CN104755614A

CN104755614A - 小核糖核酸病毒样颗粒在植物中的产生

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Publication number: CN104755614A
Application number: CN201380055096.5A
Authority: CN
Inventors: 马克-安德烈·蒂奥斯特; 皮埃尔-奥利维耶·拉瓦伊; 曼侬·库特里; 露西·鲍林; 路易斯-菲利普·维泽纳
Original assignee: Mo Di Kargo Inc
Current assignee: Mo Di Kargo Inc; Medicago Inc
Priority date: 2012-09-05
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: ES2911774T3; RU2693431C2; EP2893007A1; AU2013312971A1; US10202423B2; ZA201502264B; CA2884073C; IL237413A0; MX364778B; HK1210208A1; MX2019005315A; AU2013312971B2; CA2884073A1; IL237413B; JP2015528285A; JP2018191645A; SG11201501523XA; JP2020171302A; NZ705488A; MY174081A

Abstract

提供了在植物中产生小核糖核酸病毒样颗粒(PVLP)的方法。该方法包括将第一核酸和第二核酸引入植物、植物的部分或植物细胞。第一核酸包含植物中有活性的第一调节区，第一调节区与编码picornavims多肽的核苷酸序列可操作地连接。第二核酸包含植物中有活性的第二调节区，第二调节区与编码一种或多种picornavims蛋白酶的核苷酸序列可操作地连接。在允许核酸表达的条件下培养植物、植物的部分或植物细胞，从而产生PVLP。也提供了包含多肽的PVLP。

Description

小核糖核酸病毒样颗粒在植物中的产生

发明领域

本发明涉及在植物中产生小核糖核酸病毒结构蛋白。更具体地，本发明也涉及在植物中产生包含小核糖核酸病毒结构蛋白的病毒样颗粒。

发明背景

小核糖核酸病毒是小的无包膜的正链RNA病毒，其可以引起人和动物中多种临床表现。基于包括序列同源性和酸敏感性的多种性质，小核糖核酸病毒被分为多个属，其中包括多种人和动物的重要病原体。

小核糖核酸病毒具有裸露的核衣壳。衣壳为排列为紧密包装的二十面体结构的60个原体。每一原体由4个多肽组成，称为VP(病毒蛋白)1、2、3和4。VP2和VP4多肽起源于被称为VP0的前体，VP0在病毒基因组RNA内化到细胞后被切割。VP4位于衣壳的内侧。根据脱水类型和程度，病毒颗粒直径为约27-30nm。

小核糖核酸病毒具有7.1-8.9kb的单组分、线性、多聚腺苷酸化的ssRNA(+)基因组，其由编码多蛋白的单个ORF构成。病毒基因组RNA在5’端具有病毒蛋白(VPg)，代替甲基化核苷酸帽结构。5’端长的UTR包含内部核糖体进入位点(IRES)。P1区编码结构多肽。P2和P3区编码与复制有关的非结构蛋白。较短的3’UTR在(-)链合成中是重要的。L为存在于一些属中的额外的N末端前导蛋白，其可以为蛋白酶(口蹄疫病毒，马鼻病毒)或具有其他的功能(嵴病毒，心脏病毒)。

病毒粒子RNA为感染性的，并且作为基因组和病毒信使RNA。IRES允多种蛋白的直接翻译。由病毒蛋白酶将多蛋白最初加工为各种前体和成熟蛋白，从而产生结构蛋白、复制酶、VPg和多种修饰宿主细胞、最终导致细胞溶解的蛋白。

肠病毒71(EV71)为单链RNA病毒的小核糖核酸病毒科的成员。它是无包膜病毒，并且它的衣壳由多个作为单个病毒翻译产物的片段产生的外壳蛋白组成。图1(现有技术)中呈现了病毒多蛋白到结构和非结构组分的加工。多蛋白基因的P1区编码结构蛋白，而P2和P3区编码病毒的非结构组分。通过病毒蛋白酶2A将结构蛋白前体P1(图1中的1ABCD)从多蛋白上切割之后，P1前体被加工为衣壳蛋白VP0、VP1(图1中的1D片段)和VP3(图1中的1C片段)。3C组分和它的前体3CD(P3区所编码)为负责将P1前体加工为衣壳蛋白的病毒蛋白酶。VP0、VP1和VP3原体同时地组装为空的衣壳，并且据信，在空的颗粒组装后，病毒RNA被包装到颗粒中。空的衣壳与基因组RNA的结合导致结构转换、RNA的内化、VP0自动催化切割为VP2(图1中1B片段)和VP4(图1中1A片段)，并成熟为稳定的150S病毒粒子。通常在小核糖核酸病毒感染期间发现包含未切割的VP0前体的空的衣壳。

已从P1前体蛋白与3CD蛋白酶的共表达实现昆虫细胞中EV71VLP的产生(Hu et al.,2003,Biotechnology Letters 25:919-925)。Chung et al.描述了使用单个杆状病毒载体产生P1和3CD(2008,Vaccine 26:1855-1862)。小鼠中的免疫原性研究显示，纯化的EV71VLP为致死剂量的病毒处理提供了保护。

来自于EV71的VP1蛋白产生于转基因番茄的果实中，并且用含有VP1的转基因果实饲养小鼠导致VP1特异性粪便IgA和血清IgG的发展(Chen et al.,2006,Vaccine24:2944-2951)。

口蹄疫病毒(FMDV)的P1前体蛋白和蛋白酶3C共表达在转基因苜蓿中(Dus Santos et al.,2005,Vaccine 23:1838-1843)。用包含FMDV P1(1A、1B、1C、1D)的基因组区、2A、2B的N末端的前16个氨基酸残基、3B1、3B2、3B3、3C的全序列和3D的N末端的前16个氨基酸残基的单个载体稳定地转化苜蓿。通过Balb/c小鼠中腹腔内给药证明了来自于转基因植物的粗蛋白提取物的免疫原性。免疫小鼠也得到抵抗致死的FMDV处理的保护。用于实践目的的抗原表达的水平是低的。

阿根廷申请AR078257公开了表达空的衣壳病毒的转基因植物，其中转基因植物在它的基因组中包含编码与自动催化型2A蛋白酶连接的P1前体多肽的DNA构建体。该DNA构建体还可包含连接于编码3C蛋白酶的序列的蛋白片段2B，3C蛋白酶与编码蛋白片段3D的序列片段连接。

发明概述

根据本发明，提供了在植物中产生包含小核糖核酸病毒样颗粒(PVLP)的方法，其包括：

a)将第一核酸引入植物或植物的部分，第一核酸包含在植物中有活性的第一调节区，第一调节区与编码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的核苷酸序列可操作地连接；

b)引入第二核酸植物，第二核酸包含在植物中有活性的第二调节区，第二调节区与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地连接；

c)在允许第一和第二核酸表达的条件下培养植物、植物的部分，从而产生PVLP。

本发明还提供了产生小核糖核酸病毒样颗粒(PVLP)的方法(B)，其包括：

a)提供植物、植物的部分或植物细胞，所述植物、植物的部分或植物细胞包含第一核酸和第二核酸，第一核酸包含在植物中有活性的第一调节区，第一调节区与编码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的第一核苷酸序列可操作地连接，第二核酸包含在植物中有活性的第二调节区，第二调节区与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地连接；

b)在允许核酸表达的条件下，培养植物、植物的部分或植物细胞，从而产生PVLP。

在植物中有活性的第一调节区和在植物中有活性的第二调节区可以是相同的或不同的。

此外，在方法(A)或(B)中，引入植物、植物的部分或植物细胞的第一核酸与第二核酸的百分比率可以为95％:5％至50％:50％，或约20:1至约0.5:1。

本发明还包括上述的方法(A)或(B)，其中第一核酸序列包含与一种或多种豇豆花叶病毒(comovirus)增强子、编码多蛋白的核苷酸序列和一种或多种双生病毒(geminivirus)扩增元件可操作地连接的第一调节区，并且编码双生病毒复制酶的第三核酸被引入植物或植物的部分。一种或多种豇豆花叶病毒增强子可为豇豆花叶病毒UTR，例如，豇豆花叶病毒高度翻译(CPMV-HT)UTR，诸如CPMV-HT 5’、3’UTR或其组合。一种或多种双生病毒扩增元件可以选自大豆黄萎病病毒长基因间隔区(BeYDVLIR)和BeYDV短基因间隔区(BeYDV SIR)。

上文所述方法(方法A)也可涉及引入编码沉默阻抑蛋白(例如HcPro或p19)的另一核酸序列。

上文所述方法(方法B)也可涉及还提供包含编码沉默阻抑蛋白(例如HcPro或p19)的另一核酸序列的植物、植物的部分或植物细胞。

本发明也包括上文所述方法(A)，其中在引入步骤(步骤a)中，核酸在植物中瞬时表达。可选地，在引入步骤(步骤a)中，核酸在植物中稳定地表达。

上文所述方法(A)和(B)还可以包括收获植物和纯化PVLP的步骤。

本发明包括组合物，其包含用于诱导免疫应答的有效剂量的上文所述的PVLP和药学上可接受的载体。

本发明也包括诱导个体中对小核糖核酸病毒感染的免疫力的方法，包括向个体给予上文所述的PVLP。PVLP可通过口服、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下的方式给予个体。

