JP2020171302A - 植物におけるピコルナウイルス様粒子の産生 - Google Patents

Abstract

【課題】植物においてピコルナウイルス様粒子（ＰＶＬＰ）を生成する方法を提供する。【解決手段】第１の核酸および第２の核酸を植物、植物の一部、または植物細胞に導入することを含み、第１の核酸は、ピコルナウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、植物において活性な第１の調節領域を含み、第２の核酸は、植物において活性であり、１つまたは複数のピコルナウイルスプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した第２の調節領域を含む、方法。【選択図】図１

Description

本発明は、植物においてピコルナウイルス構造タンパク質を生成することに関する。より詳細には、本発明は、植物においてピコルナウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を生成することにも関する。

ピコルナウイルスは、ヒトおよび動物において広範囲の臨床症状を引き起こす可能性がある、小さな、エンベロープを有さないプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ピコルナウイルスは、配列相同性および酸感受性を含めたいくつかの性質に基づいて、ヒトおよび動物の多くの重要な病原体であるいくつかの属に分離される。

ピコルナウイルスは裸のヌクレオカプシドを有する。カプシドは、６０個のプロトマーがしっかりとパッキングされた正二十面体構造に配置されたものである。各プロトマーは、ＶＰ（ウイルスタンパク質）１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４として公知の４つのポリペプチドからなる。ＶＰ２ポリペプチドおよびＶＰ４ポリペプチドは、ＶＰ０として公知の１つの前駆体に由来し、この前駆体はウイルスのゲノムＲＮＡが細胞内に内部移行した後に切断される。ＶＰ４はカプシドの内側に位置する。脱水の種類および程度に応じて、ウイルス粒子は直径およそ２７〜３０ｎｍである。

ピコルナウイルスは、ポリタンパク質をコードする単一のＯＲＦで構成される７．１〜８．９ｋｂの単分節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）直鎖ポリアデニル化ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムを有する。ウイルスのゲノムＲＮＡは、その５’末端に、メチル化されたヌクレオチドキャップ構造の代わりにウイルスタンパク質（ＶＰｇ）を有する。５’末端の長いＵＴＲは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有する。Ｐ１領域は構造ポリペプチドをコードする。Ｐ２領域およびＰ３領域は、複製に関連する非構造タンパク質をコードする。より短い３’ＵＴＲは（−）鎖合成において重要である。Ｌは、いくつかの属において存在する追加的なＮ末端リーダータンパク質であり、プロテアーゼであるか（アフトウイルス、エルボウイルス）、または他の機能を有するか（コブウイルス、カルジオウイルス）のいずれかであり得る。

ビリオンＲＮＡは感染性であり、ゲノムおよびウイルスのメッセンジャーＲＮＡの両方としての機能を果たす。ＩＲＥＳは、ポリタンパク質の翻訳を導くことを可能にする。ポリタンパク質は、最初にウイルスプロテアーゼ（複数可）によって種々の前駆体および成熟タンパク質にプロセシングされて構造タンパク質、レプリカーゼ、ＶＰｇ、および宿主細胞を改変し、最終的に細胞溶解を導くいくつかのタンパク質がもたらされる。

エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）は一本鎖ＲＮＡウイルスのＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。ＥＶ７１は、エンベロープを有さないウイルスであり、そのカプシドは単一のウイルスの翻訳産物の断片として生成される多数のコートタンパク質で構成される。ウイルスのポリタンパク質の、構造成分および非構造成分へのプロセシングが図１に示されている（先行技術）。ポリタンパク質遺伝子のＰ１領域は構造タンパク質をコードし、一方、Ｐ２領域およびＰ３領域はウイルスの非構造成分をコードする。ウイルスプロテアーゼ２Ａによってポリタンパク質から構造タンパク質前駆体Ｐ１（図１の１ＡＢＣＤ）が切断された後、Ｐ１前駆体がプロセシングされてカプシドタンパク質ＶＰ０、ＶＰ１（図１の１Ｄ断片）およびＶＰ３（図１の１Ｃ断片）になる。Ｐ３領域によりコードされる３Ｃ成分およびその前駆体３ＣＤは、Ｐ１前駆体のカプシドタンパク質へのプロセシングに関与するウイルスプロテアーゼである。ＶＰ０プロトマー、ＶＰ１プロトマーおよびＶＰ３プロトマーが自然に集合して空のカプシドを構築し、空の粒子の構築後、その粒子内にウイルスＲＮＡがパッケージングされると考えられている。空のカプシドとゲノムＲＮＡが結びつくことにより、構造シフト、ＲＮＡの内部移行、ＶＰ０のＶＰ２（図１の１Ｂ断片）およびＶＰ４（図１の１Ａ断片）への自己触媒的切断、ならびに安定な１５０Ｓビリオンへの成熟がもたらされる。切断されていないＶＰ０前駆体を含有する空のカプシドがピコルナウイルス感染の間に共通して見いだされる。

昆虫細胞におけるＥＶ７１ ＶＬＰの生成が、Ｐ１前駆体タンパク質を３ＣＤプロテアーゼと同時発現することにより得られている（Ｈｕら、２００３年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２５巻：９１９〜９２５頁）。Ｐ１および３ＣＤを生成するための、単一のバキュロウイルスベクターの使用がＣｈｕｎｇら（２００８年、Ｖａｃｃｉｎｅ ２６巻：１８５５〜１８６２頁）によって記載されている。マウスにおける免疫原性試験により、精製されたＥＶ７１ ＶＬＰにより、致死用量のウイルスを用いた攻撃に対する保護が付与されることが示された。

ＥＶ７１由来のＶＰ１タンパク質はトランスジェニックトマトの果実において生成されており、マウスにＶＰ１を含有するトランスジェニック果実を与えることにより、ＶＰ１に特異的な糞便ＩｇＡおよび血清ＩｇＧの発生がもたらされた（Ｃｈｅｎら、２００６年、Ｖａｃｃｉｎｅ ２４巻：２９４４〜２９５１頁）。

口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＰ１前駆体タンパク質およびプロテアーゼ３Ｃがトランスジェニックアルファルファにおいて同時発現された（Ｄｕｓ Ｓａｎｔｏｓら、２００５年、Ｖａｃｃｉｎｅ ２３巻：１８３８〜１８４３頁）。アルファルファが、ＦＭＤＶ
Ｐ１のゲノム領域（１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ）、２Ａ、２ＢのＮ末端の最初の１６アミノ酸残基、３Ｂ１、３Ｂ２、３Ｂ３、３Ｃの完全な配列および３ＤのＮ末端の最初の１６アミノ酸残基を含む単一のベクターを用いて安定に形質転換された。トランスジェニック植物由来の粗タンパク質抽出物の免疫原性がＢａｌｂ／ｃマウスへの腹腔内投与によって実証された。免疫したマウスは、致死的なＦＭＤＶ攻撃からも保護された。抗原発現のレベルは実用的な目的のためには低かった。
アルゼンチン特許出願第ＡＲ０７８２５７号には、空のカプシドウイルスを発現しているトランスジェニック植物が開示されており、ここで、トランスジェニック植物は、自己触媒性２Ａプロテアーゼに連結したＰ１前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトをゲノム内に含む。ＤＮＡコンストラクトは、タンパク質断片３Ｄをコードする配列の断片に連結した３Ｃプロテアーゼをコードする配列に付着したタンパク質断片２Ｂをさらに含有してよい。

Ｈｕら、２００３年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２５巻：９１９〜９２５頁 Ｃｈｕｎｇら、２００８年、Ｖａｃｃｉｎｅ ２６巻：１８５５〜１８６２頁 Ｃｈｅｎら、２００６年、Ｖａｃｃｉｎｅ ２４巻：２９４４〜２９５１頁 Ｄｕｓ Ｓａｎｔｏｓら、２００５年、Ｖａｃｃｉｎｅ ２３巻：１８３８〜１８４３頁

本発明は、植物においてピコルナウイルス構造タンパク質を生成することに関する。より詳細には、本発明は、植物においてピコルナウイルス構造タンパク質を含むウイルス様粒子を生成することにも関する。

本発明によれば、植物においてピコルナウイルス様粒子（ＰＶＬＰ）を生成する方法（Ａ）であって、
ａ）１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、植物において活性な第１の調節領域を含む第１の核酸を植物または植物の一部に導入するステップと、
ｂ）植物において活性であり、１つまたは複数のプロテアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した第２の調節領域を含む第２の核酸を導入するステップと、
ｃ）植物、植物の一部を、第１の核酸および第２の核酸の発現を可能とする条件下でインキュベートし、それにより、ＰＶＬＰを生成するステップと
を含む方法（Ａ）が提供される。

本発明は、ピコルナウイルス様粒子（ＰＶＬＰ）を生成する方法（Ｂ）であって、
ａ）１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、植物において活性な第１の調節領域を含む第１の核酸と、１つまたは複数のプロテアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、植物において活性な第２の調節領域を含む第２の核酸を含む植物、植物の一部、または植物細胞を提供するステップと、
ｂ）植物、植物の一部、または植物細胞を、核酸の発現を可能とする条件下でインキュベートし、それにより、ＰＶＬＰを生成するステップと
を含む方法（Ｂ）も提供する。

植物において活性な第１の調節領域と植物において活性な第２の調節領域は同じであっても異なってもよい。

さらに、方法（Ａ）または方法（Ｂ）において、植物、植物の一部、または植物細胞に導入される第１の核酸と第２の核酸のパーセント比は、９５％：５％から５０％：５０％の間、または約２０：１から約０．５：１の間であってよい。

本発明は、上記の方法（Ａ）または方法（Ｂ）も含み、ここで、第１の核酸配列は、１つまたは２つ以上のコモウイルスエンハンサー、ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および１つまたは２つ以上のジェミニウイルス増幅エレメントと作動可能に連結した第１の調節領域を含み、ジェミニウイルスレプリカーゼをコードする第３の核酸を植物または植物の一部に導入する。１つまたは２つ以上のコモウイルスエンハンサーは、コモウイルスＵＴＲ、例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ ５’、３’ＵＴＲなどのササゲモザイクウイルス高翻訳性（ｈｙｐｅｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）（ＣＰＭＶ−ＨＴ）ＵＴＲ、またはこれらの組合せなどであってよい。１つまたは２つ以上のジェミニウイルス増幅エレメントは、マメ黄萎病ウイルスの長い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＬＩＲ）、およびＢｅＹＤＶの短い遺伝子間領域（ＢｅＹＤＶ ＳＩＲ）から選択することができる。

上記の方法（方法Ａ）は、サイレンシングのサプレッサー、例えば、ＨｃＰｒｏまたはｐ１９をコードする別の核酸配列を導入することも伴ってよい。

上記の方法（方法Ｂ）は、サイレンシングのサプレッサー、例えば、ＨｃＰｒｏまたはｐ１９をコードする別の核酸配列を含む植物、植物の一部、または植物細胞をさらに提供することも伴ってよい。

本発明は、導入するステップ（ステップａ）において、核酸を植物において一過性に発現させる上記の方法（Ａ）も含む。あるいは、導入するステップ（ステップａ）において、核酸を植物において安定に発現させる。

上記の方法（Ａ）および方法（Ｂ）は、植物を採取し、ＰＶＬＰを精製するステップをさらに含んでよい。

本発明は、免疫応答を誘導するための有効用量の前述のＰＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物を含む。

本発明は、被験体においてピコルナウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、前述のＰＶＬＰを被験体に投与することを含む方法も含む。ＰＶＬＰは、被験体に、経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与することができる。

本発明は、上記の方法（Ａ）および／または方法（Ｂ）によって生成されるＰＶＬＰを含む植物体も提供する。植物体は、被験体においてピコルナウイルス感染に対する免疫を誘導することに使用することができる。植物体は、栄養補助食品として混合することもできる。

