KR20150045896A - 가교결합에 의한 금속 단백질의 안정화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 금속 단백질을 안정화시키기 위해 고분자 나노섬유에 금속 단백질을 흡착시키고, 금속 단백질 간에 가교결합시켜 금속 이온이 단백질 외부로 빠져나가지 않도록 하여 금속 단백질의 촉매 활성을 장기간 유지할 수 있는 금속 단백질-고분자 나노섬유 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 금속 단백질-고분자 나노섬유 복합체 및 이의 제조방법은 금속 단백질끼리 응집체를 효율적으로 형성하여 같은 무게의 고분자 섬유에 많은 양의 금속 단백질 응집체가 집적이 가능하며, 외부의 환경변화에도 안정하다.
본 발명의 일 실시예로서 이산화탄소 전환 공정에서의 탄산무수화 효소의 효율성을 극대화할 수 있다. 또한 이산화탄소를 변환하여 원하는 곳에 저장이 가능하며, 이 이산화탄소를 이용하여 생성된 탄산칼슘은 시멘트의 주원료이고, 등의 각종 중화제 등 다양한 고부가가치 산업에 응용될 수 있다.

Description

가교결합에 의한 금속 단백질의 안정화 방법{Method for stabilizing metalloprotein via cross-linking}
본 발명은 가교결합에 의한 금속 단백질의 안정화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 금속 단백질 간에 가교결합이 형성되어 금속 단백질에서 이온이 탈리되지 않도록 함으로써 금속 단백질의 촉매 활성을 장기간 유지할 수 있는 금속 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다.
금속 단백질(metalloprotein)은 단백질 내에 금속 이온이 함유되어 있는 단백질로서, 생체 내에 존재하여 다양한 기능을 수행한다. 예로써, 헴(heme) 안의 철은 산화 및 환원(Fe2 + - Fe3 +)을 모두 수행할 수 있어 다양한 생물학적 기능을 수행하며, 헴 단백질(hemeprotein), 금속 효소(metalloenzyme) 등으로 구성되어 있다. 단백질 기능이 변하거나 소실되면 효소 기능이 무너진다. 효소 기능이 상실되면 생명 부지가 어렵다. 체내에 침투한 중금속은 단백질을 파고들어(결합) 단백질 고유 기능을 방해한다. 머리털이나 손발톱을 구성하는 케라틴, 산소를 운반하는 헤모글로빈, 뼈에 칼슘을 부착시키고 뼈를 구성하는 콜라겐 등도 모두 단백질이다. 헤모글로빈은 글로빈 단백질에 철분을 함유한다. 하지만 중금속, 수은이 철분을 몰아내고 그 자리를 차지하면 산소를 운반할 수 없다. 또한 콜라겐에 수은이 붙으면 뼈가 약해지고 쉽게 골절된다. 중금속이 효소 단백질과 결합하면 일꾼은 고유 기능을 상실한다. 따라서 금속단백질 내에 함유되어 있는 금속이 빠져나가게 된다면 금속단백질의 기능을 잃어버리기 때문에 큰 문제가 될 수 있다.
대표적 금속 단백질로 알려진 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase, CA)는 생물학적 이산화탄소 저감 기술에 사용될 수 있는 최적의 금속 단백질로 알려져 있다. 이 금속 단백질은 내부에 아연을 포함하고 있는데, 이산화탄소는 이 아연과 상호작용하여 매우 빨리 중탄산염 이온(HCO3 -)으로 전환된다. 탄산무수화 효소는 초당 106개의 이산화탄소 분자를 전환시키는데, 이는 이산화탄소의 공급이 충분하면 이론상으로 1 kg의 금속 단백질을 이용하여 시간당 4,600톤 이상의 이산화탄소를 전환시킬 수 있음을 의미한다. 전환된 중탄산염 이온은 다양한 용도로 응용이 될 수 있어 그 잠재적 가치가 매우 크다고 볼 수 있다. 탄산무수화 효소를 안정화시키게 되면 이산화탄소를 탄산칼슘(calcium carbonate)으로 전환하는 공정 개발이 가능하다. 안정화된 탄산무수화 효소에 의해 중탄산염 이온이 지속적으로 공급되면 이를 염화칼슘과 반응시켜 탄산칼슘을 만들 수 있게 된다. 탄산칼슘은 시멘트의 주원료이고, 등의 각종 중화제로 사용되고 있다.
