KR20150052995A - Method for the detection of fungal disease by loop-mediated isothermal amplification - Google Patents

Method for the detection of fungal disease by loop-mediated isothermal amplification Download PDF

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KR20150052995A
KR20150052995A KR1020130134609A KR20130134609A KR20150052995A KR 20150052995 A KR20150052995 A KR 20150052995A KR 1020130134609 A KR1020130134609 A KR 1020130134609A KR 20130134609 A KR20130134609 A KR 20130134609A KR 20150052995 A KR20150052995 A KR 20150052995A
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윤병수
임희영
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임희영
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Abstract

Disclosed is a method for detecting stone brood disease or chalk brood disease using a more accurate loop-mediated isothermal amplification (LAMP), not using an existing RT-PCR as a method for checking initial infection with stone brood disease and chalk brood disease as a fungal disease of honey bee. Provided in the present invention is a method for detecting stone brood disease or chalk brood disease by performing isothermal amplification with a primer composition including primer sets of sequence number 1 to 4.

Description

고리-매개 등온 증폭법을 이용한 진균성 질병 검출 방법{METHOD FOR THE DETECTION OF FUNGAL DISEASE BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION}METHOD FOR DETECTING FUNGAL DISEASE BY LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION FIELD OF THE INVENTION [0001]

본 발명은 진균성 질병 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고리-매개 등온 증폭법을 이용한 석고병 또는 백묵병 검출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a fungal disease detection method, and more particularly, to a method for detecting gypsum or chalk disease using a ring-mediated isothermal amplification method.

꿀벌의 수분매개 활동에 의해 세계 식량의 25%가 생산되며, 양봉산업을 통해 각종 기능성 식품은 물론 각종 질병 치료제도 제공되고 있다. 또한, 꿀벌은 화분매개 곤충으로 전 세계 주요 100대 농작물의 71%를 수정하여 농업생산에 큰 영향을 줄 뿐만 아니라 각종 유용 산물을 생산하여 그 경제적 가치는 매우 높다. 그러나, 해충, 응애, 원생동물, 곰팡이, 박테리아, 바이러스 등에 의하여 유발된 질병으로 봉군 감소 및 폐사로 농업생산에 심각한 위기를 초래하고 있다.The bee's moisture-mediated activity produces 25% of the world's food, and the beekeeping industry is providing various functional foods as well as various disease treatments. In addition, honey bees are pollen-borne insects that modify 71% of the world's top 100 crops, which not only greatly affects agricultural production, but also produces a variety of useful products. However, diseases caused by insect pests, mites, protozoa, fungi, bacteria, viruses, etc.

그 중 꿀벌의 진균성 질병으로는 백묵병(Chalk brood disease)와 석고병(Stone brood disease)이 가장 잘 알려져 있으며, 국내에서는 이 두 질병의 이름이 혼동되어 사용되고 있다. 하지만, 백묵병은 아스코스파에라 아피스(Ascosphaera apis)가 원인균인 것에 비해서 석고병은 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 균에 의해 발병이 되며 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)에 의해 가장 빈번하게 발병된다. 석고병의 원인 균은 독일의 Maassen에 의해 최초로 보고되었으며, 발병은 병원성의 포자가 애벌레의 소화기 안에 들어가 발아하며, 이 균사가 각 조직에 침투해 들어가 자라남에 따라 애벌레가 치사되어 사체는 딱딱한 석고 모양의 형상으로 발견된다. 그렇기에 백묵병과 비교하여 증상이 비슷하기 때문에 일반 농가에서는 혼용되어 보고되기도 한다.Among them, Chalk brood disease and Stone brood disease are the best known fungal diseases of honey bee. In Korea, the names of these diseases are confused. However, chalk disease is caused by Ascosphaera apis , whereas gypsum disease is caused by Aspergillus bacteria and most frequently by Aspergillus flavus . . The causative organism of gypsum disease was first reported by Maassen in Germany. Pathogenic spores germinate in larvae digestive germs. As the mycelium penetrates into each tissue and grows, the larvae die and the carcass becomes hard plaster . Therefore, the symptoms are similar to those of chalky mildew, so they are reported mixed in general farms.

