조직-유래 기질/줄기 세포 등의 범위에 포함된다.
본원에서, 용어 "분화된"은 세포가 충분히 발달되어, 생물학적인 특수화 및/또는 특수 환경 및/또는 기능에 순응된, 최종 성숙 상태에 도달한 세포를 지칭한다. 전형적으로, 분화된 세포는 세포에서의 분화-관련 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 특징적이다. 예를 들어, 백혈구에서의 GALC 발현은 최종 분화된 백혈구의 전형적인 일 예이다.
용어 "전구 세포", "선조 세포" 및 "줄기 세포"는 당해 기술 분야 및 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 잠재적으로 무한한 횟수의 유사 분열을 이행하여 원하는 세포 타입으로 분화할 자손 세포를 만들거나 또는 스스로 재생할 수 있는 만능성 또는 계통-미결정된 선조 세포를 지칭한다. 만능성 줄기 세포와는 대조적으로, 계통-결정된 선조 세포는 일반적으로 표현형이 서로 다른 여러가지 세포 타입으로 될 수 없는 것으로 간주된다. 대신, 선조 세포는 한가지 또는 어쩌면 2가지의 계통-결정된 세포 타입이 된다.
본원에서, 용어 "다능성 (multipotent, multipotential 또는 multipotentiality)은 줄기 세포가 2종 이상의 세포 타입으로 분화할 수 있는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "동종"은 동일한 종의 다른 포유류로부터 유래되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서, 용어 "자가"는 개체로부터 유래되며 다시 그 개체에게로 도입되는 임의의 물질을 지칭한다.
본원에서, 용어 "세포 생성물" 또는 "세포 생성물들"은 세포를 포함하지만, 성장 인자, 세포외 매트릭스 등의 다른 물질을 포함할 수 있는, 생성물을 지칭하는 것이다.
문장에서 명확하게 그렇지 않은 한, 상세한 설명과 청구항에서, 용어 "포함한다", "포함하는" 등은 한정적인 또는 전체 의미와는 반대되는 포괄적인 의미로 해석되며; 즉, "비제한적인 예로 을 포함하는"의 의미이다.
도 1: P-층.
도 2: 초음파 공동화 처리한 지방 조직으로부터 배양한, 기질 혈관 분획 유래의 플라스틱 부착 세포의 김자 염색 콜로니.
도 3: 초음파 공동화 처리한 지방 조직으로부터 배양한 간엽 줄기 세포의 세포 배양물.
도 4: 초음파 공동화의 진폭 설정에 따른 지방 조직의 온도 효과 - 지방 조직 20 g을 1 ½분간 사이클 0.4로 처리함.
도 5: 초음파 공동화의 사이클 설정에 따른 지방 조직의 온도 효과 - 지방 조직 20 g을 1 ½분간 진폭 50%로 처리함.
도 6: 초음파 공동화의 진폭에 따른 기질 혈관 분획의 세포 생존성 효과 - 지방 조직 20 g을 1 ½분간 사이클 0.4로 설정하여 처리함.
도 7: 초음파 공동화 처리한 지방 조직으로부터 수득한 유세포 측정 분석 - 초음파 공동화에 의해 분리한 지방 조직 40 g의 형광 핵에 의한 세포 카운트.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은, 지방 조직에서 지방 세포를 파괴 또는 세포 분해하여 기질 혈관 분획을 분리하도록, 지방 조직과 접촉 배치되는 탐침을 구비한 초음파 공동화 디바이스를 이용한다. 사용되는 구체적인 초음파 공동화 디바이스는 본 발명에서 중요한 사항이 아니다. 적절한 한가지 선택은 기술적으로 진보된 고 강도 초음파 프로세서인 HIELSCHLER 초음파 프로세서이다. 이 디바이스는 광범위한 유기 및 무기 물질을 - ㎕에서 L 수준에서 - 안전적으로 처리할 수 있다. 이용할 수 있는 다른 디바이스로는 Vibra-Cell™ device (Sonics), VASER (SoltaMedical) 또는 QSonica 초음파 프로세서를 포함한다.
다른 구현예에서, 생물 용액 (예, 포스페이트 완충화된 식염수 또는 정상 식염수) 중의 지방 조직을 냉각된 환경 (조직/세포는 2℃ 이하로 떨어져서는 안됨)에 둘 수 있다. 초음파 공동화 디바이스 탐침은 지방 조직으로 배치되고, 진폭은 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%로, 사이클은 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9로, 약 10초, 약 20초, 약 30초, 약 40초, 약 50초, 약 60초, 약 1분 10초, 약 1분 20초, 약 1분 30초, 약 1분 40초, 약 1분 50초, 약 2분, 약 3분, 약 4분, 약 5분, 약 6분, 약 7분, 약 8분, 약 9분, 약 10분간 설정된다. 바람직하게는, 진폭은 약 50%, 사이클은 약 0.4-0.5로 설정된다. 탐침은 조작하는 동안 튜브 안 여러 위치에서 보정될 수 있다. 공정은 냉각 환경 또는 실온에서, 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃ 보다 높아지지 않도록, 바람직하게는 37℃를 넘지 않도록 조절된 진폭, 사이클 및 시간으로 이루어질 수 있다. 초음파 공동화의 지속 기간은 지방 조직의 양에 따른 순차적인 기간 동안 수행할 수 있으며, 예를 들어, 지방 조직의 양이 많을 경우, 탐침을 튜브의 2곳에서 약 1분간 및 이후 약 40초간 올린 다음 내리거나, 또는 지방 조직의 양이 적을 경우에는, 탐침을 튜브의 정상부 지점에서 약 1분간 올린 다음 30초간 내리거나 또는 탐침을 약 30초간 지방 조직에 삽입하고 약 10초간 정지한 다음 반복한 후 약 30초간 지방 조직의 정상부로 올린다. 초음파 공동화의 시퀀스 및 타이밍 (특히, 적용 진폭, 사이클 및 시간)은 달라질 수 있지만, 지방 조직의 온도가 이상적으로 37℃ 보다 높게 상승하지 않거나 또는 약 43℃ - 약 45℃ 보다 높아지지 않도록 방지하여, 기질 혈관 분획에 최적 세포 수 및 생존성을 확보하는 수준에서 결정된다. 이들 파라미터는 단순 시행 착오로 쉽게 결정할 수 있다. 전형적으로, 진폭은 약 50%, 사이클은 약 0.4 - 약 0.5, 시간은 약 1분 30초이다. 진폭을 높이면, 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃ 보다 높게 상승하지 않도록 하기 위해 사이클 또는 시간은 그에 따라 줄일 수 있다 (또한, 그 반대도 가능함). 언급한 바와 같이, 세포 해리는 초음파 공동화에 의해 대신 달성되므로, 이러한 처리는 콜라게나제 또는 콜라겐을 분해하는 등가의 효소의 첨가를 포함하지 않는다. 초음파 처리 후, 튜브내 용액은 걸쭉해지고 (이는 쉽게 기질 혈관 분획으로 여과 또는 분리할 수 없음), 이를 원심분리할 수 있다.