この発明の概要に本発明の特徴が全て記載されているとは限らない。

本発明のこれらおよび他の特徴は、添付の図面を参照した以下の説明からより明らかになる。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
植物においてピコルナウイルス様粒子（ＰＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、該植物において活性な第１の調節領域を含む第１の核酸を、該植物、該植物の一部、または植物細胞に導入するステップと、
ｂ）該植物において活性であり、１つまたは複数のプロテアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、第２の調節領域を含む第２の核酸を、該植物、該植物の一部、または植物細胞に導入するステップと、
ｃ）該植物、該植物の一部、または植物細胞を、該第１の核酸および該第２の核酸の発現を可能とする条件下でインキュベートし、それにより、該ＰＶＬＰを生成するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記第１の核酸と前記第２の核酸の導入量の比が２０：１から０．５：１の間である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質がＰ１である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質が、構造タンパク質ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、またはその組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ピコルナウイルスがアフトウイルス、アビヘパトウイルス、カルジオウイルス、エンテロウイルス、エルボウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、サペロウイルス、セネカウイルス、テッショウウイルスおよびトゥレモウイルスの群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ピコルナウイルスがエンテロウイルス７１またはポリオウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記プロテアーゼがピコルナウイルスプロテアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記プロテアーゼが３ＣＤプロテアーゼである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸を前記植物において一過性に発現させる、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸を前記植物において安定に発現させる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記植物を採取し、前記ＰＶＬＰを精製するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
植物、植物の一部または植物細胞においてピコルナウイルス様粒子（ＰＶＬＰ）を生成する方法であって、
ａ）１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、該植物において活性な第１の調節領域を含む第１の核酸と、１つまたは複数のプロテアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、該植物において活性な第２の調節領域を含む第２の核酸とを含む植物、植物の一
部または植物細胞を提供するステップと、
ｂ）該植物、該植物の一部または植物細胞を、該核酸の発現を可能とする条件下でインキュベートし、それにより、該ＰＶＬＰを生成するステップと
を含む方法。
（項目１３）
前記植物を採取し、前記ＰＶＬＰを精製するステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
項目１に記載の方法によって生成されるＰＶＬＰ。
（項目１５）
被験体において免疫応答を誘導するための治療有効量の項目１４に記載のＰＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
（項目１６）
項目１４に記載のＰＶＬＰを投与することを含む、被験体においてピコルナウイルス感染に対する免疫を誘導する方法。
（項目１７）
前記ＰＶＬＰを被験体に、経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１４に記載のＰＶＬＰを使用して調製したポリクローナル抗体。
（項目１９）
前記第１の核酸配列が、１つまたは２つ以上のコモウイルスエンハンサー、前記ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および１つまたは２つ以上の増幅エレメントに作動可能に連結した前記第１の調節領域を含み、レプリカーゼをコードする第３の核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する、項目１または１２に記載の方法。
（項目２０）
前記第２の核酸が、１つもしくは２つ以上の増幅エレメントまたは１つもしくは複数のコモウイルスエンハンサーを含まない、項目１または１２に記載の方法。

図１は、ピコルナウイルスゲノム（エンテロウイルス７１）およびポリタンパク質プロセシング中間体の先行技術の表示を示す図である（ＶｉｒａｌＺｏｎｅウェブページより）。

図２は、Ｐ１の発現および３ＣＤによるプロセシングのウエスタンブロット分析を示す図である。上で識別された発現ベクターを用いて形質転換した植物由来のタンパク質抽出物１０マイクログラムをローディングし、非還元条件下で電気泳動した。マウス抗ＶＰ１モノクローナル抗体を免疫検出のために使用した。比は、形質転換のために使用した細菌懸濁液中の、Ｐ１ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（コンストラクト１３００または１３０１、表１参照）の３ＣＤ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（コンストラクト１３１０、１３１１または１３１５、表１参照）に対する割合を示す。Ｐ１およびＶＰ１の予測位置が示されている。

図３は、ＶＰ１の蓄積を最大にするための３ＣＤ発現戦略のスクリーニングを示す図である。上で識別された発現ベクターを用いて形質転換した植物由来のタンパク質抽出物５マイクログラムをローディングし、非還元条件下で電気泳動した。マウス抗ＶＰ１モノクローナル抗体を免疫検出のために使用した。比は、形質転換のために使用した細菌懸濁液中の、Ｐ１ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（１３０１）の３ＣＤ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（１３１０、１３１１、１３１２および１３１３）に対する割合を示す。

図４は、ＥＶ７１カプシド構築の評価を示す図である。（Ａ）Ｐ１と３ＣＤを同時発現している植物（コンストラクト１３０１＋１３１０（４：０．５））由来のタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分離からの溶出画分のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を示す図である。クーマシー染色ゲルにおけるＶＰ１に対応すると推定されるバンドが示されている。（Ｂ）ＳＥＣ溶出画分１２の陰性染色透過型電子顕微鏡検査を示す。棒は１００ｎｍを示す。

図５は、精製されたＥＶ７１ ＰＶＬＰの特徴付けを示す図である。（Ａ）精製されたＥＶ７１ ＰＶＬＰのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を示す。クーマシー染色ゲルにおけるＶＰ１に対応するバンドが示されている。分子量が他のＥＶ７１カプシドタンパク質に対応する他のバンドも同定されている。（Ｂ）精製されたＥＶ７１ ＰＶＬＰの陰性染色透過型電子顕微鏡検査を示す。検査前に試料を１／１００希釈した。棒は１００ｎｍを示す。

図６は、電子顕微鏡によるロット４７９−２３−０１８の特徴付けを示す図である。

図７は、酵素補助法によって抽出し、ＨＩＣによって処理し、選択したＥＶ７１ ＰＶＬＰのクライオ電子顕微鏡分析を示す（ロット番号４７９−３１−０２０）。

図８は、加熱処理を伴う機械的な抽出方法（ｐＨ８．０）によって抽出したＥＶ７１ ＰＶＬＰのクライオ電子顕微鏡分析を示す図である（ロット番号４７９−３２−０２０）。 図９Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号１）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号２）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号３）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号４）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｅは、Ｐ１アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１〜８６２）（配列番号５）を示す図である。図９Ｆは、Ｐ１ヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド７４３〜３３２８）（配列番号６）を示す図である。図９Ｇは、ヒトエンテロウイルスＣ血清型ＰＶ−１由来のＰＶｇｐ１ポリタンパク質ヌクレオチド配列（ゲノムについてはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８、ポリタンパク質についてはＮＰ＿０４１２７７：ヌクレオチド５４３８〜７３６９）（配列番号７）を示す図である。図９Ｈは、ポリオウイルス由来のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１５６６〜２２０９）（配列番号８）を示す図である。図９Ｉは、ＰＶｇｐ１ポリタンパク質［ヒトエンテロウイルスＣ］のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８からのヌクレオチド７４３〜３３８５）（配列番号９）を示す図である。図９Ｊは、ポリタンパク質のアミノ酸配列［ヒトエンテロウイルスＣ］ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１〜８８１）（配列番号１０）を示す図である。 図９Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号１）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号２）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号３）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号４）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｅは、Ｐ１アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１〜８６２）（配列番号５）を示す図である。図９Ｆは、Ｐ１ヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド７４３〜３３２８）（配列番号６）を示す図である。図９Ｇは、ヒトエンテロウイルスＣ血清型ＰＶ−１由来のＰＶｇｐ１ポリタンパク質ヌクレオチド配列（ゲノムについてはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８、ポリタンパク質についてはＮＰ＿０４１２７７：ヌクレオチド５４３８〜７３６９）（配列番号７）を示す図である。図９Ｈは、ポリオウイルス由来のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１５６６〜２２０９）（配列番号８）を示す図である。図９Ｉは、ＰＶｇｐ１ポリタンパク質［ヒトエンテロウイルスＣ］のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８からのヌクレオチド７４３〜３３８５）（配列番号９）を示す図である。図９Ｊは、ポリタンパク質のアミノ酸配列［ヒトエンテロウイルスＣ］ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１〜８８１）（配列番号１０）を示す図である。 図９Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号１）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号２）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号３）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号４）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｅは、Ｐ１アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１〜８６２）（配列番号５）を示す図である。図９Ｆは、Ｐ１ヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド７４３〜３３２８）（配列番号６）を示す図である。図９Ｇは、ヒトエンテロウイルスＣ血清型ＰＶ−１由来のＰＶｇｐ１ポリタンパク質ヌクレオチド配列（ゲノムについてはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８、ポリタンパク質についてはＮＰ＿０４１２７７：ヌクレオチド５４３８〜７３６９）（配列番号７）を示す図である。図９Ｈは、ポリオウイルス由来のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１５６６〜２２０９）（配列番号８）を示す図である。図９Ｉは、ＰＶｇｐ１ポリタンパク質［ヒトエンテロウイルスＣ］のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８からのヌクレオチド７４３〜３３８５）（配列番号９）を示す図である。図９Ｊは、ポリタンパク質のアミノ酸配列［ヒトエンテロウイルスＣ］ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１〜８８１）（配列番号１０）を示す図である。 図９Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号１）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号２）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号３）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号４）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｅは、Ｐ１アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１〜８６２）（配列番号５）を示す図である。図９Ｆは、Ｐ１ヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド７４３〜３３２８）（配列番号６）を示す図である。図９Ｇは、ヒトエンテロウイルスＣ血清型ＰＶ−１由来のＰＶｇｐ１ポリタンパク質ヌクレオチド配列（ゲノムについてはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８、ポリタンパク質についてはＮＰ＿０４１２７７：ヌクレオチド５４３８〜７３６９）（配列番号７）を示す図である。図９Ｈは、ポリオウイルス由来のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１５６６〜２２０９）（配列番号８）を示す図である。図９Ｉは、ＰＶｇｐ１ポリタンパク質［ヒトエンテロウイルスＣ］のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８からのヌクレオチド７４３〜３３８５）（配列番号９）を示す図である。図９Ｊは、ポリタンパク質のアミノ酸配列［ヒトエンテロウイルスＣ］ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１〜８８１）（配列番号１０）を示す図である。 図９Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号１）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号２）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号３）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号４）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｅは、Ｐ１アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１〜８６２）（配列番号５）を示す図である。図９Ｆは、Ｐ１ヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド７４３〜３３２８）（配列番号６）を示す図である。図９Ｇは、ヒトエンテロウイルスＣ血清型ＰＶ−１由来のＰＶｇｐ１ポリタンパク質ヌクレオチド配列（ゲノムについてはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８、ポリタンパク質についてはＮＰ＿０４１２７７：ヌクレオチド５４３８〜７３６９）（配列番号７）を示す図である。図９Ｈは、ポリオウイルス由来のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１５６６〜２２０９）（配列番号８）を示す図である。図９Ｉは、ＰＶｇｐ１ポリタンパク質［ヒトエンテロウイルスＣ］のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８からのヌクレオチド７４３〜３３８５）（配列番号９）を示す図である。図９Ｊは、ポリタンパク質のアミノ酸配列［ヒトエンテロウイルスＣ］ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１〜８８１）（配列番号１０）を示す図である。 図９Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号１）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号２）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号３）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｄは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４で記載されるヌクレオチド５３８７〜７３２１（配列番号４）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株由来の３ＣＤを示す図である。図９Ｅは、Ｐ１アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１〜８６２）（配列番号５）を示す図である。図９Ｆは、Ｐ１ヌクレオチド配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド７４３〜３３２８）（配列番号６）を示す図である。図９Ｇは、ヒトエンテロウイルスＣ血清型ＰＶ−１由来のＰＶｇｐ１ポリタンパク質ヌクレオチド配列（ゲノムについてはＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８、ポリタンパク質についてはＮＰ＿０４１２７７：ヌクレオチド５４３８〜７３６９）（配列番号７）を示す図である。図９Ｈは、ポリオウイルス由来のポリタンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１５６６〜２２０９）（配列番号８）を示す図である。図９Ｉは、ＰＶｇｐ１ポリタンパク質［ヒトエンテロウイルスＣ］のヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８からのヌクレオチド７４３〜３３８５）（配列番号９）を示す図である。図９Ｊは、ポリタンパク質のアミノ酸配列［ヒトエンテロウイルスＣ］ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７からのアミノ酸１〜８８１）（配列番号１０）を示す図である。

以下の説明は好ましい実施形態に関するものである。

本発明は、１つまたは複数のピコルナウイルス構造タンパク質（すなわち、ピコルナウイルス様タンパク質、またはＰＶＬＰ）を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）、および植物または植物の一部においてＰＶＬＰを生成する方法に関する。したがって、ＰＶＬＰは、１つまたは２つ以上のピコルナウイルス構造タンパク質を含んでよい。例えば、ＰＶＬＰは、１つまたは２つ以上のエンテロウイルス構造タンパク質を含んでよい。

ピコルナウイルスは、アフトウイルス、アビヘパトウイルス、カルジオウイルス、エンテロウイルス、エルボウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、サペロウイルス、セネカウイルス、テッショウウイルスおよびトゥレモウイルスの群から選択することができる。非限定的な例では、ピコルナウイルスは、エンテロウイルス、例えば、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）またはヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルスとしても公知である）であってよい。