백묵병과 석고병은 강원도 지방의 양봉농가에서 가장 심각하게 인식된 질병으로 조사된 바 있으며, 적지 않은 피해를 주는 것으로 알려져 있다. 또한, 많은 경우 노제마, 바이러스, 부저병과 함께 혼합 감염을 야기시킬 위험성이 매우 높으며, 이런 혼합 감염은 보다 심각한 결과를 초래하게 된다. 그러므로, 꿀벌 진균성 질병의 빠른 조기진단, 예방법 및 치료법의 개발이 요구되고 있다.Chungbuk and gypsum were the most seriously recognized disease in beekeeping farmers in Gangwon province and are known to cause a lot of damage. Also, in many cases there is a high risk of causing mixed infections with Nogema, viruses, and buzzer illnesses, and such mixed infections will have more serious consequences. Therefore, there is a demand for rapid early diagnosis, prevention and treatment of bee fungal diseases.

[선행기술문헌][Prior Art Literature]

- 공개특허 제2010-0083398호(2010.07.22)- Patent Publication No. 2010-0083398 (July 22, 2010)

이에 본 발명은 꿀벌의 진균성 질병으로 백묵병과 석고병의 초기 감염 확인을 위한 방법으로서, 기존의 RT-PCR을 사용하는 것이 아니라, 더욱 더 정확성이 높은 고리-매개 등온 증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplification; LAMP)을 사용하는 백묵병과 석고병의 탐지 방법을 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention is a method for confirming the initial infection of chalk and gypsum with fungal diseases of bees. It is not a conventional RT-PCR method but a more accurate loop-mediated isothermal amplification method Amplification (LAMP) is used for the detection of chalk and gypsum bottles.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 석고병(Stone brood disease) 또는 백묵병(Chalk brod disease)을 검출하는 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for detecting a stone brood disease or a chalk brod disease by performing an isothermal amplification reaction with a primer composition comprising the primer set of SEQ ID NOS: to provide.

또한, 상기 등온증폭반응은 46~54℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.Also, the isothermal amplification reaction is performed at 46 to 54 ° C.

또한, 상기 등온증폭반응은 내부 프라이머 농도 20~60pmole 및 외부 프라이머 농도 5~15pmole에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.Also, the isothermal amplification reaction is performed at an internal primer concentration of 20 to 60 pmoles and an external primer concentration of 5 to 15 pmole.

또한, 상기 등온증폭반응은 dNTP 농도 1.25~5mM에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.Also, the isothermal amplification reaction is performed at a dNTP concentration of 1.25 to 5 mM.

이러한 본 발명에 따르면, 기존 RT-PCR 반응을 수행하여 꿀벌의 진균성 질병을 검출하는 방법보다 신속하고 감도가 좋은 고리-매개 등온 증폭법을 이용하여, 등온이라는 장점으로 현장에 적용 가능할 뿐만 아니라, 꿀벌의 바이러스 감염여부도 쉽게 모니터링하여 판단할 수 있는 효과가 있다.According to the present invention, it is possible to apply the present invention to a field with the advantage of isothermal using a ring-mediated isothermal amplification method which is quicker and more sensitive than a conventional method of detecting fungal diseases of bees by performing an existing RT-PCR reaction, It is also possible to easily monitor and judge whether a bee is infected with a virus.

도 1 및 도 2는 각각 실시예 2에 따라 수행된 A. flavus-LAMP 및 A. apis-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진,
도 3 및 도 4는 각각 실시예 3에 따라 프라이머 농도 및 dNTP 농도 변화에 따른 A. apis & A. flavus-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진.1 and 2 are electrophoresis images showing A. flavus- LAMP and A. apis- LAMP results, respectively, performed according to Example 2,
FIG. 3 and FIG. 4 are electrophoresis images showing the results of A. apis & A. flavus- LAMP according to the change in primer concentration and dNTP concentration, respectively, according to Example 3. FIG.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. Prior to this, terms and words used in the present specification and claims should not be construed as limited to ordinary or dictionary terms, and the inventor should appropriately interpret the concepts of the terms appropriately The present invention should be construed in accordance with the meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention. Accordingly, it is to be understood that the constituent features of the embodiments described herein are merely the most preferred embodiments of the present invention, and are not intended to represent all of the inventive concepts of the present invention, so that various equivalents, And the like.