本发明也提供了包含通过上文所述的方法(A)和/或(B)产生的PVLP的植物物质。植物物质可用于诱导个体中对小核糖核酸病毒感染的免疫力。植物物质也可混合为食品补充剂。

发明概述部分未必描述了本发明的所有特征。

附图简述

本发明的这些和其他特征从参考附图中的以下描述会变得更清楚，其中：

图1为小核糖核酸病毒基因组(肠病毒71)和多蛋白加工中间体的现有技术展示(来自于ViralZone网页)。

图2显示了P1表达和由3CD加工的Western印迹分析。将来自用上文鉴定的表达载体转化的植物的10微克蛋白提取物上样，并在非还原条件下电泳。小鼠抗抗VP1单克隆抗体用于免疫检测。比率指示用于转化的细菌悬浮液中P1(构建体1300或1301，见表1)与3CD(构建体1310、1311或1315，见表1)农杆菌株(Agrobacterium)的比例。显示了P1和VP1的预期位置。

图3显示了针对VP1的最大化累积进行的3CD表达策略的筛选。将来自用上文鉴定的表达载体转化的植物的5微克蛋白提取物上样，并在非还原条件下电泳。小鼠抗抗VP1单克隆抗体用于免疫检测。比率指示用于转化的细菌悬浮液中P1(1301)与3CD(1310、1311、1312和1313)农杆菌株的比例。

图4显示了EV71衣壳组装的评估。(A)对来自共表达P1和3CD(构建体1301+1310(4:0.5))的植物的蛋白提取物进行的尺寸排阻色谱(SEC)分离中得到的洗脱部分的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和Western印迹分析。指示了考马斯亮蓝染色凝胶中推定对应于VP1的条带。(B)SEC洗脱部分12的负染色透射电子显微镜检测。标尺代表100nm。

图5显示了纯化的EV71PVLP的表征。(A)纯化的EV71PVLP的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和Western印迹分析。指示了考马斯亮蓝染色凝胶中推定对应于VP1的条带。另外，也鉴定了分子量与其他EV71衣壳蛋白相对应的其他条带。(B)纯化的EV71的负染色透射电子显微镜检测。在检测之前将样品以1/100稀释。标尺代表100nm。

图6显示了通过电子显微镜进行的批号479-23-018的表征。

图7显示了通过酶辅助的方法提取的、加工的并通过HIC选择的EV71 PVLP的冷冻电子显微镜分析(批号479-31-020)。

图8显示了通过机械提取方法(pH 8.0)和热处理提取的EV71 PVLP的冷冻电子显微镜分析(批号479-32-020)。

图9A显示了来自于EV71株HK08的3CD，其包含如GenBank登录号ADG57603所示的氨基酸1549-2193(SEQ ID NO:1)。图9B显示了来自于EV71株HK08的3CD，其包含如GenBank登录号GQ279369所示的核苷酸5387-7321(SEQ ID NO:2)。图9C显示了来自于EV71株GDFS08的3CD，其包含如GenBank登录号ACI25378所示的氨基酸1549-2193(SEQ ID NO:3)。图9D显示了来自于EV71株GDFS08的3CD，其包含如GenBank登录号FJ194964所示的核苷酸5387-7321(SEQ IDNO:4)。图9E显示了P1氨基酸序列GenBank登录号ADG57603(氨基酸1-862)(SEQ ID NO:5)。图9F显示了P1核苷酸序列GenBank登录号GQ279369(核苷酸743-3328)(SEQ ID NO:6)。图9G显示了来自于人肠病毒C血清型PV-1的PVgp1多蛋白核苷酸序列(对基因组而言为GenBank登录号NC_002058，对多蛋白而言为NP_041277:nt 5438-7369)(SEQ IDNO:7)。图9H显示了来自于脊髓灰质炎病毒的多蛋白的氨基酸序列(氨基酸1566-2209，来自GenBank登录号NP_041277)(SEQ ID NO:8)。图9I显示了PVgp1多蛋白的核苷酸序列[人肠病毒C](nt 743-3385，来自GenBank登录号NC_002058)(SEQ ID NO:9)。图9J显示了多蛋白的氨基酸序列[人肠病毒C]GenBank登录号NP_041277(氨基酸1-881，来自GenBank登录号NP_041277)(SEQ ID NO:10)。

发明详述

以下描述优选实施方案。

本发明涉及包含一种或多种小核糖核酸病毒结构蛋白的病毒样颗粒(VLP)(即小核糖核酸病毒样蛋白或PVLP)，和在植物中或植物的部分中产生PVLP的方法。因此，PVLP可以包含一种或多种小核糖核酸结构蛋白。例如，PVLP可以包含一种或多种肠病毒结构蛋白。

小核糖核酸病毒可以选自口蹄疫病毒(Aphthovirus)、禽肝炎病毒(Avihepatovirus)、心脏病毒(Cardiovirus)、肠病毒(Enterovirus)、马鼻病毒(Erbovirus)、肝病毒(Hepatovirus)、嵴病毒(Kobuvirus)、副肠孤病毒(Parechovirus)、萨佩洛病毒(Sapelovirus)、塞尼卡病毒(Senecavirus)、捷申病毒(Teschovirus)和震颤病毒(Tremovirus)。在非限制性实例中，小核糖核酸病毒可以为肠病毒，例如肠病毒71(EV71)或人肠病毒C(也被称为脊髓灰质炎病毒)。

本发明的一部分提供了在植物中产生VLP，例如PVLP或肠病毒样颗粒的方法。该方法可以包括将第一核酸引入植物或植物的部分，第一核酸包含在植物中有活性的第一调节区，第一调节区与编码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的第一核苷酸序列可操作地连接；引入第二核酸植物，第二核酸包含在植物中有活性的第二调节区，第二调节区与编码蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地连接。随后，在允许核酸表达的条件下培养植物或植物的部分，从而产生PVLP。

术语"病毒样颗粒(VLP)"或"VLP"指的是能自我组装并且包含一种或多种结构蛋白的结构，结构蛋白例如为一种或多种小核糖核酸结构蛋白、或一种或多种肠病毒结构蛋白或其组合，例如但不限于VP0、VP1、VP2、VP3、VP4结构蛋白或其组合。VLP通常与感染中产生的病毒粒子在形态学和抗原性上相似，但是缺乏足以复制的遗传信息，因此为非感染性的。VLP可在合适的宿主细胞中产生，包括植物宿主细胞。随着从宿主细胞提取、通过分离和在合适的条件下进一步纯化，VLP可纯化为完整的结构。

术语"小核糖核酸病毒样颗粒(PVLP)"指的是包含一种或多种小核糖核酸病毒结构蛋白的VLP。术语"肠病毒样颗粒"指的是包含一种或多种肠病毒结构蛋白的VLP。小核糖核酸病毒结构蛋白的实例可以包括但不限于VP0、VP1、VP2、VP3、VP4或其组合的结构蛋白。肠病毒结构蛋白的实例可包括但不限于VP0、VP1、VP2、VP3、VP4或其组合的结构蛋白。

多蛋白表示包含一种或多种蛋白或蛋白前体的蛋白，当其被蛋白水解加工时能提供一种或多种蛋白。例如，多蛋白可以包含一种或多种结构蛋白。多肽中的一种或多种蛋白(例如结构蛋白)例如可以被切割位点隔开，例如蛋白酶切割位点。“多蛋白”的非限制性实例为结构蛋白前体P1，也称为“P1区”。P1区定义为产生“结构蛋白”或“外壳蛋白”，例如VP0、VP1、VP2、VP3、VP4或其组合的小核糖核酸病毒多蛋白的那一部分。根据本发明可使用的小核糖核酸病毒P1或P1片段的非限制性实例包括来自于肠病毒(例如肠病毒71)的那些P1。

按照非限定方式，P1区的实例为GenBank登录号ADG57603所示的包含氨基酸1-862(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列或与其具有其至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括这些范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。此外，编码P1区的核苷酸序列的非限制性实例为GenBank登录号GQ279369所示的包含核苷酸743-3328(SEQ ID NO:6)的序列或与其具有其至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括这些范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。

还按照非限定方式，P1区的另一实例为GenBank登录号NP_041277所示的包含氨基酸1566-2209(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或与其具有其至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括这些范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。此外，编码P1区的核苷酸序列的非限制性实例为GenBank登录号NC_002058所示的包含核苷酸5438-7369(SEQ ID NO:7)的序列或与其具有其至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括这些范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。在非限定的另一实例中，P1区具有GenBank登录号NP_041277所示的包含氨基酸1-881(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列或与其具有其至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括这些范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。此外，编码P1区的核苷酸序列的非限制性实例为GenBank登录号NC_002058所示的包含核苷酸743-3385(SEQID NO:9)的序列或与其具有其至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括这些范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。