원심분리에 의해 3개의 층 - 지질 상층, 세포외 매트릭스, 지방 조직 세포 및 기질 혈관 세포를 함유한 부유성 중간층 (P-층이라 함) 및 유동 하부층 - 이 형성된다. 지질 상층은 꺼내 (지질 층의 제거로 등장성 유체의 첨가시 세포의 분리가 가능해짐) 버리고, 튜브내 나머지 내용물들을 잘 혼합하고, 용액, 전형적으로 0.9% 식염수, PBS 또는 임의의 그외 등장성 용액을 상기 튜브에 첨가한다. 다시 원심분리하여 세포와 세포외 매트릭스를 침강시켜 바닥에 펠렛화하고, 나머지 지방 세포는 튜브의 상층으로 올라가게 된다. 펠렛에는 세포외 매트릭스와, 기능성의 생존가능한 기질/줄기 세포 (간엽 줄기 세포 포함)를 포함하는 기질 혈관 분획이 포함된다. 이 펠렛을 필터로 여과하여, 임의의 큰 잔해물들을 제거할 수 있다. 이 세포 용액은 그대로 사용하거나 또는 추가로 원심분리하고 과잉의 유체를 제거함으로써 더욱 농축할 수 있다. 세포 카운팅을 위해 샘플을 취할 수 있다.
세포 생존성 및 기능성은 당해 기술 분야의 통례적인 세포 배양 기법으로 결정할 수 있다. 세포는 FACs 장치와 형광 핵 결합 염료, 즉 Guava PCA system 및 Guava Viacount를 이용하여 카운팅할 수 있다.
전형적으로, 이러한 방법을 이용하여 지방 조직 20 g으로 유래되는 세포의 수는 약 40,000,000 - 200,000,000개이며, 즉, 세포 약 2,000,000 - 10,000,000개/g이며, 이는 전형적으로 지방 조직 g 당 세포 약 500,000개가 수득되는 콜라게나제 분리시 보다 세포 수가 많다.
다른 구현예에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 초음파 공동화 디바이스 탐침을 약 40 g의 지방 조직에 배치하고, 진폭은 약 50%, 사이클은 약 0.4-0.5로 설정하는 단계;
(b) 상기 탐침을 지방 조직의 다른 2가지 위치에서 지방 조직 속에 약 1분간 상향 배치한 다음 약 40초간 하향 배치하는 단계;
(c) 지방 조직을 800g/5분간 원심 분리하는 단계;
(d) 지질 상층은 버리고, 지방 조직을 혼합하는 단계;
(e) 등장성 용액을 첨가하고, 지방 조직을 800g/5분간 원심 분리하는 단계;
(f) 수득되는 세포 펠렛은 생존가능한 줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획과 세포외 매트릭스를 포함한다.
다른 구현예로, 본 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 초음파 공동화 디바이스 탐침을 약 40 g의 지방 조직에 배치하고, 진폭은 약 50%, 사이클은 약 0.4-0.5로 설정하는 단계;
(b) 상기 탐침을 상기 지방 조직의 정상부에서 지방 조직 속에서 약 1분간 상향 배치한 다음 약 30초간 하향 배치하는 단계;
(c) 지방 조직을 800g/5분간 원심 분리하는 단계;
(d) 지질 상층은 버리고, 지방 조직을 혼합하는 단계;
(e) 등장성 용액을 첨가하고, 지방 조직을 800g/5분간 원심 분리하는 단계;
(f) 수득되는 세포 펠렛은 생존가능한 줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획과 세포외 매트릭스를 포함한다.
다른 구현예에서, 줄기 세포는 자가 또는 동종의 세포이다.
기질 혈관 분획 또는 기질/줄기 세포는 정맥내 주사 또는 관절내 주사 등의 전통적인 투여 경로에 의해 필요한 개체에게 직접 주입하거나, 또는 추가로 가공하여 간엽 줄기 세포와 같은 원하는 세포 타입 또는 STRO-1+ 세포를 투여하기 전에 정제 (하고, 필요에 따라 배양 증식)할 수 있다.
일부 구현예에서, 줄기 세포는 시험관내 증식을 위해 고유한 세포 표면 항원을 이용한 분획화와 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 기질 혈관 분획으로부터 분리, 정제 또는 농화할 수 있다.
일부 구현예에서, 기질 혈관 분획 또는 기질/줄기 세포는 표준 세포 배양 기법을 이용하여 분화하면서 또는 분화없이 배양할 수 있다. 이 세포는 적정 시점으로 배양할 수 있으며, 표준 방법으로 생존성과 수율을 분석할 수 있다.