본 발명자들은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행할 경우 신속, 정확하게 석고병과 백묵병을 탐지할 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.The inventors of the present invention have found that when an isothermal amplification reaction is performed with a primer composition comprising the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4, it is possible to rapidly and accurately detect gypsum and chalk disease.

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 석고병(Stone brood disease) 또는 백묵병(Chalk brod disease)을 검출하는 방법을 개시한다. 이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명한다.
Accordingly, the present invention discloses a method for detecting a Stone brood disease or Chalk brod disease by performing an isothermal amplification reaction with a primer composition comprising the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

실시예Example 1:  One: 프라이머primer 설계 및 제작 Design and production

아스코스파에라 아피스(이하, 'A. apis'라 칭함.) 및 아스퍼질러스 플라버스(이하, 'A. flavus'라 칭함.)-고리-매개 등온 증폭법(이하, 'LAMP'라 칭함.)에 사용할 프라이머 세트(primer set)를 하기 표 1에 나타내었다.(Hereinafter referred to as ' A. apis ') and aspergillus flavus (hereinafter referred to as ' A. flavus' ) - ring-mediated isothermal amplification method (hereinafter referred to as 'LAMP'). ) Are shown in the following Table 1. < tb >< TABLE >

Figure pat00001
Figure pat00001

표 1을 참조하면, 정방향 내부 프라이머(Forward inner primer)인 A. apis & A. flavus-FIP는 A. flavus 안티센스 서열(antisense sequence)과 A. apis 안티센스 서열의 상보적인 염기서열(F2)과 TTTT 연결자(linker) 및 고리(loop)를 형성하는 염기서열(F1c) 부분을 결합한 것으로, 45개 뉴클레오티드(45nt)의 긴 뉴클레오티드(long-nucleotide)로 제작하였다. 역방향 내부 프라이머(Reverse inner primer)인 A. apis & A. flavus-BIP는 A. flavus 센스 서열(sense sequence)과 A. apis 안티센스 서열(antisense sequence)의 상보적인 염기서열(B2)과 TTTT 연결자(linker) 및 고리(loop)를 형성하는 염기서열(B1c) 부분을 결합한 것으로, 각각 48개 뉴클레오티드(48nt)의 긴 뉴클레오티드(long-nucleotide)로 제작하였다. 또한, 외부 프라이머(outer primer)인 A. apis & A. flavus-F3와 A. apis & A. flavus-B3는 내부 프라이머(inner primer)들의 바깥쪽에 위치하도록 설계하였으며, 각각 22개 뉴클레오티드(22nt) 및 20개 뉴클레오티드(20nt)의 크기로 제작하였다. 이 프라이머 세트는 Bionics사(한국)에 의뢰하여 제작하였으며 내부 프라이머들의 경우에는 PAGE 정제 후 사용하였다.
As shown in Table 1, the forward internal primer, A. apis & A. flavus -FIP, contains the A. flavus antisense sequence and the complementary base sequence (F2) of the A. apis antisense sequence and the TTTT Linker and a portion of the nucleotide sequence (F1c) that forms a loop, and was made with a long nucleotide of 45 nucleotides (45 nt). The reverse inner primer, A. apis & A. flavus -BIP, contains a complementary sequence (B2) between the A. flavus sense sequence and the A. apis antisense sequence and a TTTT linker linker) and a nucleotide sequence (B1c) forming a loop, each of which is made of a long nucleotide of 48 nucleotides (48 nt). A. apis & A. flavus- F3 and A. apis & A. flavus- B3, which are outer primers, were designed to be located on the outer side of inner primers and 22 nucleotides (22 nt) And 20 nucleotides (20 nt) in size. This primer set was prepared by Bionics (Korea) and internal primers were used after PAGE purification.