本発明は、一部において、植物においてＶＬＰ、例えば、ＰＶＬＰまたはエンテロウイルス様粒子を生成する方法を提供する。方法は、１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、植物において活性な第１の調節領域を含む第１の核酸を植物または植物の一部に導入するステップと、プロテアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、植物において活性な第２の調節領域を含む第２の核酸を導入するステップとを含んでよい。その後、植物または植物の一部を、核酸の発現を可能とする条件下でインキュベートし、それにより、ＰＶＬＰを生成する。

「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）、または「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という用語は、自己集合し、また、１つまたは２つ以上の構造タンパク質、例えば、１つもしくは２つ以上のピコルナウイルス構造タンパク質、または１つもしくは２つ以上のエンテロウイルス構造タンパク質、またはこれらの組合せ、例えば、これだけに限定されないが、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４構造タンパク質、またはこれらの組合せを含む構造を指す。ＶＬＰは、一般に、感染症で生成されるビリオンと形態学的に、および抗原性が類似しているが、複製するために十分な遺伝情報を欠き、したがって非感染性である。ＶＬＰは、植物宿主細胞を含めた適切な宿主細胞において生成することができる。宿主細胞から抽出した後、適切な条件下で単離し、さらに精製する際に、ＶＬＰは、インタクトな構造として精製することができる。

「ピコルナウイルス様粒子」（ＰＶＬＰ）という用語は、１つまたは２つ以上のピコルナウイルス構造タンパク質を含むＶＬＰまたはＶＬＰを指す。この用語または「エンテロウイルス様粒子」とは、１つまたは２つ以上のエンテロウイルス構造タンパク質を含む１つまたは複数のＶＬＰを指す。ピコルナウイルス構造タンパク質の例としては、これだけに限定されないが、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４構造タンパク質、またはこれらの組合せを挙げることができる。エンテロウイルス構造タンパク質の例は、これだけに限定されないが、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４構造タンパク質、またはこれらの組合せを挙げることができる。

ポリタンパク質とは、タンパク質分解処理すると１つまたは複数のタンパク質がもたらされる、１つまたは２つ以上のタンパク質またはタンパク質前駆体を含むタンパク質を意味する。例えば、ポリタンパク質は、１つまたは２つ以上の構造タンパク質を含んでよい。１つまたは複数のタンパク質、例えば、ポリペプチドにおける構造タンパク質は、例えば、プロテアーゼ切断部位のような切断部位によって分離することができる。「ポリタンパク質」の非限定的な例は、「Ｐ１領域」とも称される構造タンパク質前駆体Ｐ１である。Ｐ１領域は、「構造タンパク質」または「コートタンパク質」、例えば、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４またはこれらの組合せを生じるピコルナウイルスポリタンパク質の一部と定義される。本発明に従って使用することができるピコルナウイルスＰ１、またはＰ１の断片の非限定的な例としては、エンテロウイルス、例えば、エンテロウイルス７１由来のＰ１が挙げられる。

限定するものとみなされないＰ１領域の例は、アミノ酸１〜８６２（配列番号５）を含むＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などのこれらの範囲内のいかなるパーセント類似性も含めた配列類似性を有する配列である。さらに、Ｐ１領域をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例は、ヌクレオチド７４３〜３３２８（配列番号６）を含むＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９で記載されるまたはそれに対して少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などのこれらの範囲内のいかなるパーセント類似性も含めた配列類似性を有する配列である。

限定するものとみなされないＰ１領域の別の例は、アミノ酸１５６６〜２２０９を含むＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７で記載されるアミノ酸配列（配列番号８）またはそれに対して少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などのこれらの範囲内のいかなるパーセント類似性も含めた配列類似性を有する配列である。さらに、Ｐ１領域をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例は、ヌクレオチド５４３８〜７３６９（配列番号７）を含むＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８で記載される、またはそれに対して少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などのこれらの範囲内のいかなるパーセント類似性も含めた配列類似性を有する配列である。限定するものとみなされない別の例では、Ｐ１領域は、アミノ酸１〜８８１を含むＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７で記載されるアミノ酸配列（配列番号１０）、またはそれに対して少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などのこれらの範囲内のいかなるパーセント類似性も含めた配列類似性を有する配列である。さらに、Ｐ１領域をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例は、ヌクレオチド７４３〜３３８５（配列番号９）を含むＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８で記載される、またはそれに対して少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などのこれらの範囲内のいかなるパーセント類似性も含めた配列類似性を有する配列である。

「ピコルナウイルスポリタンパク質」とは、任意の天然に存在するまたはバリアントピコルナウイルス株または分離株、例えば、エンテロウイルスポリタンパク質に存在する、ピコルナウイルスから単離されたピコルナウイルスポリタンパク質の全部または一部を指す。同様に、「ピコルナウイルス構造タンパク質」とは、任意の天然に存在するまたはバリアントピコルナウイルス株または分離株に存在する、ピコルナウイルスから単離されたピコルナウイルス構造タンパク質、例えば、エンテロウイルス構造タンパク質、例えば、ポリオウイルスまたはエンテロウイルス７１から得たものの全部または一部を指し得る。したがって、「ピコルナウイルスポリタンパク質」および「ピコルナウイルス構造タンパク質」などの用語は、ウイルスの生活環の間に突然変異によって生じるまたは選択圧（例えば、薬物療法、宿主細胞トロピズムまたは感染性の増大など）に応答して生じる、ピコルナウイルスポリタンパク質、ピコルナウイルス構造タンパク質、またはこれらの組合せの天然に存在するバリアントを含む。「ピコルナウイルスポリタンパク質」という用語は「エンテロウイルスポリタンパク質」をさらに含み、「エンテロウイルス構造タンパク質」などは、ウイルスの生活環の間に突然変異によって生じるまたは選択圧（例えば、薬物療法、宿主細胞トロピズムまたは感染性の増大など）に応答して生じるエンテロウイルスポリタンパク質、エンテロウイルス構造タンパク質、またはこれらの組合せの天然に存在するバリアントを含む。「ピコルナウイルスポリタンパク質」という用語は「ポリオウイルスポリタンパク質」も含み得、「ポリオウイルス構造タンパク質」などは、ウイルスの生活環の間に突然変異によって生じるまたは選択圧（例えば、薬物療法、宿主細胞トロピズムまたは感染性の増大など）に応答して生じるポリオウイルスポリタンパク質、ポリオウイルス構造タンパク質、またはこれらの組合せの天然に存在するバリアントを含む。当業者には理解される通り、ピコルナウイルス、エンテロウイルスもしくはポリオウイルスのポリタンパク質、またはピコルナウイルス、エンテロウイルスもしくはポリオウイルスの構造タンパク質のネイティブなものおよびバリアントは、組換え技法を使用して生成することもできる。

ポリタンパク質は、１つまたは複数の構造タンパク質、例えば、カプシドタンパク質を含んでよい。ピコルナウイルス構造タンパク質またはカプシドタンパク質の非限定的な例は、ピコルナウイルスタンパク質ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４ならびにＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４の断片である。本発明に従って使用することができるＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４、またはＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質の断片の非限定的な例としては、エンテロウイルス、例えば、ポリオウイルスまたはエンテロウイルス７１に由来するＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４タンパク質が挙げられる。さらに、ポリタンパク質構造タンパク質、またはこれらの組合せは、例えば、エンテロウイルス７１ ＨＫ０８株またはＧＤＦＳ０８株であってよい。別の非限定的な例では、ポリタンパク質構造タンパク質またはこれらの組合せは、ポリオウイルスとしても公知であるヒトエンテロウイルスＣに由来するものであってよい。

アミノ酸配列の類似性または同一性は、ＢＬＡＳＴ（基本局所アラインメント検索ツール）２．０アルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用することによって計算することができる。アミノ酸配列の類似性または同一性を計算するための技法は当業者には周知であり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用はＡＬＴＳＣＨＵＬら（１９９０年、Ｊ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３〜４１０頁）およびＡＬＴＳＣＨＵＬら（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５巻：３３８９〜３４０２頁）に記載されている。

本発明では、ピコルナウイルス、エンテロウイルス（ポリオウイルスを含める）のＶＬＰを、植物、植物の一部または植物細胞において、ピコルナウイルス、エンテロウイルスまたはポリオウイルスのポリタンパク質、例えば、これだけに限定されないが、Ｐ１をコードする核酸（第１の核酸）と、プロテアーゼ、例えば、ピコルナウイルス、エンテロウイルスまたはポリオウイルスのプロテアーゼ、例えばこれだけに限定されないが、３ＣＤなどをコードする第２の核酸を同時発現させ、それにより、ＶＬＰを生成することによって生成する。

限定するものとみなされないプロテアーゼの例は、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号１）を含むＥＶ７１ ＨＫ０８株由来のアミノ酸配列である。ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９、ヌクレオチド５３８７〜ヌクレオチド７３２１で記載されるヌクレオチド配列（配列番号２）、または配列番号２に対して少なくとも約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などの、この範囲内の任意のパーセント類似性を含めた配列類似性を有する配列。別の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８で記載されるアミノ酸１５４９〜２１９３（配列番号３）を含むＥＶ７１ ＧＤＦＳ０８株からのアミノ酸配列である。ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４、ヌクレオチド５３８７〜ヌクレオチド７３２１で記載されるヌクレオチド配列（配列番号４）を使用してアミノ酸配列を生成することができる。さらに、配列番号４に対して約９０〜１００％の配列類似性、それに対して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％などの、この範囲内の任意のパーセント類似性を含めた配列類似性を有する配列。

第１の核酸と第２の核酸は、植物に同じステップで導入することもでき、植物に逐次的に導入することもできる。

配列
本発明で使用することができる配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる：

アフトウイルス、アビヘパトウイルス、カルジオウイルス、エンテロウイルス、エルボウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、サペロウイルス、セネカウイルス、テッショウウイルスおよびトゥレモウイルスに由来するＰ１配列を使用して、Ｐ１ポリタンパクを生成することができる。非限定的な例では、Ｐ１ポリタンパク質をコードする配列は、エンテロウイルス、例えば、エンテロウイルス７１またはヒトエンテロウイルスＣ（ポリオウイルスとしても公知である）に由来するものであってよい。

本明細書に記載の通り使用するためのプロテアーゼをコードするために使用することができる配列のさらに非限定的な例としては、例えば、アフトウイルス、アビヘパトウイルス、カルジオウイルス、エンテロウイルス、エルボウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、サペロウイルス、セネカウイルス、テッショウウイルスおよびトゥレモウイルスから得たプロテアーゼ３ＣＤの配列が挙げられる。非限定的な例では、３ＣＤプロテアーゼをコードする配列は、エンテロウイルス、例えば、エンテロウイルス７１またはポリオウイルス（ヒトエンテロウイルスＣとしても公知である）に由来するものであってよい。

ポリタンパク質およびプロテアーゼを植物または植物の一部に導入し、同時発現させることにより、生成されるＶＬＰの収率を調節することができることが見いだされている。ポリタンパク質とプロテアーゼは、別々の核酸コンストラクト上でもたらされ、同時発現させることもでき、必要に応じて下記の通りＶＬＰの生成を最適化するために、同じコンストラクト上でもたらされるが各配列を示差的に発現させることもできる。

「同時発現させる」とは、２つ、または３つ以上のヌクレオチド配列を植物内で、植物の同じ組織内で、および植物の同じ細胞内でほぼ同時に発現させることを意味する。さらに、２つ、または３つ以上のヌクレオチド配列を、例えば、小胞体、ゴルジ装置、アポプラスト、細胞質ゾル、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム（ｐｅｒｏｘｙｓｏｍｅ）などの同じ細胞区画内で発現させることが必要な場合がある。ヌクレオチド配列を正確に同時に発現させる必要はない。その代わり、２つ以上のヌクレオチド配列を、コード産物が相互作用する機会があるように発現させる。例えば、ポリタンパク質の構造タンパク質への切断が起こり得るように、ポリタンパク質を発現させる期間の前またはその間にプロテアーゼを発現させることができる。２つまたは３つ以上のヌクレオチド配列は、一過性発現系を使用して同時発現させることができ、その場合、２つ以上の配列をほぼ同時に、両方の配列が発現される条件下で植物内に導入する。２つまたは３つ以上の配列は異なるコンストラクト上に存在してよく、同時発現にはコンストラクトのそれぞれを植物、植物の一部または植物細胞に導入することが必要であり、または２つまたは３つ以上の配列は、植物、植物の一部または植物細胞に導入された１つのコンストラクト上に存在してもよい。

