KR20150046348A - 식물에서 피코르나바이러스-유사 입자 생산 - Google Patents

식물에서 피코르나바이러스-유사 입자 생산 Download PDF

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Abstract

식물에서 피코르나바이러스-유사 입자 (PVLP)를 생산하는 방법이 제공된다. 방법은 제1 핵산 및 제2 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입하는 단계를 포함한다. 제1 핵산은 피코르나바이러스 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함한다. 제2 핵산은 하나 이상의 피코르나바이러스 프로테아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함한다. 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포는 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양되고, 이로 인해 PVLP를 생산한다. 폴리펩티드를 포함하는 PVLP가 또한 제공된다.

Description

식물에서 피코르나바이러스-유사 입자 생산{PICORNAVIRUS-LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PLANTS}
본 발명은 식물에서 피코르나바이러스(picornavirus) 구조 단백질의 생산에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 또한 식물에서 피코르나바이러스 구조단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자에 관한 것이다.
피코르나바이러스는 인간 및 동물에서 광범위한 임상적 징후를 유발할 수 있는 작은 비-외피성 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 서열 상동성 및 신성 민감도를 포함하는 많은 속성을 기반으로 하여, 피코르나바이러스는 그 중에서 많은 속으로 분류되며, 인간 및 동물의 많은 중요한 병원체이다.
피코르나바이러스는 노출된 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 갖고 있다. 캡시드(capsid)는 빽빽한 정20면체 구조의 60개의 프로모터 배열이다. 각 프로모터는 VP (바이러스 단백질) 1, 2, 3 및 4로 알려져 있는 4개의 폴리펩티드로 구성된다. VP2 및 VP4 폴리펩티드는 VPO으로 알려져 있는 하나의 전구체로부터 기원하는데, 이것은 바이러스 게놈 RNA의 세포로의 내재화(internalization) 이후 분할된다. VP4는 캡시드의 내측면에 위치한다. 타입 및 탈수의 정도에 따라서, 바이러스 입자는 지름이 약 27-30 nm이다.
피코르나바이러스는 7.1-8.9 kb의 단립형(monopartite), 선형, 폴리아데닐화된 ssRNA(+) 게놈을 가지고 있다, 즉, 다단백질(polyprotein)을 암호화하는 단일 ORF로 구성된다. 바이러스 게놈 RNA는 그것의 5' 끝에 메틸화된 뉴클레오티드 캡(cap) 구조 대신에 바이러스 단백질 (VPg)을 갖고 있다. 5' 끝에서 긴 UTR은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 함유한다. P1 영역은 구조 폴리펩티드를 암호화한다. P2 및 P3 영역은 복제와 관련된 비구조 단백질을 암호화한다. 더 짧은 3' UTR은 (-) 가닥 합성에 중요하다. L은 프로테아제 (아프토바이러스(aphthovirus), 에르보바이러스(erbovirus))이거나 또는 다른 기능을 가질 수 있는 (코부바이러스(kobuvirus), 카르디오바이러스(cardiovirus)) 일부 속에 존재하는 추가의 N-말단 선도 단백질이다.
비리온 RNA는 전염성이고 게놈 및 바이러스 메신저(messenger) RNA 둘 다의 역할을 한다. IRES는 다단백질의 직접적인 번역을 허용한다. 다단백질은 처음에 구조 단백질, 레플리카제, VPg, 및 궁극적으로 세포 용해로 이어지는, 숙주 세포를 변형시키는 많은 단백질을 수득하기 위해 바이러스 프로테아제(들)에 의해 다양한 전구체 및 성숙한 단백질로 가공된다.
엔테로바이러스(enterovirus) 71 (EV71)은 단일 가닥 RNA 바이러스의 피코르나비리대(Picornaviridae) 과의 멤버이다. 그것은 비-외피성 바이러스이고 그것의 캡시드는 단일 바이러스 번역 생성물의 단편으로서 생산된 다중 코팅 단백질로 구성된다. 바이러스 다단백질의 구조 및 비-구조 구성요소로의 가공은 도 1에서 제공된다 (선행 기술). 다단백질 유전자의 P1 영역은 구조 단백질을 암호화하는 한편 P2 및 P3 영역은 바이러스의 비-구조 구성요소를 암호화한다. 바이러스 프로테아제 2A에 의해 다단백질로부터 구조 단백질 전구체 P1 (도 1의 1ABCD)의 분할 후, P1 전구체는 캡시드 단백질 VPO, VP1 (도 1의 1D 단편) 및 VP3 (도 1의 1C 단편)로 가공된다. 3C 구성요소 및 그것의 전구체 3CD - P3 영역에 의해 암호화됨 - 는 P1 전구체를 캡시드 단백질로 가공하는데 원인이 되는 바이러스 프로테아제이다. VPO, VP1 및 VP3 프로모터는 자발적으로 빈 캡시드로 조립하고 바이러스 RNA는 빈 입자의 조립 후 입자로 포장된다. 빈 캡시드와 게놈 RNA의 결합은 구조적 이동, RNA의 내재화, VPO의 VP2 (도 1의 1B 단편) 및 VP4 (도 1의 1A 단편)로의 자가촉매 분할, 및 안정한 150S 비리온으로의 성숙화를 초래한다. 비분할된 VP0 전구체를 함유하는 빈 캡시드는 보통 피코르나바이러스 감염 중에 발견된다.
곤충 세포에서 EV71 VLP의 생산은 P1 전구체 단백질과 3CD 프로테아제의 동시-발현으로부터 얻어졌다 (Hu et al., 2003, Biotechnology Letters 25: 919-925). P1 및 3CD의 생산에 단일 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터의 사용은 Chung et al. (2008, Vaccine 26: 1855-1862)에 의해 설명된다. 마우스에서 면역원성 연구는 정제된 EV71 VLP가 바이러스의 치사량으로의 도전에 대한 보호를 부여한다는 것을 나타냈다.
EV71의 VP1 단백질은 트랜스제닉(transgenic) 토마토의 열매에서 생산되었고, 마우스에 VP1을 함유하는 트랜스제닉 열매를 공급하는 것은 VP1-특이적 배설물 IgA 및 혈청 IgG의 발달을 초래하였다 (Chen et al., 2006, Vaccine24:2944-2951).
구제역 바이러스 (foot and mouth disease virus; FMDV)의 P1 전구체 단백질 및 프로테아제 3C는 트랜스제닉 알팔파(alfalfa)에서 동시-발현되었다 (Dus Santos et al. 2005, Vaccine 23: 1838-1843). 알팔파는 FMDV P1 (1A, 1B, 1C, 1D)의 게놈 영역, 2A, 2B의 N 말단의 처음 16개의 아미노산 잔기, 3B1, 3B2, 3B3, 3C의 완전한 서열 및 3D의 N 말단의 처음 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 단일 벡터로 안정하게 형질전환되었다. 트랜스제닉 식물의 조단백질(crude protein) 추출물의 면역원성은 Balb/c 마우스에서 복강 내 투여에 의해 입증되었다. 면역화된 마우스는 또한 치명적인 FMDV 도전에 대하여 보호되었다. 항원 발현의 수준은 실용적인 목적을 위해 낮았다.
아르헨티나 출원 제AR078257호는 빈 캡시드 바이러스를 발현하는 트랜스제닉 식물을 개시하며, 트랜스제닉 식물은 그것의 게놈에서 자가촉매 2A 프로테아제에 결합된 P1 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 구조를 포함한다. DNA 구조는 단백질 단편 3D를 암호화하는 서열의 단편에 결합된 3C 프로테아제를 암호화하는 서열에 부착된 단백질 단편 2B를 더 함유할 수도 있다.
본 발명은 식물에서 피코르나바이러스 구조 단백질의 생산에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 또한 식물에서 피코르나바이러스 구조 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자의 생산에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 다음을 포함하는 식물에서 피코르나바이러스-유사 입자 (PVLP)를 생산하는 방법 (A)이 제공된다:
a) 하나 이상의 피코르나바이러스 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계,
b) 하나 이상의 프로테아제를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하는 제2 핵산을 도입하는 단계;
c) 제1 및 제2 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부를 배양하여, PVLP를 생산하는 단계.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 피코르나바이러스-유사 입자 (PVLP)를 생산하는 방법 (B)를 제공한다:
a) 하나 이상의 피코르나바이러스 다단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산 및 하나 이상의 프로테아제를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 제공하는 단계,
b) 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하여 PVLP를 생산하는 단계.
식물에서 활성인 제1 조절 영역, 및 식물에서 활성인 제2 조절 영역은 같거나 다를 수도 있다.
게다가, 방법 (A) 또는 (B)에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입된 제1 핵산 대 제2 핵산의 퍼센트 비는 95%:5% 내지 50%:50%, 또는 약 20:1 내지 약 0.5:1일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A) 또는 (B)를 포함하며, 제1 핵산 서열은 하나 또는 하나 이상의 코모바이러스(comovirus) 인핸서(enhancer)와 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함하고, 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 하나 또는 하나 이상의 제미니바이러스(geminivirus) 증폭 요소, 및 제미니바이러스 레플리카제를 암호화하는 제3 핵산은 식물 또는 식물의 일부로 도입된다. 하나 또는 하나 이상의 코모바이러스 인핸서는 코모바이러스 UTR, 예를 들어, CPMV-HT 5', 3'UTR, 또는 이것들의 조합과 같이 동부 모자이크 바이러스(Cowpea Mosaic Virus) 과번역 가능한 (CPMV-HT) UTR일 수도 있다. 하나 또는 하나 이상의 제미니바이러스 증폭 요소는 강낭콩 황고병 바이러스(Bean Yellow Dwarf Virus) 긴 유전자간 영역 (BeYDV LIR), 및 BeYDV 짧은 유전자간 영역 (BeYDV SIR)으로부터 선택될 수도 있다.
상기 설명된 방법 (방법 A)은 또한 침묵의 억제자(suppressor of silencing), 예를 들어, HcPro 또는 p19를 암호화하는 또 다른 핵산를 도입하는 단계를 수반할 수도 있다.
상기 설명된 방법 (방법 B)은 또한 침묵의 억제자, 예를 들어, HcPro 또는 P19를 암호화하는 또 다른 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 제공하는 단계를 더 수반할 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A)를 포함하며, 도입 단계 (단계 a)에서는, 핵산이 식물에서 일과성으로 발현된다. 대안으로, 도입 단계 (단계 a)에서, 핵산은 식물에서 안정하게 발현된다.
상기 설명된 방법 (A) 및 (B)는 식물을 수확하고 PVLP를 정제하는 단계를 더 포함할 수도 있다.
본 발명은 면역 반응을 유발하기 위해 상기 설명된 PVLP의 유효량, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 피코르나바이러스 감염에 대한 면역력을 유발하는 방법을 포함하는데, 대상체에 상기 설명된 PVLP를 투여하는 단계를 포함한다. PVLP는 대상체에 경구로, 피부 내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법 (A) 및/또는 (B)에 의해 생산된 PVLP를 포함하는 식물 물질을 제공한다. 식물 물질은 대상체에서 피코르나바이러스 감염에 대한 면역력을 유발하는데 사용될 수도 있다. 식물 물질은 또한 식품 보충제로서 혼합될 수도 있다.
본 발명의 이 개요가 반드시 본 발명의 모든 특징을 설명하는 것은 아니다.
본 발명의 여러 특징들은 첨부된 도면을 참조하여 하기 설명으로부터 더 분명해질 것이다:
도 1은 피코르나바이러스 게놈 (엔테로바이러스 71) 및 다단백질 가공 중간물의 선행 기술 대표도를 나타내고 (ViralZone 웹페이지),
도 2는 3CD에 의한 P1 발현 및 가공의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 나타낸다. 상기 확인된 발현 벡터로 형질전환된 식물의 단백질 추출물 10 마이크로그램이 로딩되었고 비-환원 조건 하에서 전기영동되었다. 마우스 항-VP1 단클론성 항체는 면역 검출에 사용되었다. 비(ratio)는 형질전환에 사용된 박테리아 현탁액에서 P1 (구조 1300 또는 1301, 표 1 참조) 대 3CD (구조 1310, 1311 또는 1315, 표 1 참조) 아그로박테리움(Agrobacterium) 균주의 비율(proportion)을 나타낸다. P1 및 VP1의 예상 위치가 표시된다.
도 3은 VP1의 최대 축적에 대한 3CD 발현 계획의 스크리닝(screening)을 나타낸다. 상기 확인된 발현 벡터로 형질전환된 식물의 단백질 추출물 5 마이크로그램이 로딩되었고 비-환원 조건 하에서 전기영동되었다. 마우스 항-VP1 단클론성 항체는 면역 검출에 사용되었다. 비는 형질전환에 사용된 박테리아 현탁액에서 P1 (1301) 대 3CD (1310, 1311, 1312 및 1313) 아그로박테리움 균주의 비율을 나타낸다.
도 4는 EV71 캡시드 조립체의 평가를 나타낸다. (A) P1 및 3CD를 동시-발현하는 식물의 단백질 추출물의 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography; SEC) 분리로부터 용출 분획의 쿠마시(Coomassie)-염색된 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 (구조 1301+1310 (4:0.5)). 쿠마시-염색된 겔에서 추정적으로 VP1에 해당하는 밴드가 표시된다. (B) SEC 용출 분획 12의 음성 염색 투과 전자 현미경 검사. 막대는 100 nm를 나타낸다.
도 5는 정제된 EV71 PVLP의 특성을 나타낸다. (A) 정제된 EV71 PVLP의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석. 쿠마시-염색된 겔에서 VP1에 해당하는 밴드가 표시된다. 중량이 다른 EV71 캡시드 단백질에 해당하는 다른 밴드가 또한 확인된다. (B) 정제된 EV71 PVLP의 음성 염색 투과 전자 현미경 검사. 샘플은 검사 전에 1/100으로 희석되었다. 막대는 100 nm를 나타낸다.
도 6은 전자 현미경 검사에 의해 lot 479-23-018의 특성을 나타낸다.