실시예Example 2:  2: LAMPLAMP 최적 반응 온도 확인 Determination of optimum reaction temperature

먼저, A. flavus 검출을 위한 프라이머 세트의 활성 최적 온도를 측정하였다. 반응액은 주형인 A. flavus 플라스미드(plasmid) 1ng, A. flavus-FIP/BIP는 각각 40pmole, A. flavus-F3/B3는 각각 10pmole, 5mM dNTP, 10×완충액(Reaction buffer), 8U Bst DNA 중합효소(polymerase)(NEB, 미국), DMSO(최종농도 5%)를 첨가하여 총 20㎕로 조성하였다. Bst DNA 중합효소는 80℃ 이상이 되면 불활성화되는 특징을 가지고 있어, 94℃에서 5분간 DNA를 해리시킨 뒤 즉시 4℃로 온도를 낮추고 1분 정치 후에 첨가하였으며, 이후 60분간 DNA 신장을 진행하였고 80℃에서 10분간 정치해 Bst DNA 중합효소를 불활성화시킨 후 종료하였다. DNA 신장의 최적온도 측정은 45~65℃ 구간에서 1시간 동안 등온조건하에서 진행하였으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인하여 A. flavus-LAMP에 대한 최적온도를 확인하였다.First, the optimum temperature of the primer set for the detection of A. flavus was measured. The reaction mixture contained 1 ng of A. flavus plasmid, 40 pmoles of A. flavus- FIP / BIP, 10 pmole of each of A. flavus- F3 / B3, 5 mM dNTP, 10 × buffer (Reaction buffer) Polymerase (NEB, USA) and DMSO (final concentration: 5%) were added to make a total of 20 μl. The Bst DNA polymerase was inactivated when the temperature was above 80 ° C. After the DNA was dissociated at 94 ° C for 5 minutes, the temperature was immediately lowered to 4 ° C. After 1 minute, the DNA was elongated for 60 minutes After standing at 80 ° C for 10 minutes, the Bst DNA polymerase was inactivated and terminated. The optimum temperature for DNA elongation was measured at 45 ~ 65 ℃ for 1 hour under isothermal conditions. After each LAMP reaction, the optimum temperature for A. flavus - LAMP was confirmed by electrophoresis.

다음으로, A. apis 검출을 위한 프라이머 세트의 활성 최적 온도를 측정하였다. 반응액은 주형인 A. apis 플라스미드 1ng, A. apis & A. flavus-FIP/BIP는 각각 40pmole, A. apis & A. flavus-F3/B3는 각각 10pmole, 2.5mM dNTP, 10×완충액, 8U Bst DNA 중합효소(NEB, 미국), DMSO(최종농도 5%)를 첨가하여 총 20㎕로 조성하였다. Bst DNA 중합효소는 80℃ 이상이 되면 불활성화되는 특징을 가지고 있어, 94℃에서 5분간 DNA를 해리시킨 뒤 즉시 4℃로 온도를 낮추고 1분 정치 후에 첨가하였으며, 이후 60분간 DNA 신장을 진행하였고 80℃에서 10분간 정치해 Bst DNA 중합효소를 불활성화시킨 후 종료하였다. DNA 신장의 최적온도 측정은 45~65℃ 구간에서 1시간 동안 등온조건하에서 진행하였으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인하여 A. apis & A. flavus-LAMP에 대한 최적온도를 확인하였다.Next, the active optimum temperature of the primer set for A. apis detection was measured. The reaction mixture is mold in plasmid A. apis 1ng, A. apis & A. flavus -FIP / BIP each 40pmole, A. apis & A. flavus -F3 / B3 are each 10pmole, 2.5mM dNTP, 10 × buffer, 8U Bst DNA polymerase (NEB, USA) and DMSO (final concentration 5%) were added to make 20 μl total. The Bst DNA polymerase was inactivated when the temperature was above 80 ° C. After the DNA was dissociated at 94 ° C for 5 minutes, the temperature was immediately lowered to 4 ° C. After 1 minute, the DNA was elongated for 60 minutes After standing at 80 ° C for 10 minutes, the Bst DNA polymerase was inactivated and terminated. The optimal temperature for DNA elongation was measured at 45 ~ 65 ℃ for 1 hour under isothermal condition. After each LAMP reaction, the optimum temperature for A. apis & A. flavus - LAMP was confirmed by electrophoresis.