あるいは、ヌクレオチド配列のうちの１つ、例えば、プロテアーゼをコードする配列を含む植物を、ポリタンパク質をコードする追加的な配列を用いて一過性にまたは安定に形質転換することができる。この場合、プロテアーゼをコードする配列を、所望の組織内で、所望の発育段階の間に発現させることもでき、誘導性プロモーターを使用してその発現を誘導することもでき、かつ、ポリタンパク質をコードする追加的な配列を同様の条件下、同じ組織で発現させて、ヌクレオチド配列の同時発現が確実になるようにすることができる。さらに、ポリタンパク質をコードする配列を、プロテアーゼをコードする追加的な配列を用いて一過性にまたは安定に形質転換することができる。この場合、ポリタンパク質をコードする配列は、所望の組織内で、所望の発育段階の間に発現させることもでき、誘導性プロモーターを使用してその発現を誘導することもでき、かつ、プロテアーゼをコードする追加的な配列を同様の条件下、同じ組織で発現させて、ヌクレオチド配列の同時発現が確実になるようにすることができる。

図２および図３において見ることができる通り、植物、植物の一部または植物細胞におけるＶＬＰ蓄積のレベルは、植物、植物の一部または植物細胞に浸潤させるポリタンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの比に影響される。ポリタンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの比は、例えば、約２０：１から約０．５：１まで（ポリタンパク質：プロテアーゼ）にわたってもよく、その間の任意の量、例えば、約２０：１、１８：１、１６：１、１４：１、１２：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、０．５：１（ポリタンパク質：プロテアーゼ）、またはその間の任意の量であってもよい。

ポリタンパク質とプロテアーゼの比は、例えば、第１の核酸を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと第２の核酸を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを異なる比で植物、植物の一部または植物細胞に導入することによって変動させることができる。あるいは、ポリタンパク質およびプロテアーゼが同じコンストラクト上に存在し、したがって同じＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに導入される場合、所望のポリタンパク質とプロテアーゼの比が得られるように、適切なプロモーターを使用してこれらを植物、植物の一部または植物細胞において示差的に発現させることができる。

したがって、本発明は、第１の核酸と第２の核酸の比を調節することによってＰＶＬＰ生成の収率を上昇させるための方法も提供する。

一実施形態では、プロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの百分率は、浸潤させる総Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの０．５％から５０％の間、またはその間の任意の量であってよい。例えば、プロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのパーセント比は、０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％または５０％またはその間の任意の量であってよい。

ポリタンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの百分率比は、浸潤させる総Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの９５％：５％〜４０％：６０％、またはその間の任意の量であってよい。例えば、浸潤させるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの総量中のポリタンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの百分率は、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％または５１％であってよい。例えば、ポリタンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの百分率比は、５０％：５０％から９５％：５％の間、またはその間の任意のパーセント比であってもよく、ポリタンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの百分率比は、５０％：５０％、５５％：４５％、６０％：４０％、６５％：３５％、７０％：３０％、７５％：２５％、８０％：２０％、８５％：１５％、９０％：１０％、９５％：５％、またはその間の任意の百分率比であってもよい。

第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を植物細胞内で発現させることによりＶＬＰを形成し、ＶＬＰを、例えば、ウイルスタンパク質、例えば、これだけに限定されないが、ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３および／またはＶＰ４を含めたピコルナウイルス構造タンパク質などに結合することができる抗体を生成するために使用することができる。ＶＬＰを被験体に投与すると、免疫応答が誘導され得る。

下にさらに記載されている通り、ポリタンパク質とプロテアーゼの比を、例えば、ポリタンパク質とプロテアーゼを示差的に発現させることによってさらに変動させることができる。発現は、例えば、ポリタンパク質、プロテアーゼ、またはタンパク質とプロテアーゼの両方の複製、転写、翻訳、またはこれらの組合せを調節することによって変動させることができる。例えば、上記の通り浸潤させるポリタンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの比を変動させることに加えて、プロモーター、増幅エレメント、エンハンサーまたはこれらの組合せを含めた種々の調節エレメントを使用することができる。調節エレメントの第１のセットまたは組合せを使用して第１の核酸の複製、転写またはこれらの組合せを調節することができ、調節エレメントの第２のセットまたは組合せを使用して、第２の核酸の複製、転写またはこれらの組合せを調節することができる。調節エレメントの第１のセットまたは組合せは調節エレメントの第２のセットまたは組合せとは異なり、第１の核酸と第２の核酸の示差的な発現を可能として、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるポリタンパク質：プロテアーゼの比を調節することを可能とするものである。例えば、限定するものとみなされない、調節エレメントの１つのセットまたは組合せ、例えば第１のセットは、増幅エレメント、例えば、ＢｅＹＤＶから得たエレメントを含んでよく、一方、調節エレメントの他のセットまたは組合せ、例えば、第２のセットには増幅エレメント、例えば、ＢｅＹＤＶから得た増幅エレメントが存在しなくてよい。あるいは、第２のセットは、増幅エレメント（例えば、ＢｅＹＤＶから得たエレメント）を含んでよく、一方、調節エレメントの第１のセットまたは組合せには増幅エレメント（例えば、ＢｅＹＤＶから得たエレメント）が存在しなくてよい。同様に、プロモーターの強度が調節エレメントの第１のセットまたは組合せと第２のセットまたは組合せの間で異なってもよく、プロモーターの一方が誘導性であり他方が構成的であってもよく、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてポリタンパク質とプロテアーゼの間の示差的な発現が実現される。

サイズ
ＶＬＰの出現は、任意の適切な方法、例えば、ショ糖勾配、またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して検出することができる。ＶＬＰを構造およびサイズについて、例えば、電子顕微鏡によって、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって評価することができる。

サイズ排除クロマトグラフィーに関しては、抽出緩衝液中の凍結粉砕した植物性材料の試料をホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって植物組織から総可溶性タンパク質を抽出し、不溶性材料を遠心分離によって除去することができる。ＰＥＧ補助沈殿による濃縮も有益であり得る。ＶＬＰは、ＷＯ２０１１／０３５４２２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用してプロトプラストまたはプロトプラスト画分を調製することによって生成することもできる。可溶性タンパク質を数量化し、抽出物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）カラム、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ５００カラムを通過させる。Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ２０００を較正標準として使用することができる。

細胞の細片は、遠心分離によって排除することができる。次いで、遠心分離された抽出物を濾過することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、そのような１つまたは複数の濾過ステップにより、さらに精製する前に懸濁液中の固体を除去し、バイオバーデンを低下させ、抽出物を安定化し調整することができると考えられる。それらのサイズに起因して、ＰＶＬＰは、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用してさらに精製することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、ＴＦＦにより、細胞壁の解重合のために使用した酵素を含めた、清澄化された抽出物中に見いだされる低分子量の可溶性タンパク質が効率的かつ選択的に排除される。さらに、ＴＦＦステップによりＶＬＰの濃縮も起こり、クロマトグラフィーのために調製物中の緩衝液を交換することが可能になる。ＴＦＦステップの後に、いくつかのクロマトグラフィーステップ、例えば、陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および／または偽アフィニティー（ｐｓｅｕｄｏ−ａｆｆｉｎｉｔｙ）を続けることができる。追加的なＴＦＦステップをクロマトグラフステップの後に加えることができる。クロマトグラフィーおよび／またはＴＦＦの後、画分を免疫ブロットによってさらに分析して、画分のタンパク質相補体を決定することができる。

分離された画分は、例えば、上清であってもよく（遠心分離、沈渣、または沈殿を行った場合）、濾液であってもよく（濾過した場合）、タンパク質、または、例えば、高次ＶＬＰ、高分子量ＶＬＰ、粒子ＶＬＰ、または完全なＶＬＰなどの超構造（ｓｕｐｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）タンパク質に富んでいる。分離された画分を、例えば、追加的な遠心分離ステップ、沈殿、クロマトグラフィーステップ（例えば、サイズ排除、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィー）、接線流濾過、またはこれらの組合せによって、タンパク質、超構造タンパク質または高次の粒子の単離、精製、濃縮またはこれらの組合せを行うためにさらに処理することができる。精製されたタンパク質、超構造タンパク質または高次の粒子、例えば、ＶＬＰなどの存在は、例えば、ネイティブなまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適切な検出用抗体を使用したウエスタン分析、キャピラリー電気泳動、電子顕微鏡、または当業者には明らかであると思われる任意の他の方法によって確認することができる。

図４Ａには、ＰＶＬＰを含む植物抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー分析の溶出プロファイルの例が示されている。この場合、ＶＬＰを含むエンテロウイルスＥＶ７１カプシドが画分９〜およそ１４に溶出し、画分１２でピークに達する。

ＶＬＰは、任意の適切な方法、例えば、化学的または生化学的抽出を使用して精製または抽出することができる。ＶＬＰは、乾燥、熱、ｐＨ、界面活性物質および界面活性剤に対して比較的感受性が高い可能性がある。したがって、収率を最大にし、ＶＬＰ画分の細胞タンパク質によるコンタミネーションを最小限にし、タンパク質またはＶＬＰの完全性を維持する方法、および細胞壁を緩めてタンパク質、またはＶＬＰを放出させる方法を使用することが有用であり得る。例えば、プロトプラストおよび／またはスフェロプラストを生成する方法を使用して（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０３５４２２を参照されたい）、本明細書に記載のＶＬＰを得ることができる。例えばＳＤＳまたはトリトンＸ−１００のような界面活性剤または界面活性物質の使用を最小限にするまたは排除することが、ＶＬＰ抽出の収率を改善するために有益であり得る。次いで、ＶＬＰを構造およびサイズについて、例えば、電子顕微鏡によって、または上記の通りサイズ排除クロマトグラフィーによって評価し、分析用超遠心に供することができる。

上で定義されているＰＶＬＰのサイズ（すなわち、直径）は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）技法または電子顕微鏡（ＥＭ）技法によって測定することができ、通常、２０ｎｍから５０ｎｍの間、またはその間の任意のサイズである。例えば、インタクトなＰＶＬＰ構造のサイズは、約２５ｎｍから約３５ｎｍまでの範囲、またはその間の任意のサイズ、または２０ｎｍ、２１ｎｍ、２２ｎｍ、２３ｎｍ、２４ｎｍ、２５ｎｍ、２６ｎｍ、２７ｎｍ、２８ｎｍ、２９ｎｍ、３０ｎｍ、３１ｎｍ、３２ｎｍ、３３ｎｍ、３４ｎｍ、３５ｎｍ、３６ｎｍ、３７ｎｍ、３８ｎｍ、３９ｎｍ、４０ｎｍ、４１ｎｍ、４２ｎｍ、４３ｎｍ、４４ｎｍ、４５ｎｍ、４６ｎｍ、４７ｎｍ、４８ｎｍ、４９ｎｍ、５０ｎｍ、またはその間の任意のサイズであってよい。

ＰＶＬＰは、植物の総タンパク質含有量の約４０％に対応する、植物の新鮮重１キログラム当たり２ｇまでの量で合成することができる。例えば、本明細書に記載の通り、合成されるＶＬＰの量は、新鮮重１キログラム当たり１０ｍｇから２．０ｇの間、またはその間の任意の量、例えば、新鮮重１キログラム当たり１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２０ｍｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１１００ｍｇ、１２００ｍｇ、１３００ｍｇ、１４００ｍｇ、１５００ｍｇ、１６００ｍｇ、１７００ｍｇ、１８００ｍｇ、１９００または２０００ｍｇなど、またはその間の任意の量であってよい。

宿主
本発明の１つまたは２つ以上の遺伝子コンストラクトを、本発明のヌクレオチド配列、またはコンストラクト、またはベクターによって形質転換する任意の適切な植物宿主または植物の一部、例えば、１枚もしくは複数枚の葉、幹と１枚もしくは複数枚の葉、または根において発現させることができる。適切な宿主の例としては、これだけに限定されないが、アルファルファ、キャノーラ、Ｂｒａｓｓｉｃａ種、トウモロコシ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウマメ、エンバク、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、サンフラワー、綿などを含めた農作物が挙げられる。

本発明の１つまたは複数の遺伝子コンストラクトは、３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域をさらに含んでよい。３’非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域とは、ｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができるポリアデニル化シグナルおよび任意の他の調節シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子の部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端を追跡するポリアデニル酸の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、一般に、変動が珍しくないにもかかわらず、標準形態５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性が存在することによって認識される。適切な３’領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子などのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ｒｉｂｕｌｏｓｅ−Ｉ， ５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照により本明細書に組み込まれる）、ＵＳ７，１２５，９７８（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているプラストシアニン発現の調節に使用するプロモーターのポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳（ｎｏｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域である。