금속 단백질은 상대적으로 고가의 촉매이므로 공정에서 사용 후 재사용하기 위해 일반적으로 담체에 고정화시킨다. 고정화된 금속 단백질은 촉매의 활성이 증대되고, 활성을 유지하면서 장기화가 가능하다. 따라서, 고정화 방법은 산업적인 생촉매로서의 금속 단백질의 사용에서 필수적인 요소라 할 수 있다. 나노 구조물을 이용한 일반적인 금속 단백질 고정화 방법으로서 효소 고정화 방법인 단순 흡착(adsorption)이나 공유결합을 이용한 금속 단백질 부착(covalent attachment)의 방법이 사용되고 있다. 나노 구조물이 제공하는 높은 표면적은 금속 단백질의 담지량을 높여주고, 또한 단위 무게당 금속 단백질의 활성을 높여주는 효과를 나타낼 수 있다. 그러나, 안정성 및 지속성에 있어서는 아직 많은 문제점들을 가지고 있다.
또한, 이러한 금속 단백질은 환경에 민감하여 작은 변화에도 금속 이온이 쉽게 빠져나가 그 기능을 다하지 못하는 문제점이 있었다.
이에 따라 본 발명자들은 금속 단백질을 안정화하여 촉매 활성이 높고, 금속 이온을 단백질 내에 저장하기 위한 방안을 창출하였다.
본 발명이 해결하려는 첫 번째 과제는 가교결합을 통하여 금속 단백질내 금속 이온이 탈리되는 것을 방지함으로써 금속 단백질을 안정화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하려는 두 번째 과제는 높은 촉매 활성을 나타내고, 사용 후에도 분리 및 재사용이 용이한 금속 단백질 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명의 제1 양태는 (a) 불용성 담체에 금속 단백질을 고정화시키는 단계; 및 (b) 상기 고정화된 금속 단백질 간에 가교결합을 형성시키기 위해 가교결합제를 첨가하는 단계를 포함하는 금속 단백질의 안정화 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계 후에, 상기 불용성 담체에 고정화된 금속 단백질을 석출시키기 위하여 상기 불용성 담체에 석출화제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계 후에, 첨가된 가교결합제 및/또는 석출화제를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 양태는 상기 방법에 의해서 안정화된 금속 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명의 제3 양태는 불용성 담체; 및 상기 불용성 담체에 고정화된 금속 단백질을 포함하고, 상기 금속 단백질 간에 가교결합이 형성되어 금속 이온의 탈리를 방지하는 것을 특징으로 하는 가교결합된 금속 단백질 복합체를 제공한다.
상기 불용성 담체는 고분자 나노섬유, 탄소나노섬유, 세라믹 멤브레인, 활성탄, 실리카계 담체, 알루미나계 담체, 세라이트계 담체 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.
상기 고분자 나노섬유는 폴리(스티렌-co-무수말레산), 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리비닐알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.
상기 금속 단백질은 탄산무수화 금속 단백질, 헴(heme) 단백질, 트랜스페린, 메탈로티오네인, 포름산탈수소효소, 포름알데히드탈수소효소, 알콜탈수소효소, 글리세롤탈수소효소, 질소고정화효소, 칼모듈린, 트로포닌, 펄프알부민 및 칼파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.
상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알코올, 아세톤, 폴리에틸렌글리콜, 암모늄 설페이트, 암모늄 설파이드, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것일 수 있다.
상기 가교결합제는 글루타르알데하이드, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상의 화합물일 수 있다.
본 발명의 가교결합을 통한 금속 단백질의 안정화 방법은 금속 단백질끼리 응집체를 효율적으로 형성함으로써 금속 이온이 단백질 밖으로 유출되지 않으며, 같은 무게의 담체에 많은 양의 금속 단백질 응집체가 집적이 가능하며, 외부의 환경 변화에도 안정하므로 촉매 활성 효율을 극대화할 수 있으며, 장기간 안정성을 유지할 수 있다.
도 1. 본 발명의 일 실시예에 따른 탄산무수화 효소-고분자 나노섬유 복합체의 제조방법에 관한 모식도이다.
도 2. 본 발명의 일 실시예에 따른 고정화된 탄산무수화 효소의 초기활성 및 안정성을 보여주는 그래프이다.
도 3. 본 발명의 일 실시예에 따른 고정화된 탄산무수화 효소 내 금속이온의 누출 방지에 따른 안정성을 보여주는 그래프이다.
도 4. 본 발명의 일 실시예에 따른 고정화된 탄산무수화 효소의 다양한 환경에서의 안정성을 보여주는 그래프이다. 도 4a는 바닷물 환경 내 교반 조건에서의 고정화된 금속단백질의 안정성을 보여주는 그래프이다. 도 4b는 바닷물 환경 내 이산화탄소 주입 조건에서의 고정화된 금속단백질의 안정성을 보여주는 그래프이다. 도 4c는 다양한 유사환경인 증류수, 수돗물, pH에 따른 고정화된 금속단백질의 안정성을 보여주는 그래프이다.