도 7은 효소-지원형 방법, 가공에 의해 추출되고 HIC에 의해 선택된 EV71 PVLP (로트 번호 479-31-020)의 냉동-전자 현미경 분석을 나타낸다.
도 8은 열 처리와 함께 기계적 추출 방법 (pH 8.0)에 의해 추출된 EV71 PVLP (로트 번호 479-32-020)의 냉동-전자 현미경 분석을 나타낸다.
도 9A는 아미노산 1549-2193 (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 EV71 균주 HK08의 3CD를 나타내며, GenBank ID ADG57603 하에서 제시된 바와 같다. 도 9B는 GenBank ID GQ279369 하에서 제시된 뉴클레오티드 5387-7321 (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 EV71 균주 HK08의 3CD를 나타낸다. 도 9C는 GenBank ID ACI25378 하에서 제시된 바와 같이 아미노산 1549-2193 (SEQ ID NO: 3)을 포함하는 EV71 균주 GDFS08의 3CD를 나타낸다. 도 9D는 GenBank ID FJ194964 하에 제시된 뉴클레오티드 5387-7321 (SEQ ID NO: 4)을 포함하는 EV71 균주 GDFS08의 3CD를 나타낸다. 도 9E는 P1 아미노산 서열 GenBank ID ADG57603 (아미노산 1-862) (SEQ ID NO: 5)를 나타낸다. 도 9F는 P1 뉴클레오티드 서열 GenBank ID GQ279369 (뉴클레오티드 743-3328) (SEQ ID NO: 6)를 나타낸다. 도 9G는 인간 엔테로바이러스 C 혈청형 PV-1의 PVgp1 다단백질 뉴클레오티드 서열 (게놈에 대하여 GenBank ID NC_002058 및 다단백질에 대하여 NP_041277: nt 5438-7369) (SEQ ID NO: 7)을 나타낸다. 도 9H는 폴리오바이러스의 다단백질의 아미노산 서열 (GenBank ID NP 041277의 aa 1566-2209) (SEQ ID NO: 8)을 나타낸다. 도 9I는 PVgp1 다단백질 [인간 엔테로바이러스 C]의 뉴클레오티드 서열 (GenBank ID NC 002058의 nt 743-3385) (SEQ ID NO: 9)을 나타낸다. 도 9J는 다단백질 [인간 엔테로바이러스 C] GenBank ID NP_041277의 아미노산 서열 (GenBank ID NP 041277의 aa 1-881) (SEQ ID NO: 10)을 나타낸다.
다음 설명은 바람직한 구체예의 것이다.
본 발명은 하나 이상의 피코르나바이러스 구조 단백질 (즉, 피코르나바이러스 유사 단백질, 또는 PVLP)을 포함하는 바이러스-유사 입자 (VLP), 및 식물 또는 식물의 일부에서 PVLP를 생산하는 방법에 관한 것이다. 그러므로 PVLP는 하나 또는 하나 이상의 피코르나바이러스 구조 단백질을 포함할 수도 있다. 예를 들어, PVLP는 하나 또는 하나 이상의 엔테로바이러스 구조 단백질을 포함할 수도 있다.
피코르나바이러스는 아프토바이러스, 아비헤파토바이러스(Avihepatovirus), 카르디오바이러스, 엔테로바이러스, 에르보바이러스, 헤파토바이러스(Hepatovirus), 코부바이러스, 파레초바이러스(Parechovirus), 사펠로바이러스(Sapelovirus), 세네카바이러스(Senecavirus), 테스코바이러스(Teschovirus) 및 트레모바이러스(Tremovirus)의 군으로부터 선택될 수도 있다. 비-제한 예에서 피코르나바이러스는 엔테로바이러스, 예를 들어, 엔테로바이러스 71 (EV71) 또는 인간 엔테로바이러스 C (폴리오바이러스로도 알려져 있음)일 수도 있다.
본 발명은 부분적으로 식물에서 VLP, 예를 들어, PVLP 또는 엔테로바이러스 유사 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 방법은 하나 이상의 피코르나바이러스 다단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산을 식물, 또는 식물의 일부로 도입하는 단계 및 프로테아제를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하는 제2 핵산을 도입하는 단계를 포함할 수도 있다. 이어서 식물 또는 식물의 일부 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하고, 이로 인해 PVLP를 생산한다.
용어 "바이러스-유사 입자 (VLP)", 또는 "바이러스-유사 입자들" 또는 "VLP"는 자가-조립되고 하나 또는 하나 이상의 구조 단백질, 예를 들어, 하나 또는 하나 이상의 피코르나바이러스 구조 단백질, 또는 하나 또는 하나 이상의 엔테로바이러스 구조 단백질, 또는 이것들의 조합, 제한은 아니지만, 예를 들어, VP0, VP1, VP2, VP3, VP4 구조 단백질, 또는 이것들의 조합을 포함하는 구조를 나타낸다. VLP는 일반적으로 감염 시 생산된 비리온과 형태적으로 및 항원에 관하여 유사하지만, 복제하기에 충분한 유전 정보가 부족하고 따라서 비-감염성이다. VLP는 식물 숙주 세포를 포함하는 적합한 숙주 세포에서 생산될 수도 있다. 숙주 세포로부터 추출 후 및 적합한 조건 하에서 분리 및 추가의 정제 시, VLP는 온전한 구조로서 정제될 수도 있다.
용어 "피코르나바이러스-유사 입자 (PVLP)"는 VLP 또는 하나 또는 하나 이상의 피코르나바이러스 구조 단백질을 포함하는 VLP를 나타낸다. 용어 "엔테로바이러스-유사 입자"는 VLP 또는 하나 또는 하나 이상의 엔테로바이러스 구조 단백질을 포함하는 VLP를 나타낸다. 피코르나바이러스 구조 단백질의 예는 VPO, VP1, VP2, VP3, VP4, 또는 이것들의 조합 구조 단백질을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되지 않는다. 엔테로바이러스 구조 단백질의 예는 VPO, VP1, VP2, VP3, VP4, 또는 이것들의 조합, 구조 단백질을 포함할 수도 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다단백질은 하나 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 전구체를 포함하는 단백질을 의미하는데, 이것은 단백질 가수 분해가 처리될 때 하나 이상의 단백질을 제공한다. 예를 들어, 다단백질은 하나 또는 하나 이상의 구조 단백질을 포함할 수도 있다. 폴리펩티드에서 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 구조 단백질은, 예를 들어, 분할 부위, 예를 들어, 프로테아제 분할 부위에 의해 분리될 수도 있다. "다단백질"에 대한 비-제한 예는 "P1 영역"으로도 불리는 구조 단백질 전구체 P1이다. P1 영역은 "구조 단백질" 또는 "코팅 단백질"을 생성하는 피코르나바이러스 다단백질, 예를 들어, VPO, VP1, VP2, VP3, VP4 또는 이것들의 조합의 일부로서 정의된다. 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 피코르나바이러스 P1, 또는 P1의 단편의 비-제한 예는 엔테로바이러스의 상기 P1, 예를 들어, 엔테로바이러스 71을 포함한다.
제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌 P1 영역의 예는 아미노산 1-862 (SEQ ID NO: 5)를 포함하는 GenBank ID ADG57603 하에 제시된 아미노산 서열 또는 그것에 대하여 적어도 90-100% 서열 유사성을 가진 서열이며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성을 포함한다. 게다가, P1 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비-제한 예는 뉴클레오티드 743-3328 (SEQ ID NO: 6) 또는 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가진 서열을 포함하는 GenBank ID GQ279369 하에서 제시되며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성을 포함한다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌 P1 영역의 또 다른 예는 아미노산 1566-2209 (SEQ ID NO: 8)를 포함하는 GenBank ID NP_041277 하에서 제시된 아미노산 서열 또는 그것에 대하여 적어도 90-100% 서열 유사성을 가진 서열이며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성을 포함한다. 게다가, P1 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비-제한 예는 뉴클레오티드 5438-7369 (SEQ ID NO: 7) 또는 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가진 서열을 포함하는 GenBank ID NC_002058 하에서 제시되며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성을 포함한다. 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌 또 다른 예에서 P1 영역은 아미노산 1-881 (SEQ ID NO: 10) 또는 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가진 서열을 포함하는 GenBank ID NP 041277 하에서 제시된 아미노산 서열을 가지며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성을 포함한다. 게다가, P1 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비-제한 예는 뉴클레오티드 743-3385 (SEQ ID NO: 9) 또는 그것에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가진 서열을 포함하는 GenBank ID NC_002058 하에서 제시되며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성을 포함한다.
"피코르나바이러스 다단백질"은 어떤 자연 발생한 또는 변종 피코르나바이러스 균주 또는 분리체, 예를 들어, 엔테로바이러스 다단백질에도 존재하는, 피코르나바이러스로부터 분리된 피코르나바이러스 다단백질 전부 또는 일부를 나타낸다. 유사하게, "피코르나바이러스 구조 단백질"은 어떤 자연 발생한 또는 변종 피코르나바이러스 균주 또는 분리체에도 존재하는, 피코르나바이러스로부터 분리된 피코르나바이러스 구조 단백질, 예를 들어, 폴리오바이러스 또는 엔테로바이러스 71로부터 얻어진 엔테로바이러스 구조 단백질 전부 또는 일부를 나타낼 수도 있다. 따라서, 용어 "피코르나바이러스 다단백질" 및 "피코르나바이러스 구조 단백질" 등은 바이러스 생활 주기 동안 돌연변이에 의해 생산되거나 선택압 (예를 들어, 약물 치료, 숙주 세포 향성(tropism)의 확장 또는 전염성, 등)에 반응하여 생산되는, 피코르나바이러스 다단백질, 피코르나바이러스 구조 단백질, 또는 이것들의 조합의 자연 발생한 변종을 포함한다. 용어 "피코르나바이러스 다단백질"은 "엔테로바이러스 다단백질"을 더 포함하고 "엔테로바이러스 구조 단백질" 등은 바이러스 생활 주기 동안 돌연변이에 의해 생산되거나 선택압 (예를 들어, 약물 치료, 숙주 세포 향성의 확장 또는 전염성, 등)에 반응하여 생산되는, 엔테로바이러스 다단백질, 엔테로바이러스 구조 단백질, 또는 이것들의 조합의 자연 발생한 변종을 포함한다. 용어 "피코르나바이러스 다단백질"은 또한 "폴리오바이러스 다단백질"을 포함할 수도 있고 "폴리오바이러스 구조 단백질" 등은 바이러스 생활 주기 동안 돌연변이에 의해 생산되거나 선택압 (예를 들어, 약물 치료, 숙주 세포 향성의 확장 또는 전염성, 등)에 반응하여 생산되는, 폴리오바이러스 다단백질, 폴리오바이러스 구조 단백질, 또는 이것들의 조합의 자연 발생한 변종을 포함한다. 당업자가 인정한 바와 같이, 피코르나바이러스, 엔테로바이러스 또는 폴리오바이러스 다단백질, 또는 피코르나바이러스의 네이티브(native) 및 변종, 엔테로바이러스 또는 폴리오바이러스 구조 단백질은 또한 재조합 기술을 사용하여 생산될 수도 있다.
다단백질은 하나 이상의 구조 단백질, 예를 들어, 캡시드 단백질을 포함할 수도 있다. 피코르나바이러스 구조 단백질 또는 캡시드 단백질의 비-제한 예는 피코르나바이러스 단백질 VP0, VP1, VP2, VP3 및 VP4 및 VP0, VP1, VP2, VP3 및 VP4의 단편이다. 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 VP0, VP1, VP2, VP3 및 VP4, 또는 VP0, VP1, VP2, VP3 및 VP4 단백질의 단편의 비-제한 예는 엔테로바이러스의 상기 VP0, VP1, VP2, VP3 및 VP4 단백질, 예를 들어, 폴리오바이러스 또는 엔테로바이러스 71을 포함한다. 게다가, 다단백질 구조 단백질, 또는 이것들의 조합은, 예를 들어, 엔테로바이러스 71 균주 HK08 또는 균주 GDFS08로부터의 것일 수도 있다. 또 다른 비 제한 예에서, 다단백질 구조 단백질 또는 이것들의 조합은 폴리오바이러스로도 알려져 있는 인간 엔테로바이러스 C로부터의 것일 수도 있다.
아미노산 서열 유사성 또는 동일성은 BLAST (basic local alignment search tool) 2.0 알고리즘을 이용하는 BLASTP 및 TBLASTN 프로그램을 사용함으로써 산출될 수도 있다. 아미노산 서열 유사성 또는 동일성을 산출하는 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고, BLAST 알고리즘의 사용은 ALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403- 410) 및 ALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)에서 설명된다.
본 발명에서 피코르나바이러스, 엔테로바이러스 (폴리오바이러스 포함) VLP는 피코르나바이러스, 엔테로바이러스 또는 폴리오바이러스 다단백질, 제한은 아니지만, 예를 들어, P1을 암호화하는 핵산 (제1 핵산)과 프로테아제, 예를 들어, 피코르나바이러스, 엔테로바이러스 또는 폴리오바이러스 프로테아제, 제한은 아니지만, 예를 들어, 3CD를 암호화하는 제2 핵산을 동시-발현함으로써 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 생산되고, 이로 인해 VLP를 생산한다.
제한하는 것으로 간주되는 것은 아닌 프로테아제의 예는 아미노산 1549-2193을 포함하는 EV71 균주 HK08의 아미노산 서열이고, GenBank ID ADG57603 (SEQ ID NO:1) 하에서 제시된 바와 같다. 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 5387에서 뉴클레오티드 7321로의 GenBank ID GQ279369 (SEQ ID NO:2) 또는 SEQ ID NO:2에 대하여 적어도 약 90-100% 서열 유사성을 가진 서열 하에서 제시되며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성도 포함한다. 또 다른 비-제한 예는 GenBank ID ACI25378 (SEQ ID NO:3) 하에서 제시된 바와 같이 아미노산 1549-2193을 포함하는 EV71 균주 GDFS08의 아미노산 서열이다. 뉴클레오티드 5387에서 뉴클레오티드 7321로의, GenBank ID FJ194964 (SEQ ID NO:4) 하에서 제시된 뉴클레오티드 서열은 아미노산 서열을 생산하기 위해 사용될 수도 있다. 게다가, 서열은 SEQ ID NO:4에 대하여 약 90-100% 서열 유사성을 가지며, 이 범위 내의 어떤 퍼센트 유사성, 예를 들어, 그것에 대하여 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% 서열 유사성도 포함한다.