다른 구현예에서, 기질 혈관 분획 또는 기질/줄기 세포는 향후 이식/주입을 위해 보관 (예, 냉동보존)될 수 있다. 또한, 세포 은행에서의 중기 내지 장기 보관도 본 발명에 포함된다.
처리 종료시, 기질 혈관 분획 또는 기질/줄기 세포는, 피하, 정맥내, 근육내 또는 복막내 기법 중 한가지로 수여체에 투여하기 위해, 시린지 또는 IV 백 등의 전달 디바이스에 로딩될 수 있다. 즉, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 수단에 의해, 세포를 환자에게 제공할 수 있으며, 예를 들어, 전신 또는 국소 전달을 위해 혈관으로, 조직 (예, 심근 또는 골격근)으로, 진피 (피하)로, 조직 공간 (예, 심막 또는 복막)으로, 조직 (예, 요관주위 배치 (periurethral emplacement)) 또는 그외 위치로 주사할 수 있다. 바람직한 구현예는 바늘 또는 카테터에 의한 투여, 또는 사전-형성된 매트릭스, 지방 조직-유래 세포외 매트릭스 또는 기질-유래 세포외 매트릭스 등의 첨가제와 조합한 직접적인 외과적 이식에 의한 투여를 포함한다.
기질 혈관 분획 또는 기질/줄기 세포는 단독으로, 또는 다른 세포, 조직, 조직 단편, 탈회골 (demineralized bone), 인슐린 등의 성장 인자, 또는 약물, 예컨대 티아글리타존 패밀리의 약물, 생물 활성 화합물, 불활성 화합물, 재흡수성 플라스틱 스캐폴드, 지방 조직-유래 또는 기질-유래 락티스 (lattice) 및/또는 세포외 매트릭스, 또는 세포 집단의 전달, 효능, 허용성 또는 기능을 강화하기 위한 기타 첨가제와 조합하여, 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예들에서, 세포는, 사이토카인 및 성장인자 등의 하나 이상의 세포 분화 물질과 더불어 환자에게 투여된다. 다른 구현예들에서, 세포는 혈소판 풍부 혈장으로 처리된다.
다른 구현예에서, 기질 혈관 분획 또는 기질/줄기 세포는 개체에게서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위해 개체에게 투여된다.
다른 구현예에서, 상기 질환 또는 장애는 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애이다.
이제 본 발명은 구체적인 조성물과 이용 방법이 기술된 구체적이지만 비-제한적인 실시예들을 참조하여, 더욱 상세하게 설명될 것이다. 하지만, 구체적인 절차, 조성물 및 방법에 대한 상세한 설명은 본 발명을 예시하기 위한 목적으로만 포함되는 것으로 이해하여야 한다. 이는 전술한 본 발명의 개념에 대한 광의의 설명을 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1 - 지질흡입에 의한 지방 조직의 확보
지방흡입 수술을 수행하기 전에 흡입할 지방흡입물의 양 보다 많은, 과량의 Tumescent 용액 (정상 식염수 1 L 중에, 아드레날린 1 mg, 리그노카인 400 mg - 800 mg 및 8.4% 소듐 바이카보네이트 용액 10 mL을 포함함)을, 피하 지방층 (tumescent 방법)에 주입한 다음, 예를 들어 내경 2-3 mm인 (흡인기가 장착되어 있으며 금속으로 제조된) 캐뉼러를 사용하여 지방흡입 시술을 수행하였다. 지방흡입술은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, BUNKODO에 의해 간행된, Biyo Seikei Shujutsu Practice 2 (Cosmetic Operation Practice 2), ed. Masanari ICHIDA, Ryusaburo TANINO, and Yoshiaki HOSAKA, pp. 429-469를 참조할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
흡입한 지방을 식염수로 세척하였다. 세척한 흡입물 약 50 ml - 10 L를 수득할 수 있으며, 수득되는 지방 조직 유래 세포 물질은 기질 혈관 분획들의 유도에 사용할 수 있다.
실시예 2 - 수술에 의한 지방 조직의 확보
지방 조직은 사전 동의를 받은 인간 개체로부터 수술을 통해 수득하였다. 당해 기술 분야에 잘 공지된 기법을 이용하여 분리를 수행하였다. 간략하게는, 인간 지방 조직은, 사전 동의를 구한 인간 개체로부터 흡입한 지방 조직으로부터 무균적으로 분리하였다. 수득한 지방 조직 유래 세포 물질은 기질 혈관 분획 유도에 사용된다.
실시예 3 - 초음파 공동화에 의한 생존가능한 줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획의 제조 (진폭 40% 및 사이클 0.5에서 1분 40초간 초음파 공동화를 수행함)
1) 지방흡입물로부터 유래된 지방 조직을 50 ml 튜브에 45 ml로 넣는다.
2) 200g/2분간 원심분리하여 과잉의 유체와 지방 조직을 분리하여, 과잉의 유체를 제거한다. 튜브 기저부의 과잉의 유체를 제거하고, 전형적으로 지방 조직 40 ml을 남긴다.
3) (선택사항) 이 튜브를 냉각시킨 환경에 놓고, 조직/세포의 온도가 2℃ 미만으로 떨어지지 않도록 주의를 기울인다.
4) 초음파 공동화 디바이스 프로브 Hielschler UP200S를 지방 조직으로 배치하고, 진폭 50%, 사이클 0.5로 설정한다. 프로브를 튜브 안 2가지 다른 위치에서 1분간 올리고, 이후 40초간 내린 (즉, 튜브의 바닥부와 상위부) 다음, 3분간 휴지기를 가지며, 선택적으로 이 프로세스를 반복한다. 지방 조직의 온도가 43℃ 보다 높아지지 않도록, 바람직하게는 37℃ 보다 높아지지 않도록 주의를 기울인다.
5) 초음파 처리 후, 튜브 안에서 걸쭉한 용액이 관찰되며, 이를 300g/5분으로 원심분리한다.