“小核糖核酸病毒多蛋白”指的是从小核糖核酸病毒分离的小核糖核酸病毒多蛋白的全部或一部分，其可以存在于任何天然存在的或变异的小核糖核酸病毒株或分离物，例如肠病毒多蛋白。相似地，“小核糖核酸病毒结构蛋白”可指的是从小核糖核酸病毒分离的小核糖核酸病毒结构蛋白的全部或一部分，其可以存在于任何天然存在的或变异的小核糖核酸病毒株或分离物，例如肠病毒结构蛋白，例如从脊髓灰质炎病毒或肠病毒71获得。因此，“小核糖核酸病毒多蛋白”和“小核糖核酸病毒结构蛋白”等术语包括小核糖核酸病毒多蛋白、小核糖核酸病毒结构蛋白或其组合的天然存在的变体，可通过病毒生命周期中突变产生或响应于选择压力产生(例如，药物治疗、宿主细胞嗜性的扩大或感染性等)。术语“小核糖核酸病毒多蛋白”还包括“肠病毒多蛋白”、“肠病毒结构蛋白”等，它们包括肠病毒多蛋白、肠病毒结构蛋白或其组合的天然存在的变体，可通过病毒生命周期中突变产生或响应于选择压力产生(例如，药物治疗、宿主细胞嗜性的扩大或感染性等)。术语“小核糖核酸病毒多蛋白”也可以包括“脊髓灰质炎病毒多蛋白”和“脊髓灰质炎病毒结构蛋白”等，它们包括脊髓灰质炎病毒多蛋白、脊髓灰质炎病毒结构蛋白或其组合的天然存在变体，可通过病毒生命周期中突变产生或响应于选择压力产生(例如，药物治疗、宿主细胞嗜性的扩大或感染性等)。本领域中技术人员应理解，也可使用重组技术产生小核糖核酸病毒、肠病毒或脊髓灰质炎病毒多蛋白、或小核糖核酸病毒，肠病毒或脊髓灰质炎病毒结构蛋白的天然体和变体。

多蛋白可以包含一种或多种结构蛋白，例如衣壳蛋白。小核糖核酸病毒结构蛋白或衣壳蛋白的非限制性实例为小核糖核酸病毒蛋白VP0、VP1、VP2、VP3和VP4以及VP0、VP1、VP2、VP3和VP4的片段。根据本发明可使用的VP0、VP1、VP2、VP3和VP4或VP0、VP1、VP2、VP3和VP4蛋白的片段的非限制性实例包括来自于肠病毒(例如脊髓灰质炎病毒或肠病毒71)的VP0、VP1、VP2、VP3和VP4蛋白。此外，多蛋白、结构蛋白或其组合可来自于例如肠病毒71HK08株或GDFS08株。在另一非限制性实例中，多蛋白、结构蛋白或其组合可来自于人肠病毒C，也称为脊髓灰质炎病毒。

通过使用利用BLAST(基本局部比对搜索工具)2.0算法的BLASTP和TBLASTN程序，可以计算氨基酸序列相似性或同一性。计算氨基酸序列相似性或同一性的技术为本领域中熟知的，并且在ALTSCHUL et al.(1990,J Mol.Biol.215:403-410)和ALTSCHUL et al.(1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402)中描述了BLAST算法的使用。

在本发明中，通过将编码小核糖核酸病毒、肠病毒或脊髓灰质炎病毒多蛋白(例如但不限于P1)的核酸(第一核酸)与编码蛋白酶(例如小核糖核酸病毒、肠病毒或脊髓灰质炎病毒蛋白酶(例如但不限于3CD))的第二核酸共表达，并且从而产生VLP，可以在植物、植物的部分或植物细胞中产生小核糖核酸病毒、肠病毒(包括脊髓灰质炎病毒)VLP。

按照非限定方式，蛋白酶的实例为来自于EV71HK08株的GenBank登录号ADG57603所示的包含氨基酸1549-2193的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)。核苷酸序列为GenBank登录号GQ279369(SEQ ID NO:2)所示的核苷酸5387-核苷酸7321的序列或与SEQ ID NO:2具有至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括该范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。另一非限制性实例为来自于EV71GDFS08株的包含GenBank登录号ACI25378所示的氨基酸1549-2193的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。GenBank登录号FJ194964(SEQ ID NO:4)所示的核苷酸5387-核苷酸7321核苷酸序列可用于产生氨基酸序列。此外，与SEQ ID NO:4具有至少约90-100％序列相似性的序列，相似性包括该范围内任何百分比相似性，诸如与其具有90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％序列相似性。

第一核酸和第二核酸可在相同的步骤中引入植物，或可依次地引入植物。

序列

可用于本发明的序列的非限制性实例包括：

来自于口蹄疫病毒、禽肝炎病毒、心脏病毒、肠病毒、马鼻病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、萨佩洛病毒、塞尼卡病毒、捷申病毒和震颤病毒的P1序列可用于产生P1多蛋白。在非限制性实例中，编码P1多蛋白的序列可来自于肠病毒，例如肠病毒71或人肠病毒C(也称为脊髓灰质炎病毒)。

此外，可用于编码本文所述使用的蛋白酶的序列的非限制性实例包括蛋白酶3CD的序列，例如获自口蹄疫病毒、禽肝炎病毒、心脏病毒、肠病毒、马鼻病毒、肝病毒、嵴病毒、副肠孤病毒、萨佩洛病毒、塞尼卡病毒、捷申病毒和震颤病毒。在非限制性实例中，编码3CD蛋白酶的序列可来自于肠病毒，例如肠病毒71或脊髓灰质炎病毒(也称为人肠病毒C)。

已发现通过在植物或植物的部分中引入和共表达多蛋白和蛋白酶，可以调节所产生的VLP的产率。多蛋白和蛋白酶可以提供在分别的核酸构建体并共表达，或它们可以提供在相同的构建体上，但是根据需要，每一序列差异地表达从而如下文所述使VLP产生最佳化。

“共表达”指两个或多于两个核苷酸序列在植物内、在植物相同的组织内和在植物相同的细胞内几乎同时表达。此外，可能需要在相同的细胞室内表达两个或多于两个核苷酸序列，细胞室例如内质网、高尔基氏体、质外体、胞液、线粒体、叶绿体、抗氧化物酶体。核苷酸序列不需要在完全相同的时间表达。例如，两个或更多个核苷酸序列以使所编码的产物有机会互相作用的方式表达。例如，蛋白酶可在多蛋白表达之前或表达期间表达，从而使得可以发生多蛋白切割为结构蛋白。可使用瞬时表达系统共表达两个或多于两个核苷酸序列，其中在表达两个序列的条件下，几乎同时将两个或更多个序列引入植物内。两个或多于两个序列可存在于不同的构建体上，并且共表达要求每一构建体被引入植物、植物的部分或植物细胞中，或两个或多于两个序列可存在于一个构建体上，并且该构建体被引入植物、植物的部分或植物细胞中。

可选地，包含核苷酸序列之一(例如编码蛋白酶的序列)的植物可以用编码多蛋白的额外的序列以瞬时的或以稳定的方式进行转化。在这种情况下，编码蛋白酶的序列可在期望的组织内、在期望的发育阶段期间表达，或可以使用诱导型启动子诱导它的表达，并且编码多蛋白的额外的序列可在相似的条件下和相同的组织中表达，从而确保核苷酸序列的共表达。此外，以瞬时的或稳定的方式用编码蛋白酶的额外的序列转化编码多蛋白的序列。在这种情况下，编码多蛋白的序列可在期望的组织内、在期望的发育阶段期间表达，或使用诱导型启动子诱导它的表达，并且编码蛋白酶的额外的序列可在相似的条件下和相同的组织中表达，从而确保核苷酸序列的共表达。

如图2和3所示，植物、植物的部分或植物细胞中VLP累积水平受引入到植物、植物的部分或植物细胞中的含有多蛋白的农杆菌与含有蛋白酶的农杆菌的比率影响。含有多蛋白的农杆菌与含有蛋白酶的农杆菌的比率范围可以例如从约20:1至约0.5:1(多蛋白:蛋白酶)，或在此范围中间的任何数，例如约20:1、18:1、16:1、14:1、12:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、05:1(多蛋白:蛋白酶)，或其间的任何数。

例如，通过将不同比率的含有第一核酸的农杆菌与含有第二核酸的农杆菌多蛋白与蛋白酶引入植物、植物的部分或植物细胞中，可改变多蛋白与蛋白酶的比率。可选地，如果多蛋白和蛋白酶存在于相同的构建体上，并且因此被引入相同的农杆菌，那么可以使用合适的启动子在植物、植物的部分或植物细胞中差异地表达它们，从而获得期望的多蛋白与蛋白酶的比率。

因此，本发明也提供了通过调节第一和第二核酸之间的比率增加PVLP产率的方法。

在一个实施方案中，含有蛋白酶的农杆菌的百分比可以为引入的总农杆菌的0.5％至50％或在其间的任何量。例如，含有蛋白酶的农杆菌的百分比可以为0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％或其间的任何量。

含有多蛋白的农杆菌与含有蛋白酶的农杆菌的百分比率为引入的总农杆菌的95％:5％至40％:60％，或其间的任何量。例如，引入的农杆菌总量中含有多蛋白的农杆菌的百分比可以为99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％或51％。例如，含有多蛋白的农杆菌与含有蛋白酶的农杆菌的百分比率可以为50％:50％至95％:5％，或其间的任何百分比率，或含有多蛋白的农杆菌与含有蛋白酶的农杆菌的百分比率可以为50％:50％、55％:45％、60％:40％、65％:35％、70％:30％、75％:25％、80％:20％、85％:15％、90％:10％、95％:5％，或其间的任何百分比率。

植物细胞中第一和第二核苷酸序列的表达形成VLP，并且VLP可用于例如产生能够结合病毒蛋白(例如小核糖核酸病毒结构蛋白，包括但不限于VP0、VP1、VP2、VP3和/或VP4)的抗体。当将VLP给予个体时，VLP能诱导免疫应答。