제1 핵산, 및 제2 핵산은 같은 단계에서 식물에 도입될 수도 있거나, 또는 순차적으로 식물에 도입될 수도 있다.
서열
본 발명과 함께 사용될 수도 있는 서열의 비-제한 예는 다음을 포함한다:
아프토바이러스, 아비헤파토바이러스, 카르디오바이러스, 엔테로바이러스, 에르보바이러스, 헤파토바이러스, 코부바이러스, 파레초바이러스, 사펠로바이러스, 세네카바이러스, 테스코바이러스 및 트레모바이러스의 P1 서열은 P1 다단백질을 생산하기 위해 사용될 수도 있다. 비-제한 예에서, P1 다단백질을 암호화하는 서열은 엔테로바이러스, 예를 들어, 엔테로바이러스 71 또는 인간 엔테로바이러스 C (폴리오바이러스로도 알려져 있음)로부터의 것일 수도 있다.
게다가 본원에서 설명된 바와 같이 사용되는 프로테아제를 암호화하기 위해 사용될 수도 있는 서열의 비-제한 예는, 예를 들어, 아프토바이러스, 아비헤파토바이러스, 카르디오바이러스, 엔테로바이러스, 에르보바이러스, 헤파토바이러스, 코부바이러스, 파레초바이러스, 사펠로바이러스, 세네카바이러스, 테스코바이러스 및 트레모바이러스로부터 얻어진 프로테아제 3CD의 서열을 포함한다. 비-제한 예에서, 3CD 프로테아제를 암호화하는 서열은 엔테로바이러스, 예를 들어, 엔테로바이러스 71 또는 폴리오바이러스 (인간 엔테로바이러스 C로도 알려져 있음)로부터의 것일 수도 있다.
식물 또는 식물의 일부에서 단백질과 프로테아제를 도입하고 이것들을 동시-발현함으로써 생산된 VLP의 수득율이 조절될 수도 있다는 것이 발견되었다. 다단백질 및 프로테아제는 별개의 핵산 구조에서 제공되고 동시-발현될 수도 있거나, 또는 그것들은 같은 구조에서 제공되지만, 각 서열은, 필요하면, 하기 설명된 바와 같이 VLP를 최적화하기 위해서 별도로 발현될 수도 있다.
"동시-발현된"은 둘, 또는 둘 이상의 뉴클레오티드 서열이 식물 내, 식물의 같은 조직 내 및 식물의 같은 세포 내에서 거의 동시에 발현된다는 것을 의미한다. 게다가, 둘, 또는 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, 소포체, 골지체, 아포플라스트, 시토졸, 미토콘드리아, 엽록체, 퍼옥시좀과 같이 같은 세포 구획 내에서 발현될 필요가 있을 수도 있다. 뉴클레오티드 서열은 정확하게 동시에 발현될 필요는 없다. 오히려, 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 암호화된 생성물이 상호작용할 기회를 갖는 방식으로 발현된다. 예를 들어, 프로테아제는 다단백질의 구조 단백질로의 분할이 일어날 수 있도록 다단백질이 발현되는 기간 전에 또는 그 동안에 발현될 수도 있다. 둘 또는 둘 이상의 뉴클레오티드 서열은 일과성 발현 시스템을 사용하여 동시-발현될 수 있는데, 둘 이상의 서열이 두 서열이 발현되는 조건 하에서 거의 동시에 식물 내로 도입된다. 둘 또는 둘 이상의 서열은 상이한 구조에 존재할 수도 있으며 동시-발현은 각 구조의 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로의 도입을 필요로 하거나, 또는 둘 또는 둘 이상 서열은 하나의 구조에 존재할 수도 있으며 구조는 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입된다.
대안으로, 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 프로테아제를 암호화하는 서열 중 하나를 포함하는 식물은, 일과성으로 또는 안정한 방식으로, 다단백질을 암호화하는 추가 서열로 형질전환될 수도 있다. 이 경우에서, 프로테아제를 암호화하는 서열은 원하는 조직 내에서, 원하는 발달 단계 동안 발현될 수도 있거나, 또는 그것의 발현은 유발성 프로모터를 사용하여 유발될 수도 있고, 다단백질을 암호화하는 추가의 서열은 뉴클레오티드 서열이 동시-발현된다는 것을 보장하기 위해, 유사한 조건 하에서 및 같은 조직에서 발현될 수도 있다. 추가적으로, 다단백질을 암호화하는 서열은, 일과성으로 또는 안정한 방식으로, 프로테아제를 암호화하는 추가 서열로 형질전환될 수도 있다. 이 경우에서, 다단백질을 암호화하는 서열은 원하는 조직 내에서, 원하는 발달 단계 동안 발현될 수도 있거나, 또는 그것의 발현이 유발성 프로모터를 사용하여 유발될 수도 있고, 프로테아제를 암호화하는 추가의 서열은 뉴클레오티드 서열이 동시-발현된다는 것을 보장하기 위해, 유사한 조건 하에서 및 같은 조직에서 발현될 수도 있다.
도 2 및 3에서 보이는 바와 같이, 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 VLP 축적의 수준은 다단백질-함유 아그로박테리움 대 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 침투된 프로테아제-함유 아그로박테리움의 비에 영향을 받는다. 다단백질-함유 대 프로테아제-함유 아그로박테리움의 비는, 예를 들어, 약 20:1 내지 약 0.5:1 (다단백질:프로테아제), 또는 그 사이의 어떤 양, 예를 들어, 약 20:1, 18:1, 16:1, 14:1, 12:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 05:1 (다단백질:프로테아제), 또는 그 사이의 어떤 양의 범위에 있을 수도 있다.
다단백질 대 프로테아제의 비는, 예를 들어, 다른 비의 제1 핵산을 함유하는 아그로박테리움 대 제2 핵산을 함유하는 아그로박테리움을 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포로 도입함으로써 달라질 수도 있다. 대안으로, 다단백질 및 프로테아제가 같은 구조 상에 존재하고, 그러므로 같은 아그로박테리움으로 도입되면, 그것들은 다단백질 대 프로테아제의 원하는 비가 얻어지도록 적합한 프로모터를 사용하여 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 별개로 발현될 수도 있다.
그러므로 본 발명은 또한 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 비를 조절함으로써 증가된 PVLP 생산 수득 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트는 침투된 총 아그로박테리움 중 0.5% 내지 50% 또는 그 사이의 어떤 양일 수도 있다. 예를 들어, 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트 비율은 0, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 또는 50% 또는 그 사이의 어떤 양일 수도 있다.
다단백질을 함유하는 아그로박테리움 대 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트 비율은 침투된 총 아그로박테리움 중 95%:5% 내지 40%:60%, 또는 그 사이의 어떤 양일 수도 있다. 예를 들어, 침투된 아그로박테리움의 총량 내 다단백질을 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트는 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52% 또는 51%일 수도 있다. 예를 들어, 다단백질을 함유하는 아그로박테리움 대 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움의 퍼센트 비는 50%:50% 내지 95%:5%, 또는 그 사이의 어떤 퍼센트 비율일 수도 있거나, 또는 다단백질을 함유하는 아그로박테리움과 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움 사이의 퍼센트 비는 50%:50%, 55%:45%, 60%:40%, 65%:35%, 70%:30%, 75%:25%, 80%:20%, 85%:15%, 90%:10%, 95%:5%, 또는 그 사이의 어떤 퍼센트 비일 수도 있다.
식물 세포 내에서 제1 및 제2 뉴클레오티드 서열의 발현은 VLP를 형성하고, VLP는, 예를 들어, 바이러스 단백질, 예를 들어, VP0, VP1, VP2, VP3 및/또는 VP4를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 피코르나바이러스 구조 단백질에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 사용될 수도 있다. VLP는, 대상체에 투여될 때, 면역 반응을 유발한다.
하기 더 설명된 바와 같이 다단백질 대 프로테아제의 비는, 예를 들어, 다단백질 및 프로테아제를 별개로 발현함으로써 달라질 수도 있다. 발현은 예를 들어, 다단백질, 프로테아제, 또는 단백질 및 프로테아제 둘 다의 복제, 전사, 번역, 또는 이것들의 조합을 조절함으로써 달라질 수도 있다. 예를 들어, 프로모터, 증폭 요소, 인핸서 또는 이것들의 조합을 포함하는 상이한 조절 요소는 또한 상기 설명된 바와 같이 다단백질-함유 아그로박테리움 대 침투된 프로테아제-함유 아그로박테리움의 비를 변화시키기 위해 사용될 수도 있다. 조절 요소의 제1 세트 또는 조합은 제1 핵산의 복제, 전사 또는 이것들의 조합을 조절하기 위해 사용될 수도 있고 조절 요소의 제2 세트 또는 조합은 제2 핵산의 복제, 전사 또는 이것들의 조합을 조절하기 위해 사용될 수도 있다. 조절 요소의 제1 세트 또는 조합은 조절 요소의 제2 세트 또는 조합과 다르며 생체 내 다단백질:프로테아제 비의 조절을 허용하기 위해 제1 및 제2 핵산의 별개의 발현을 허용한다. 예를 들어, 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌, 조절 요소의 한 세트 또는 조합, 예를 들어, 제1 세트는 증폭 요소, 예를 들어, BeYDV로부터 얻은 요소를 포함할 수도 있는 한편, 증폭 요소, 예를 들어, BeYDV로부터 얻어진 것들은 조절 요소의 다른 세트 또는 조합, 예를 들어, 제2 세트에는 없을 수도 있다. 대안으로, 제2 세트는 증폭 요소 (예를 들어, BeYDV로부터 얻은 요소)를 포함할 수도 있는 한편, 증폭 요소 (예를 들어, BeYDV로부터 얻은 요소)는 조절 요소의 제1 세트 또는 조합에는 없을 수도 있다. 유사한 방식으로, 프로모터의 강도는 조절 요소의 제1 및 제2 세트 또는 조합 사이에서 다를 수도 있거나, 다단백질과 프로테아제 사이의 별개의 발현이 생체 내에서 달성되도록 프로모터 중 하나는 유발성이고, 다른 것은 구성적이다.
크기
VLP의 발생은 어떤 적합한 방법, 예를 들어, 수크로스 구배, 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 검출될 수도 있다. VLP는, 예를 들어, 전자 현미경, 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 구조 및 크기에 대하여 평가될 수도 있다.
크기 배제 크로마토그래피를 위해서, 전체 가용성 단백질은 추출 버퍼에서 동결-파쇄된 식물 재료의 샘플을 균질화함으로써 (Polytron) 식물 조직으로부터 추출될 수도 있고, 불용성 재료는 원심분리에 의해 제거된다. PEG-지원형 침전에 의한 농축이 또한 유익할 수도 있다. VLP는 또한 제WO 2011/035422호 (이것은 본원에 참고로 포함된다)에서 설명된 방법을 사용하여 원생동물 또는 원생동물 분획을 제조함으로써 생산될 수도 있다. 가용성 단백질이 정량되고, 추출물은 Sephacryl™ 컬럼, 예를 들어, Sephacryl™ S500 컬럼을 통과하였다. Blue Dextran 2000은 보정 표준으로서 사용될 수도 있다.
세포 데브리(debris)는 원심분리에 의해 제거될 수도 있다. 원심분리된 추출물은 그때 여과될 수도 있다. 이론에 결부되지 않으면서, 이러한 여과 단계 또는 단계들은 추가의 정제 전에 현탁액에서 고체를 제거하고, 바이오버든(bioburden)을 감소시키며 추출물을 안정화시키고 조절할 수도 있다고 생각된다. 그것들의 크기로 인해, PVLP는 접선 유동 여과 (tangential flow filtration; TFF)를 사용하여 더 정제될 수도 있다. 이론에 결부되지 않으면서, TFF는 세포벽 탈폴리머화에 사용된 효소를 포함하는, 정화된 추출물에서 발견된 더 낮은 분자량의 가용성 단백질을 효과적으로 및 선택적으로 제거한다. 게다가, TFF 단계는 또한 크로마토그래피용 조제물에서 VLP를 농축하고 버퍼 교환을 가능하게 한다. TFF 단계는 여러 크로마토그래피 단계, 예를 들어, 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (hydrophobic interaction chromatography; HIC) 및/또는 가성(pseudo)-친화도로 이어질 수도 있다. 추가적인 TFF 단계는 크로마토그래피 단계 다음에 추가될 수도 있다. 크로마토그래피 및/또는 TFF 다음에, 분획은 분획의 단백질 보체를 결정하기 위해 면역 블롯(immunoblot)에 의해 더 분석될 수도 있다.
분리된 분획은, 예를 들어, 상층액 (원심분리되거나, 침전되거나(sedimented), 또는 침전되면(precipitated)), 또는 여과물 (여과되면)일 수도 있고, 단백질, 또는 상기 구조 단백질, 예를 들어, 고차원, 더 높은 분자량, 입자, 또는 완전한 VLP가 풍부하다. 분리된 분획은, 예를 들어, 추가의 원심분리 단계, 침전, 크로마토그래피 단계 (예를 들어, 크기 배제, 이온 교환, 친화도 크로마토그래피), 접선 유동 여과, 또는 이것들의 조합에 의해 단백질, 상기 구조 단백질 또는 고차원 입자를 분리하거나, 정제하거나, 농축하거나 또는 이것들의 조합을 위해 더 가공될 수도 있다. VLP와 같은 정제된 단백질, 상기 구조 단백질 또는 고차원 입자의 존재는, 예를 들어, 네이티브(native) 또는 SDS-PAGE, 적절한 검출 항체를 사용하는 웨스턴 분석, 모세관 전기영동, 전자 현미경, 또는 당업자에게 명백한 어떤 다른 방법에 의해 확인될 수도 있다.