6) 원심분리 후, 3개의 층이 형성된다 - 상부 지질 층, 세포외 매트릭스와 기질 혈관 세포가 포함된 중간 부유 층, 그리고 바닥 유체 층.
7) 믹싱 캐뉼러와 시린지를 이용하여 상부 지질 층을 취하여 제거하고 (지질 층의 제거는 등장성 유체 첨가시 세포의 분리를 가능하게 함), 튜브에 남아있는 내용물들을 잘 혼합하여, 세포외 매트릭스를 추가로 파괴한다.
8) 등장 용액 (전형적으로 0.9% 식염수 또는 PBS)을 튜브에 50 ml까지 첨가하고, 이 튜브를 600g/5분으로 원심분리하여, 세포와 세포외 매트릭스가 침강되기 시작하여 바닥에 펠렛으로 형성된다.
9) 세포외 매트릭스와, 생존가능한 기능성 줄기 세포를 함유한 기질 혈관 분획이 든 튜브 바닥에서 큰 펠렛이 관찰된다. 이 펠렛을 믹싱 캐뉼러 및 시린지를 이용하여 유체 약 15 ml을 사용하여 취하고, 100 ㎛ 필터에서 여과하여 임의의 큰 찌꺼기는 제거한다.
10) 세포 용액은 그대로 사용하거나, 또는 추가적인 원심분리에 의해 추가로 원심분리하고, 과잉의 유체를 제거한다.
분리된 기질 혈관 분획에 대한 유세포 분석 결과 생존가능한 세포의 존재가 확인된다 (도 1).
실시예 4 - 초음파 공동화에 의한 생존가능한 줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획의 제조 (진폭 50% 및 사이클 0.5에서 1분 30초간 초음파 공동화를 수행함)
1) 지방흡입물로부터 유래된 지방 조직을 2 x 50 ml 튜브에 25 ml로 넣는다.
2) 200g/2분간 원심분리하여 과잉의 유체와 지방 조직을 분리하여, 과잉의 유체를 제거한다. 튜브 기저부의 과잉의 유체를 제거하고, 전형적으로 지방 조직 20 ml을 남긴다.
3) (선택사항) 이 튜브를 냉각시킨 환경 또는 실온에 놓고, 조직/세포의 온도가 2℃ 미만으로 떨어지지 않도록 주의를 기울인다.
4) 초음파 공동화 디바이스 프로브 Hielschler UP200S를 지방 조직으로 배치하고, 진폭 50%, 사이클 0.5로 설정한다. 프로브를 각 튜브에서 상부에서 1분간 올리고, 이후 30초간 내린다. 지방 조직의 온도가 43℃ 보다 높아지지 않도록, 바람직하게는 37℃ 보다 높아지지 않도록 주의를 기울인다.
5) 초음파 처리 후, 튜브 안에서 걸쭉한 용액이 관찰되며, 이를 300g/5분으로 원심분리한다.
6) 원심분리 후, 3개의 층이 형성된다 - 상부 지질 층, 세포외 매트릭스와 기질 혈관 세포가 포함된 중간 부유 층, 그리고 바닥 유체 층.
7) 믹싱 캐뉼러와 시린지를 이용하여 상부 지질 층을 취하여 제거하고 (지질 층의 제거는 등장성 유체 첨가시 세포의 분리를 가능하게 함), 튜브에 남아있는 내용물들을 잘 혼합하여, 세포외 매트릭스를 추가로 파괴한다.
8) 등장 용액 (전형적으로 0.9% 식염수 또는 PBS)을 튜브에 50 ml까지 첨가하고, 이 튜브를 600g/5분으로 원심분리하여, 세포와 세포외 매트릭스가 침강되기 시작하여 바닥에 펠렛으로 형성된다.
9) 세포외 매트릭스와, 생존가능한 기능성 줄기 세포를 함유한 기질 혈관 분획이 든 튜브 바닥에서 큰 펠렛이 관찰된다. 이 펠렛을 믹싱 캐뉼러 및 시린지를 이용하여 유체 약 15 ml을 사용하여 취하고, 100 ㎛ 필터에서 여과하여 임의의 큰 찌꺼기는 제거한다.
10) 세포 용액은 그대로 사용하거나, 또는 추가적인 원심분리에 의해 추가로 원심분리하고, 과잉의 유체를 제거한다.
실시예 5 - 초음파 공동화에 의한 생존가능한 줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획의 제조 (진폭 50% 및 사이클 0.4에서 1분 40초간 초음파 공동화를 수행함)
1) 지방흡입물로부터 유래된 지방 조직을 50 ml 튜브에 45 ml로 넣는다.
2) 200g/2분간 원심분리하여 과잉의 유체와 지방 조직을 분리하여, 과잉의 유체를 제거한다. 튜브 기저부의 과잉의 유체를 제거하고, 전형적으로 지방 조직 20 ml을 남긴다.
3) 초음파 공동화 디바이스 프로브 Hielschler UP200S를 지방 조직으로 배치하고, 진폭 50%, 사이클 0.4로 설정한다. 프로브를 튜브 안 2가지 다른 위치에서 1분간 올리고, 이후 40초간 내리고 (즉, 튜브의 바닥부와 상위부), 지방 조직의 온도가 43℃ 보다 높아지지 않도록, 바람직하게는 37℃ 보다 높아지지 않도록 주의를 기울인다.
4) 초음파 처리 후, 튜브 안에서 걸쭉한 용액이 관찰되며, 이를 800g/5분으로 원심분리한다.
5) 원심분리 후, 3개의 층이 형성된다 - 상부 지질 층, 세포외 매트릭스와 기질 혈관 세포가 포함된 중간 부유 층, 그리고 바닥 유체 층.
6) 믹싱 캐뉼러와 시린지를 이용하여 상부 지질 층을 취하여 제거하고 (지질 층의 제거는 등장성 유체 첨가시 세포의 분리를 가능하게 함), 튜브에 남아있는 내용물들을 잘 혼합하여, 세포외 매트릭스를 추가로 파괴한다.