도 1 및 도 2는 각각 실시예 2에 따라 수행된 A. flavus-LAMP 및 A. apis-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 도 1 및 도 2에서 레인 1 내지 8은 각각 45℃, 46.7℃, 48.2℃, 53.4℃, 56.7℃, 61.8℃, 63.4℃, 65℃에서 진행한 LAMP-PCR 결과이고, 레인 N은 LAMP-PCR의 음성 대조군(negative control) 결과를 나타내고 있다.1 and 2 are electrophoresis images showing A. flavus- LAMP and A. apis- LAMP results, respectively, performed according to Example 2. FIG. Lanes 1 to 8 in FIG. 1 and FIG. 2 are LAMP-PCR results at 45 ° C, 46.7 ° C, 48.2 ° C, 53.4 ° C, 56.7 ° C, 61.8 ° C, 63.4 ° C and 65 ° C, (Negative control) results.

먼저, 도 1을 참조하면, 실험 결과 46~54℃에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 47℃부터 강하게 증폭이 되는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 약 48℃부터 LAMP에 의한 증폭량이 가장 크게 나온 것으로 확인되었다. 따라서, A. flavus는 상기 사용된 프라이머에서는 48℃가 최적의 온도인 것으로 확인되었다.First, referring to FIG. 1, it was confirmed that the amplification was good at 46 to 54 ° C. and strongly amplified at 47 ° C. Among them, the amplification by LAMP was the largest at about 48 ° C. Respectively. Therefore, it was confirmed that A. flavus had an optimal temperature of 48 캜 in the primer used above.

다음으로, 도 2를 참조하면, 실험 결과 백묵병 또한, 46~54℃에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 47℃부터 강하게 증폭이 되는 것을 확인할 수 있었으며, 그 중에서도 약 48℃부터 증폭량이 가장 크게 나온 것으로 확인되었다. 따라서, 결과적으로 진균성 질병(백묵병, 석고병)용 LAMP 키트(Kit)의 최적온도를 48℃로 확정할 수 있었다.
Next, referring to FIG. 2, it was found that the chalky bottle also showed a good amplification at 46 to 54 ° C., and that the amplification was strongly amplified at 47 ° C., It was confirmed that it came out largely. As a result, the optimum temperature of the LAMP kit for fungal diseases (chalk disease, gypsum bottle) was determined to be 48 ° C.

실시예Example 3:  3: LAMPLAMP 최적 반응액 조성 확인 Determination of Optimum Reaction Solution Composition

먼저, A. flavus-LAMP의 최적 반응 조건을 확립하기 위하여 프라이머 세트와 dNTP의 농도를 달리하여 반응액 조성에 따른 최적 조건을 확인하였다. 프라이머의 농도는 Notomi 등(2000)이 제시한 외부 프라이머와 내부 프라이머의 농도가 1:4일때 가장 높은 효율을 보였다는 결과를 바탕으로 이 비율을 유지하되 프라이머의 절대농도만을 변화시켜 그 결과를 측정하였다. 즉, 내부 프라이머의 각 농도가 20pmole, 40pmole, 60pmole, 80pmole, 100pmole일 때 외부 프라이머의 각 농도는 5pmole, 10pmole, 15pmole, 20pmole, 25pmole로 하여 LAMP를 수행하였다. dNTP의 경우 각각 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM이 되도록 조성하여 측정함으로써 최적 반응 조건을 확인하였다.First, to establish optimal reaction conditions for A. flavus- LAMP, optimum conditions according to the reaction solution composition were determined by varying the concentrations of primer set and dNTP. The concentration of the primer was determined by Notomi et al. (2000), which showed the highest efficiency when the concentration of external primer and internal primer was 1: 4. Respectively. That is, when the concentrations of the internal primers were 20 pmole, 40 pmole, 60 pmole, 80 pmole, and 100 pmole, the concentrations of the external primers were 5 pmole, 10 pmole, 15 pmole, 20 pmole, and 25 pmole, respectively. and dNTPs were prepared so as to be 1.25 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM and 10.0 mM, respectively.