如下文所述，还可例如通过差异地表达多蛋白和蛋白酶，改变多蛋白与蛋白酶的比率。可通过调节例如复制、转录、翻译或其组合，改变多蛋白、蛋白酶或多蛋白和蛋白酶两者的表达。例如，除了如上文所述改变引入的含有多蛋白的农杆菌与含有蛋白酶的农杆菌的比率之外，可使用不同的调节元件，包括启动子、扩增元件、增强子或其组合。第一集合或组合的调节元件可用于调节第一核酸的复制、转录或其组合，第二集合或组合的调节元件的可用于调节第二核酸的复制、转录或其组合。第一集合或组合的调节元件与第二集合或组合的调节元件不同，并且允许第一核酸和第二核酸的差异表达，从而允许体内调节多蛋白:蛋白酶的比率。例如，按照非限制性方式，一个集合或组合的调节元件(例如第一集合)可包括扩增元件(例如获取自BeYDV的元件)，而该扩增元件(例如获取自BeYDV的那些)可以不存在于另一集合或组合的调节元件(例如第二集合)。可选地，第二集合可包括扩增元件(例如获取自BeYDV的元件)，而该扩增元件(例如获取自BeYDV的元件)可以不存在于第一集合或组合的调节元件。以相似的方式，第一和第二集合或组合的调节元件之间的启动子强度可以不同，或启动子之一可以为诱导型，另一个是组成型，从而体内实现多蛋白相对于蛋白酶之间的差异表达。

大小

可以使用任何合适的方法(例如蔗糖梯度或尺寸排阻色谱)检测VLP的存在。例如，可以通过电子显微镜或通过尺寸排阻色谱评估VLP的结构和大小。

对尺寸排阻色谱而言，通过在提取缓冲液中均质化(Polytron)冷冻粉碎的植物物质样品，并且通过离心除去不可溶的物质，可以从植物组织提取总的可溶蛋白。通过PEG辅助沉淀进行的浓缩也是有利的。可以使用WO 2011/035422(通过引用将其并入本文)中描述的方法，通过制备原生质体或原生质体部分，也可产生VLP。定量可溶蛋白，并且使提取物通过Sephacryl^TM柱，例如Sephacryl^TM S500柱。Blue Dextran 2000可用作校准标准。

可通过离心消除细胞碎片。然后，可过滤离心的提取物。不希望受理论限制，据信这样的过滤步骤可除去悬浮液中的固体，减少生物负载以及在进一步的纯化之前稳定及调整提取物。根据PVLP的大小，可以使用正切流动过滤(TFF)进一步纯化PVLP。不希望受理论限制，TFF能有效地并且选择性地消除澄清的提取物中存在的较低分子量的可溶蛋白，包括用于细胞壁解聚的酶。此外，TFF步骤也能浓缩VLP并实现用于色谱法的制备中的缓冲液交换。TFF步骤之后可以为数个色谱步骤，例如阴离子交换、阳离子交换、疏水性相互作用色谱(HIC)和/或伪亲和力。色谱步骤之后，可增加额外的TFF步骤。在色谱法和/或TFF之后，可以通过免疫印迹进一步地分析组分，从而确定组分的蛋白补充物。

例如，分离的组分可为上清液(如果进行离心、沉降或沉淀)，或滤出物(如果进行过滤)，并且富集蛋白或表壳结构蛋白，例如高级别、高分子量的颗粒或完整的VLP。可以进一步加工分离的组分，从而对蛋白、表壳蛋白或高级别颗粒进行分离、纯化、浓缩或其组合，例如通过额外的离心步骤、沉淀、色谱步骤(例如尺寸排阻、离子交换、亲和色谱法)、正切流动过滤或以上的组合。例如，可以通过天然或SDS-PAGE、使用适当的检测抗体的Western印迹分析、毛细管电泳、电子显微镜法或本领域中技术人员明显知晓的任何其他方法，确认纯化的蛋白、表壳结构蛋白或高级别颗粒(诸如VLP)的存在。

图4A显示了包含PVLP的植物提取物的尺寸排阻色谱分析的洗脱图的实例。在该实例中，包含肠病毒EV71衣壳的VLP在组分9至约14洗脱，峰值在组分12。

可以使用任何合适的方法纯化或提取VLP，例如化学或生化提取法。VLP可以对干燥、热、pH、表面活性剂和去垢剂相对敏感。因此，它对使用使VLP的产率最大化、使具有细胞蛋白的VLP组分污染最小化、维持蛋白完整性的方法，以及松解细胞壁从而释放蛋白的方法是有用的。例如，可使用产生原生质体和/或原生质球的方法(例如见WO2011/035422，通过引用将其并入本文)，从而获得本文所述的VLP。最小化或消除去垢剂或表面活性剂(例如SDS或Triton X-100)的使用对提高VLP提取的产率是有利的。然后，可通过例如电子显微镜法或通过上文所提及的尺寸排阻色谱并且进行分析型超速离心，评估VLP的结构和大小。

例如，通过动态光散射(DLS)或电子显微镜(EM)技术，可测量上文所定义的PVLP的大小(即直径)，通常在20至50nm，或其间的任何大小。例如，完整的PVLP结构的大小范围在约25nm至约35nm，或其间的任何大小，或从20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm或其间的任何大小。

PVLP合成的量可以达到2g/kg植物鲜重，对应于植物的总蛋白含量的约40％。例如，本文所述的VLP合成的量可为10mg至2.0g/kg鲜重，或其间的任何量，诸如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000mg/kg鲜重，或其间的任何量。

宿主

本发明的一种或多种基因构建体可在通过本发明的核苷酸序列、或构建体、或载体转化的任何合适的植物宿主或植物的部分中表达，例如一片或多片叶子、茎加上一片或多片叶子或根。合适的宿主实例包括但不限于农作物，包括苜蓿、油菜、芸苔、玉米、烟草、马铃薯、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花等。

本发明的一种或多种基因构建体还可以包含3'非翻译区。3'非翻译区指的是包含DNA区段的基因部分，所述DNA区段包含多聚腺苷酸化信号和任何其他能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号。通常，多聚腺苷酸化信号的特征为影响多聚腺苷酸追踪被添加到mRNA前体的3'端。多聚腺苷酸化信号通常被公认为存在典型形式5'AATAAA-3'的同源性，但是变异也并不是少见的。合适的3'区的非限制性实例为包含诸如烟脂碱合成酶(NOS)基因的农杆菌肿瘤诱导的(Ti)质粒基因，诸如大豆贮存蛋白基因的植物基因，核酮糖-I,5-二磷酸羧化酶基因的小亚基(ssRUBISCO；US 4,962,028；通过引用将其并入本文)，美国7,125,978号(通过引用将其并入本文)中所述的用于调节质体蓝素表达的启动子的多聚腺苷酸化信号的3'转录非翻译区。

本发明的一种或多种基因构建体也可进一步包括增强子，可视需要为翻译或转录增强子。增强子可以位于被转录的序列的5'或3'。增强子区为本领域中熟知的，并且可包括ATG起始密码子、邻近序列等。起始密码子，如果存在，可以与编码序列的阅读框同相("框内")，从而提供转录序列的正确翻译。

使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等可以将本发明的构建体引入植物细胞。此类技术的综述例如见Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,AcademyPress,New York VIII,pp.421-463(1988)；Geierson and Corey,PlantMolecular Biology,2d Ed.(1988)；以及Miki and Iyer,Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In Plant Metabolism,2d Ed.DT.Dennis,DHTurpin,DD Lefebrve,DB Layzell(eds),Addison Wesly,Langmans Ltd.London,pp.561-579(1997)。其他方法包括直接DNA摄取、脂质体使用、电穿孔(例如使用原生质体)、微注射、微粒或晶须和真空导入。例如见Bilang,et al.(Gene 100:247-250(1991),Scheid et al.(Mol.Gen.Genet.228:104-112,1991),Guerche et al.(Plant Science 52:111-116,1987),Neuhauseet al.(Theor.Appl Genet.75:30-36,1987),Klein et al.,Nature 327:70-73(1987)；Howell et al.(Science 208:1265,1980),Horsch et al.(Science 227:1229-1231,1985),DeBlock et al.,Plant Physiology 91:694-701,1989),Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.,Academic Press Inc.,1988),Methods in Plant Molecular Biology(Schulerand Zielinski,eds.,Academic Press Inc.,1989),Liu and Lomonossoff(JVirol Meth,105:343-348,2002)，美国专利4,945,050号；5,036,006号；和5,100,792号,1995年5月10日提交的美国专利申请08/438,666号,和1992年9月25日提交的07/951,715号(通过引用将所有文献并入本文)。

瞬时表达

不希望受理论约束，不同小核糖核酸病毒结构蛋白、小核糖核酸病毒多蛋白和/或蛋白酶的蛋白浓度和比率对PVLP的组装效率是重要的。因此，多样性和感染时间对控制植物中的蛋白浓度和VLP总体组装效率是重要的。