7) 등장 용액 (전형적으로 0.9% 식염수 또는 PBS)을 튜브에 50 ml까지 첨가하고, 이 튜브를 800g/5분으로 원심분리하여, 세포와 세포외 매트릭스가 침강되기 시작하여 바닥에 펠렛으로 형성된다.
8) 세포외 매트릭스와, 생존가능한 기능성 줄기 세포를 함유한 기질 혈관 분획이 든 튜브 바닥에서 큰 펠렛이 관찰된다. 이 펠렛을 믹싱 캐뉼러 및 시린지를 이용하여 유체 약 15 ml을 사용하여 취하고, 100 ㎛ 필터에서 여과하여 임의의 큰 찌꺼기는 제거한다.
9) 세포 용액은 그대로 사용하거나, 또는 추가적인 원심분리에 의해 추가로 원심분리하고, 과잉의 유체를 제거한다.
실시예 6 - 초음파 공동화에 의한 생존가능한 줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획의 제조 (진폭 50% 및 사이클 0.4에서 1분 30초간 초음파 공동화를 수행함)
1) 지방흡입물로부터 유래된 지방 조직을 2 x 50 ml 튜브에 25 ml로 넣는다.
2) 200g/2분간 원심분리하여 과잉의 유체와 지방 조직을 분리하여, 과잉의 유체를 제거한다. 튜브 기저부의 과잉의 유체를 제거하고, 전형적으로 지방 조직 20 ml을 남긴다.
3) 초음파 공동화 디바이스 프로브 Hielschler UP200S를 지방 조직으로 배치하고, 진폭 50%, 사이클 0.4로 설정한다. 탐침을 각 튜브의 상부에서 1분간 올린 다음 다시 30초간 내린다. 지방 조직의 온도가 43℃ 보다 높아지지 않도록, 바람직하게는 37℃ 보다 높아지지 않도록 주의를 기울인다
4) 초음파 처리 후, 튜브 안에서 걸쭉한 용액이 관찰되며, 이를 800g/5분으로 원심분리한다.
5) 원심분리 후, 3개의 층이 형성된다 - 상부 지질 층, 세포외 매트릭스와 기질 혈관 세포가 포함된 중간 부유 층, 그리고 바닥 유체 층.
6) 믹싱 캐뉼러와 시린지를 이용하여 상부 지질 층을 취하여 제거하고 (지질 층의 제거는 등장성 유체 첨가시 세포의 분리를 가능하게 함), 튜브에 남아있는 내용물들을 잘 혼합하여, 세포외 매트릭스를 추가로 파괴한다.
7) 등장 용액 (전형적으로 0.9% 식염수 또는 PBS)을 튜브에 50 ml까지 첨가하고, 이 튜브를 800g/5분으로 원심분리하여, 세포와 세포외 매트릭스가 침강되기 시작하여 바닥에 펠렛으로 형성된다.
8) 세포외 매트릭스와, 생존가능한 기능성 줄기 세포를 함유한 기질 혈관 분획이 든 튜브 바닥에서 큰 펠렛이 관찰된다. 이 펠렛을 믹싱 캐뉼러 및 시린지를 이용하여 유체 약 15 ml을 사용하여 취하고, 100 ㎛ 필터에서 여과하여 임의의 큰 찌꺼기는 제거한다.
9) 세포 용액은 그대로 사용하거나, 또는 추가적인 원심분리에 의해 추가로 원심분리하고, 과잉의 유체를 제거한다.
실시예 7 - 초음파 공동화에 의한 P-층의 제조
1) 지방흡입물로부터 유래된 지방 조직을 2 x 50 ml 튜브에 25 ml로 넣는다.
2) 200g/2분간 원심분리하여 과잉의 유체와 지방 조직을 분리하여, 과잉의 유체를 제거한다. 튜브 기저부의 과잉의 유체를 제거하고, 전형적으로 지방 조직 20 ml을 남긴다.
3) 초음파 공동화 디바이스 프로브 Hielschler UP200S를 지방 조직으로 배치하고, 진폭 50%, 사이클 0.4로 설정한다. 탐침을 각 튜브에서 상부에서 1분 및 이후 30초간 올리고 내린다. 지방 조직의 온도가 43℃ 보다 높아지지 않도록, 바람직하게는 37℃ 보다 높아지지 않도록 주의를 기울인다
4) 초음파 처리 후, 튜브 안에서 걸쭉한 용액이 관찰되며, 이를 800g/5분으로 원심분리한다.
5) 원심분리 후, 3개의 층이 형성된다 - 상부 지질 층, 세포외 매트릭스와 기질 혈관 세포가 포함된 중간 부유 층 (P 층), 그리고 바닥 유체 층 (도 1).
6) 상부 지질 층과 바닥 유체 층은 제거하고, 중간 P-층을 믹싱 캐뉼러를 사용하여 수집한다.
P-층 용액은 그대로 사용하거나, 또는 추가적인 원심분리에 의해 추가로 원심분리하여 과잉의 유체를 제거하건 또는 등장성 용액으로 희석한다.
실시예 8 - 증폭된 줄기 세포의 제조
실시예 3 또는 실시예 4의 방법에 의해 수득한 세포를, 표준 세포 배양 배지 (예, 소 태아 혈청 또는 인간 혈청이 전형적으로 첨가된 알파MEM 또는 무혈청 배지)를 이용하여 분화시키지 않고 배양하였다. 일차 배양물을 1x 106/100mm로 접종하고, 세포를 1-2회 계대로 5% CO2 또는 저산소 환경에서는 증폭시켰다.
실시예 3의 분리된 기질 혈관 분획 배양물에서는, 생존가능한 세포가 증식 및 증폭할 수 있으며 (도 2), 간엽 줄기 세포의 형태를 가지는 것으로 (도 3), 확인된다.