이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 금속 단백질의 고정화는 산업적인 생촉매로서의 금속 단백질의 사용에서 필수적인 요소라 할 수 있다. 일반적인 금속 단백질 고정화 방법으로는 효소 고정화 방법인 단순 흡착(adsorption)이나 공유결합 방법(covalent attachment)이 사용되고 있으나, 물질전달 저항으로 인한 촉매 반응의 효율성 저하 및 작용 부위의 불활성화 등 아직 많은 문제점들을 가지고 있다.
이에 본 발명에서는 (a) 불용성 담체에 금속 단백질을 고정화시키는 단계; 및 (b) 상기 고정화된 금속 단백질 간에 가교결합을 시키기 위해 가교결합제를 첨가하는 단계를 포함하는 금속 단백질의 안정화 방법을 제공한다. 이를 통해 종래 고정화된 금속 단백질에 비하여 단위 면적당 많은 양의 금속 단백질이 담체 표면에 고정화되고 상기 단백질로부터 금속 이온이 빠져나가는 것을 방지하여 금속 단백질의 기능을 오래 안정적으로 유지할 수 있다.
본 발명에 사용되는 금속 단백질은 탄산무수화 효소, 헴(heme) 단백질, 트랜스페린, 메탈로티오네인, 포름산탈수소효소, 포름알데히드탈수소효소, 알콜탈수소효소, 글리세롤탈수소효소, 질소고정화효소, 칼모듈린, 트로포닌, 펄프알부민 및 칼파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.
상기 담체는 불용성 담체로서, 고분자 나노섬유, 탄소나노섬유, 세라믹 멤브레인, 활성탄, 실리카계 담체, 알루미나계 담체, 세라이트계 담체 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있으며 이에 의해 한정되지 않는다.
상기 담체로서, 고분자 나노섬유는 폴리(스티렌-co-무수말레산), 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리비닐알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.
상기 가교결합제는 글루타르알데하이드, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상의 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 부착된 금속 단백질을 석출시키기 위하여 상기 불용성 담체에 석출화제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 석출화제로는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알코올, 아세톤, 폴리에틸렌글리콜, 암모늄 설페이트, 암모늄 설파이드, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 금속 단백질-고분자 나노섬유 복합체의 제조방법을 나타낸 모식도이다. 도 1을 살펴보면, 고분자 나노섬유에 탄산무수화 효소를 첨가하여 고분자 나노섬유 표면에 부착하는데 부착된 효소는 고분자 나노섬유 표면에 거의 단일층으로 존재한다. 이에 상기 부착된 효소를 석출시켜 수십 내지 수백 효소로 이루어진 집적체를 형성하도록 한다. 이 집접체는 단일층이 아니라 효소들이 가교결합을 통해 수십 내지 수백 층을 형성하므로 종래에 비하여 고분자 나노섬유 표면적 당 훨씬 많은 양의 효소가 고정될 수 있을 뿐 아니라, 더 단단히 고정되며, 오랜 시간이 경과한 후에도 효소 내 금속 이온이 빠져나가지 못하도록 한다.
또한 상기 (b)단계 이후에, 바람직하게는 상기 안정화된 금속 단백질을 수세하여, 첨가된 가교결합제 및/또는 석출화제를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 방법에 의해서 안정화된 금속 단백질을 제공한다. 상기 금속 단백질은 금속 단백질 본연의 성질 및 기능은 유지하면서 재사용이 가능하고, 저장성 및 안정성이 우수하여 이산화탄소 포집 기술, 바이오 의학 분야등에 적용이 가능할 것이다.
또한, 본 발명은 불용성 담체; 및 상기 불용성 담체에 고정화되어 있는 금속 단백질을 포함하고, 상기 금속 단백질 간에 가교결합이 형성되어 금속 이온의 탈리를 방지하는 것을 특징으로 하는 금속 단백질 복합체를 제공한다. 불용성 담체에 금속 단백질을 흡착 또는 공유결합 등을 통하여 고정화시키고, 다시 금속 단백질 간에 가교결합을 형성시켜 금속 단백질 내부에 있는 금속 이온이 금속 단백질 외부에 빠져나가지 못하도록 하여 금속 단백질의 기능 및 활성을 오래 유지하도록 한다. 따라서, 본 발명의 금속 단백질 복합체는 저장 및 재수득이 용이할 뿐만 아니라 금속 이온의 활성도 유지되어 촉매 활성도 감소되지 않아 고정화 되지 않은 금속 단백질과 동등한 효율을 가진다.