도 4A는 PVLP를 포함하는 식물 추출물의 크기 배제 크로마토그래피 분석의 용출 프로파일의 예를 나타낸다. 이 경우에서, 엔테로바이러스 EV71 캡시드를 포함하는 VLP는 분획 9 내지 대략 14에서 용출되며, 분획 12에서 최대이다.
VLP는 어떤 적합한 방법, 예를 들어, 화학적 또는 생화학적 추출을 사용하여 정제되거나 추출될 수도 있다. VLP는 건조, 열, pH, 계면활성제 및 세제에 비교적 민감할 수도 있다. 그러므로 수득율을 최대화하거나, VLP 분획의 세포 단백질로의 오염을 최소화하거나, 단백질, 또는 VLP의 온전함을 유지하는 방법, 및 세포벽을 느슨하게 하여 단백질, 또는 VLP를 방출하는 방법을 사용하는 것이 유용할 수도 있다. 예를 들어, 본원에서 설명된 바와 같이 VLP를 얻기 위해 원생동물 및/또는 스페로플라스트(spheroplast)를 생산하는 방법이 사용될 수도 있다 (예를 들어, 제WO 2011/035422호 참조, 이것은 본원에서 참고로 포함된다). 세제 또는 계면활성제, 예를 들어, SDS 또는 Triton X-100의 사용을 최소화하거나 제거하는 것이 VLP 추출의 수득율을 개선하는데 유익할 수도 있다. VLP는 그때 상기 언급된 바와 같이, 예를 들어, 전자 현미경, 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 구조 및 크기에 대하여 평가되고, 분석적 초원심분리에 제출될 수도 있다.
상기-정의된 PVLP의 크기 (즉, 지름)는 예를 들어, 동적 광 산란 (dynamic light scattering; DLS) 또는 전자 현미경 (EM) 기술에 의해 측정될 수도 있으며, 보통은 20 내지 50 nm, 또는 그 사이의 어떤 크기이다. 예를 들어, 온전한 PVLP 구조의 크기는 약 25 nm 내지 약 35 nm, 또는 그 사이의 어떤 크기, 또는 20nm, 21nm, 22nm, 23nm, 24nm, 25nm, 26nm, 27nm, 28nm, 29nm, 30nm, 31nm, 32nm, 33nm, 34nm, 35nm, 36nm, 37nm, 38nm, 39nm, 40nm, 41nm, 42nm, 43nm, 44nm, 45nm, 46nm, 47nm, 48nm, 49nm, 50nm, 또는 그 사이의 어떤 크기의 범위에 있을 수도 있다.
PVLP는 식물 생중량의 킬로그램 당 최대 2g의 양으로 합성될 수도 있으며, 식물의 총 단백질 함량의 약 40%에 해당한다. 예를 들어, 본원에서 설명된 바와 같이, 합성된 VLP의 양은 생중량의 킬로그램 당 1Omg 내지 2.0 g, 또는 그 사이의 어떤 양, 예를 들어, 생중량의 킬로그램 당 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000 mg 또는 그 사이의 어떤 양일 수도 있다.
숙주
본 발명의 하나 또는 하나 이상의 유전적 구조는 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 또는 구조, 또는 벡터에 의해 형질전환된 어떤 적합한 식물 숙주 또는 식물의 일부, 예를 들어, 하나 이상의 잎, 줄기 플러스 하나 이상의 잎, 또는 뿌리에서 발현될 수도 있다. 적합한 숙주의 예는 알팔파, 캐놀라(canola), 브라시카 종(Brassica spp.), 옥수수(maize), 니코티아나 종(Nicotiana spp.), 감자, 인삼, 완두콩, 귀리, 쌀, 대두, 밀, 보리, 해바라기, 목화 등을 포함하는 농작물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 하나 이상의 유전적 구조는 3' 비번역된 영역을 더 포함할 수 있다. 3' 비번역된 영역은 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 어떤 다른 조절 신호를 함유하는 DNA 세그먼트를 포함하는 유전자의 일부를 나타낸다. 폴리아데닐화 신호는 보통 mRNA 전구체의 3' 끝에 폴리아데닐산 트랙(track)의 추가를 일으키는 것을 특징으로 한다. 폴리아데닐화 신호는 보통 기본형 5' AATAAA-3'에 대한 상동성의 존재에 의해 인식되지만 변화가 흔한 일은 아니다. 적합한 3' 영역의 비-제한 예는 노팔린 신타제 (NOS) 유전자와 같은 아그로박테리움 종양 유발 (Ti) 플라스미드 유전자, 대두 저장 단백질 유전자와 같은 식물 유전자, 리불로스-I, 5-비스포스페이트 카르복실라제 유전자의 작은 서브유닛 (ssRUBISCO; 제US 4,962,028호; 이것은 본원에서 참고로 포함된다), 제US 7,125,978호에서 설명된, 플라스토시아닌 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터 (이것은 본원에서 참고로 포함된다)의 폴리아데닐화 신호를 함유하는 3' 전사된 비번역된 영역이다.
본 발명의 유전적 구조 중 하나 이상은 또한 필요에 따라 추가의 인핸서, 번역 또는 전사 인핸서를 포함할 수도 있다. 인핸서는 전사되는 서열에 대하여 5' 또는 3'에 자리할 수도 있다. 인핸서 영역은 당업자에게 잘 알려져 있고, ATG 개시 코돈, 인접 서열 등을 포함할 수도 있다. 개시 코돈은, 존재하면, 전사된 서열의 올바른 번역을 제공하기 위해 암호화 서열의 리딩 프레임 상에 있을 수도 있다 ("인 프레임(in frame)").
본 발명의 구조는 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질전환, 미세-주사, 전기천공, 등을 사용하여 식물 세포로 도입될 수 있다. 이러한 기술의 재검토를 위해서는, 예를 들어, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988); 및 Mild and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997)를 참고하면 된다. 다른 방법들은 직접적인 DNA 흡수, 리포솜의 사용, 예를 들어, 원생동물을 사용하는 전기천공, 미세-주사, 미세투사물(microprojectile) 또는 위스커(whisker), 및 진공 침투를 포함한다. 예를 들어, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), 미국 특허 번호 제4,945,050호; 제5,036,006호; 및 제5,100,792호, 1995년 5월 10일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제08/438,666호, 및 1992년 9월 25일에 출원된 제07/951,715호를 참고하면 된다 (이것들 모두가 본원에 참고로 포함된다).
일과성 발현
이론에 결부되지 않으면서, 단백질 농도 및 다른 피코르나바이러스 구조 단백질, 피코르나바이러스 다단백질 및/또는 프로테아제의 비는 PVLP의 조립 효율에 중요할 수도 있다. 그러므로 감염의 다중도 및 시간은 식물에서 VLP의 단백질 농도 및 전체적인 조립 효율을 조작하는데 중요할 수도 있다.
본 발명의 구조는 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포에서 일과성으로 발현될 수도 있다. 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 침투를 통해 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입된 재조합 다단백질의 에피염색체(epichoromosome) 발현에 의존하는 일과성 발현 시스템은 다양한 세포 구획 또는 부분-구획으로 표적화된, 피코르나바이러스 구조 단백질, 피코르나바이러스 다단백질 및/또는 프로테아제를 발현시키는데 사용될 수도 있다. 일과성 발현 시스템은 높은 생산 속도를 허용한다. 게다가, 다량의 단백질이 식물에서 재조합 아그로박테리움의 침투 후 수일 내에 얻어질 수 있다 (Rybicki, 2010; Fischer et al., 1999). 또한 긴 유전자 서열을 발현하고 같은 세포에서 동시에 발현된 하나 이상의 유전자를 가지며, 멀티머 단백질의 효율적인 조립을 허용하는 것이 가능하다 (Lombardi et al, 2009).
하지만, 일과성 발현 중에 전사 후 유전자 침묵은 식물에서 이종 기원 단백질의 발현을 제한할 수도 있다. 침묵의 억제자, 제한은 아니지만, 예를 들어, 토마토 반점 위조 바이러스(Tomato spotted wilt virus)의 Nss의 동시-발현은 전이유전자 mRNA의 특이적 분해에 대응하기 위해 사용될 수도 있다 (Brigneti et al., 1998). 침묵의 대체 억제자, 제한은 아니지만, 예를 들어, HcPro, TEV-p1/HC-Pro (Tobacco etch virus-p1/HC-Pro), BYV-p21, 토마토 덤불 위축 바이러스(Tomato bushy stunt virus)의 p19 (TBSV P19), 토마토 주름 바이러스(Tomato crinkle virus)의 캡시드 단백질 (TCV -CP), 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus)의 2b (CMV-2b), 감자 바이러스 X의 p25 (PVX-p25), 감자 바이러스 M의 P11 (PVM-p11), 감자 바이러스 S의 p11 (PVS-p11), 블루베리 스코치 바이러스(Blueberry scorch virus)의 P16 (BScV-p16), 시트러스 트리스텍사 바이러스(Citrus tristexa virus)의 p23 (CTV-p23), 포도덩굴 잎말이병-관련 바이러스(Grapevine leafroll-associated virus)-2의 p24, (GLRaV-2 p24), 포도덩굴 바이러스 A의 p10, (GVA-p10), 포도덩굴 바이러스 B의 p14 (GVB-p14), 헤라클레움 잠재 바이러스(Heracleum latent virus)의 p10 (HLV-p10), 또는 마늘 일반 잠재 바이러스(Garlic common latent virus)의 P16 (GCLV-p16)은 업계에 잘 알려져 있으며 본원에서 설명된 바와 같이 사용될 수도 있다 (Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14; 이것은 본원에서 참고로 포함된다). 그러므로, 침묵의 억제자, 예를 들어, HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 또는 GVA-p10은 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 내에서 높은 수준의 단백질 생산을 더 보장하기 위해서 하나 이상의 피코르나바이러스 구조 단백질, 피코르나바이러스 다단백질 및/또는 프로테아제와 함께 동시-발현될 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 설명된 방법을 제공하는데, 추가적인 (제3) 뉴클레오티드 서열은 식물 내에서 발현되고, 침묵의 억제자를 암호화하는 추가적인 (제3) 뉴클레오티드 서열은 식물에서 활성인 추가적인 (제3) 조절 영역에 작동 가능하게 결합된다. 침묵의 억제자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, Nss, HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 또는 GVA-p10일 수도 있다.
하기 설명된 바와 같이, 일과성 발현 방법은 본 발명의 구조를 발현시키는데 사용될 수도 있다 (Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348 참조; 이것은 본원에서 참고로 포함된다). 대안으로, Kapila et al., 1997에 의해 설명된 바와 같이, 진공-기반 일과성 발현 방법이 사용될 수도 있으며, 이것은 본원에서 참고로 포함된다. 이 방법들은 제한은 아니지만, 예를 들어, 아그로-접종(Agro-inoculation) 또는 아그로-침투(Agro-infiltration), 주사기 침투의 방법을 포함할 수도 있지만, 다른 일과성 방법은 또한 상기 언급된 바와 같이 사용될 수도 있다. 아그로-접종, 아그로-침투, 또는 주사기 침투로, 원하는 핵산을 포함하는 아그로박테리아의 혼합물은 조직, 예를 들어, 잎, 식물의 공기 중의 부분 (줄기, 잎 및 꽃 포함), 다른 식물의 일부 (줄기, 뿌리, 꽃), 또는 전체 식물의 세포 내 공간으로 진입한다. 표피를 통과한 후 아그로박테리아는 t-DNA 카피를 감염시키고 이것을 세포로 이동시킨다. t-DNA는 에피솜에 의해 전사되고 mRNA는 번역되며, 감염된 세포에서 원하는 단백질의 생산으로 이어지지만, 핵 내부에 t-DNA의 통로는 일과성이다.
또한 본 발명의 고려해야될 부분은 본 발명의 핵산 또는 하나 또는 하나 이상의 유전자를 함유하는 트랜스제닉 식물, 식물 세포 또는 종자이다. 식물 세포로부터 전체 식물을 재생시키는 방법이 또한 업계에 알려져 있다. 일반적으로, 형질전환된 식물 세포는 적절한 배지에서 배양는데, 이것은 항생제와 같은 선택적 약제를 함유할 수도 있으며, 선택 가능 마커는 안정하게 형질전환된 식물 세포의 확인을 용이하게 하는데 사용된다. 안정하게 형질전환된 식물 세포의 확인을 돕기 위해서, 본 발명의 구조는 식물 선택 가능 마커를 포함하도록 더 조작될 수도 있다. 유용한 선택 가능 마커는 항생제, 예를 들어, 젠타마이신, 히그로마이신, 카나마이신과 같이 화학물질에 저항성을 제공하는 효소, 또는 포스피노트리신, 글리포세이트, 클로로술푸론, 등과 같은 제초제를 포함한다. 유사하게, GUS (베타-글루쿠로니다제)와 같이 색깔 변화에 의해 확인 가능한 화합물, 또는 루시퍼라제 또는 GFP와 같이 발광에 의해 확인 가능한 화합물의 생산을 제공하는 효소가 사용될 수도 있다. 캘러스(callus)를 형성하면, 순(shoot) 형성은 알려져 있는 방법에 따라 적절한 식물 호르몬을 이용함으로써 자극될 수 있고 순은 식물의 재생을 위해 발근 배지로 이동된다. 식물은 그때 종자로부터, 또는 식물 증식 기술을 사용하여 반복적인 재생을 확립하기 위해 사용될 수도 있다. 트랜스제닉 식물은 또한 조직 배양을 사용하지 않고 발생될 수 있다.