本発明の遺伝子コンストラクトの１つまたは複数は、必要に応じて、翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれかの別のエンハンサーも含んでよい。エンハンサーは、転写される配列の５’側に位置しても３’側に位置してもよい。エンハンサー領域は当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドン、近接する配列などを含んでよい。開始コドンが存在する場合、それは、転写された配列の正確な翻訳をもたらすために、コード配列の読み枠と同相にあってよい（「インフレーム」）。

本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入、電気穿孔などを使用して植物細胞に導入することができる。そのような技法の総説に関しては、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＶＩＩＩ、４２１〜４６３頁（１９８８年）；ＧｅｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８８年）；ならびにＭｉｋｉおよびＩｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ． Ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第２版、ＤＴ． Ｄｅｎｎｉｓ、ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ、ＤＤ Ｌｅｆｅｂｒｖｅ、ＤＢ Ｌａｙｚｅｌｌ（編）、Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ、Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ． Ｌｏｎｄｏｎ、５６１〜５７９頁（１９９７年）を参照されたい。他の方法としては、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、例えばプロトプラストを使用した電気穿孔、微量注入、微粒子銃またはウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）、および減圧浸潤（ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）が挙げられる。例えば、Ｂｉｌａｎｇら（Ｇｅｎｅ１００巻：２４７〜２５０頁（１９９１年）、Ｓｃｈｅｉｄら（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２８巻：１０４〜１１２頁、１９９１年）、Ｇｕｅｒｃｈｅら（Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２巻：１１１〜１１６頁、１９８７年）、Ｎｅｕｈａｕｓｅら（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ７５巻：３０〜３６頁、１９８７年）、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７巻：７０〜７３頁（１９８７年）；Ｈｏｗｅｌｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８巻：１２６５頁、１９８０年）、Ｈｏｒｓｃｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７巻：１２２９〜１２３１頁、１９８５年）、ＤｅＢｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１巻：６９４〜７０１頁、１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＳｃｈｕｌｅｒおよびＺｉｅｌｉｎｓｋｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８９年）、ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ、１０５巻：３４３〜３４８頁、２００２年）、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；ならびに同第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日出願の米国特許出願第０８／４３８，６６６号、および１９９２年９月２５日出願の同第０７／９５１，７１５号（全てがこれによって参照により組み込まれる）を参照されたい。

一過性発現
理論に束縛されることを望むものではないが、異なるピコルナウイルス構造タンパク質、ピコルナウイルスポリタンパク質および／またはプロテアーゼのタンパク質濃度および比がＰＶＬＰの構築効率に対して重要であり得る。したがって、植物におけるタンパク質の濃度およびＶＬＰの全体的な構築効率を操作するためには、感染症の多重度および時間が重要であり得る。

本発明のコンストラクトは、植物、植物の一部、または植物細胞において一過性に発現させることができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの浸潤によって植物、植物の一部、または植物細胞に導入した組換えポリタンパク質の染色体外（ｅｐｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）発現に依拠する一過性発現系を使用して、種々の細胞区画または亜区画にターゲティングしたピコルナウイルス構造タンパク質、ピコルナウイルスポリタンパク質および／またはプロテアーゼを発現させることができる。一過性発現系は、高スピードの生成を可能にする。さらに、組換えＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを植物に浸潤させた後、数日以内に大量のタンパク質を得ることができる（Ｒｙｂｉｃｋｉ、２０１０年；Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９９年）。長い遺伝子配列を発現させること、および同じ細胞において２つ以上の遺伝子を同時に発現させることも可能であり、これは、多量体タンパク質の効率的な構築を可能にする（Ｌｏｍｂａｒｄｉら、２００９年）。

しかし、一過性発現の間、転写後遺伝子サイレンシングにより植物における異種タンパク質の発現が限定される可能性がある。サイレンシングのサプレッサー、例えば、これだけに限定されないが、トマト黄化壊疽ウイルス由来のＮｓｓの同時発現を使用して、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的な分解を打ち消すことができる（Ｂｒｉｇｎｅｔｉら、１９９８年）。代替のサイレンシングのサプレッサー、例えば、これだけに限定されないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチ病ウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルス（Ｔｏｍａｔｏ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ）のカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ；ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモＸウイルスのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモＭウイルスのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモＳウイルスのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルス（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｃｏｒｃｈ ｖｉｒｕｓ）のｐ１６、（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、カンキツトリステザウイルス（Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｘａ ｖｉｒｕｓ）のｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻病関連ウイルス−２（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｌｅａｆｒｏｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−２）のｐ２４、（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウＡウイルスのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウＢウイルスのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ハナウド潜在ウイルス（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）のｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク共通潜在ウイルス（Ｇａｒｌｉｃ ｃｏｍｍｏｎ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）のｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）が当技術分野で周知であり、本明細書に記載の通り使用することができる（Ｃｈｉｂａら、２００６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４６巻：７〜１４頁；参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、サイレンシングのサプレッサー、例えば、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０を、１つまたは複数のピコルナウイルス構造タンパク質、ピコルナウイルスポリタンパク質および／またはプロテアーゼと同時発現させて、植物、植物の一部または植物細胞における高レベルのタンパク質生成をさらに確実にすることができる。

本発明は、追加的な（第３の）ヌクレオチド配列を植物において発現させ、その追加的な（第３の）ヌクレオチド配列がサイレンシングのサプレッサーをコードし、植物において活性な追加的な（第３の）調節領域に作動可能に連結している上記の方法も提供する。サイレンシングのサプレッサーをコードするヌクレオチド配列は、例えば、Ｎｓｓ、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０であってよい。

下記の通り、一過性発現方法を使用して、本発明のコンストラクトを発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれるＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５巻：３４３〜３４８頁を参照されたい）。あるいは、参照により本明細書に組み込まれるＫａｐｉｌａら、１９９７年に記載されている真空に基づく一過性発現方法を使用することができる。これらの方法としては、例えば、これだけに限定されないが、Ａｇｒｏ−接種またはＡｇｒｏ−浸潤、シリンジ浸潤の方法を挙げることができる。しかし、他の一過性の方法も上記の通り使用することができる。Ａｇｒｏ−接種、Ａｇｒｏ−浸潤、またはシリンジ浸潤を用いて、所望の核酸を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａの混合物を組織、例えば葉の細胞間の空間、植物の空気中にある部分（幹、葉および花を含めた）、他の植物の一部（幹、根、花）、または植物全体に進入させる。上皮を渡ってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａが感染した後、ｔ−ＤＮＡコピーが細胞内に移入される。ｔ−ＤＮＡがエピソームとして転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、それにより、感染細胞における対象のタンパク質の生成がもたらされるが、ｔ−ＤＮＡが核の内側を通過するのは一過性である。

本発明の核酸または１つまたは２つ以上の遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニック植物、植物の細胞または種子も本発明の一部とみなされる。植物細胞から植物全体を再生する方法も当技術分野で公知である。一般に、形質転換された植物細胞を抗生物質などの選択剤を含有してよい適切な培地で培養し、選択マーカーを使用して、安定に形質転換された植物細胞の同定を容易にする。安定に形質転換された植物細胞の同定を補助するために、本発明のコンストラクトをさらに操作して植物選択マーカーを含めることができる。有用な選択マーカーとしては、例えば、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシンなどの抗生物質などの化学物質、または除草剤、例えば、ホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｙｃｉｎ）、グリホサート、クロロスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）などに対する耐性をもたらす酵素が挙げられる。同様に、色の変化によって同定可能な化合物の生成をもたらす酵素、例えば、ＧＵＳ（ベータグルクロニダーゼ）など、または発光によって同定可能な化合物の生成をもたらす酵素、例えば、ルシフェラーゼまたはＧＦＰなどを使用することができる。カルスが形成されたら、公知の方法に従って適切な植物ホルモンを使用することによって苗条形成を促進し、植物を再生させるために苗条を発根培地に移すことができる。次いで、その植物を使用して、種子から、または栄養繁殖技法を使用して反復的発生を確立することができる。トランスジェニック植物は、組織培養物を使用せずに作出することもできる。

増幅エレメント
ポリタンパク質とプロテアーゼの比は、例えば、ポリタンパク質およびプロテアーゼの発現を駆動するために使用する核酸配列に種々の調節エレメント、または調節エレメントの組合せを使用することによって変動させることができる。例えば、調節エレメントの第１のセットまたは組合せを使用して第１の核酸の複製、転写またはこれらの組合せを調節することができ、調節エレメントの第２のセットまたは組合せを使用して、第２の核酸の複製、転写またはこれらの組合せを調節することができ、したがって、第１の核酸の発現と第２の核酸の発現の差異が実現され、それにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるポリタンパク質：プロテアーゼの比が調節される。例えば、限定するものとみなされない調節エレメントの第１のセットまたは組合せは、増幅エレメント、例えば、ＢｅＹＤＶから得たエレメントを含んでよく、一方、調節エレメントの第２のセットまたは組合せには増幅エレメントが存在しなくてよい。あるいは、第２のセットは、増幅エレメント、例えば、ＢｅＹＤＶから得たエレメントを含んでよく、一方、調節エレメントの第１のセットまたは組合せには増幅エレメントが存在しなくてよい。

「発現カセット」とは、宿主細胞において対象の核酸を転写するための適切なプロモーターまたは他の調節エレメントの制御下にあり、それに作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ（ｏｒ ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ））連結している対象の核酸を含むヌクレオチド配列を指す。

本明細書に記載の発現系は、二分節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ウイルス、または二分節型ゲノムを有するウイルスに基づく発現カセットを含んでよい。例えば、二分節型ウイルスは、Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスであってよい。Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ科の属としては、コモウイルス（Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ）、ネポウイルス（Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ）、ファバウイルス（Ｆａｂａｖｉｒｕｓ）、チェラウイルス（Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ）およびサドワウイルス（Ｓａｄｗａｖｉｒｕｓ）が挙げられる。コモウイルス（Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ）としては、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ササゲ重症モザイクウイルス（Ｃｏｗｐｅａ ｓｅｖｅｒｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＣＰＳＭＶ）、カボチャモザイクウイルス（ＳｑＭＶ）、ムラサキツメクサ斑紋ウイルス（ＲＣＭＶ）、マメさや斑紋ウイルス（ＢＰＭＶ）、カブ輪斑ウイルス（ＴｕＲＳＶ）、ソラマメ真性モザイクウイルス（ＢＢｔＭＶ）、ソラマメステインウイルス（ＢＢＳＶ）、ダイコンモザイクウイルス（ＲａＭＶ）が挙げられる。本発明の種々の態様に対して有用であり得るエンハンサーエレメントを含むコモウイルスＲＮＡ−２配列の例としては、これだけに限定されないが、ＣＰＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３５５０）、ＲＣＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３７３８）、ＢＰＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３４９５）、ＣＰＳＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３５４４）、ＳｑＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３８００）、ＴｕＲＳＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１３２１９．１）、ＢＢｔＭＶ ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＵ８１０９０４）、ＢＢＳＶ ＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ０２８６５０）、ＲａＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３８００）が挙げられる。

二分節型コモウイルスのＲＮＡゲノムのセグメントは、ＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と称される。ＲＮＡ−１は複製に関与するタンパク質をコードし、一方、ＲＮＡ−２は細胞間移行に必要なタンパク質および２つのカプシドタンパク質をコードする。ＣＰＭＶ、ＣＰＳＭＶ、ＳｑＭＶ、ＲＣＭＶ、またはＢＰＭＶを含めた、任意の適切なコモウイルスに基づくカセットを使用することができ、例えば、発現カセットはＣＰＭＶに基づくものであってよい。

発現系は、ジェミニウイルス由来の増幅エレメント、例えば、マメ黄萎病ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の増幅エレメントも含んでよい。ＢｅＹＤＶは、双子葉植物に適応するマストレウイルス（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）属に属する。ＢｅＹＤＶは、一本鎖環状ＤＮＡゲノムを有する単分節型であり、ローリングサークル機構によって非常に高いコピー数を複製することができる。ＢｅＹＤＶ由来のＤＮＡレプリコンベクター系は、植物においてタンパク質を急速に高収率で生成するために使用されている。