실시예 9 - 초음파 공동화 진폭 및 사이클이 지방 조직의 온도와 세포 생존성에 미치는 영향
초음파 공동화 진폭과 사이클이 지방 조직 온도에 미치는 영향을 평가하기 위해 실험을 수행하였다 (도 4 및 5). 그 결과, 지방 조직의 온도는 하기 조건에서 43℃ 보다 높게 상승하지 않는 것으로 나타났다:
- 진폭 > 50% (사이클 0.4, 1분 30초) - 도 4 참조; 및
- 사이클 > 0.5 (진폭 50%, 1분 30초) - 도 5 참조.
또한, 공동화 및 48시간 배양 직후, 세포 생존성에 대한 초음파 공동화 진폭 효과를 평가하기 위해, 실험을 수행하였다. 진폭 증가는 공동화 직후의 세포 생존성에 대해 현저한 효과가 없지만 (도 6 및 7), 배양한 세포의 생존성은 48시간째에 진폭 > 50%에 따라 현저하게 감소하였다 (도 6).
실시예 10 - 혈소판-풍부 혈장 및 혈소판 풍부 성장 인자의 제조
1) 마취하기 전에 채혈한다. 2 x 9 mL 액시드 사이트레이트 덱스트로스 (ACD-A) 혈액 채혈관 (BD vacutainer)에 채운다 (진공압). 혈액을 18G 이상의 바늘을 사용하여 채혈하여, 전단에 의한 혈소판의 활성화를 방지한다. 채혈관의 내용물은 관을 3-4번 아래 위로 뒤집어 혼합한다.
2) ACD-A 채혈관을 450g x 10분간 원심분리한다.
3) 각 채혈관에서 동일한 이동 파이펫을 이용하여 혈장 층 (상층)을 취하여, 15 mL 무균 관으로 옮긴다. 혈액은 교란되어서는 안되며, 혈액 상의 휴면 백색 세포로 된 박층이 방지되어야 한다. 적혈구 세포 위로 혈장 층을 5 mm 남기는 것이 최선이다. 이러한 농화된 혈소판 함유 혈장 (PRP)은 후술한 바와 같이 추가로 처리하거나 또는 그대로 사용할 수 있다.
4) 혈장이 든 시험관을 2000g /10분간 원심분리하며 - 시험관 바닥에 소형 혈소판 펠렛이 형성되어야 한다.
5) 상부 혈소판 결핍 혈장은 이동 파이펫을 이용하여 1.5 mL까지 남게 취하여, 버려야 한다. 펠렛은 동일한 이동 파이펫을 이용하여 잔류물 1.5 mL에 재현탁하여야 한다. 이것이 혈소판 풍부 혈장 (PRP)이다.
6) PRP는 그대로 사용하거나, 또는 필요에 따라 칼슘 글루코네이트 (1 mL 시린지 및 바늘) 150 ㎕를 PRP에 첨가 및 잘 혼합하여 응고시킬 수 있다. 시험관은 따뜻한 수조 (37℃ - 교반하지 않음)에 두거나, 또는 실온에 두어야 한다. PRP는 솔리드 겔을 형성하여야 한다.
7) 고체화 이후에, 세포에 첨가할 준비가 되는 동안 PRP를 37℃ (진행 속도를 높이기 위함) 또는 실온에 두어, 다시 1-2시간 동안 일부 용해시킬 수 있으며 - 이는 성장 인자 풍부 혈장 (PRGF)이다.
실시예 11 - 주입용 기질 혈관 분획 또는 P-층의 제조
실시예 3 - 9의 방법에 따라 수득한 세포들을 주입하기 전에 PRP 또는 PRGF로 처리할 수 있다. PRGF, 전형적으로 2.5 ml을 주입하기 건에 세포에 직접 첨가한다. 세포와 PRGF를 실시예 12와 같이 적용한다. PRP를 기질/줄기 세포 (전형적으로 5 ml 씩)와 함께 사용하는 경우, 솔리드 겔을 개시하기 시작하기 때문에 주사 직전에 세포에 첨가하거나 또는 기질 혈관 분획을 투여한 직후에 개별 주입할 수 있다.
실시예 12 - 지방 조직의 기질 혈관 분획의 골관절염 환자로의 투여
웨스턴 온타리오 대학과 맥마스터 대학의 관절염 지수 (WOMAC)는 관절의 통증, 강직 및 신체 기능을 비롯하여 무릎과 엉덩이 골관절염을 가진 환자의 상태를 평가하기 위해, 의료 종사자들이 이용하는, 널리 사용되는, 등록된 표준 설문서 세트이다.
WOMAC는 관절염 연구에서 가장 널리 사용되는 평가법이다. WOMAC는 통증에 대해 5 항목 (스코어 범위 0-20), 강직성에 대해 2 항목 (스코어 범위 0-8), 기능 제한에 대한 17 항목 (스코어 범위 0-68)을 평가한다. 관절염 통증 평가 시스템은 0 (통증/불안정성 없음)에서 96 (통증/불안정성이 가장 심각함) 범위이다.
WOMAC는 하위 척도 3개로 나뉘는 항목 24개로 구성된다:
- 통증 (항목 5): 보행 중, 계단을 이용할 때, 취침시, 착석시 또는 누웠을 때, 그리고 서 있을 때
- 강직성 (항목 2): 첫 걸음 후, 그 날 오후
- 신체 기능 (항목 17): 계단 이용시, 앉아있다가 일어날때, 서 있을 때, 구브릴 때, 보행시, 차에 타거나 내릴 때, 쇼핑할 때, 양말을 신거나 벗을 때, 침대에 오를 때, 침대에 누울 때, 욕조에 들어가거나 나갈 때, 앉아 있을 때, 화장실에 들어가거나 나올 때, 힘든 가사 노동시, 경도의 가사 노동시.