本发明的构建体可在植物、植物的部分或植物细胞中瞬时表达。依赖于重组多蛋白经由根瘤农杆菌导入而在植物、植物的部分或植物细胞中的表染色体表达的瞬时表达系统可用于靶向于各种细胞室或亚室表达小核糖核酸病毒结构蛋白、小核糖核酸病毒多蛋白和/或蛋白酶。瞬时表达系统允许高的产生速率。此外，在重组农杆菌导入植物后几天内，可以获得大量蛋白(Rybicki,2010；Fischer et al.,1999)。表达长的基因序列和使多个基因同时表达在相同细胞中也是可能的，这允许有效组装多亚基蛋白(Lombardi et al.,2009)。

然而，在瞬时表达期间，转录后基因沉默可能限制异源蛋白在植物中的表达。沉默阻抑基因(例如但不限于来自于番茄斑点枯萎病毒的Nss)的共表达可用于对抗转基因mRNA的特异性降解作用(Brigneti et al.,1998)。可选的沉默阻抑基因为本领域中熟知的，并且可如本文所述的使用(Chiba et al.,2006,Virology 346:7-14；通过引用将其并入本文)，例如但不限于HcPro、TEV-p1/HC-Pro(烟草蚀纹病毒-p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的p19(TBSV p19)、番茄皱纹病毒的衣壳蛋白(TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯病毒X的p25(PVX-p25)、马铃薯病毒M的p11(PVM-p11)、马铃薯病毒S的p11(PVS-p11)，蓝莓枯黄病毒的p16、(BScV–p16)、柑橘衰退病毒的p23(CTV-p23)，葡萄卷叶伴随病毒-2的p24(GLRaV-2p24)、葡萄病毒A的p10(GVA-p10)、葡萄病毒B的p14(GVB-p14)，独活潜伏病毒的p10(HLV-p10)或大蒜常见潜伏病毒的p16(GCLV-p16)。因此，沉默阻抑基因，例如HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10，可随同一种或多种小核糖核酸病毒结构蛋白、小核糖核酸病毒多蛋白和/或蛋白酶共表达，从而进一步地确保蛋白在植物、植物的部分或植物细胞中高水平的产生。

本发明也提供了上文所述方法，其中额外的(第三)核苷酸序列在植物中表达，编码沉默阻抑基因的额外的(第三)核苷酸序列与植物中有活性的额外的(第三)调节区可操作地连接。例如，编码沉默阻抑基因的核苷酸序列可为Nss、HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10。

如下文所述，瞬时表达方法可用于表达本发明的构建体(见Liu andLomonossoff,2002,Journal of Virological Methods,105:343-348；通过引用将其并入本文)。可选地，可使用如Kapila et al.,1997(通过引用将其并入本文)所述的基于真空的瞬时表达方法。例如，这些方法可包括但不限于，农业接种或农业导入、注射导入的方法，然而，也可使用上文所述其他瞬时方法。利用农业接种、农业导入或注射导入，包含期望的核酸的农杆菌的混合物进入组织(例如叶子\植物的地上部分(包括茎、叶子和花)，植物的其他部分(茎、根、花)或植物整体)的细胞间隙。穿过表皮后，农杆菌感染并转移t-DNA拷贝到细胞中。t-DNA被游离基因转录并且mRNA被翻译，引起感兴趣的蛋白在感染细胞中产生，然而，t-DNA在细胞核内的传代是瞬时的。

本发明的一部分也考虑包含本发明的核酸或一种或多种基因构建体的转基因植物、植物细胞或种子。从植物细胞再生全植物的方法为本领域中熟知的。通常，在适当的培养基中培养转化的植物细胞，培养基可包含诸如抗生素的选择剂，其中选择标记用于方便鉴定稳定转化的植物细胞。为帮助鉴定稳定转化的植物细胞，可进一步地操控本发明的构建体来包括植物选择标记。有用的选择标记包括提供化学品(诸如抗生素，例如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素，或除草剂，诸如草胺膦、草甘膦、氯磺隆等)抗性的酶。相似地，可使用通过提供颜色改变(诸如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或发光(诸如荧光素酶或GFP)可鉴定化合物产生的酶。一旦愈合组织形成，通过根据已知的方法应用适当的植物激素可以促使发芽，并将嫩芽转移到用于植物再生的生根培养基。然后，植物可用于建立重复传代，从种子开始或使用无性繁殖技术。不使用组织培养物也可以产生转基因植物。

扩增元件

例如，通过在用于驱动多蛋白和蛋白酶表达的核酸序列中使用不同的调节元件或调节元件的组合，可以改变多蛋白与蛋白酶的比率。例如，第一集合或组合的调节元件可用于调节第一核酸的复制、转录或其组合，第二集合或组合的调节元件可用于调节第二核酸的复制、转录或其组合，使得实现第一核酸和第二核酸的差异表达，从而调节多蛋白:蛋白酶的体内比率。例如，按照非限制的形式，第一集合或组合的调节元件可包括扩增元件(例如获取自BeYDV的元件)，而该扩增元件(例如获取自BeYDV的那些)可以不存在于第二集合或组合的调节元件。可选地，第二集合可包括扩增元件(例如获取自BeYDV的元件)，而该扩增元件可以不存在于第一集合或组合的调节元件。

“表达盒”指的是包含感兴趣的核酸的核苷酸序列，感兴趣的核酸受控于并且可操作地(或操作地)于合适的启动子或其他用于在宿主细胞中转录感兴趣的核酸的调节元件。

本文所述的表达系统可包含基于二分(bipartite)病毒或带有二分基因组的病毒的表达盒。例如，二分病毒可为豇豆镶嵌病毒科(Comoviridae)。豇豆镶嵌病毒科的属包括豇豆花叶病毒属、线虫传多面体病毒属(Nepovirus)、蚕豆病毒属(Fabavirus)，樱桃锉叶病毒属(Cheravirus)和缩病毒属(Sadwavirus)。豇豆花叶病毒属包括豇豆花叶病毒(CPMV)、豇豆重花叶病毒(CPSMV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、红色苜蓿斑点病毒(RCMV)、豆荚斑驳病毒(BPMV)、萝卜轮点病毒(TuRSV)、蚕豆真花叶病毒(BBtMV)、蚕豆染色病毒(BBSV)、小萝卜花叶病毒(RaMV)。包含对本发明的各方面有用的增强子元件的豇豆花叶病毒RNA-2序列的实例包括但不限于：CPMV RNA-2(GenBank登录号NC_003550)，RCMVRNA-2(GenBank登录号NC_003738)，BPMV RNA-2(GenBank登录号NC_003495)，CPSMV RNA-2(GenBank登录号NC_003544)，SqMVRNA-2(GenBank登录号No.NC_003800)，TuRSV RNA-2(GenBank登录号NC_013219.1)，BBtMV RNA-2(GenBank登录号GU810904)，BBSVRNA2(GenBank登录号FJ028650)，RaMV(GenBank登录号NC_003800)。

二分豇豆花叶病毒RNA基因的区段被称为RNA-1和RNA-2。RNA-1编码参与复制的蛋白，而RNA-2编码细胞到细胞移动所必需的蛋白和两个衣壳蛋白。可使用任何合适的基于豇豆花叶病毒的盒，包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，例如，表达盒可基于CPMV。

表达系统也可包含来自于双生病毒的扩增元件，例如，来自于大豆黄萎病病毒(BeYDV)的扩增元件。BeYDV属于适应于双子叶植物的玉米线条病毒属。BeYDV为具有单链环状DNA基因组的单分体，并且通过滚环机制可以复制到非常高的拷贝数。BeYDV衍生的DNA复制子载体系统已用于在植物中快速高产率的蛋白产生。

本文所用的短语“扩增元件”指的是包含双生病毒基因组的一种或多种长基因间隔区(LIR)的至少一部分的核酸区段。本文所用的“长基因间隔区”指的是包含rep结合位点的、能够通过双生病毒Rep蛋白介导切除和复制的长基因间隔区的区域。在一些方面，包含一种或多种LIR的核酸区段还可以包含双生病毒基因组的短基因间隔区(SIR)。本文所用的“短基因间隔区”指的是互补链(玉米线条病毒的短IR(SIR))。本文可使用任何合适的双生病毒衍生的扩增元件。例如见WO2000/20557；WO2010/025285；Zhang X et al.(2005,生物技术与生物工程,Vol.93,271-279),Huang Z etal.,(2009,生物技术与生物工程,Vol.103,706-714),Huang Z.et al.,(2009,生物技术与生物工程,Vol.106,9-17)；通过引用将其并入本文)。

调节元件

本发明还涉及包含与植物中起作用的调节元件可操作地连接的编码上文所述的多蛋白(诸如一种或多种小核糖核酸病毒蛋白或蛋白酶，例如但不限于小核糖核酸病毒蛋白酶)的核酸的基因构建体。

本申请中术语"调节区"、"调节元件"或"启动子"的使用意图反映核酸的一部分，通常但不一定位于基因的蛋白编码区上游，其可由DNA或RNA组成、或由DNA和RNA两者组成。当调节区被激活，并且与感兴趣的基因操作关联中或可操作地连接时，这可导致感兴趣的基因的表达。调节元件可以能够介导器官特异性或控制发育性或时间性基因激活。"调节区"可包括启动子元件、展示基础启动子活性的核心启动子元件、可响应于外部刺激诱导的元件、介导启动子活性的元件，诸如负调节元件或转录增强子。本文所用的"调节区"也可包括转录后有活性的元件，例如，调节基因表达的调节元件，诸如翻译增强子和转录增强子、翻译和转录阻抑子、上游激活序列和mRNA不稳定性决定子。这些后者元件中的几种可位于编码区附近。