다음으로, A. apis & A. flavus-LAMP의 최적 반응 조건을 확립하기 위하여 프라이머 세트와 dNTP의 농도를 달리하여 반응액 조성에 따른 최적 조건을 확인하였다. 프라이머의 농도는 Notomi 등(2000)이 제시한 외부 프라이머와 내부 프라이머의 농도가 1:4일 때 가장 높은 효율을 보였다는 결과를 바탕으로 이 비율을 유지하되 프라이머의 절대농도만을 변화시켜 그 결과를 측정하였다. 즉, 내부 프라이머의 각 농도가 20pmole, 40pmole, 60pmole, 80pmole, 100pmole일 때 외부 프라이머의 각 농도는 5pmole, 10pmole, 15pmole, 20pmole, 25pmole로 하여 LAMP를 수행하였다. dNTP의 경우 각각 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM이 되도록 조성하여 측정함으로써 최적 반응 조건을 확인하였다.Next, optimal conditions for the reaction mixture were determined by varying the concentrations of primer set and dNTP to establish optimal reaction conditions for A. apis & A. flavus- LAMP. The concentration of the primer was the highest when the concentration of the external primer and the internal primer indicated by Notomi et al. (2000) was 1: 4, and the ratio was maintained, but only the absolute concentration of the primer was changed. Respectively. That is, when the concentrations of the internal primers were 20 pmole, 40 pmole, 60 pmole, 80 pmole, and 100 pmole, the concentrations of the external primers were 5 pmole, 10 pmole, 15 pmole, 20 pmole, and 25 pmole, respectively. and dNTPs were prepared so as to be 1.25 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM and 10.0 mM, respectively.

도 3 및 도 4는 각각 실시예 3에 따라 프라이머 농도 및 dNTP 농도 변화에 따른 A. apis & A. flavus-LAMP 결과를 나타낸 전기영동 사진이다. 도 3에서 레인 M은 1kbp 래더 마커(ladder marker), 레인 1 내지 5는 A. apis-LAMP 결과이고 각각 내부 프라이머 농도/외부 프라이머 농도가 20pmole/5pmole, 40pmole/10pmole, 60pmole/15pmole, 80pmole/20pmole, 100pmole/25pmole일 때, 레인 6 내지 10은 A. flavus-LAMP 결과이고 각각 내부 프라이머 농도/외부 프라이머 농도가 20pmole/5pmole, 40pmole/10pmole, 60pmole/15pmole, 80pmole/20pmole, 100pmole/25pmole일 때, 레인 N은 음성 대조군(negative control) 결과를 나타내고 있다. 또한, 도 4에서 레인 M은 1kbp 래더 마커(ladder marker), 레인 1 내지 5는 A. apis-LAMP 결과이고 각각 dNTP 농도가 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM일 때, 레인 6 내지 10은 A. flavus-LAMP 결과이고 1.25mM, 2.5mM, 5mM, 7.5mM, 10.0mM일 때, 레인 N은 음성 대조군(negative control) 결과를 나타내고 있다. 3 and 4 are electrophoresis images showing the results of A. apis & A. flavus- LAMP according to the change in primer concentration and dNTP concentration, respectively, according to Example 3. Fig. 3, lane M was 1 kbp ladder marker, lanes 1 to 5 were results of A. apis- LAMP and internal primer concentration / external primer concentration was 20 pmole / 5 pmole, 40 pmole / 10 pmole, 60 pmole / 15 pmole, 80 pmole / , Lane 6-10 were A. flavus- LAMP results, and when the internal primer concentration / external primer concentration was 20 pmole / 5 pmole, 40 pmole / 10 pmole, 60 pmole / 15 pmole, 80 pmole / Lane N shows negative control results. 4, lane M was 1 kbp ladder marker, lanes 1 to 5 were results of A. apis- LAMP, and lane 6, lane 6, and lane 6 when dNTP concentrations were 1.25 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, To 10 are A. flavus- LAMP results and lane N shows negative control results when 1.25 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, and 10.0 mM.