둔부 기능부전 및 골관절염 결과 스코어 (HOOS)는 둔부 골관절염 (OA) 도는 전체 둔부 치환 (THR) 환자를 평가하기 위한 평가 항목을 포함한다. HOOS는 골관절염 (OA)이 수반되거나 수반되지 않은 둔부 장애에 대해 사용된다. HOOS는 하위 척도 5가지로 구성된다: 통증, 그외 증상, 일상 생활 기능 (ADL), 운동 및 레크레이션 기능 (Sport/Rec) 및 둔부 관련 삶의 질 (QOL).
환자 1 - 둔부의 골관절염
지방 조직의 기질 혈관 분획을 실시예 3에 따라 준비하고, 여기에 PRGF를 처리한 다음, 각 엉덩이에 관절내 주사 (세포 84 x 106개) 및 정맥내 주사 (세포 130 x 106개)에 의해 투여하였다. 환자의 처리전 HOOS 스코어는 102였으며, 처리 후 5주째의 HOOS 스코어는 23으로 감소되어, 77% 개선되었다.
환자 2 - 무릎의 골관절염
지방 조직의 기질 혈관 분획을 실시예 3에 따라 준비하고, 여기에 PRGF를 처리한 다음, 각 무릎에 관절내 주사 (세포 100 x 106) 및 정맥내 주사 (세포 79 x 106)에 의해 투여하였다. 환자의 처리전 WOMAC 스코어는 59였으며, 처리 후 4주째의 WOMAC 스코어는 28로 감소되어, 61% 개선되었다.
환자 3 - 무릎의 골관절염
진폭 90% 및 사이클 0.9에서 3분간 설정 (지방 조직은 온도가 43℃ 보다 높아지지 않도록 하기 위해 20℃ 겔 팩으로 냉각시켰음)한 것을 제외하고는 실시예 3에 따라 지방 조직의 기질 혈관 분획을 준비하고, 여기에 PRGF를 처리한 다음, 각 무릎에 관절내 주사 (세포 100 x 106개) 및 정맥내 주사 (세포 236 x 106개)에 의해 투여하였다. 환자의 처리전 WOMAC 스코어는 37이었으며, 처리 후 11주째의 WOMAC 스코어는 7로 감소되어, 81% 개선되었다.
환자 4 - 무릎의 골관절염
실시예 4에 따라 지방 조직의 기질 혈관 분획을 준비하고, 여기에 PRP를 처리한 다음, 각 무릎에 관절내 주사 (세포 86 x 106개) 및 정맥내 주사 (세포 86 x 106개)에 의해 투여하였다. 환자의 처리전 WOMAC 스코어는 39이었으며, 처리 후 6주째의 WOMAC 스코어는 17로 감소되어, 56% 개선되었다.
환자 5 - 무릎의 골관절염
실시예 6에 따라 지방 조직의 기질 혈관 분획을 준비하고, 이를 각 무릎에 관절내 주사 (세포 175 x 106개) 및 정맥내 주사 (세포 150 x 106개)에 의해 투여하였다. 환자의 처리전 WOMAC 스코어는 38이었으며, 처리 후 2달째의 WOMAC 스코어는 8로 감소되어, 78% 개선되었다.
환자 6 - 무릎의 골관절염
실시예 5에 따라 지방 조직의 기질 혈관 분획을 준비하고, 이를 각 무릎에 관절내 주사 (세포 85 x 106개) 및 정맥내 주사 (세포 85 x 106개)에 의해 투여하였다. 환자의 처리전 WOMAC 스코어는 56이었으며, 처리 후 7달째의 WOMAC 스코어는 28로 감소되어, 50% 개선되었다.
실시예 13 - 골관절염 환자로의 P-층의 투여
환자 7 - 무릎의 골관절염
P-층 세포 (5ml)를 실시예 7에 따라 준비하여, 무릎에 관절내 주사 및 정맥내 주사에 의해 투여하였다 (세포 170 x 109개). 환자의 처리 전 WOMAC 스코어는 58이었고, 처리 후 3개월째의 WOMAC 스코어는 10으로 감소하여, 82 % 개선되었다.
환자 8 - 무릎의 골관절염
P-층 세포 (2.5ml)를 실시예 7에 따라 준비하여, 왼쪽 무릎에 관절내 주사 및 정맥내 주사에 의해 투여하였다 (세포 200 x 106개). 환자의 처리 전 WOMAC 스코어는 37이었고, 처리 후 2개월째의 WOMAC 스코어는 2로 감소하여, 94 % 개선되었다.
실시예 14 - 다른 질환의 환자에로의 지방 조직의 기질 혈관 분획의 투여.
환자 9 - 류마티티스 관절염
지방 조직의 기질 혈관 분획을 실시예 5에 따라 제조하고 (하기 사항으로 수정함 - 진폭 90%, 사이클 0.2, 4분), 정맥내 주사 (세포 276 x 107개)에 의해 투여하였다. 1주째에 환자는 괜찮은 것으로 느꼈지만, 이후 류마티스 관절염은 다시 표출되었다. 환자는 좀더 민첩해졌다고 느꼈다.