根据本发明可使用的植物细胞中起作用的调节元件的实例包括但不限于，质体蓝素调节区(美国7,125,978号；通过引用将其并入本文)，或核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的调节区(RuBisCO；美国4,962,028号；通过引用将其并入本文)，叶绿素a/b结合蛋白(CAB；Leutwiler et al.,；1986；通过引用将其并入本文)，ST-LS1(与光系统II的放氧复合体有关并且如Stockhaus et al..1987,1989所述；通过引用将其并入本文)。

在本申请的上下文中，术语"调节元件"或"调节区"通常指的是DNA序列，通常但不一定位于结构基因的编码序列的上游(5')，其通过提供对RNA聚合酶和/或在特定位点开始转录所需的其他因子的识别，控制编码区的表达。然而，应理解的是，位于内含子内或序列的3'的其他核苷酸序列也可以贡献于调节感兴趣的编码区的表达。提供对RNA聚合酶或确保在特定位点启动的其他转录因子的识别的调节元件的实例为启动子元件。大多数真核启动子元件包含TATA盒，但不是所有，TATA盒为由腺苷和胸腺嘧啶核苷酸碱基对组成的保守核酸序列，通常位于转录起始位点的上游约25个碱基对。启动子元件包含负责转录启动的基础启动子元件，以及修饰基因表达的其他调节元件(如上文所列)。

有几种类型的调节区，包括发育调节型、诱导型或组成型。发育调节型调节区或控制在它的控制下的基因差异表达的调节区在某些器官或器官的组织内、在该器官或组织的发育期间特定的时间活化。然而，在一些发育调节型调节区可以优先地在某些器官或组织内、在特定的发育阶段活化，它们也可以发育调节的方式活化或在植物中的其他器官或组织中处于基础水平。组织特异型调节区的实例，例如种子特异型调节区，包括油菜籽蛋白启动子，和十字花科植物启动子(Rask et al.,1998,J.PlantPhysiol.152:595-599；Bilodeau et al.,1994,Plant Cell 14:125-130)。叶子特异型启动子的实例包括质体蓝素启动子(见美国7,125,978号,通常引用将其并入本文)。

诱导型调节区为能响应于诱导物而直接地或间接地激活一种或多种DNA序列或基因的转录的调节区。在诱导物不存在时，DNA序列或基因不会发生转录。通常，与诱导型调节区特异地结合从而激活转录的蛋白因子可以以失活形式存在，然后由诱导物直接地或间接地转换为活性形式。然而，蛋白因子也可不存在。诱导物可以为化学剂，诸如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐、或有毒元素直接赋予或通过病原体或致病剂(诸如病毒)的作用间接赋予的生理应激。通过向细胞或植物外部施加(诸如通过喷洒、浇水、加热或相似的方法)诱导物，包含诱导型调节区的植物细胞可暴露于诱导物。诱导型调节元件可来源于植物或非植物基因(例如Gatz,C.和Lenk,LR.P.,1998,Trends Plant Sci.3,352-358；通过引用将其并入本文)。可能的诱导型启动子的实例包括但不限于，四环素诱导型启动子(Gatz,C.,1997,Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.BioI.48,89-108；通过引用将其并入本文)，类固醇诱导型启动子(Aoyama.T.and Chua,N.H.,1997,Plant 1.2,397-404；在此通过引用将其并入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter,M.G et al.,1998,Plant 10urnal 16,127-132；Caddick,M.X et al.,1998,Nature Biotech.16,177-180,通过引用将其并入本文)、细胞分裂素诱导型IB6和CKI 1基因(Brandstatter,I and K.ieber,1.1.,1998,Plant Cell 10,1009-1019；Kakimoto,T.,1996,Science 274,982-985；通过引用并入本文)和植物生长素诱导型元件DR5(Ulmasov,T et al.,1997,Plant Cell 9,1963-1971；通过引用将其并入本文)。

组成型调节区在植物的各个部分并且贯穿植物发育连续地指导基因表达。已知的组成型调节元件的实例包括CaMV 35S转录物相关的启动子(Odell et al.,1985,Nature,313:810-812)，水稻肌动蛋白1(Zhang et al.,1991,Plant Cell,3:1155-1165)，肌动蛋白2(An et al.,1996,Plant J.,10:107-121)，或tms 2(美国5,428,147号,通过引用将其并入本文)，磷酸丙糖异构酶1(Xu et al.,1994,Plant Physiol.106:459-467)基因，玉米泛素1基因(Cornejo et al.,1993,Plant Mol.BioI.29:637-646)，拟南芥泛素1和6基因(Holtorf et al.,1995,Plant Mol.BioI.29:637-646)，烟草翻译起始因子4A基因(Mandel et al.,1995,Plant Mol.BioI.29:995-1004)。

本文所用的术语"组成型"不是必然指基因在组成型调节区控制下在所有细胞类型中以相同水平表达，而是指基因在多种细胞类型中表达，虽然经常观察到丰度的改变。组成型调节元件可与其他序列连接，从而进一步地增强与它们可操作地连接的核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，CPMV-HT系统来源于豇豆花叶病毒(CPMV)的非翻译区，并且展示了相关编码序列增强的翻译。"天然"意指核酸或氨基酸序列为天然存在的，或"野生型"。"可操作地连接"意指具体序列(例如调节元件和感兴趣的编码区)直接地或间接地相互作用从而实现预期的功能，诸如基因表达的介导或调节。例如，可操作地连接的序列的相互作用可以通过与可操作地连接的序列相互作用的蛋白所介导。

例如，通过使用调节元件、扩增元件和/或增强子，可进一步地改变多蛋白与蛋白酶的比率。例如，第一核酸可包含调节元件、扩增元件和/或增强子。第二核酸可以包含或可以不包含相同组合的调节元件、扩增元件和/或增强子。

例如，不同的启动子可用于驱动多蛋白与蛋白酶之间的体内差异表达。例如，第一集合或组合的调节元件可包括诱导型启动子，而第二集合或组合的调节元件中的启动子可为组成型的，或第二集合或组合的调节元件可包含诱导型启动子，而第一集合或组合的调节元件中的启动子可为组成型的。第一和第二集合或组合的调节元件之间的启动子强度也可以是不同的，从而实现多蛋白与蛋白酶之间的体内差异表达。

以下实施例中进一步地展示了本发明。

实施例1表达EV71

基因合成

使用编码EV71结构蛋白P1和蛋白酶3CD的DNA区段。GenBank中P1和3CD的候选序列是可利用的。这些序列的非限制性实例为：

对P1氨基酸序列而言：氨基酸序列GenBank登录号ADG57603(氨基酸1-862)(SEQ ID NO:5)；核苷酸序列：GenBank登录号GQ279369(核苷酸743-3328)(SEQ ID NO:6)；

对3CD(HK08株)而言：氨基酸序列：GenBank登录号ADG57603(氨基酸1549-2193)(SEQ ID NO:1)；核苷酸序列：GenBank登录号GQ279369(核苷酸5386-7321)(SEQ ID NO:2)；

对3CD(GDFS08株)而言：氨基酸序列GenBank登录号ACI25378(氨基酸1549-2193)(SEQ ID NO:3)；核苷酸序列：GenBank登录号FJ194964(核苷酸5387-7321)(SEQ ID NO:4)。

合成两个P1基因。使用野生型序列产生第一个，而第二个是基于使用本领域中已知的标准方法确定的优化序列(人密码子利用)。基于野生型序列合成两个3CD基因。通过Invitrogen^TM(以前)合成3个野生型基因，并且通过DNA2.0优化和合成优化P1基因。

分子克隆

合成的基因被克隆到植物表达载体中。选择的载体组分包括来自于基于豇豆花叶病毒(CPMV)的盒或苜蓿质体蓝素基因的转录和翻译调节元件。在我们的平台上已经成功地使用两种调节元件获得了重组蛋白的高表达。另一元件为来自于大豆黄萎病双生病毒(BeYDV)的DNA扩增元件，其可以整合到我们的植物表达载体。它已经对于一些候选者引起蛋白表达的极大增加。因此，在用或不用DNA扩增元件的情况下，我们每个基因构建体克隆在表达载体中。表1呈现了为这个项目配置的植物表达盒。

表达分析-选择最佳重组基因构建体

每一表达盒被克隆到质粒载体，然后将质粒载体转移到根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。通过引起DNA构建体的可移动DNA拷贝向植物细胞转移的转基因农杆菌接种体的真空导入启动瞬时表达。通过农杆菌接种体的混合的导入(共导入)进行多组分的瞬时表达(共表达)。因为被引入植物的一种组分为结构性的(P1)，和第二组分3CD蛋白酶的底物，所以两种组分的表达水平得到调节。通过使用不同的启动子，强度可变的DNA扩增系统，通过在导入时改变每一接种体(P1和3CD)的相对丰度或以上的组合，完成这个过程。