증폭 요소
다단백질 대 프로테아제의 비율은 다단백질 및 프로테아제의 발현을 구동하는데 사용된 핵산 서열에서, 상이한 조절 요소, 또는 조절 요소의 조합을 사용함으로써 달라질 수도 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 핵산 발현의 차이가 달성되고 이로 인해 생체 내 다단백질:프로테아제의 비가 조절되도록 조절 요소의 제1 세트 또는 조합은 제1 핵산의 복제, 전사 또는 이것들의 조합을 조절하는데 사용될 수도 있고 조절 요소의 제2 세트 또는 조합은 제2 핵산의 복제, 전사 또는 이것들의 조합을 조절하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 제한하는 것으로 간주되는 것이 아닌, 조절 요소의 제1 세트 또는 조합은 증폭 요소, 예를 들어, BeYDV로부터 얻어진 요소를 포함할 수도 있는 한편, 증폭 요소는 조절 요소의 제2 세트 또는 조합에는 없을 수도 있다. 대안으로, 제2 세트는 증폭 요소, 예를 들어, BeYDV로부터 얻어진 요소를 포함할 수도 있는 한편, 증폭 요소는 조절 요소의 제1 세트 또는 조합에는 없을 수도 있다.
"발현 카세트"는 숙주 세포에서 원하는 핵산의 전사에 적절한 프로모터 또는 다른 조절 요소의 제어 하에, 및 이것들에 작동적으로(또는 작동 가능하게) 결합된 원하는 핵산을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
본원에서 설명된 발현 시스템은 이분 바이러스, 또는 이분 게놈을 가진 바이러스를 기반으로 하는 발현 카세트를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이분 바이러스는 코모비리대(Comoviridae) 과의 것일 수도 있다. 코모비리대 과의 속은 코모바이러스, 네포바이러스(Nepovirus), 파바바이러스(Fabavirus), 체라바이러스(Cheravirus) 및 사드와바이러스(Sadwavirus)를 포함한다. 코모바이러스는 동부 모자이크 바이러스 (CPMV), 동부 중증 모자이크 바이러스 (Cowpea severe mosaic virus; CPSMV), 호박 모자이크 바이러스 (Squash mosaic virus; SqMV), 붉은 클로버 반점 바이러스 (Red clover mottle virus; RCMV), 콩껍질 반점 바이러스 (Bean pod mottle virus; BPMV), 순무 원형반점 바이러스 (Turnip ringspot virus; TuRSV), 잠두 트루 모자이크 바이러스 (Broad bean true mosaic virus; BBtMV), 잠두 염색 바이러스 (Broad bean stain virus; BBSV), 무 모자이크 바이러스 (Radish mosaic virus; RaMV)를 포함한다. 본 발명의 다양한 양태에 유용할 수도 있는 인핸서 요소를 포함하는 코모바이러스 RNA-2 서열의 예는 CPMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC_003550), RCMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC_003738), BPMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC_003495), CPSMV RNA-2 (GenBank 수납 번호NC_003544), SqMV RNA-2 (GenBank 수납 번호NC_003800), TuRSV RNA-2 (GenBank 수납 번호 NC_013219.1), BBtMV RNA-2 (GenBank 수납 번호 GU810904), BBSV RNA2 (GenBank 수납 번호 FJ028650), RaMV (GenBank 수납 번호 NC_003800)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
이분 코모바이러스 RNA 게놈의 세그먼트는 RNA-1 및 RNA-2로 불린다. RNA-1은 복제에 수반된 단백질을 암호화하는 한편 RNA-2는 세포-대-세포 이동(cell-to-cell movement)에 필수적인 단백질 및 두 개의 캡시드 단백질을 암호화한다. CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV, 또는 BPMV를 포함하는 어떤 적합한 코모바이러스-기반 카세트도 사용될 수 있는데, 예를 들어, 발현 카세트는 CPMV를 기반으로 할 수도 있다.
발현 시스템은 또한 제미니바이러스의 증폭 요소, 예를 들어, 강낭콩 황고병 바이러스 (BeYDV)의 증폭 요소를 포함할 수도 있다. BeYDV는 쌍자엽 식물에 적응된 매스트레바이러스(Mastreviruses) 속에 속한다. BeYDV는 단일 가닥 DNA 게놈을 가진 단립형이고 롤링 서클(rolling circle) 메커니즘에 의해 매우 높은 카피 수로 복제할 수 있다. BeYDV-유래된 DNA 레플리콘(replicon) 벡터 시스템은 식물에서 신속한 고수득율 단백질 생산에 사용되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 구절 "증폭 요소"는 제미니바이러스 게놈의 하나 이상의 긴 유전자간 영역 (LIR)의 적어도 일부를 포함하는 핵산 세그먼트를 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이, "긴 유전자간 영역"은 제미니바이러스 Rep 단백질에 의해 절제 및 복제를 매개할 수 있는 rep 결합 부위를 함유하는 긴 유전자간 영역의 영역을 나타낸다. 일부 양태에서, 하나 이상의 LIR을 포함하는 핵산 세그먼트는 제미니바이러스 게놈의 짧은 유전자간 영역 (SIR)을 더 포함할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "짧은 유전자간 영역"은 상보성 가닥 (매스트레바이러스의 짧은 IR (SIR))을 나타낸다. 어떤 적합한 제미니바이러스-유래된 증폭 요소도 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 제WO2000/20557호; 제WO2010/025285호; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al.(2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17)을 참고하면 된다; 이것들은 본원에 참고로 포함된다).
조절 요소
본 발명은 하나 이상의 피코르나바이러스 단백질과 같이 다단백질, 또는 프로테아제, 제한은 아니지만, 예를 들어, 식물에서 작동 가능한 조절 요소에 작동 가능하게 결합된, 상기 설명된 피코르나바이러스 프로테아제를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 구조와 더 관련된다.
본 출원에서 용어 "조절 영역", "조절 요소" 또는 "프로모터"의 사용은 핵산의 일부, 항상은 아니지만, 전형적으로 유전자의 단백질 암호화 영역의 업스트림(upstream)을 반영하는 것을 의미하는데, 이것은 DNA 또는 RNA, 또는 DNA와 RNA 둘 다로 구성될 수도 있다. 조절 영역이 활성이고, 원하는 유전자와 작동 가능한 관계이거나, 또는 이것과 작동 가능하게 결합될 때, 이것은 원하는 유전자의 발현을 일으킬 수도 있다. 조절 요소는 기관 특이성을 매개하거나, 발달적 또는 일시적 유전자 활성화를 제어할 수도 있다. "조절 영역"은 프로모터 요소, 기저 프로모터 활성을 나타내는 코어 프로모터 요소, 외부 자극에 반응하여 유발성인 요소, 음성 조절 요소 또는 전사 인핸서와 같이 프로모터 활성을 매개하는 요소를 포함할 수도 있다. "조절 영역"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 전사 후 활성인 요소, 예를 들어, 번역 및 전사 인핸서, 번역 및 전사 억제 물질, 업스트림 활성화 서열, 및 mRNA 불안정 결정 요인과 같이 유전자 발현을 조절하는 조절 요소도 포함할 수 있다. 이 후자의 요소 중 다수는 암호화 영역에 근위에 위치할 수도 있다.
식물 세포에서 작동 가능하고 본 발명에 따라 사용될 수도 있는 조절 요소는 플라스토시아닌 조절 영역 (제US 7,125,978호; 이것은 본원에서 참고로 포함된다), 또는 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 (RuBisCO; 제US 4,962,028호; 이것은 본원에서 참고로 포함된다), 클로로필 a/b 결합 단백질 (CAB; Leutwiler et al; 1986; 이것은 본원에서 참고로 포함된다), ST-LS1 (광계 II의 산소-방출 복합체(oxygen-evolving complex)와 연관되고 Stockhaus et al. 987, 1989에 의해 설명된다; 이것은 본원에서 참고로 포함된다)의 조절 영역을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이 개시물의 맥락에서, 용어 "조절 요소" 또는 "조절 영역"은 전형적으로 DNA의 서열, 항상은 아니지만, 보통은 구조 유전자의 암호화 서열의 업스트림 (5')을 나타내며, 이것은 특정 부위에서 시작하기 위해 전사에 필요한 RNA 폴리머라제 및/또는 다른 인자들에 대한 인식을 제공함으로써 암호화 영역의 발현을 제어한다. 하지만, 인트론 내에 위치한 다른 뉴클레오티드 서열, 또는 서열의 3'이 또한 원하는 암호화 영역의 발현 조절에 기여할 수도 있다고 생각되어야 한다.
특정 부위에서의 시작을 보장하기 위해 RNA 폴리머라제 또는 다른 전사 인자에 대한 인식을 제공하는 조절 요소의 예는 프로모터 요소이다. 전부는 아니지만, 대부분의 진핵생물 프로모터 요소는 TATA 박스, 보통 전사 시작 부위의 대략 25 염기쌍 업스트림에 위치하는 아데노신 및 티미딘 뉴클레오티드 염기쌍으로 구성된 보존된 핵산 서열을 함유한다. 프로모터 요소는 전사의 개시의 원인이 되는 기저 프로모터 요소, 뿐만 아니라 유전자 발현을 변형시키는 다른 조절 요소 (상기 나열됨)를 포함한다.
여러 타입의 조절 영역이 있는데, 발달적으로 제어되거나, 유발성 또는 구성적인 것들을 포함한다. 발달적으로 제어되거나, 또는 그것의 제어 하에서 유전자의 차등적 발현을 제어하는 조절 영역은 기관 또는 조직의 발달 동안의 특정 시간에 특정 기관 또는 조직 내에서 활성화된다. 하지만, 발달적으로 조절되는 일부 조절 영역은 바람직하게 특정 발달 단계에서 특정 기관 또는 조직 내에서 활성일 수도 있고, 그것들은 또한 발달적으로 조절되는 방식으로 활성이거나, 또는 식물 내 다른 기관 또는 조직에서 기저 수준일 수도 있다. 조직-특이적 조절 영역의 예, 예를 들어, 참조-특이적 조절 영역은 나핀 프로모터, 및 크루시페린 프로모터를 포함한다 (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130). 잎-특이적 프로모터의 예는 플라스토시아닌 프로모터를 포함한다 (제US 7,125,978호를 참고하면 되고, 이것은 본원에서 참고로 포함된다).
유발성 조절 영역은 인듀서(inducer)에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접적으로 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 것이다. 인듀서의 부재 시, DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 전형적으로 유발성 조절 영역에 특이적으로 결합하여 전사를 활성화시키는 단백질 인자는 인듀서에 의해 활성형으로 직접적으로 또는 간접적으로 전환된다. 하지만, 단백질 인자가 또한 없을 수도 있다. 인듀서는
단백질, 대사산물, 성장 조절 물질, 제초제 또는 페놀성 화합물 또는 직접적으로는 열, 추위, 염, 또는 독성 요소에 의해, 또는 간접적으로는 바이러스와 같은 병원체 또는 병원균의 작용을 통해 부과된 생리학적 스트레스와 같은 화학 작용제일 수 있다. 유발성 조절 영역을 함유하는 식물 세포는 인듀서를 세포 또는 식물에 외부에서 적용함으로써, 예를 들어, 분무, 관수(watering), 가열 또는 유사한 방법에 의해 인듀서에 노출될 수도 있다. 유발성 조절 요소는 식물 또는 비-식물 유전자로부터 유래될 수도 있다 (예를 들어, Gatz, C. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; 이것은 참고로 포함된다). 잠재적 유발성 프로모터의 예는 테트라시클린-유발성 프로모터 (Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48,89-108; 이것은 참고로 포함된다), 스테로이드 유발성 프로모터 (Aoyama. T. and Chua, N.H.,1997, Plant 1. 2, 397-404; 이것은 참고로 포함된다) 및 에탄올-유발성 프로모터 (Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180, 이것은 참고로 포함된다), 시토키닌 유발성 IB6 및 CKI 1 유전자 (Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274,982-985; 이것은 참고로 포함된다) 및 옥신 유발성 요소, DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; 이것은 참고로 포함된다)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
구성적 조절 영역은 식물의 다양한 부분에 걸쳐 및 지속적으로 식물 발달에 걸쳐 유전자의 발현을 지시한다. 알려져 있는 구성적 조절 요소의 예는 CaMV 35S 전사물과 연관된 프로모터 (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), 쌀 액틴 1 (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), 액틴 2 (An et al, 1996, Plant J., 10: 107-121), 또는 tms 2 (제U.S. 5,428,147호, 이것은 본원에서 참고로 포함된다), 및 트리오스포스페이트 이소머라제 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467) 유전자, 옥수수 유비퀴틴 1 유전자 (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 아라비돕시스(Arabidopsis) 유비퀴틴 1 및 6 유전자 (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646), 및 담배 번역 개시 인자 4A 유전자 (Mandel et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004)를 포함한다.
용어 "구성적"은 본원에서 사용된 바와 같이 반드시 구성적 조절 영역의 제어 하에서 유전자가 모든 세포 타입에서 같은 수준으로 발현되지만, 유전자는 풍부함의 변화가 종종 관찰됨에도 불구하고 광범위한 세포 타입에서 발현된다는 것을 나타내지는 않는다. 구성적 조절 요소는 작동 가능하게 결합되는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 더 향상시키기 위해서 다른 서열과 커플링될 수도 있다. 예를 들어, CPMV-HT 시스템은 동부 모자이크 바이러스 (CPMV)의 비번역된 영역으로부터 유래되고 관련된 암호화 서열의 향상된 번역을 입증한다. "토종"은 핵산 또는 아미노산 서열이 자연적으로 발생하거나, 또는 "야생형"인 것을 의미한다. "작동 가능하게 결합된"은 특정 서열, 예를 들어, 원하는 조절 요소 및 암호화 영역이 유전자 발현의 매개 또는 조절과 같이, 의도된 기능을 수행하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용한다는 것을 의미한다. 작동 가능하게 결합된 서열의 상호작용은, 예를 들어, 작동 가능하게 결합된 서열과 상호작용하는 단백질에 의해 매개될 수도 있다.