本明細書で使用される場合、「増幅エレメント」という句は、ジェミニウイルスゲノムの１つまたは複数の長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部分を含む核酸セグメントを指す。本明細書で使用される場合、「長い遺伝子間領域」とは、ジェミニウイルスＲｅｐタンパク質による除去および複製を媒介することができるｒｅｐ結合部位を含有する、長い遺伝子間領域の領域を指す。いくつかの態様では、１つまたは複数のＬＩＲを含む核酸セグメントは、ジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）をさらに含んでよい。本明細書で使用される場合、「短い遺伝子間領域」とは、相補鎖（マストレウイルス（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓ）の短いＩＲ（ＳＩＲ））を指す。任意の適切なジェミニウイルス由来の増幅エレメントを本発明で使用することができる。例えば、ＷＯ２０００／２０５５７；ＷＯ２０１０／０２５２８５；Ｚｈａｎｇ Ｘ．ら（２００５年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９３巻、２７１〜２７９頁）、Ｈｕａｎｇ Ｚ．ら（２００９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０３巻、７０６〜７１４頁）、Ｈｕａｎｇ Ｚ．ら（２００９年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０６巻、９〜１７頁）；参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

調節エレメント
本発明は、上記の通り、植物において作動可能な調節エレメントに作動可能に連結したポリタンパク質、例えば、１つまたは複数のピコルナウイルスタンパク質など、またはプロテアーゼ、例えば、これだけに限定されないが、ピコルナウイルスプロテアーゼをコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトをさらに対象とする。

本出願では「調節領域」、「調節エレメント」または「プロモーター」という用語の使用は、常にではないが一般には遺伝子のタンパク質コード領域の上流にあり、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかで構成されてもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方で構成されてもよい核酸の一部を反映するものとする。調節領域が活性であり、対象の遺伝子と作動可能な関係にある、または対象の遺伝子に作動可能に連結している場合、これにより、対象の遺伝子の発現がもたらされ得る。調節エレメントは、器官特異性を媒介すること、または発生遺伝子もしくは時間的遺伝子の活性化を制御することができ得る。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基底のプロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘導できるエレメント、プロモーター活性を媒介するエレメント、例えば、負の調節エレメントまたは転写エンハンサーなどを含んでよい。「調節領域」とは、本明細書で使用される場合、転写後に活性なエレメント、例えば、遺伝子発現を調節する調節エレメント、例えば、翻訳エンハンサーおよび転写エンハンサー、翻訳サプレッサーおよび転写サプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子なども含んでよい。これらの後者のエレメントのいくつかはコード領域の近位に位置してよい。

植物細胞において作動可能であり、本発明に従って使用することができる調節エレメントの例としては、これだけに限定されないが、プラストシアニン調節領域（ＵＳ７，１２５，９７８；参照により本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの調節領域（ＲｕＢｉｓＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照により本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合性タンパク質（ＣＡＢ；Ｌｅｕｔｗｉｌｅｒら；１９８６年；参照により本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体に関連し、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｏｃｋｈａｕｓら１９８７年、１９８９年に記載されている）が挙げられる。

本開示に関しては、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、一般には、常にではないが通常は、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または特定の部位で転写が開始されるために必要な他の因子の認識をもたらすことによってコード領域の発現を制御する構造遺伝子のコード配列の上流（５’）にあるＤＮＡの配列を指す。しかし、配列のイントロン内、または３’に位置する他のヌクレオチド配列が、対象のコード領域の発現の調節に寄与し得ることが理解されるべきである。ＲＮＡポリメラーゼまたは特定の部位における開始を確実にするための他の転写因子の認識をもたらす調節エレメントの例は、プロモーターエレメントである。全てではないが大部分の真核生物プロモーターエレメントは、通常は転写開始部位のおよそ２５塩基対上流に位置する、アデノシンヌクレオチドとチミジンヌクレオチドの塩基対で構成される保存された核酸配列であるＴＡＴＡボックスを含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基底のプロモーターエレメント、および遺伝子発現を改変する他の調節エレメント（上で列挙した）を含む。

発生的に調節される調節領域、誘導性調節領域または構成的調節領域を含めたいくつかの種類の調節領域が存在する。発生的に調節される、またはその制御下にある遺伝子の示差的な発現を制御する調節領域は、特定の器官または器官の組織内で、その器官または組織の発生の間の特定の期間に活性化される。しかし、発生的に調節される調節領域の中には、特定の器官または組織内で特定の発生段階において優先的に活性になるものもあり、それらは、発生的に調節される様式でも活性であり得、植物内の他の器官または組織において基底のレベルでも同様に活性であり得る。組織特異的な調節領域、例えば、種子特異的（ｓｅｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）調節領域の例としては、ナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーター、およびクルシフェリンプロモーターが挙げられる（Ｒａｓｋら、１９９８年、Ｊ．
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １５２巻：５９５〜５９９頁；Ｂｉｌｏｄｅａｕら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４巻：１２５〜１３０頁）。葉特異的プロモーターの例としてはプラストシアニンプロモーターが挙げられる（参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，１２５，９７８を参照されたい）。

誘導性調節領域は、誘導因子に応答して、１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるものである。誘導因子の不在下ではＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。一般には、誘導性調節領域に特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子が不活性な形態で存在してよく、これはその後、誘導因子によって活性型に直接または間接的に変換される。しかし、タンパク質因子は存在しなくてもよい。誘導因子は、化学薬剤、例えば、タンパク質、代謝産物、成長調節因子、除草剤もしくはフェノール化合物など、または熱、低温、塩、または毒性要素によって直接課される生理的ストレスもしくはウイルスなどの病原体もしくは疾患因子の作用によって間接的に課される生理的ストレスであってよい。誘導性調節領域を含有する植物細胞を、誘導因子を細胞または植物に外部から適用することによって、例えば、噴霧、散水、加熱または同様の方法などによって誘導因子に曝露させることができる。誘導性調節エレメントは、植物遺伝子または非植物遺伝子のいずれかに由来するものであってよい（例えば、Ｇａｔｚ， Ｃ．およびＬｅｎｋ， ＬＲ．Ｐ．、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ
Ｓｃｉ． ３巻、３５２〜３５８頁；参照により組み込まれる）。潜在的な誘導性プロモーターの例としては、これだけに限定されないが、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｇａｔｚ， Ｃ．，１９９７年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８巻、８９〜１０８頁；参照により組み込まれる）、ステロイド誘導性プロモーター（Ａｏｙａｍａ． Ｔ．およびＣｈｕａ， Ｎ．Ｈ．、１９９７年、Ｐｌａｎｔ １．２巻、３９７〜４０４頁；参照により組み込まれる）およびエタノール誘導性プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ， Ｍ．Ｇ．ら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ １０ｕｒｎａｌ １６巻、１２７〜１３２頁；Ｃａｄｄｉｃｋ， Ｍ．Ｘ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６巻、１７７〜１８０頁、参照により組み込まれる）サイトカイニン誘導性のＩＢ６遺伝子およびＣＫＩ １遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ， Ｉ．およびＫ．ｉｅｂｅｒ、１．１巻、１９９８年、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ １０巻、１００９〜１０１９頁；Ｋａｋｉｍｏｔｏ， Ｔ．、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４巻、９８２〜９８５頁；参照により組み込まれる）ならびにオーキシン誘導性エレメント、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ， Ｔ．ら、１９９７年、Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ ９巻、１９６３〜１９７１頁；参照により組み込まれる）が挙げられる。

構成的調節領域は、植物の種々の部分全体にわたって、かつ植物の発生全体にわたって継続的に遺伝子の発現を導くものである。公知の構成的調節エレメントの例としては、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写物に関連するプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１３巻：８１０〜８１２頁）、イネアクチン１に関連するプロモーター（Ｚｈａｎｇら、１９９１年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３巻：１１５５〜１１６５頁）、アクチン２に関連するプロモーター（Ａｎら、１９９６年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０巻：１０７〜１２１頁）、またはｔｍｓ２遺伝子に関連するプロモーター（Ｕ．Ｓ．５，４２８巻，１４７頁、参照により本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子に関連するプロモーター（Ｘｕら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０６巻：４５９〜４６７頁）、トウモロコシユビキチン１遺伝子に関連するプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏら、１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９巻：６３７〜６４６頁）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチン１および６遺伝子に関連するプロモーター（Ｈｏｌｔｏｒｆら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９巻：６３７〜６４６頁）、ならびにタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子に関連するプロモーター（Ｍａｎｄｅｌら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９巻：９９５〜１００４頁）が挙げられる。

「構成的な」という用語は、本明細書で使用される場合、必ずしも、構成的調節領域の制御下にある遺伝子が全ての細胞型において同じレベルで発現されることを示すものではなく、遺伝子が、存在量の変動が多くの場合に観察されるとしても、広範囲の細胞型において発現されることを示すものである。構成的調節エレメントを他の配列とカップリングして、それが作動可能に連結したヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をさらに増強することができる。例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴ系はササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域に由来し、関連するコード配列の翻訳を増強することが実証されている。「ネイティブな」とは、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在すること、または「野生型」であることを意味する。「作動可能に連結した」とは、特定の配列、例えば、調節エレメントと対象のコード領域が直接または間接的に相互作用して、意図された機能、例えば、遺伝子発現の媒介または調節などがなされることを意味する。作動可能に連結した配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結した配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。

ポリタンパク質とプロテアーゼの比は、例えば、調節エレメント、増幅エレメントおよび／またはエンハンサーを使用することによってさらに変動させることができる。例えば、第１の核酸は調節エレメント、増幅エレメントおよび／またはエンハンサーを含んでよい。第２の核酸は、調節エレメント、増幅エレメントおよび／またはエンハンサーの同じ組合せを含んでも含まなくてもよい。

例えば、異なるプロモーターを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるポリタンパク質とプロテアーゼの間の示差的な発現を駆動することができる。例えば、調節エレメントの第１のセットもしくは組合せは誘導性プロモーターを含んでよく、一方で、調節エレメントの第２のセットもしくは組合せ内のプロモーターは構成的なものであってよい、または、調節エレメントの第２のセットもしくは組合せは誘導性プロモーターを含んでよく、一方で、調節エレメントの第１のセットもしくは組合せ内のプロモーターは構成的なものであってよい。プロモーターの強度が調節エレメントの第１のセットまたは組合せと第２のセットまたは組合せの間で異なってもよく、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてポリタンパク質とプロテアーゼの間の示差的な発現が実現される。

本発明を以下の実施例においてさらに例示する。

（実施例１）
ＥＶ７１の発現
遺伝子合成
ＥＶ７１構造タンパク質Ｐ１をコードするＤＮＡセグメントおよびプロテアーゼ３ＣＤをコードするＤＮＡセグメントを使用した。Ｐ１および３ＣＤの候補配列はＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能である。これらの配列の非限定的な例は以下のものである：
・Ｐ１アミノ酸配列：アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１〜８６２）（配列番号５）；ヌクレオチド配列：ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド７４３〜３３２８）（配列番号６）；
・３ＣＤ（ＨＫ０８株）：アミノ酸配列：ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＤＧ５７６０３（アミノ酸１５４９〜２１９３）（配列番号１）；ヌクレオチド配列：ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＧＱ２７９３６９（ヌクレオチド５３８６〜７３２１）（配列番号２）；
・３ＣＤ（ＧＤＦＳ０８株）：アミノ酸配列 ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＡＣＩ２５３７８（アミノ酸１５４９〜２１９３）（配列番号３）；ヌクレオチド配列：ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＦＪ１９４９６４（ヌクレオチド５３８７〜７３２１）（配列番号４）。

２種のＰ１遺伝子を合成した。第１のＰ１遺伝子は野生型配列を使用して生成し、第２のＰ１遺伝子は、当技術分野で公知の標準の方法を使用して決定した最適化配列（ヒトコドンを使用）に基づいた。２種の３ＣＤ遺伝子をそれらの野生型配列に基づいて合成した。３種の野生型遺伝子をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（以前はＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標））によって合成し、ＤＮＡ２．０によって最適化Ｐ１遺伝子を最適化し、合成した。

分子クローニング
合成された遺伝子を、植物発現ベクターにクローニングした。選択されたベクター成分は、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）に基づくカセットに由来する転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントまたはアルファルファプラストシアニン遺伝子を含む。どちらの調節エレメントも、組換えタンパク質を高発現させるための我々のプラットフォームにおいて首尾よく使用されている。本発明者らの植物発現ベクターに組み込むことができる別の特徴はマメ黄萎病ジェミニウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来のＤＮＡ増幅エレメントである。これにより、いくつかの候補についてタンパク質の発現が大きく増大した。したがって、各遺伝子コンストラクトを、ＤＮＡ増幅エレメントを伴ってまたは伴わずに、発現ベクターにクローニングした。表１には、本プロジェクトのために構築された植物発現カセットが提示されている。