根据单独表达P1能力以及当与载体1310-1318组合时，产生高水平的蛋白水解片段VP1-4的能力，筛选表达载体1300-1308。因为只有抗VP1抗体是可利用的(Abnova,MAB1255-M05)，所以通过VP1的累积和未加工P1的消失监测蛋白水解片段的累积。如图2中所示，单独P1的表达(载体号1300)引起具有对应于未加工的结构蛋白的分子量(98kDa)的明显分子量的含有VP1的产物累积，这指示植物蛋白酶不能切割P1，从而产生病毒衣壳蛋白。然而，当P1与3CD共表达时(载体号1300+1310和1300+1315)，98kDa信号完全地消失，并且检测到对应于VP1分子量(33.5kDa)的新产物。该结果显示，病毒蛋白酶在植物中产生，并且有高度活性，它在植物细胞中识别和切割它的共生底物从而产生EV71衣壳蛋白。

获得的结果指示，植物中VP1累积的水平受到含有P1蛋白的农杆菌与含有3CD蛋白酶的农杆菌的比率的影响，含有3CD蛋白酶的农杆菌的比例越低，获得的累积越高(图2:比较1300+1315(4:2),1300+1315(4:1)和1300+1315(4:0.5))。3CD的来源，不论是HK08还是GDFS08，也影响植物中VP1的累积水平(图2:1300+1310(4:0.5)相对于1300+1315(4:0.5))。最终，观察到的是，从包含DNA扩增元件的表达载体获得了最高的VP1累积水平(图2:1301+1311(4:2))。

在下列的实验中，将P1保持在CPMV-HT+BeYDV(1301)的控制下，同时在导入时以不同的稀释度共转化不同的3CD表达盒。使用抗VP1单克隆抗体在来自于转化的植物的粗蛋白提取物上进行的Western印迹指示，在一系列P1与蛋白酶比率和构建组分中观察到VP1累积。导致最高水平的VP1累积的载体组合为1301+1310，其在细菌悬液中农杆菌株浓度的比率4:0.5(结构蛋白:蛋白酶)(图3)。

VLP形成的分析

使用浓缩提取物的尺寸排阻色谱(SEC)评估VP1向VLP的合并。通过高速离心(75000x g，20分钟)，从粗的澄清提取物浓缩胶粒。洗涤沉淀，并且再悬浮于1/6体积的再悬浮缓冲液(50mM PBS pH 7.4,150mMNaCl)中，并且加载到Sephacryl S-500凝胶过滤柱。用再悬浮缓冲液洗脱柱，并且通过SDS-PAGE和Western印迹表征洗脱组分。

来自于用1301+1310(4:0.5)瞬时转化的植物的蛋白提取物经过SEC分离，并且通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和抗VP1Western印迹分析洗脱组分。图4A中呈现结果显示，大部分宿主蛋白洗脱自柱的后期组分，峰值在组分16，同时在较早期的组分中发现VP1特异信号，峰值在组分12，其中发现非常少量的宿主蛋白。VP1是相对小的蛋白，如果其没有并入到高分子量的结构，则预期它与大多数宿主蛋白一起从柱洗脱。因此，观察到的VP1洗脱谱有利地表明，VP1已并入到高分子量的结构。Western印迹和考马斯亮蓝染色的凝胶的组合也提示，图4A中考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE中箭头所鉴定的高丰度蛋白为VP1。

将来自于这一实验的洗脱组分12的样品送往Armand-Frappier研究所(IAF,Laval,Québec)，通过透射电子显微镜法(TEM)分析。用3％磷钨酸负染色后，检测样品。图4B显示，洗脱组分12中观察到在大小和外形方面与EV71感染的Vero细胞培养物中发现的空的EV71颗粒(Liu et al.,PLoS ONE 6,e20005)相同的30nm球形颗粒。这一结果指示，VP1并入的高分子量结构确实为EV71VLP。

部分纯化

研发VLP表达筛选平台的VLP纯化方法，用于从转化的植物生物质中纯化包膜的VLP(140nm直径)。该方法使用细胞壁的酶消化，用于释放细胞外的和胞质的内容物，并且将所获得提取物进行深过滤和微过滤，然后在16000g离心6小时，从而沉淀VLP。将沉淀再悬浮在1/60体积的再悬浮溶液(100mM Na/KPO4pH 7.4,150mM NaCl,0.01％吐温-80)并且无菌过滤(0.2μm)。

测试VLP表达纯化方法的浓缩30nm无包膜的EV71VLP的能力。该纯化方法应用于表达载体1301+1310(4:0.5)转化的植物。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE和抗VP1Western印迹分析得到的产物(图5A)。纯化产物的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析显示，存在对应于EV71外壳蛋白的分子量的蛋白(箭头所示,图5A,右图)。通过Western印迹确认VP1的身份(图5A,左图)。对其他衣壳蛋白而言，鉴定是基于估算的分子量，VP0：37.5kDa，VP3：26.5kDa。VP4和VP2预期以未切割的VP0的形式存在，因为在病毒颗粒的形成中VP4和VP2之间的切割仅发生病毒RNA内化后。纯化产物的透射电子显微镜分析显示了高丰度的30nm球状结构，大小和形状对应于EV71VLP(图5B)。

表达方面的结论

证明基于植物的瞬时表达平台产生所进行的工作得到下列结论：

在系统中有效地产生EV71P1和3CD蛋白

3CD在植物中是有活性的，并且正确地将P1加工为衣壳蛋白

EV71衣壳蛋白组装为VLP

EV71VLP为可提取的，并且可以从植物生物质中完整纯化。

实施例2-脊髓灰质炎病毒表达

基因合成

可以使用编码来自于人肠病毒C血清型PV-1的脊髓灰质炎病毒(PV)结构蛋白P1和蛋白酶3CD的DNA区段。GenBank中P1和3CD的候选序列是可利用的。这些序列的非限制性实例为：

对P1而言：氨基酸序列GenBank登录号NP_041277(氨基酸1-881)(SEQ ID NO:10)；核苷酸序列：GenBank登录号NC_002058(核苷酸743-3385)(SEQ ID NO:9)；

对3CD而言：氨基酸序列GenBank登录号NP_041277(氨基酸1566-2209)(SEQ ID NO:8)；核苷酸序列：GenBank登录号NC_002058(核苷酸5438-7369)(SEQ ID NO:7)。

合成两个P1基因。使用野生型序列产生第一个，而第二个可以基于使用本领域中已知的标准方法确定的优化序列(人密码子利用)。基于野生型序列合成3CD基因。可以通过Invitrogen^TM(以前)合成野生型基因(P1和3CD)，并且通过DNA2.0优化和合成优化P1基因。

分子克隆

可以将合成的基因克隆到植物表达载体中。选择的载体组分包括来自于基于豇豆花叶病毒(CPMV)的盒或苜蓿质体蓝素基因的转录和翻译调节元件，因为已成功地使用两种调节元件获得了重组蛋白的高表达。来自于大豆黄萎病双生病毒(BeYDV)的DNA扩增元件也可以整合到植物表达载体。在用或不用DNA扩增元件的情况下，将每个基因构建体克隆在表达载体中。表2提供了可以组装的植物表达盒。

表2.用于本生烟草中PV结构蛋白P1和蛋白酶3CD的表达的植物表达盒

表达分析-选择最佳重组基因构建体

每一表达盒可以被克隆到质粒载体，然后将质粒载体转移到根瘤农杆菌。可以通过引起DNA构建体的可移动的DNA拷贝转移到植物细胞的转基因农杆菌接种体的真空导入，启动瞬时表达。可以通过农杆菌接种体的混合的导入(共导入)完成多组分的瞬时表达(共表达)。因为被引入植物的一种组分为结构性的(P1)，第二组分3CD蛋白酶的底物，所以可以调节两种组分的表达水平。可以通过使用不同的启动子、强度可变的DNA扩增系统、通过在导入时改变每一接种体(P1和3CD)的相对丰度或以上组合，进行这个过程。

首先，可以根据单独表达P1能力，以及当与3CD载体组合时产生高水平的蛋白水解片段能力，筛选P1表达载体。可以通过未加工的VP1的消失监测蛋白水解片段的累积。病毒蛋白酶被证实在植物中产生，并且有高度活性，以及它能在植物细胞中识别和切割它的共生底物，从而产生PV衣壳蛋白。

植物中蛋白水解片段的累积水平可以受到含有P1蛋白的农杆菌与含有3CD蛋白酶的农杆菌的比率的影响，含有3CD蛋白酶的农杆菌的比例越低，获得的累积越高。对于DNA扩增元件的存在和不同的调节元件在P1加工和蛋白水解片段累积方面进行了观察。

VLP形成分析

可以使用浓缩提取物的尺寸排阻色谱(SEC)评估VP1向VLP的并入。可以通过高速离心从粗的澄清提取物浓缩胶粒。洗涤沉淀，并且再悬浮在1/6体积的再悬浮缓冲液中，并且加载到凝胶过滤柱。可以用再悬浮缓冲液洗脱柱，并且通过SDS-PAGE和Western印迹表征洗脱组分。

来自于瞬时转化的植物的蛋白提取物可以进行SEC分离，并且通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析洗脱组分。结果显示，大部分宿主蛋白洗脱自柱后期组分，而在较早期的组分中可以发现VP1特异性信号。VP1是相对小的蛋白，如果VP1没有并入到高分子量的结构，那么预期它与大部分宿主蛋白一起从柱洗脱。因此，观察到的VP1洗脱谱可以有力地证明，VP1已并入高分子量的结构。Western印迹和考马斯亮蓝染色的凝胶的组合也提示，考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE观察到的高丰度蛋白为VP1。