다단백질 대 프로테아제의 비는, 예를 들어, 조절 요소, 증폭 요소 및/또는 인핸서를 사용함으로써 더 달라질 수도 있다. 예를 들어, 제1 핵산은 조절 요소, 증폭 요소 및/또는 인핸서를 포함할 수도 있다. 제2 핵산은 조절 요소, 증폭 요소 및/또는 인핸서의 같은 조합을 포함할 수도 있거나 또는 포함하지 않을 수도 있다.
예를 들어, 다른 프로모터는 생체 내 프로테아제에 관하여 다단백질 사이에서 차등적 발현을 구동하기 위해 사용될 수도 있다. 예를 들어, 조절 요소의 제1 세트 또는 조합은 유발성 프로모터를 포함할 수도 있는 한편, 조절 요소의 제2 세트 또는 조합에서 프로모터는 구성적일 수도 있거나, 또는 조절 요소의 제2 세트 또는 조합은 유발성 프로모터를 포함할 수도 있는 한편, 조절 요소의 제1 세트 또는 조합에서 프로모터는 구성적일 수도 있다. 프로모터의 강도는 또한, 프로테아제에 비해 다단백질 사이에서 차등적 발현이 생체 내에서 달성되도록, 조절 요소의 제1 및 제2 세트 또는 조합 사이에서 다를 수도 있다.
본 발명은 다음 실시예에서 더 예시될 것이다.
실시예 1 발현 EV71
유전자 합성
EV71 구조 단백질 P1 및 프로테아제 3CD를 암호화하는 DNA 세그먼트를 사용하였다. P1 및 3CD에 대한 후보 서열은 GenBank에서 이용 가능하다. 이 서열들의 비제한 예는 다음과 같다:
● P1 aa 서열에 대하여: 아미노산 서열 GenBank ID ADG57603 (아미노산 1-862) (SEQ ID NO:5); 뉴클레오티드 서열: GenBank ID GQ279369 (뉴클레오티드 743-3328) (SEQ ID NO:6);
● 3CD (균주 HK08)에 대하여: 아미노산 서열: GenBank ID ADG57603 (아미노산 1549-2193) (SEQ ID NO: 1); 뉴클레오티드 서열: GenBank ID GQ279369 (뉴클레오티드 5386-7321) (SEQ ID NO:2);
● 3CD (균주 GDFS08)에 대하여: 아미노산 서열 GenBank ID ACI25378 (아미노산 1549-2193)(SEQ ID NO: 3); 뉴클레오티드 서열: GenBank ID FJ194964 (뉴클레오티드 5387-7321) (SEQ ID NO: 4).
두 개의 P1 유전자를 합성하였다. 첫 번째를 야생형 서열을 사용하여 생산하는 한편, 두 번째는 업계에 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 결정된 최적화된 서열 (인간 코돈 사용)을 기반으로 하였다. 두 개의 3CD 유전자를 야생형 서열에 기초하여 합성하였다. 3개의 야생형 유전자를 Invitrogen™ (구 GeneArt®)으로 합성하였고 최적화된 P1 유전자를 최적화하고 DNA2.0으로 합성하였다.
분자 클로닝
합성된 유전자를 식물 발현 벡터로 클로닝하였다. 선택된 벡터 구성요소는 동부 모자이크 바이러스 (CPMV)-기반 카세트 또는 알팔파 플라스토시아닌 유전자의 전사 및 번역 조절 요소를 포함한다. 조절 요소 둘 다를 재조합 단백질의 높은 발현을 위해 발명자들의 플랫폼(platform)으로 성공적으로 사용하였다. 강낭콩 황고병 제미니바이러스 (BeYDV)의 DNA 증폭 요소는 발명자들의 식물 발현 벡터로 통합될 수 있는 또 다른 특징이다. 그것은 일부 후보물질에 대한 단백질 발현의 큰 증가로 이어졌다. 그러므로 발명자들은 DNA 증폭 요소가 있거나 없는 발현 벡터에서 각 유전자 구조를 클로닝하였다. 표 1은 프로젝트를 위해 조립된 식물 발현 카세트를 나타낸다.
Figure pct00001
발현의 분석 - 최선의 재조합 유전자 구조의 선택
각 발현 카세트를 아그로박테리움 튜메파시엔스로 이동된 플라스미드 벡터로 클로닝하였다. 일과성 발현은 DNA 구조의 이동식 DNA 카피의 이동으로 이어지는 트랜스제닉 아그로박테리움 접종물의 진공 침투에 의해 시작되었다. 다수의 구성요소의 일과성 발현 (동시-발현)을 아그로박테리움 접종물의 혼합물의 침투 (동시-침투)에 의해 수행하였다. 식물로 도입되는 하나의 구성요소 (P1), 및 제2 구성요소, 3CD 프로테아제의 기질이 구조적이기 때문에, 두 개의 구성요소의 발현 수준을 조절하였다. 이것은 상이한 프로모터, 가변적인 강도의 FNA 증폭 시스템의 사용에 의해, 침투의 시간에 각 접종물 (P1 및 3CD)의 상대적 풍부함을 변화시킴으로써, 또는 이것들의 조합에 의해 수행하였다.
발현 벡터 1300 내지 1308을 P1 단독을 발현하는 능력에 대하여, 및 벡터 1310 내지 1318와 결합될 때, 높은 수준의 단백질 가수 분해 단편 VP 1-4를 생산하는 능력에 대하여 스크리닝하였다. 항-VP1 항체만 이용 가능하기 때문에 (Abnova, MAB1255-M05), 단백질 가수 분해 단편의 축적을 VP1의 축적 및 미가공된 P1의 소실을 통해 관찰하였다. 도 2에서 나타난 바와 같이, P1 단독 (벡터 번호 1300)의 발현은 미가공된 구조 단백질 (98 kDa)에 해당하는 분명한 분자량을 갖는 VP1-함유 생성물의 축적으로 이어졌으며, 식물 프로테아제가 바이러스 캡시드 단백질을 생성하기 위해 P1을 분할시킬 수 없다는 것을 나타낸다. 하지만, P1은 3CD와 동시-발현되고 (벡터 번호 1300 + 1310 및 1300 + 1315), 98 kDa 신호는 완전히 사라지고 분자량이 VP1 (33.5 kDa)에 해당하는 새로운 생성물이 검출된다. 이 결과는 바이러스 프로테아제가 생산되고 식물에서 고도로 활성이며 그것은 식물 세포에서 그것의 동시-생산된 기질을 인식하고 분할하여 EV71 캡시드 단백질을 생성하는 것으로 나타난다.
얻어진 결과는 식물에서 VP1 축적의 수준이 P1 단백질을 함유하는 아그로박테리움 대 3CD 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움의 비에 영향을 받으며, 더 높은 축적이 낮은 비율의 3CD 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움과 함께 얻어진다는 것을 나타낸다 (도 2: 1300+1315 (4:2), 1300+1315 (4:1) 및 1300+1315 (4:0.5)를 비교). 3CD의 기원, HK08 대 GDFS08은 또한 식물에서 VP1의 축적 수준에 영향을 준다 (도 2: 1300+1310 (4:0.5) 대 1300+1315 (4:0.5)). 최종적으로, 가장 높은 VP1 축적 수준을 DNA 증폭 요소를 포함하는 발현 벡터로부터 얻어진다는 것을 관찰하였다 (도 2: 1301+1311 (4:2)).
다음 실험에서, P1을 CPMV-HT+BeYDV (1301)의 제어 하에서 유지하는 한편, 상이한 3CD 발현 카세트를 침투의 시간에 상이한 희석배수로 동시-형질전환하였다. 형질전환된 식물의 조단백질 추출물에서 항-VP1 단클론성 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석은 VP1 축적이 P1 대 프로테아제 비의 범위 및 구조 구성요소에 걸쳐 관찰된다는 것을 나타냈다. 가장 높은 수준의 VP1 축적을 일으키는 벡터 조합은 1301 + 1310이었으며, 박테리아 현탁액에서 아그로박테리움 균주 농도의 비는 4:0.5였다 (구조 단백질: 프로테아제) (도 3).
VLP 형성의 분석
VP1의 VLP로의 통합을 농축된 추출물의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 사용으로 평가하였다. 콜로이드 입자를 고속 원심분리 (20분 동안 75 000 xg)에 의해 정화된 조추출물로부터 농축하였다. 펠릿을 세척하였고 1/6 부피의 재현탁 버퍼 (50 mM PBS pH 7.4, 150 mM NaCl)에서 재현탁하였으며 Sephacryl S-500 겔 여과 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 재현탁 버퍼로 용출하였고 용출 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 특성화하였다.
1301+1310 (4:0.5)으로 일과성으로 형질전환된 식물의 단백질 추출물은 SEC 분리를 받았고 용출 분획을 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 및 항-VP1 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도 4A에서 나타난 결과는 숙주 단백질 대부분이 후기 분획에서 컬럼으로부터 용출되며, 분획 16에서 최대인 한편, VP1-특이적 신호를 초기 분획에서 발견하였으며, 분획 12에서 최대인데 극소량의 숙주 단백질이 발견된다. VP1은 상대적으로 작은 단백질이며, 고분자량 구조로 통합되지 않으면 대부분의 숙주 단백질이 컬럼으로부터 용출될 것으로 예상된다. 따라서, VP1에 대하여 관찰된 용출 프로파일은 VP1이 고분자량 구조로 통합되었다는 것을 강하게 나타냈다. 웨스턴 블롯 및 쿠마시-염색된 겔의 조합은 또한 도 4A에서 쿠마시-염색된 SDS-PAGE에서 화살표로 확인된 풍부한 단백질이 VP1일 수 있다고 제안하였다.
이 실험의 용출 분획 12의 샘플을 투과 전자 현미경 (TEM)에 의한 분석을 위해 Institut Armand-Frappier (IAF, Laval, Quebec)로 보냈다. 샘플을 3% 포스포텅스텐산으로 음성 염색한 후 검사하였다. 도 4B는 EV71-감염된 Vero 세포 배양물에서 발견된 빈 EV71 입자와 크기 및 외관이 동일한 30 nm의 구체 입자 (Liu et al., p10S ONE 6, e20005)가 용출 분획 12에서 관찰된다는 것을 나타낸다. 이 결과는 VP1이 통합되는 고분자량 구조가 진짜 EV71 VLP인 것을 나타낸다.
부분적 정제
VLFExpress 스크리닝 플랫폼의 VLP 정제 방법을 형질전환된 식물 바이오매스(biomass)의 외피성 VLP (140 nm 지름)의 정제를 위해 개발하였다. 방법은 세포 외 및 시토졸 함량의 방출을 위해 세포벽의 효소 분해를 사용하고 얻어진 추출물은 6시간 동안 16 000g로 원심분리되어 VLP를 펠릿화하기 전에 심층 여과(deep filtration) 및 미세여과를 받는다. 펠릿을 1/60 부피의 재현탁 용액 (100 mM Na/KP04 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.01% Tween-80)에서 재현탁하였고 멸균 여과하였다
VLPExpress 정제 방법을 30 nm 비-외피성 EV71 VLP를 농축하는 능력에 대하여 테스트하였다. 정제 방법을 발현 벡터 1301 + 1310 (4:0.5)으로 형질전환된 식물에 적용하였다. 결과의 생성물을 쿠마시-염색된 SDS- PAGE 및 항-VP1 웨스턴 블롯으로 분석하였다 (도 5A). 정제된 생성물의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 분석은 분자량이 EV71 코팅 단백질에 해당하는 단백질의 존재를 나타낸다 (화살표로 표시됨, 도 5A, 오른쪽 패널). VP1의 동일성을 웨스턴 블롯으로 확인하였다 (도 5A, 왼쪽 패널). 다른 캡시드 단백질에 대하여, 확인은 추정된 분자량; VPO에 대하여 37.5 kDa 및 VP3에 대하여 26.5 kDa를 기반으로 하였다. VP4 및 VP2는 비분할된 VP0의 형태로 발견될 것으로 예상되는데, 바이러스 입자의 형태에서 VP4 및 VP2 사이의 분할은 단지 바이러스 RNA의 내재화 후에만 발생하기 때문이다. 정제된 생성물의 투과 전자 현미경 분석은 크기 및 모양이 EV71 VLP에 해당하는 30 nm의 풍부한 구체 구조를 나타낸다 (도 5B).
발현에 대한 결론
EV71 VLP를 생산하는 식물-기반 일과성 발현 플랫폼의 능력을 입증하기 위해 수행된 작업은 다음 결론으로 이어졌다:
● EV71 P1 및 3CD 단백질은 시스템에서 효과적으로 생산된다.
● 3CD는 식물체 안에서(in planta) 활성이고 P1을 캡시드 단백질로 올바르게 가공한다.
● EV71 캡시드 단백질은 VLP로 조립된다.
● EV71 VLP는 추출 가능하고 식물 바이어매스로부터 온전하게 정제될 수 있다.
실시예 2 - 발현 폴리오바이러스 발현
유전자 합성
인간 엔테로바이러스 C 혈청형 PV-1의 폴리오바이러스 (PV) 구조 단백질 P1 및 프로테아제 3CD를 암호화하는 DNA 세그먼트가 사용될 수도 있다. P1 및 3CD에 대한 후보 서열은 GenBank에서 이용 가능하다. 이 서열들의 비 제한 실시예는 다음과 같다:
P1에 대하여: 아미노산 서열 GenBank ID NP_041277 (아미노산 1-881) (SEQ ID NO: 10); 뉴클레오티드 서열: GenBank ID NC_002058 (뉴클레오티드 743-3385) (SEQ ID NO: 9);
3CD에 대하여: 아미노산 서열 GenBank ID NP 041277 (아미노산 1566-2209) (SEQ ID NO:8); 뉴클레오티드 서열: GenBank ID NC_002058 (뉴클레오티드 5438-7369) (SEQ ID NO:7).