방법 ID 상태 세포 수 및 전달 결과
실시예 5 10 운동 신경 질환 IV 130 x 106 + 냉동보존한 세포 반복 주사 체중이 처리한 이후 11개월간 안정적이며, 보행이 개선됨. 스스로 좋다고 느낌
실시예 5 11 급성 전방 십자인대 파열 (ACL) IA 169 x 106, 6개월 후 2차 IA 주사 91 x 106 파열된 인대가 다시 붙어 완전히 치유되어, 사이클링, 런닝 등 마라톤 가능
실시예 5 12 회전 근개 및 근긴장이상 각 어깨에 IA 23 x 106 & 100 x 106 IV. 2차 IV 5달 후 세포 250 x 106개 어깨 통증이 없어져 다음날 밤에 잠을 잘 잤으며, 오른쪽 손 오픈. 3개월째에 2차 주사 후 근긴장이상이 개선됨
실시예 5 13 다발성 경화증 IV 389 x 106 & IA 150 x 106 방광 기능 개선, 수면 향상, 에너지와 체력이 향상됨
실시예 5 14 안면견갑상완근 이영양증 (FSHD) IV 180 x 106 1주일 간격으로 여러번 치료를 수행함, 개선은 보이지 않음
실시예 5 15 강직성 대마비 IV 80 x 106 팔/손의 힘이 1-2개월째에 모두 향상됨
실시예 6 16 류마티스 관절염 IV 10 x 106 통증이 완화되고, RF가 감소되면, 모든 약물 치료가 중단됨. 한달간 지속됨. 일시적인 개선
실시예 6 17 다발성 경화증 IV 200 x 106 2주 후 신체가 건강해지고, 방광/장 기능이 개선됨. 6개월 후 진척이 유지됨
실시예 6 18 근이영양증 IV 100 x 106 -> 매주 7x 113 x106 2달 후 체력이 개선되고, 보행이 개선(균형)되고, 근긴장이 증가됨
실시예 6 19 공피증 IV 111 x 106 -> 매달 IV 처리 55 x 106 op 후 2일간 더 건강해진 것으로 느낌, 무기력 또한 개선되는 것으로 보임
실시예 5 20 만성 피로 IV 1.9 x 109 op 후 2일 간 더 활력이 생기고, 1달 후 에너지 수준이 변동됨
실시예 6 21 강직성 척추염, 만성 피로 증후군 1 x 106 IV 및 .5 x 106 IA, 각 어깨에 어깨가 개선됨, 피로는 개선되지 않음
실시예 6 22 뇌척추 운동실조 IV 200 x 106 -> 3달 및 4달째에 5.3 x 106 IA 및 100 x 106 첫 3개월 동안에는 복시가 달라지지 않았음. 2차 및 3차후, 증상이 수적으로 향상됨
실시예 6 23 신경 손상 IV 463 x 106 2달 후 개선됨, 일부 감각도 다시 돌아옴
실시예 6 24 양측 하지 족하수 (Bilateral Foot Drop) 각 무릎에 IV 100 x 106 IA 50 x 106. 2차 주사 IA 74 x 106 2달 후 다음날 다리에 약간의 개선이 있으며, 2차 주사 후 다리에 따끔한 느낌이 있음
실시예 6 25 천식 IV 200 x 106 & IA 200 x 106 객담이 더 쉽게 올라오며, 1달 후 관절 개선이 지속되며, 호흡이 쉬워짐

Claims (19)

  1. 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획 (stromal vascular fraction)을 분리하는 방법으로서,
    지방 조직에, 초음파 공동화 (ultrasonic cavitation) 처리를, 상기 조직을 파괴하고 성숙한 지방세포를 세포 분해하면서 동시에 기질/줄기 세포의 생존성은 유지하는데 충분한 시간, 진폭 (amplitude) 및 사이클로 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지방 조직의 온도는 초음파 공동화를 수행하는 동안 상기 기질/줄기 세포의 생존성을 확보하는 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 지방 조직의 온도는 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 지방 조직은 진폭 약 20 - 약 90% 및 사이클 약 0.2 - 약 0.9로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여 약 10초 - 약 10분간의 초음파 공동화에 의해 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 시간, 진폭 및 사이클은, 상기 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않도록 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 지방 조직은 진폭 약 50% 및 사이클 약 0.4 - 약 0.5로 설정된 초음파 탐침을 이용하여 약 1분 30초 - 약 1분 40초간 초음파 공동화에 의해 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 초음파 공동화에 의해 생성되는 지질 층을 제거한 다음, 등장성 용액을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 방법에 의해 분리된 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획.
  9. 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애의 치료 방법으로서,
    제8항에 따른 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애의 치료 방법으로서,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 방법에 의해 분리된 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애의 치료용 약제를 제조하기 위한,
    제8항에 따른 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획의 용도.
  12. 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애의 치료용 약제를 제조하기 위한,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 방법에 의해 분리된 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획의 용도.
  13. 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애를 치료하는데 사용하기 위한,
    제8항에 따른 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획.
  14. 골관절염, 관절-관련 염증 장애, 염증성 관절염 장애, 연조직 상해 또는 열상, 연골 장애, 골 장애, 자가면역 장애, 근 위축증, 만성 피로, 폐 장애, 폐 염증성 장애, 신경계 장애, 척추 장애 또는 신경학적 장애를 치료하는데 사용하기 위한,
    제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 따른 방법에 의해 분리된 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는, 기질 혈관 분획.
  15. 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법으로서,
    지방 조직에, 초음파 공동화 처리를, 약 1분 30초 - 약 1분 40초간, 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않게 하는 진폭 및 사이클로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법으로서,
    진폭이 약 50%로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여 지방 조직을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 디바이스는 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않게 하는 사이클 및 시간으로 설정되어 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법으로서,
    사이클이 약 0.4 - 약 0.5로 설정된 초음파 디바이스를 이용하여 지방 조직을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 디바이스는 지방 조직의 온도가 약 43℃ - 약 45℃를 넘지 않게 하는 진폭 및 시간으로 설정되어 적용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 지방 조직으로부터 생존가능한 기질/줄기 세포를 포함하는 기질 혈관 분획을 분리하는 방법으로서,
    상기 지방 조직에, 초음파 공동화 처리를, 약 1분 30초 - 약 1분 40초간, 진폭 약 50% 및 사이클 약 0.4 - 약 0.5로 설정된 초음파 탐침을 이용하여 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 초음파 공동화에 의해 지방 조직으로부터 분리되는 기질 혈관 분획에서 기질/줄기 세포의 생존성을 유지시키는 방법으로서,
    상기 초음파 공동화의 시간, 진폭 및 사이클은, 상기 세포를 48시간 배양한 후 기질/줄기 세포가 생존하도록, 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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