将来自于这一实验的样品送往Armand-Frappier研究所(IAF,Laval,Québec)，通过透射电子显微镜法(TEM)分析。结果指示，VP1并入的高分子量结构为真正的PV VLP。

部分纯化

研发VLP表达筛选平台的VLP纯化方法，用于从转化的植物生物质中纯化包膜的VLP(140nm直径)。该方法使用细胞壁的酶消化，用于释放细胞外的和胞质的内容物，将获得的提取物进行深过滤和微过滤，然后离心而使VLP成沉淀。将沉淀再悬浮在再悬浮溶液中并且无菌过滤。

可以测试VLP表达纯化方法的浓缩无包膜的PV VLP能力。纯化产物的考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析可以显示对应于PV外壳蛋白分子量的蛋白的存在。衣壳蛋白的鉴定可基于它们估算的分子量。

实施例3-纯化

使用机械提取技术，或如WO 2011/035422号和PCT/CA2012/050180(通过引用将它们并入本文)中所述的细胞壁的酶学降解，进行蛋白提取。酶学提取比机械提取有利在于，它能实现产物释放增加，而污染植物蛋白的释放最小，得到的提取物中的主要数污染物是用于细胞壁破坏的酶，使用足够的后续下游步骤可以将其除去。

机械提取物或酶解提取物经过离心从而消除细胞碎片、农杆菌、DNA和较大的颗粒。然后，经过离心的提取物经过过滤步骤，进行过滤步骤是为了除去悬浮液中的固体、减少生物负载、并且在下游加工之前稳定和调整提取物。尽管在缺少定量测定时不能评估滤出物中EV71VLP的回收，但是Western印迹指示过滤步骤期间的VLP损失非常小。将得到的澄清的提取物使用正切流动过滤(TFF)进一步加工或在适合的情况下，直接加载到色谱分析介质。

VLP的大小使得能够使用TFF有效地和选择性地去除澄清的提取物中存在的可溶的蛋白，包括用于细胞壁解聚的酶。TFF步骤也能浓缩VLP，并且实现在用于色谱分析准备中的缓冲液交换。

评估几种色谱分析方法(阴离子交换、阳离子交换、疏水性相互作用色谱分析(HIC)和伪亲和力)、模型(结合或流通)和缓冲条件(pH 5-8，导电性10-80mS/cm)的增加纯度和减少受到污染DNA和内毒素，同时保留VLP期望的特征的能力。我们已发现，在某些条件下，流通模式中所用的(弱阴离子交换树脂)可以提供最有效率的从浓缩的EV71VLP除去DNA和内毒素。

在EV71VLP纯化过程中中，色谱分析后添加第二TFF步骤。该TFF步骤的作用为在期望的缓冲液中浓缩和配制产物。基于第一TFF鉴定的参数，确定第二TFF步骤的孔径和操作条件。最终，在0.22-μm过滤后，获得具有明显浓缩的纯EV71颗粒的药物物质。在含有0.01％聚山梨醇酯80的PBS中配制产物。

VLP表征

利用上文所述的适合的过程产生第一批EV71VLP(批号479-23-018)并且充分表征产物(表3，批号479-23-018)。从考马斯亮蓝染色的凝胶扫描通过密度测定法检测纯度，其中仅在Western印迹(抗VP1-VP2)上显示阳性信号并且可通过质谱分析法进一步地确认的条带被认为是产物的一部分。产物质量图分析指示，制备物包含高纯度的EV71VLP。

表3.EV71VLP的质量属性，批号479-23-018.

*自单次运行计算的初步估计

通过电子显微镜进一步地分析产物确认，纯化的EV71VLP为完整的(图6A)，并且通过质谱分析法的胰蛋白酶映射确认产物的纯度。

实施例4–过程修改

通过HIC纯化带有完整VP1的VLP

在用以纯化EV71VLP的色谱分析方法的初步筛选期间，已注意到HIC树脂可以从包含片段化VP1的颗粒分离包含完整VP1的VLP。在某些条件下，当包含LMW VP1片段的颗粒与树脂强烈地结合时，完整的颗粒流穿柱。因此这一HIC步骤作为色谱分析随后的精制步骤插入。通过这一过程纯化的EV71颗粒大小均匀(光散射)，接近100％纯度，没有通过质谱分析法检测到蛋白污染物。这种产物(批号479-31-020)的产品质量属性提供在表3中的中间栏。

修改的提取程序

可以通过pH约5.2的酸化或通过热处理和通过离心消除凝固物，澄清植物提取物。热处理插入到机械提取和离心步骤之间。使用在60℃下热处理10分钟(pH 8.0)消除超过90％可溶蛋白，而不会在可检测的水平影响EV71VLP溶解度。当在这些条件下提取和澄清时，VP1保持完整。

对EV71VLP纯化过程，实施pH 8.0下的机械提取与基于热处理的澄清的组合来替代酶学提取。这一过程产生VLP批次(批号479-32-020)。产物特征提供在表4中(第3栏)。获得的结果显示，机械提取与基于热的蛋白澄清联合使用提供了与之前定义的下游步骤完全相当的有效率的初步回收步骤。由此得到的过程为高产率，并且产生98％纯的EV71VLP产物。自这一过程制备的EV71VLP的光散射图显示了高均匀性。这种产物的冷冻TEM分析确认了，颗粒具有EV71VLP的大小和形状(图8)。

表4.包括进行或不进行HIC的酶学提取或机械提取的过程产生的批次的EV71VLP特征的比较

*初步估算计算自每一过程的单次运行。

通过引用将所有引文并入本文。

参考一种或多种实施方案描述了本发明。然而，对本领域中技术人员明显的是，在不背离权利要求中所定义的本发明的范围的情况下，可以作出多种改变和修改。

Claims

1.在植物中产生小核糖核酸病毒样颗粒(PVLP)的方法，包括：

a)将第一核酸引入所述植物、所述植物的部分或植物细胞，所述第一核酸包含在所述植物中有活性的第一调节区，所述第一调节区与编码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的核苷酸序列可操作地连接；

b)将第二核酸引入所述植物、所述植物的部分或植物细胞，所述第二核酸包含在所述植物中有活性的第二调节区，所述第二调节区与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地连接；

c)在允许第一和第二核酸表达的条件下培养所述植物、所述植物的部分或植物细胞，从而产生PVLP。

2.如权利要求1中所述的方法，其中第一核酸相对于第二核酸的引入量的比为20:1至0.5:1。

3.如权利要求1中所述的方法，其中所述一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白为P1。

4.如权利要求1中所述的方法，其中所述一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白包含结构蛋白VP0、VP1、VP2、VP3、VP4或它们的组合。

5.如权利要求1中所述的方法，其中所述小核糖核酸病毒选自口蹄疫病毒(Aphthovirus)、禽肝炎病毒(Avihepatovirus)、心脏病毒(Cardiovirus)、肠病毒(Enterovirus)、马鼻病毒(Erbovirus)、肝病毒(Hepatovirus)、嵴病毒(Kobuvirus)、副肠孤病毒(Parechovirus)、萨佩洛病毒(Sapelovirus)、塞尼卡病毒(Senecavirus)、捷申病毒(Teschovirus)和震颤病毒(Tremovirus)。

6.如权利要求1中所述的方法，其中所述小核糖核酸病毒为肠病毒71或脊髓灰质炎病毒。

7.如权利要求1中所述的方法，其中所述蛋白酶为小核糖核酸病毒蛋白酶。

8.如权利要求7中所述的方法，其中所述蛋白酶为3CD蛋白酶。

9.如权利要求1中所述的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述核酸在所述植物中瞬时表达。

10.如权利要求1中所述的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述核酸在所述植物中稳定表达。

11.如权利要求1中所述的方法，还包括收获所述植物和纯化PVLP的步骤。

12.在植物、植物的部分或植物细胞中产生小核糖核酸病毒样颗粒(PVLP)的方法，包括：

a)提供植物、植物的部分或植物细胞，所述植物、植物的部分或植物细胞包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸包含在所述植物中有活性的第一调节区，所述第一调节区与编码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的第一核苷酸序列可操作地连接，所述第二核酸包含在所述植物中有活性的第二调节区，所述第二调节区与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷酸序列可操作地连接；

b)在允许所述核酸表达的条件下，培养所述植物、植物的部分或植物细胞，从而产生PVLP。

13.权利要求12中所述的方法，还包括收获所述植物和纯化PVLP的步骤。

14.通过权利要求1中所述的方法产生的PVLP。

15.组合物，其包含用于诱导个体中免疫应答的治疗有效量的权利要求14中所述的PVLP和药学上可接受的载体。

16.诱导个体中对小核糖核酸病毒感染的免疫力的方法，包括给予权利要求14中所述的PVLP。

17.如权利要求16中所述的方法，其中通过口服、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下的方式将PVLP给予个体。

18.利用权利要求14中所述的PVLP制备的多克隆抗体。

19.如权利要求1或12中所述的方法，其中所述第一核酸序列包含与一种或多种豇豆花叶病毒(comovirus)增强子、编码所述多蛋白的核苷酸序列和一种或多种扩增元件可操作地连接的第一调节区，并且编码复制酶的第三核酸被引入所述植物或植物的部分。

20.如权利要求1或12中所述的方法，其中所述第二核酸不包含一种或多种扩增元件或一种或多种豇豆花叶病毒增强子。