두 개의 P1 유전자를 합성할 수도 있다. 첫 번째는 야생형 서열을 사용하여 생산될 수도 있는 한편 두 번째는 업계에 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 결정된 최적화된 서열 (인간 코돈 사용)을 기반으로 하였다. 3CD 유전자를 야생형 서열을 기반으로 하여 합성할 수도 있다. 야생형 유전자 둘 다 (P1 및 3CD)를 Invitrogen™ (구 GeneArt®)으로 합성하였고 최적화된 P1 유전자를 최적화하고 DNA2.0으로 합성하였다.
분자 클로닝
합성된 유전자를 식물 발현 벡터로 클로닝하였다. 선택된 벡터 구성요소는 동부 모자이크 바이러스 (CPMV)-기반 카세트 또는 알팔파 플라스토시아닌 유전자의 전사 및 번역 조절 요소를 포함하는데, 조절 요소 둘 다를 이전에 재조합 단백질의 높은 발현을 위해 성공적으로 사용하였기 때문이다. 강낭콩 황고병 제미니바이러스 (BeYDV)의 DNA 증폭 요소는 또한 식물 발현 벡터로 통합될 수도 있다. 그러므로 각 유전자 구조를 DNA 증폭 요소가 있거나 없는 발현 벡터에서 클로닝할 수도 있다. 표 2는 조립될 수도 있는 식물 발현 카세트를 나타낸다.
Figure pct00002
발현의 분석 - 최선의 재조합 유전자 구조의 선택
각 발현 카세트를 아그로박테리움 튜메파시엔스로 이동된 플라스미드 벡터로 클로닝하였다. 일과성 발현은 DNA 구조의 이동식 DNA 카피의 식물 세포로의 이동으로 이어지는 트랜스제닉 아그로박테리움 접종물의 진공 침투에 의해 시작되었다. 다수의 구성요소의 일과성 발현 (동시-발현)을 아그로박테리움 접종물의 혼합물의 침투 (동시-침투)에 의해 수행하였다. 식물로 도입되는 하나의 구성요소 (P1), 및 제2 구성요소, 3CD 프로테아제의 기질이 구조적이기 때문에, 두 개의 구성요소의 발현 수준을 조절할 수도 있다. 이것은 상이한 프로모터, 가변적인 강도의 FNA 증폭 시스템의 사용에 의해, 침투의 시간에 각 접종물 (P1 및 3CD)의 상대적 풍부함을 변화시킴으로써, 또는 이것들의 조합에 의해 수행하였다.
P1를 가진 발현 벡터를 먼저 P1 단독을 발현하는 능력에 대하여, 및 3CD 벡터와 조합될 때, 높은수준의 단백질 가수 분해 단편을 생산하는 능력에 대하여 스크리닝할 수도 있다. 단백질 가수 분해 단편의 축적을 미가공된 P1의 소실을 통해 관찰하였다. 바이러스 프로테아제는 생산되고 식물에서 고도로 활성일 뿐만 아니라 식물 세포에서 동시-생산된 기질을 인식하고 분할하여 PV 캡시드 단백질을 생성하는 것으로 나타난다.
식물에서 단백질 가수 분해 단편의 수준은 P1 단백질을 함유하는 아그로박테리움 대 3CD 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움의 비에 영향을 받을 수도 있으며, 더 높은 축적이 낮은 비율의 3CD 프로테아제를 함유하는 아그로박테리움과 함께 얻어진다는 것을 나타낸다. DNA 증폭 요소의 존재 및 P1의 가공 및 단백질 가수 분해 단편의 축적 시 상이한 조절 요소의 사용에 관하여 관찰하였다.
VLP 형성의 분석
VP1의 VLP로의 통합을 농축된 추출물의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 사용으로 평가할 수도 있다. 콜로이드 입자를 고속 원심분리에 의해 정화된 조추출물로부터 농축할 수도 있다. 펠릿을 세척하였고 1/6 부피의 재현탁 버퍼에서 재현탁하였으며 겔 여과 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 재현탁 버퍼로 용출하였고 용출 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 특성화하였다.
일과성으로 형질전환된 식물의 단백질 추출물은 SEC 분리를 받을 수도 있고 용출 분획을 쿠마시-염색된 SDS-PAGE로 분석하였다. 결과는 숙주 단백질 대부분이 후기 분획에서 컬럼으로부터 용출되는 한편, VP1-특이적 신호를 초기 분획에서 발견하였다. VP1은 상대적으로 작은 단백질이며, 고분자량 구조로 통합되지 않으면 대부분의 숙주 단백질이 컬럼으로부터 용출될 것으로 예상된다. 따라서, VP1에 대하여 관찰된 용출 프로파일은 VP1이 고분자량 구조로 통합되었다는 것을 강하게 나타냈다. 웨스턴 블롯 및 쿠마시-염색된 겔의 조합은 또한 쿠마시-염색된 SDS-PAGE에서 관찰된 풍부한 단백질이 VP1일 수 있다고 제안하였다.
이 실험의 샘플을 투과 전자 현미경 (TEM)에 의한 분석을 위해 Institut Armand-Frappier (IAF, Laval, Quebec)로 보낼 수도 있다. 결과는 VP1이 통합되는 고분자량 구조가 진짜 EV71 VLP인 것을 나타낸다.
부분적 정제
VLFExpress 스크리닝 플랫폼의 VLP 정제 방법을 형질전환된 식물 바이오매스의 외피성 VLP (140 nm 지름)의 정제를 위해 개발하였다. 방법은 세포 외 및 시토졸 함량의 방출을 위해 세포벽의 효소 분해를 사용하고 얻어진 추출물은 원심분리되어 VLP를 펠릿화하기 전에 심층 여과 및 미세여과를 받는다. 펠릿을 재현탁 용액에서 재현탁하였고 멸균 여과하였다
VLPExpress 정제 방법을 비-외피성 PV VLP를 농축하는 능력에 대하여 테스트할 수도 있다. 정제된 생성물의 쿠마시-염색된 SDS-PAGE 분석은 분자량이 PV 코팅 단백질에 해당하는 단백질의 존재를 나타낼 수도 있다. 캡시드 단백질의 확인은 추정된 분자량을 기반으로 할 수도 있다.
실시예 3-정제
단백질 추출을 기계적 추출 기술, 또는 제WO 2011/035422호 및 제PCT/CA2012/050180호에서 설명된 바와 같이 세포 벽의 효소에 의한 분해를 사용하여 수행하였다 (이것은 본원에 참고로 포함된다). 효소에 의한 추출은 오염되고 있는 식물 단백질의 최소 방출과 함께 생성물의 증가된 방출을 초래한다는 점에서 기계적 추출보다 유리하며, 결과의 추출물에서 주요 오염물질은 세포벽 파괴에 사용된 효소인데, 이것은 충분한 이후의 다운스트림(downstream) 단계를 사용하여 제거될 수도 있다.
기계적 또는 효소에 의한 추출물을 세포 데브리, 아그로박테리아, DNA 및 더 큰 입자를 제거하기 위해 원심분리에 제출하였다. 원심분리된 추출물을 그때 현탁액에서 고체를 제거하고, 바이오버든을 감소시키고, 다운스트림 가공 전에 추출물을 안정화하고 조절하도록 위해 수행된 여과 단계를 통과시켰다. 여과물에서 EV71 VLP의 회수가 정량 검정의 부재 시 평가될 수 없지만, 웨스턴 블롯 분석은 여과 단계 중에 VLP 손실이 최소인 것으로 나타냈다. 결과의 정화된 추출물을 접선 유동 여과 (TFF)를 사용하여 더 가공하였거나 또는 적합한 크로마토그래피 배지에 직접적으로 로딩하였다.
VLP의 크기는 세포벽 탈폴리머화에 사용된 효소를 포함하는, 정화된 추출물에서 발견된 가용성 단백질의 효과적이고 선택적인 제거를 위해 TFF의 사용을 가능하게 한다. TFF 단계는 또한 크로마토그래피용 조제물에서 VLP를 농축하고 버퍼 교환을 가능하게 한다.
여러 크로마토그래피 접근법 (음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 및 가성-친화도), 방식 (결합 또는 통과) 및 버퍼 조건 (pH 5 내지 8, 10 내지 80 mS/cm의 전도성)을 순도를 증가시키고 오염되고 있는 DNA 및 내독소를 감소시키는 능력에 대하여 평가하는 한편, VLP의 원하는 특성을 보존하였다. 발명자들은 특정 조건 하에서, 통과 방식에서 사용된 POROS® D (약한 음이온 교환 레진)이 농축된 EV71 VLP로부터 DNA 및 내독소의 가장 효과적인 제거를 제공할 수 있다는 것을 발견하였다.
제2 TFF 단계를 EV71 VLP 정제 공정에서 크로마토그래피 다음에 추가하였다. 이 TFF 단계의 역할은 원하는 버퍼에서 생성물을 농축하고 제형화하는 것이다. 이 제2 TFF 단계를 위한 기공 크기 및 작동 조건을 제1 TFF에 대하여 확인된 파라미터를 기반으로 하여 결정하였다. 최종적으로, 농축된 명백하게 순수한 EV71 입자를 가진 약물 물질을 0.22-μm 여과 후에 얻었다. 생성물을 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유하는 PBS에서 제형화하였다.
VLP 특성화
EV71 VLP의 제1 로트를 상기 설명된 적용된 공정으로 생산하였고 (로트 번호 479-23-018) 생성물을 완전히 특성화하였다 (표 3, 로트 번호 479-23-018). 순도를 웨스턴 블롯 (항 VP1-VP2)에서 양성 신호를 나타내고, 질량 분석법에 의해 더 확인될 수 있는 유일한 밴드가 생성물의 일부로서 간주되는 쿠마시 염색된 겔의 스캔의 밀도계로 결정하였다. 생성물 품질 프로파일 분석은 조제물이 고도로 순수한 EV71 VLP를 함유한다는 것을 나타냈다.
Figure pct00003
전자 현미경에 의한 생성물의 추가 분석은 정제된 EV71 VLP가 온전하다는 것을 확인하였고 (도 6A) 질량 분석법에 의한 트립신의 맵핑(mapping)이 생성물의 순도를 확인한다는 것을 확인하였다.
실시예 4 - 공정 변형
HIC에 의한 VLP의 온전한 VP1으로 정제
EV71 VLP를 정제하기 위한 크로마토그래피 접근법의 초기 스크리닝 중에 동안, 단편화된 VP1을 함유하는 입자로부터 온전한 VP1을 함유하는 VLP를 분리할 수 있다는 것이 발견되었다. 특정 조건 하에서, LMW VP1 단편을 함유하는 입자는 레진에 강력하게 결합되는 한편, 온전한 입자는 컬럼을 통과하였다. 그러므로 이 HIC 단계를 POROS® D 크로마토그래피 다음의 연마 단계로서 삽입하였다. 이 공정을 통해 정제된 EV71 입자는 크기가 균일하였고 (광 산란), 100% 순도에 가까웠으며, 질량 분석법에 의해 검출 가능한 단백질 오염물질이 없었다. 이 생성물 (로트 번호 479-31-020)의 생성물 품질 속성이 표 3, 중앙 열에서 나타난다.
변형된 추출 과정
식물 추출물을 대략 pH 5.2에서 산성화 또는 열 처리에 의해 정화할 수도 있고 응고물은 원심분리에 의해 제거하였다. 열 처리를 기계적 추출 및 원심분리 단계 사이에 삽입하였다. 60℃에서 10분 동안의 열 처리 (pH 8.0)를 사용하여 EV71 VLP의 가용성에 영향을 미치지 않고 가용성 단백질의 90% 이상을 검출 가능한 수준으로 제거하였다. VP1은 이 조건 하에서 추출되고 정화될 때 온전하게 유지되었다.
열 처리-기반 정화와 함께, pH 8.0에서 기계적 추출을 효소에 의한 추출 대신에 EV71 VLP 정제 공정을 위해 시행하였다. VLP 로트를 이 공정으로 생산하였다 (로트 번호 479-32-020). 생성물의 특성은 표 4 (제3 열)에서 나타난다. 얻어진 결과는 단백질의 열-기반 정화와 함께 사용된 기계적 추출이 이전에 정의된 다운스트림 단계와 완벽하게 호환성인, 효과적인 1차 회수 단계를 대표한다는 것을 나타낸다. 결과의 공정은 매우 유연하고 98% 순수한 EV71 VLP 생성물을 생성한다. 이 공정에서 제조된 EV71 VLP의 광 산란 프로파일은 높은 균질성을 나타낸다. 이 생성물의 Cryo TEM 분석은 입자가 EV71 VLP으이 크기 및 모양을 갖는다는 것을 확인하였다 (도 8).
Figure pct00004
모든 인용문은 본원에서 참고로 포함된다.