発現の分析−最良の組換え遺伝子コンストラクトの選択
各発現カセットをプラスミドベクターにクローニングし、次いでそれをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに移入した。ＤＮＡコンストラクトの移動性ＤＮＡコピーの植物細胞への移入を導くトランスジェニックＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種菌の減圧浸潤によって一過性発現を開始した。多数の成分の一過性発現（同時発現）をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種菌の混合物を浸潤させること（同時浸潤）によって実施した。植物に導入される１つの成分は構造的なもの（Ｐ１）であり、かつ、第２の成分である３ＣＤプロテアーゼの基質であるので、２つの成分の発現レベルを調節した。これは、強度が変動し得る異なるプロモーター、ＤＮＡ増幅系を使用することによって、浸潤時の各種菌（Ｐ１および３ＣＤ）の相対的な存在量を変動させることによって、またはこれらを組合せて実施した。

発現ベクター１３００〜１３０８を、Ｐ１を単独で発現するそれらの能力について、およびベクター１３１０〜１３１８と組み合わせて、タンパク質分解断片ＶＰ１〜４を高レベルで生成するそれらの能力についてスクリーニングした。抗ＶＰ１抗体のみが入手可能であったので（Ａｂｎｏｖａ、ＭＡＢ１２５５−Ｍ０５）、タンパク質分解断片の蓄積をＶＰ１の蓄積およびプロセシングされていないＰ１の消失によってモニターした。図２に示されている通り、Ｐ１単独の発現（ベクター番号１３００）により、プロセシングされていない構造タンパク質の分子量に対応する見かけの分子量（９８ｋＤａ）を有するＶＰ１含有生成物の蓄積が導かれ、これにより、植物プロテアーゼはＰ１を切断してウイルスカプシドタンパク質を生じることができないことが示された。しかし、Ｐ１を３ＣＤと同時発現させた場合（ベクター番号１３００＋１３１０および１３００＋１３１５）、９８ｋＤａのシグナルは完全に消失し、ＶＰ１の分子量（３３．５ｋＤａ）に対応する新しい生成物が検出される。この結果により、ウイルスプロテアーゼが植物において生成され、高度に活性であること、および、ウイルスプロテアーゼにより、植物細胞において同時に生成されたその基質が認識され、切断されて、ＥＶ７１カプシドタンパク質が生じることが示される。

得られた結果により、植物におけるＶＰ１蓄積のレベルは、Ｐ１タンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと３ＣＤプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの比に影響され、３ＣＤプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの割合が低いほど高い蓄積が得られることが示された（図２：１３００＋１３１５（４：２）、１３００＋１３１５（４：１）および１３００＋１３１５（４：０．５）を比較されたい）。３ＣＤの起源がＨＫ０８対ＧＤＦＳ０８のいずれであるかも、植物におけるＶＰ１の蓄積レベルに影響を及ぼす（図２：１３００＋１３１０（４：０．５）対１３００＋１３１５（４：０．５））。最後に、ＤＮＡ増幅エレメントを含む発現ベクターから最も高いＶＰ１蓄積レベルが得られることが観察された（図２：１３０１＋１３１１（４：２））。

以下の実験では、Ｐ１をＣＰＭＶ−ＨＴ＋ＢｅＹＤＶ（１３０１）の制御下で維持しながら、種々の３ＣＤ発現カセットを浸潤時に種々の希釈度で用いて同時形質転換した。形質転換された植物由来の粗タンパク質抽出物に対する抗ＶＰ１モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット分析により、様々なＰ１とプロテアーゼの比およびコンストラクト成分にわたってＶＰ１蓄積が観察されることが示された。最も高いＶＰ１蓄積のレベルがもたらされたベクターの組合せは、１３０１＋１３１０であり、細菌懸濁液中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株濃度の比は４：０．５（構造タンパク質：プロテアーゼ）であった（図３）。

ＶＬＰ形成の分析
ＶＬＰへのＶＰ１の組み入れを、濃縮した抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して評価した。粗製の清澄化された抽出物から、高速遠心分離（７５０００×ｇ、２０分）によってコロイド粒子を濃縮した。ペレットを洗浄し、１／６体積の再懸濁緩衝液（５０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に再懸濁し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ゲル濾過カラムにローディングした。カラムを、再懸濁緩衝液を用いて溶出し、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によって特徴付けた。

１３０１＋１３１０（４：０．５）を用いて一過性に形質転換した植物由来のタンパク質抽出物をＳＥＣ分離に供し、溶出画分をクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＶＰ１ウエスタンブロットによって分析した。図４Ａに示されている結果により、カラムから溶出した宿主タンパク質の大部分は後半の画分にあり、画分１６でピークに達するが、一方、ＶＰ１に特異的なシグナルは前の画分に見いだされ、画分１２でピークに達し、そこで見いだされる宿主タンパク質は非常に少ないことが示されている。ＶＰ１は比較的小さなタンパク質であり、高分子量の構造に組み入れられていなければ、大多数の宿主タンパク質と一緒にカラムから溶出することが予測される。したがって、ＶＰ１について観察された溶出プロファイルにより、ＶＰ１が高分子量の構造に組み込まれていたことが強力に示される。ウエスタンブロットとクーマシー染色ゲルの組合せによっても、図４Ａのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて矢印によって同定された豊富なタンパク質がＶＰ１であり得ることが示唆された。

この実験の溶出画分１２の試料を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析のためにＩｎｓｔｉｔｕｔ Ａｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ（ＩＡＦ、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ）に送付した。試料を、３％リンタングステン酸を用いて陰性染色した後に検査した。図４Ｂには、ＥＶ７１に感染しているＶｅｒｏ細胞培養物に見いだされる空のＥＶ７１粒子（Ｌｉｕら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６巻、ｅ２０００５頁）とサイズおよび外観が同一である３０ｎｍの球状粒子が溶出画分１２において観察されることが示されている。この結果により、ＶＰ１が組み込まれる高分子量の構造が真性のＥＶ７１ ＶＬＰであることが示されている。

部分的な精製
形質転換された植物バイオマスからエンベロープを有するＶＬＰ（直径１４０ｎｍ）を精製するためにＶＬＰ精製法であるＶＬＰ Ｅｘｐｒｅｓｓスクリーニングプラットフォームを開発した。当該方法では、細胞外の内容物および細胞質ゾルの内容物を放出させるために細胞壁の酵素による消化を使用し、得られた抽出物を深層濾過および精密濾過に供した後に、１６０００ｇで６時間遠心分離してＶＬＰをペレット化する。ペレットを１／６０体積の再懸濁溶液（１００ｍＭのＮａ／ＫＰＯ_４、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０）に再懸濁し、滅菌濾過する（０．２μｍ）。

ＶＬＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ精製法を、３０ｎｍのエンベロープを有さないＥＶ７１ ＶＬＰを濃縮するその能力について試験した。精製法を発現ベクター１３０１＋１３１０（４：０．５）を用いて形質転換した植物に適用した。生じた生成物を、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＶＰ１ウエスタンブロット（図５Ａ）によって分析した。精製生成物のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、分子量がＥＶ７１コートタンパク質に対応するタンパク質が存在することが示された（矢印によって示されている、図５Ａ、右側のパネル）。ＶＰ１の同一性をウエスタンブロットによって確認した（図５Ａ、左側のパネル）。他のカプシドタンパク質については、同定は、推定分子量；ＶＰ０については３７．５ｋＤａ、およびＶＰ３について２６．５ｋＤａに基づいた。ウイルス粒子の形成においてＶＰ４とＶＰ２の間の切断はウイルスＲＮＡが内部移行した後にのみ起こるので、ＶＰ４およびＶＰ２は切断されていないＶＰ０の形態で見いだされることが予測された。精製された生成物の透過型電子顕微鏡分析により、サイズおよび形状がＥＶ７１ ＶＬＰに対応する３０ｎｍの球状構造が豊富にあることが明らかになった（図５Ｂ）。

発現に関する結論
植物に基づく一過性発現プラットフォームのＥＶ７１ ＶＬＰを生成する能力を実証するために実施した試験により、以下の結論が導かれた：
・ＥＶ７１ Ｐ１タンパク質および３ＣＤタンパク質は当該系において効率的に生成される
・３ＣＤは植物体において活性であり、Ｐ１がカプシドタンパク質に正確にプロセシングされる
・ＥＶ７１カプシドタンパク質は集合してＶＬＰを構築する
・ＥＶ７１ ＶＬＰは抽出可能であり、植物バイオマスからインタクトに精製することができる

（実施例２）
発現ポリオウイルス発現
遺伝子合成
ヒトエンテロウイルスＣ血清型ＰＶ−１由来のポリオウイルス（ＰＶ）構造タンパク質Ｐ１をコードするＤＮＡセグメントおよびプロテアーゼ３ＣＤをコードするＤＮＡセグメントを使用することができる。Ｐ１および３ＣＤの候補配列はＧｅｎＢａｎｋにおいて入手可能である。これらの配列の非限定的な例は以下のものである：
Ｐ１：アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（アミノ酸１〜８８１）（配列番号１０）；ヌクレオチド配列：ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８（ヌクレオチド７４３〜３３８５）（配列番号９）；
３ＣＤ：アミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＰ＿０４１２７７（アミノ酸１５６６〜２２０９）（配列番号８）；ヌクレオチド配列：ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＮＣ＿００２０５８（ヌクレオチド５４３８〜７３６９）（配列番号７）。

２種のＰ１遺伝子を合成することができる。第１のＰ１遺伝子は野生型配列を使用して生成することができ、一方、第２のＰ１遺伝子は、当技術分野で公知の標準の方法を使用して決定した最適化配列（ヒトコドンを使用）に基づいてよい。３ＣＤ遺伝子はその野生型配列に基づいて合成することができる。どちらの野生型遺伝子（Ｐ１および３ＣＤ）もＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（以前はＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標））によって合成することができ、ＤＮＡ２．０によって最適化Ｐ１遺伝子を最適化し、合成する。

分子クローニング
合成された遺伝子を植物発現ベクターにクローニングすることができる。選択されたベクター成分は、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）に基づくカセットに由来する転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントまたはアルファルファプラストシアニン遺伝子を含み、どちらの調節エレメントも組換えタンパク質を高発現させるために以前から首尾よく使用されている。マメ黄萎病ジェミニウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来のＤＮＡ増幅エレメントも植物発現ベクターに組み込むことができる。したがって、各遺伝子コンストラクトを、ＤＮＡ増幅エレメントを伴って、または伴わずに発現ベクターにクローニングすることができる。表２には、構築することができる植物発現カセットが提示されている。

発現の分析−最良の組換え遺伝子コンストラクトの選択
各発現カセットをプラスミドベクターにクローニングすることができ、次いでそれをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに移入することができる。ＤＮＡコンストラクトの移動性ＤＮＡコピーの植物細胞への移入を導くトランスジェニックＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種菌の減圧浸潤によって一過性発現を開始させることができる。多数の成分の一過性発現（同時発現）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種菌の混合物を浸潤させること（同時浸潤）によって実施することができる。植物に導入される１つの成分は構造的であり（Ｐ１）、かつ、第２の成分である３ＣＤプロテアーゼの基質であるので、２つの成分の発現レベルを調節することができる。これは、異なるプロモーター、種々の強度のＤＮＡ増幅系を使用することによって、各種菌（Ｐ１および３ＣＤ）の浸潤時の相対的な存在量を変動させることによって、またはこれらを組合せて実施することができる。

Ｐ１を伴う発現ベクターを、まずＰ１を単独で発現するそれらの能力について、および３ＣＤベクターと組み合わせて、高レベルのタンパク質分解断片を生成するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。タンパク質分解断片の蓄積を、プロセシングされていないＰ１の消失によってモニターすることができる。ウイルスプロテアーゼは植物において生成され、高度に活性であること、およびウイルスプロテアーゼにより、植物細胞において同時に生成されるその基質が認識され、切断されて、ＰＶカプシドタンパク質が生じることが示されている。