도 3을 참조하면, 먼저, 각각의 내부 프라이머 농도 60~100pmole 및 외부 프라이머 농도 5~15pmole에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 내부 프라이머가 40pmole이고 외부 프라이머가 10pmole일 때 부터 석고병 및 백묵병 유전자의 증폭을 가장 잘 확인할 수 있었다. 물론 레인 3~5 또한 증폭이 양호하였으나, 레인 2와의 증폭량에서 큰 차이를 보이지 않고 있기에 레인 2에 사용한 조성의 프라이머를 최적 프라이머 농도로 확인하였다.Referring to FIG. 3, it can be seen that the internal primer concentration was 60 to 100 pmoles and the external primer concentration was 5 to 15 pmole, respectively. Since the internal primer was 40 pmole and the external primer was 10 pmole, The amplification of the gene was best confirmed. Of course, the lanes 3 to 5 were also amplified well, but since the amount of amplification with lane 2 did not show a large difference, the primer of the composition used in lane 2 was confirmed as the optimal primer concentration.

다음으로, dNTP 농도 1.25~5mM에서 양호한 증폭을 보인 것을 알 수 있고, 1.25mM의 dNTP와 2.5mM의 dNTP에서 반응이 가장 잘 일어난 것을 확인할 수 있었다. dNTP 농도가 5mM을 초과하면 양쪽 모두 증폭이 일어나지 않았고, 가장 반응이 잘 일어난 농도는 2.5mM로 확인되었다.
Next, it was found that the amplification was satisfactory at a dNTP concentration of 1.25 to 5 mM, and it was confirmed that the reaction was best performed at 1.25 mM dNTP and 2.5 mM dNTP. When the dNTP concentration exceeded 5 mM, no amplification occurred, and the most favorable concentration was 2.5 mM.

실시예Example 4: 최종 확립 조건 4: Final establishment condition

실시예 3에서 확인된 최적 반응액 조성을 기초로 하기 표 2에 제시된 조성으로 실험을 진행하였다. Bst DNA 중합효소는 80℃ 이상이 되면 불활성화되는 특징을 가지고 있어, 99℃에서 10분간 DNA를 해리시킨 뒤 즉시 4℃로 온도를 낮추고 1분 정치 후에 첨가하였으며, 이후 60분간 DNA 신장을 진행하였고, 80℃에서 10분간 정치해 Bst DNA 중합효소를 불활성화시킨 후 종료하였다. DNA 신장의 최적온도로 확인된 48℃ 구간에서 1시간 동안 등온조건하에서 진행하였으며, 각 LAMP 반응이 끝난 후 전기영동으로 확인한 결과 DNA가 성공적으로 증폭됨을 확인하였다.Based on the optimum reaction liquid composition identified in Example 3, the experiment was carried out with the compositions shown in Table 2 below. The Bst DNA polymerase was inactivated when the temperature was above 80 ° C. After the DNA was dissociated at 99 ° C for 10 minutes, the temperature was immediately lowered to 4 ° C. After 1 minute, the DNA was elongated for 60 minutes , And incubated at 80 ° C for 10 minutes to inactivate the Bst DNA polymerase and terminate. After incubation at 48 ℃ for 1 hour, DNA was successfully amplified by electrophoresis after each LAMP reaction.

Figure pat00002
Figure pat00002

이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
While the preferred embodiments of the present invention have been disclosed for illustrative purposes, those skilled in the art will appreciate that various modifications, additions and substitutions are possible, Such modifications and changes are to be considered as falling within the scope of the following claims.

Claims (4)

서열번호 1 내지 4의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물로 등온증폭반응을 수행하여 석고병(Stone brood disease) 또는 백묵병(Chalk brod disease)을 검출하는 방법.A method for detecting a Stone brood disease or Chalk brod disease by performing an isothermal amplification reaction with a primer composition comprising the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4. 제1항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 46~54℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1,
Wherein the isothermal amplification reaction is performed at 46 to 54 占 폚. 제1항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 내부 프라이머 농도 20~60pmole 및 외부 프라이머 농도 5~15pmole에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 1,
Wherein the isothermal amplification reaction is performed at an internal primer concentration of 20 to 60 pmoles and an external primer concentration of 5 to 15 pmoles. 제1항에 있어서,
상기 등온증폭반응은 dNTP 농도 1.25~5mM에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the isothermal amplification reaction is performed at a dNTP concentration of 1.25 to 5 mM.
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