본 발명은 하나 이상의 구체예에 관하여 설명되었다. 하지만, 많은 변화 및 변형이 청구범위에서 정의된 바와 같이 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MEDICAGO INC. <120> PICORNA VIRUS-LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PLANTS <130> V84804WO <150> US 61/697,266 <151> 2012-09-05 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 645 <212> PRT <213> Enterovirus A71 <400> 1 Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Val Arg 1 5 10 15 Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg Asp 20 25 30 Arg Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile Trp 35 40 45 Ile Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val Asp 50 55 60 Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Ile Thr Leu Asp Thr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser Ala 85 90 95 Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser Met 100 105 110 Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu Ser 115 120 125 Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys Ala 130 135 140 Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Ile Ile Gly Ile 145 150 155 160 His Ile Gly 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Ala Phe Gly His Leu Tyr Glu Ala Phe His Ala Asn 370 375 380 Pro Gly Thr Ile Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Thr Phe 385 390 395 400 Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe Asp 405 410 415 Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala Leu 420 425 430 Glu Leu Val Leu Arg Glu Ile Gly Tyr Ser Glu Gly Ala Val Ser Leu 435 440 445 Ile Glu Gly Ile Asn His Thr His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr Tyr 450 455 460 Cys Val Leu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe 465 470 475 480 Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala Leu Leu Ile Lys Thr 485 490 495 Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly Asp 500 505 510 Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe Pro Ile Asp Cys Leu Glu Leu Ala 515 520 525 Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser 530 535 540 Pro Cys Phe Asn Glu Val Asn Trp Gly Asn Ala Thr Phe Leu Lys Arg 545 550 555 560 Gly Phe Leu Pro Asp Glu Gln Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr Met 565 570 575 Pro Met Arg Glu 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ttggttcgag gcactaaaga tggtgcttga gaaaatcgga 1320 ttcggagaca gagttgacta catcgactac ctaaaccact cacaccacct gtacaagaat 1380 aaaacatact gtgtcaaggg cggtatgcca tctggctgct caggcacttc aatttttaac 1440 tcaatgatta acaacttgat tatcaggaca ctcttactga aaacctacaa gggcatagat 1500 ttagaccacc taaaaatgat tgcctatggt gatgatgtaa ttgcttccta cccccatgaa 1560 gttgacgcta gtctcctagc ccaatcagga aaagactatg gactaactat gactccagct 1620 gacaaatcag ctacatttga aacagtcaca tgggagaatg taacattctt gaagagattc 1680 ttcagggcag acgagaaata cccatttctt attcatccag taatgccaat gaaggaaatt 1740 catgaatcaa ttagatggac taaagatcct aggaacactc aggatcacgt tcgctctctg 1800 tgccttttag cttggcacaa tggcgaagaa gaatataaca aattcctagc taaaatcagg 1860 agtgtgccaa ttggaagagc tttattgctc ccagagtact caacattgta ccgccgttgg 1920 cttgactcat tt 1932 <210> 8 <211> 644 <212> PRT <213> Enterovirus C <400> 8 Gly Pro Gly Phe Asp Tyr Ala Val Ala Met Ala Lys Arg Asn Ile Val 1 5 10 15 Thr Ala Thr Thr Ser Lys Gly Glu Phe Thr Met Leu Gly Val His Asp 20 25 30 Asn Val Ala Ile Leu Pro Thr His Ala Ser Pro Gly Glu Ser Ile Val 35 40 45 Ile Asp Gly Lys Glu Val Glu Ile Leu Asp Ala Lys Ala Leu Glu Asp 50 55 60 Gln Ala Gly Thr Asn Leu Glu Ile Thr Ile Ile Thr Leu Lys Arg Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Arg Asp Ile Arg Pro His Ile Pro Thr Gln Ile Thr Glu 85 90 95 Thr Asn Asp Gly Val Leu Ile Val Asn Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Met 100 105 110 Tyr Val Pro Val Gly Ala Val Thr Glu Gln Gly Tyr Leu Asn Leu Gly 115 120 125 Gly Arg Gln Thr Ala Arg Thr Leu Met Tyr Asn Phe Pro Thr Arg Ala 130 135 140 Gly Gln Cys Gly Gly Val Ile Thr Cys Thr Gly Lys Val Ile Gly Met 145 150 155 160 His Val Gly Gly Asn Gly Ser His Gly Phe Ala Ala Ala Leu Lys Arg 165 170 175 Ser Tyr Phe Thr Gln Ser Gln Gly Glu Ile Gln Trp Met Arg Pro Ser 180 185 190 Lys Glu Val Gly Tyr Pro Ile Ile Asn Ala Pro Ser Lys Thr Lys Leu 195 200 205 Glu Pro Ser Ala Phe His Tyr Val Phe Glu Gly Val Lys Glu Pro Ala 210 215 220 Val Leu Thr Lys Asn Asp Pro Arg Leu Lys Thr Asp Phe Glu Glu Ala 225 230 235 240 Ile Phe Ser Lys Tyr Val Gly Asn Lys Ile Thr Glu Val Asp Glu Tyr 245 250 255 Met Lys Glu Ala Val Asp His Tyr Ala Gly Gln Leu Met Ser Leu Asp 260 265 270 Ile Asn Thr Glu Gln Met Cys Leu Glu Asp Ala Met Tyr Gly Thr Asp 275 280 285 Gly Leu Glu Ala Leu Asp Leu Ser Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr Val 290 295 300 Ala Met Gly Lys Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asn Lys Gln Thr Arg Asp 305 310 315 320 Thr Lys Glu Met Gln Lys Leu Leu Asp Thr Tyr Gly Ile Asn Leu Pro 325 330 335 Leu Val Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Lys Thr Lys Val Glu 340 345 350 Gln Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser Val 355 360 365 Ala Met Arg Met Ala Phe Gly Asn Leu Tyr Ala Ala Phe His Lys Asn 370 375 380 Pro Gly Val Ile Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asp Pro Asp Leu Phe 385 390 395 400 Trp Ser Lys Ile Pro Val Leu Met Glu Glu Lys Leu Phe Ala Phe Asp 405 410 415 Tyr Thr Gly Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Ala Trp Phe Glu Ala Leu 420 425 430 Lys Met Val Leu Glu Lys Ile Gly Phe Gly Asp Arg Val Asp Tyr Ile 435 440 445 Asp Tyr Leu Asn His Ser His His Leu Tyr Lys Asn Lys Thr Tyr Cys 450 455 460 Val Lys Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile Phe Asn 465 470 475 480 Ser Met Ile Asn Asn Leu Ile Ile Arg Thr Leu Leu Leu Lys Thr Tyr 485 490 495 Lys Gly Ile Asp Leu Asp His Leu Lys Met Ile Ala Tyr Gly Asp Asp 500 505 510 Val Ile Ala Ser Tyr Pro His Glu Val Asp Ala Ser Leu Leu Ala Gln 515 520 525 Ser Gly Lys Asp Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys Ser Ala 530 535 540 Thr Phe Glu Thr Val Thr Trp Glu Asn Val Thr Phe Leu Lys Arg Phe 545 550 555 560 Phe Arg Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Phe Leu Ile His Pro Val Met Pro 565 570 575 Met Lys Glu Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Pro Arg Asn 580 585 590 Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His Asn Gly 595 600 605 Glu Glu Glu Tyr Asn Lys Phe Leu Ala Lys Ile Arg Ser Val Pro Ile 610 615 620 Gly Arg Ala Leu Leu Leu Pro Glu Tyr Ser Thr Leu Tyr Arg Arg Trp 625 630 635 640 Leu Asp Ser Phe <210> 9 <211> 2643 <212> DNA <213> Enterovirus C <400> 9 atgggtgctc aggtttcatc acagaaagtg 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Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly 180 185 190 Val Phe Ala Val Pro Glu Met Cys Leu Ala Gly Asp Ser Asn Thr Thr 195 200 205 Thr Met His Thr Ser Tyr Gln Asn Ala Asn Pro Gly Glu Lys Gly Gly 210 215 220 Thr Phe Thr Gly Thr Phe Thr Pro Asp Asn Asn Gln Thr Ser Pro Ala 225 230 235 240 Arg Arg Phe Cys Pro Val Asp Tyr Leu Leu Gly Asn Gly Thr Leu Leu 245 250 255 Gly Asn Ala Phe Val Phe Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn 260 265 270 Asn Cys Ala Thr Leu Val Leu Pro Tyr Val Asn Ser Leu Ser Ile Asp 275 280 285 Ser Met Val Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Ala Ile Leu Pro Leu Ala 290 295 300 Pro Leu Asn Phe Ala Ser Glu Ser Ser Pro Glu Ile Pro Ile Thr Leu 305 310 315 320 Thr Ile Ala Pro Met Cys Cys Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr 325 330 335 Leu Pro Arg Leu Gln Gly Leu Pro Val Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn 340 345 350 Gln Tyr Leu Thr Ala Asp Asn Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Glu 355 360 365 Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile Asp Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met 370 375 380 Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Met Ile Pro Phe Asp Leu Ser Ala 385 390 395 400 Thr Lys Lys Asn Thr Met Glu Met Tyr Arg Val Arg Leu Ser Asp Lys 405 410 415 Pro His Thr Asp Asp Pro Ile Leu Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser 420 425 430 Asp Pro Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr 435 440 445 Thr His Trp Ala Gly Ser Leu Lys Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Phe 450 455 460 Met Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Val Ser Tyr Ala Pro Pro Gly Ala 465 470 475 480 Asp Pro Pro Lys Lys Arg Lys Glu Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile 485 490 495 Trp Asp Ile Gly Leu Gln Ser Ser Cys Thr Met Val Val Pro Trp Ile 500 505 510 Ser Asn Thr Thr Tyr Arg Gln Thr Ile Asp Asp Ser Phe Thr Glu Gly 515 520 525 Gly Tyr Ile Ser Val Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Leu Ser 530 535 540 Thr Pro Arg Glu Met Asp Ile Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Asn Asp 545 550 555 560 Phe Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Thr His Ile Glu Gln Lys Ala 565 570 575 Leu Ala Gln Gly Leu Gly Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Asp Asn Thr 580 585 590 Val Arg Glu Thr Val Gly Ala Ala Thr Ser Arg Asp Ala Leu Pro Asn 595 600 605 Thr Glu Ala Ser Gly Pro Thr His Ser Lys Glu Ile Pro Ala Leu Thr 610 615 620 Ala Val Glu Thr Gly Ala Thr Asn Pro Leu Val Pro Ser Asp Thr Val 625 630 635 640 Gln Thr Arg His Val Val Gln His Arg Ser Arg Ser Glu Ser Ser Ile 645 650 655 Glu Ser Phe Phe Ala Arg Gly Ala Cys Val Thr Ile Met Thr Val Asp 660 665 670 Asn Pro Ala Ser Thr Thr Asn Lys Asp Lys Leu Phe Ala Val Trp Lys 675 680 685 Ile Thr Tyr Lys Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe 690 695 700 Thr Tyr Ser Arg Phe Asp Met Glu Leu Thr Phe Val Val Thr Ala Asn 705 710 715 720 Phe Thr Glu Thr Asn Asn Gly His Ala Leu Asn Gln Val Tyr Gln Ile 725 730 735 Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Pro Glu Lys Trp Asp Asp Tyr 740 745 750 Thr Trp Gln Thr Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Thr Tyr Gly Thr 755 760 765 Ala Pro Ala Arg Ile Ser Val Pro Tyr Val Gly Ile Ser Asn Ala Tyr 770 775 780 Ser His Phe Tyr Asp Gly Phe Ser Lys Val Pro Leu Lys Asp Gln Ser 785 790 795 800 Ala Ala Leu Gly Asp Ser Leu Tyr Gly Ala Ala Ser Leu Asn Asp Phe 805 810 815 Gly Ile Leu Ala Val Arg Val Val Asn Asp His Asn Pro Thr Lys Val 820 825 830 Thr Ser Lys Ile Arg Val Tyr Leu Lys Pro Lys His Ile Arg Val Trp 835 840 845 Cys Pro Arg Pro Pro Arg Ala Val Ala Tyr Tyr Gly Pro Gly Val Asp 850 855 860 Tyr Lys Asp Gly Thr Leu Thr Pro Leu Ser Thr Lys Asp Leu Thr Thr 865 870 875 880 Tyr

Claims (20)

  1. 식물에서 피코르나바이러스-유사 입자 (PVLP)를 생산하는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 피코르나바이러스 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입하는 단계;
    b) 하나 이상의 프로테아제를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하는 제2 핵산을 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포로 도입하는 단계; 및
    c) 제1 및 제2 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 식물, 식물의 일부, 또는 식물 세포를 배양하고, 이로 인해 PVLP를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 제1 핵산 대 제2 핵산의 도입된 양의 비는 20:1 내지 0.5:1인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 하나 이상의 피코르나바이러스 다단백질은 P1인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1 항에 있어서, 하나 이상의 피코르나바이러스 다단백질은 구조 단백질 VPO, VP1, VP2, VP3, VP4, 또는 이것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1 항에 있어서, 피코르나바이러스는 아프토바이러스, 아비헤파토바이러스, 카르디오바이러스, 엔테로바이러스, 에르보바이러스, 헤파토바이러스, 코부바이러스, 파레초바이러스, 사펠로바이러스, 세네카바이러스, 테스코바이러스 및 트레모바이러스의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1 항에 있어서, 피코르나바이러스는 엔테로바이러스 71 또는 폴리오바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1 항에 있어서, 프로테아제는 피코르나바이러스 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7 항에 있어서, 프로테아제는 3CD 프로테아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1 항에 있어서, 도입 단계 (단계 a)에서, 핵산은 식물에서 일과성으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1 항에 있어서, 도입 단계 (단계 a)에서, 핵산은 식물에서 안정하게 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1 항에 있어서, 식물을 수확하고 PVLP를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포에서 피코르나바이러스-유사 입자 (PVLP)를 생산하는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 피코르나바이러스 다단백질을 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제1 조절 영역을 포함하는 제1 핵산 및 하나 이상의 프로테아제를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 결합된 식물에서 활성인 제2 조절 영역을 포함하는 제2 핵산을 포함하는 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포를 제공하는 단계; 및
    b) 식물, 식물의 일부 또는 식물 세포 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하고, 이로 인해 PVLP를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  13. 제12 항에 있어서, 식물을 수확하고 PVLP를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1 항의 방법에 의해 생산된 PVLP.
  15. 대상체에서 면역 반응을 유발하기 위한 제14 항의 PVLP의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  16. 대상체에서 피코르나바이러스 감염에 대한 면역력을 유발하는 방법으로서, 제14 항의 PVLP를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16 항에 있어서, PVLP는 대상체에 경구로, 피부 내로, 비강 내로, 근육 내로, 복강 내로, 정맥 내로, 또는 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14 항에서 설명된 바와 같이 PVLP를 사용하여 제조된 다클론성 항체.
  19. 제1 항 또는 제12 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 하나 또는 하나 이상의 코모바이러스 인핸서, 다단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소에 작동 가능하게 결합된 제1 조절 영역을 포함하고, 레플리카제를 암호화하는 제3 핵산은 식물 또는 식물의 일부로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1 항 또는 제12 항에 있어서, 제2 핵산은 하나 또는 하나 이상의 증폭 요소 또는 하나 이상 코모바이러스 인핸서를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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