植物におけるタンパク質分解断片の蓄積のレベルは、Ｐ１タンパク質を含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと３ＣＤプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの比の影響を受ける可能性があり、３ＣＤプロテアーゼを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの割合が低いほど高い蓄積が得られる。Ｐ１のプロセシングおよびタンパク質分解断片の蓄積に対するＤＮＡ増幅エレメントの存在および種々の調節エレメントの使用に関する観察を行った。

ＶＬＰ形成の分析
ＶＬＰへのＶＰ１の組み入れを、濃縮した抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて評価することができる。粗製の清澄化された抽出物から、高速遠心分離によってコロイド粒子を濃縮することができる。ペレットを洗浄し、１／６体積の再懸濁緩衝液に再懸濁し、ゲル濾過カラムにローディングすることができる。カラムを、再懸濁緩衝液を用いて溶出し、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法によって特徴付けることができる。

一過性に形質転換した植物由来のタンパク質抽出物をＳＥＣ分離に供し、溶出画分をクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。結果により、カラムから溶出した宿主タンパク質の大部分は後半の画分にあり、一方、ＶＰ１に特異的なシグナルは前の画分において見いだすことができることが示され得る。ＶＰ１は比較的小さなタンパク質であり、高分子量の構造に組み入れられていなければ、大多数の宿主タンパク質と一緒にカラムから溶出することが予測される。したがって、ＶＰ１について観察された溶出プロファイルにより、ＶＰ１が高分子量の構造に組み込まれていたことが強力に示され得る。ウエスタンブロットとクーマシー染色ゲルの組合せによっても、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された豊富なタンパク質がＶＰ１であり得ることが示唆され得る。

この実験の試料を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による分析のためにＩｎｓｔｉｔｕｔ
Ａｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ（ＩＡＦ、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ）に送付することができる。結果により、ＶＰ１が組み込まれる高分子量の構造が真性のＰＶ ＶＬＰであることが示されている。

部分的な精製
形質転換された植物バイオマスからエンベロープを有するＶＬＰ（直径１４０ｎｍ）を精製するためにＶＬＰ精製法であるＶＬＰＥｘｐｒｅｓｓスクリーニングプラットフォームを開発した。当該方法では、細胞外の内容物および細胞質ゾルの内容物を放出させるために細胞壁の酵素による消化を使用し、得られた抽出物を深層濾過および精密濾過に供した後に、遠心分離してＶＬＰをペレット化する。ペレットを再懸濁溶液に再懸濁し、滅菌濾過する。

ＶＬＰＥｘｐｒｅｓｓ精製法を、エンベロープを有さないＰＶ ＶＬＰを濃縮するその能力について試験することができる。精製生成物のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、分子量がＰＶコートタンパク質に対応するタンパク質が存在することが示され得る。カプシドタンパク質の同定は、それらの推定分子量に基づいてよい。

（実施例３）
精製
タンパク質抽出を、ＷＯ２０１１／０３５４２２およびＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０１８０（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の機械的抽出技法または細胞壁の酵素による分解のいずれかを使用して実施した。酵素による抽出は、これにより、生成物の放出の増加がもたらされ、混入植物タンパク質の放出は最小限であり、生じた抽出物中の主要な混入物が細胞壁の破壊のために使用される酵素であり、適切なその後の下流のステップを使用して除去することができるという点で、機械的抽出よりも有利である。

機械的抽出物または酵素による抽出物を遠心分離に供して、細胞の細片、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、ＤＮＡおよび大きな粒子を排除した。次いで、遠心分離された抽出物を、下流の処理の前に、懸濁液中の固体を除去するため、バイオバーデンを低下させるため、および抽出物を安定化し調整するために実施した濾過ステップを通過させた。濾液中のＥＶ７１ ＶＬＰの回収率は数量化アッセイが存在せず評価することができなかったが、ウエスタンブロット分析により、濾過ステップの間のＶＬＰの損失は最小限であったことが示された。生じた清澄化された抽出物を、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用してさらに処理した、または適切なクロマトグラフィー媒体に直接ローディングした。

ＶＬＰのサイズにより、細胞壁の解重合のために使用した酵素を含めた、清澄化された抽出物中に見いだされる可溶性タンパク質を効率的かつ選択的に排除するためにＴＦＦを使用することが可能になる。ＴＦＦステップによりＶＬＰの濃縮も起こり、クロマトグラフィーのために調製物中の緩衝液を交換することが可能になる。

いくつかのクロマトグラフィー手法（陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および偽アフィニティー）、方式（結合またはフロースルー）ならびに緩衝駅の条件（ｐＨ５〜ｐＨ８、伝導率１０〜８０ｍＳ／ｃｍ）を、純度を増加させ混入ＤＮＡおよび内毒素を減少させながら、ＶＬＰの所望の特性を保護するその能力について評価した。ある特定の条件下で、フロースルー方式で使用したＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｄ（弱い陰イオン交換樹脂）により、濃縮されたＥＶ７１ ＶＬＰからのＤＮＡおよび内毒素の最も効率的な除去がもたらされることが見いだされた。

ＥＶ７１ ＶＬＰ精製プロセスにおいて、クロマトグラフィー後に第２のＴＦＦステップを追加した。このＴＦＦステップの役割は、生成物を所望の緩衝液中に濃縮し、製剤化することであった。この第２のＴＦＦステップのための孔径および動作条件は、第１のＴＦＦに関して同定されたパラメータに基づいて決定した。最後に、０．２２μｍで濾過した後、濃縮された、見たところでは純粋なＥＶ７１粒子を有する原薬を得た。生成物を、０．０１％ポリソルベート８０を含有するＰＢＳ中に製剤化した。

ＶＬＰの特徴付け
ＥＶ７１ ＶＬＰの第１のロットを、上記の適合させたプロセスを用いて生成し（ロット番号４７９−２３−０１８）、生成物を十分に特徴付けた（表３、ロット番号４７９−２３−０１８）。クーマシー染色ゲルのスキャンからのデンシトメトリーによって純度を決定し、ウエスタンブロット（抗ＶＰ１−ＶＰ２）で陽性シグナルが示され、質量分析によってさらに確認することができたバンドのみを生成物の一部とみなした。生成物品質プロファイル分析により、調製物が高度に純粋なＥＶ７１ ＶＬＰを含有することが示された。

生成物を電子顕微鏡によってさらに分析することにより、精製されたＥＶ７１ ＶＬＰがインタクトであることが確認され（図６Ａ）、質量分析によるトリプシンマッピングにより、生成物の純度が確認された。

（実施例４）
プロセスの改変
インタクトなＶＰ１を有するＶＬＰのＨＩＣによる精製
ＥＶ７１ ＶＬＰを精製するためのクロマトグラフィーの手法の最初のスクリーニングの間に、ＨＩＣ樹脂により、断片化されたＶＰ１を含有する粒子からインタクトなＶＰ１を含有するＶＬＰを分離することができることが認められた。ある特定の条件下では、ＬＭＷ ＶＰ１断片を含有する粒子は樹脂に強力に結合するが、インタクトな粒子はカラムを通って流れる。したがって、このＨＩＣステップをＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｄクロマトグラフィーの後に最終精製ステップとして挿入した。このプロセスによって精製されたＥＶ７１粒子はサイズが均一であり（光散乱）、ほぼ１００％の純度であり、質量分析によって検出可能なタンパク質混入物はなかった。この生成物（ロット番号４７９−３１−０２０）の生成物品質が表３の中央の列に示されている。

改変された抽出手順
植物抽出物は、およそ５．２のｐＨで酸性化することによって、または加熱処理し、遠心分離によって凝固物を排除することによって清澄化することができる。機械的抽出ステップと遠心分離ステップの間に加熱処理を挿入した。６０℃で１０分の加熱処理（ｐＨ８．０）を使用して、ＥＶ７１ ＶＬＰの溶解性に検出可能なレベルまでの影響を及ぼすことなく、可溶性タンパク質の９０％超を排除した。ＶＰ１は、これらの条件下で抽出し、清澄化した際にインタクトなままであった。

加熱処理に基づく清澄化と組み合わせたｐＨ８．０での機械的抽出を、ＥＶ７１ ＶＬＰ精製プロセスのために、酵素による抽出の代わりに実行した。ＶＬＰロットがこのプロセスを用いて生成された（ロット番号４７９−３２−０２０）。生成物の特性が表４に示されている（３列目）。得られた結果により、機械的抽出をタンパク質の熱に基づく清澄化と併せて使用することにより、以前に定義済みの下流のステップに十分に適合する効率的な一次回収ステップが示されることが示された。得られたプロセスは、高収率のものであり、それにより、９８％純粋なＥＶ７１ ＶＬＰ生成物が生じる。このプロセスで調製したＥＶ７１ ＶＬＰの光散乱プロファイルでは、高い均一性が示された。この生成物のＣｒｙｏ ＴＥＭ分析により、粒子がＥＶ７１ ＶＬＰのサイズおよび形状を有することが確認された（図８）。

全ての引用が本明細書に参照により組み込まれる。

本発明が１つまたは複数の実施形態に関して記載されている。しかし、特許請求の範囲において定義されている本発明の範囲から逸脱することなくいくつかの変形および改変を行うことができることが当業者には明らかである。

Claims (20)

1. 植物においてピコルナウイルス様粒子（ＰＶＬＰ）を生成する方法であって、
   ａ）１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、該植物において活性な第１の調節領域を含む第１の核酸を、該植物、該植物の一部、または植物細胞に導入するステップと、
   ｂ）該植物において活性であり、１つまたは複数のプロテアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、第２の調節領域を含む第２の核酸を、該植物、該植物の一部、または植物細胞に導入するステップと、
   ｃ）該植物、該植物の一部、または植物細胞を、該第１の核酸および該第２の核酸の発現を可能とする条件下でインキュベートし、それにより、該ＰＶＬＰを生成するステップと
   を含む方法。
2. 前記第１の核酸と前記第２の核酸の導入量の比が２０：１から０．５：１の間である、請求項１に記載の方法。
3. 前記１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質がＰ１である、請求項１に記載の方法。
4. 前記１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質が、構造タンパク質ＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４、またはその組合せを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記ピコルナウイルスがアフトウイルス、アビヘパトウイルス、カルジオウイルス、エンテロウイルス、エルボウイルス、ヘパトウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、サペロウイルス、セネカウイルス、テッショウウイルスおよびトゥレモウイルスの群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. 前記ピコルナウイルスがエンテロウイルス７１またはポリオウイルスである、請求項１に記載の方法。
7. 前記プロテアーゼがピコルナウイルスプロテアーゼである、請求項１に記載の方法。
8. 前記プロテアーゼが３ＣＤプロテアーゼである、請求項７に記載の方法。
9. 前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸を前記植物において一過性に発現させる、請求項１に記載の方法。
10. 前記導入するステップ（ステップａ）において、前記核酸を前記植物において安定に発現させる、請求項１に記載の方法。
11. 前記植物を採取し、前記ＰＶＬＰを精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
12. 植物、植物の一部または植物細胞においてピコルナウイルス様粒子（ＰＶＬＰ）を生成する方法であって、
    ａ）１つまたは複数のピコルナウイルスポリタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、該植物において活性な第１の調節領域を含む第１の核酸と、１つまたは複数のプロテアーゼをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結した、該植物において活性な第２の調節領域を含む第２の核酸とを含む植物、植物の一部または植物細胞を提供するステップと、
    ｂ）該植物、該植物の一部または植物細胞を、該核酸の発現を可能とする条件下でインキュベートし、それにより、該ＰＶＬＰを生成するステップと
    を含む方法。
13. 前記植物を採取し、前記ＰＶＬＰを精製するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 請求項１に記載の方法によって生成されるＰＶＬＰ。
15. 被験体において免疫応答を誘導するための治療有効量の請求項１４に記載のＰＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
16. 請求項１４に記載のＰＶＬＰを投与することを含む、被験体においてピコルナウイルス感染に対する免疫を誘導する方法。
17. 前記ＰＶＬＰを被験体に、経口的に、皮内に、鼻腔内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、または皮下に投与する、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１４に記載のＰＶＬＰを使用して調製したポリクローナル抗体。
19. 前記第１の核酸配列が、１つまたは２つ以上のコモウイルスエンハンサー、前記ポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および１つまたは２つ以上の増幅エレメントに作動可能に連結した前記第１の調節領域を含み、レプリカーゼをコードする第３の核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する、請求項１または１２に記載の方法。
20. 前記第２の核酸が、１つもしくは２つ以上の増幅エレメントまたは１つもしくは複数のコモウイルスエンハンサーを含まない、請求項１または１２に記載の方法。

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