상기 담체는 불용성 담체로서, 고분자 나노섬유, 탄소나노섬유, 세라믹 멤브레인, 활성탄, 실리카계 담체, 알루미나계 담체, 세라이트계 담체 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있으며 이에 의해 한정되지 않는다.
상기 담체로서, 고분자 나노섬유는 폴리(스티렌-co-무수말레산), 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리비닐알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상일 수 있다.
상기 가교결합제는 글루타르알데하이드, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상의 화합물일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
재료의 준비
(1) 금속 단백질
고정화를 위한 금속 단백질은 소(bovine)에서 유래된 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase)를 사용하였다. 탄산무수화 효소는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
(2) 고분자 나노섬유 (polymer nanofiber)
본 발명에서는 담체로서 고분자 나노섬유를 사용하였다. 고분자 나노섬유를 만들기 위한 고분자는 PS(Polystyrene, molecular weight(MW) = 950,400) 와 폴리(스티렌-co-무수말레산)(Poly(styrene-co-maleic anhydride), PSMA, Mw = 224,000)을 사용하였고, 고분자를 녹이기 위한 유기용매는 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran, THF)과 아세톤(acetone)을 사용하였다. 이들 재료는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
(3) 버퍼(buffer) 및 화학 물질
버퍼는 인산염 버퍼(phosphate buffer, PB) 10, 100 mM, pH 7.6를 사용하였고, 탄산무수화 효소 코팅을 사용하기 위해 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 사용하였다. 탄산무수화 효소 코팅 후 고분자 나노섬유에 있는 무수말레산(maleic anhydride) 기를 막아주기 위해 트리스 버퍼(Tris buffer) 50mM, pH 7.6를 사용하였다. 탄산무수화 효소의 활성 및 물성 측정을 위해 반응기질로 파라 나이트로페닐 아세테이트(para-nitrophenyl acetate, NPA)를 사용하였다.
[실시예 2]
불용성 담체에 탄산무수화 효소의 고정화
(1) 전기방사 방법을 이용한 PS + PSMA 나노섬유의 준비 및 고분자 나노섬유의 알코올 처리
탄산무수화 효소 고정화를 위한 나노섬유는 폴리스티렌(polystyrene, PS)과 폴리(스티렌-co-무수말레산)(Poly(styrene-co-maleic anhydride), PSMA)를 사용하게 되는데, PSMA의 무수말레산(maleic anhydride)에 탄산무수화 효소의 아민(amine) 그룹과 공유결합으로 고정화된다. PS + PSMA 나노섬유의 생산방법은 다음과 같다. 상온에서 PS와 PSMA를 2 : 1 무게 비로 섞은 후 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF)에 녹인 후, 자성 교반기(magnetic stirrer)를 이용해 3시간 정도 섞어주었다. 그 후, 고분자 용액의 점성을 낮춰주기 위해 아세톤(acetone) 용액을 섞어준 후, 고분자 용액을 30 게이지 스테인레스 스틸 니들(gauge stainless steel needle)이 있는 5 mL 시린지(syringe)에 담았다. 전압의 운용 조건은 7 kV이며, 시린지 펌프(syringe pump)를 이용해 유속은 0.1 ml/hr로 진행하였다. 전기방사를 통해 나온 나노섬유는 깨끗한 알루미늄 호일에 모았다.
분산된 나노섬유를 만들기 위한 알코올 처리 과정은 다음과 같다. 50% v/v 알코올 용액(에탄올)이 들어있는 바이알(vial)에 나노섬유를 넣은 후, 200 rpm에서 10분간 쉐이킹(shaking) 시켰다. 나노섬유가 완전히 분산되면 용액 상에 알코올이 완전히 제거될 때까지 건조과정 없이 씻어주었다. 분산된 나노섬유는 탄산무수화 효소 고정화 전까지 버퍼 용액에 보관하였다.
(2) 불용성 담체를 이용한 공유결합된 효소 고정화
불용성 담체(고분자 나노섬유)를 이용한 금속 단백질(탄산무수화 효소) 고정화는 다음과 같은 2가지 종류를 이용해 진행되었다[알코올 처리된 나노섬유를 이용한 공유결합 효소 고정화 방법(CA-CA/EtOH-NF), 알코올 처리된 나노섬유를 이용한 효소 석출코팅 방법(EPC-CA/EtOH-NF)].
탄산무수화 효소 고정화를 위해 상기에서 제조한 분산된 나노섬유를 탄산무수화 효소용액(10 mg/ml, 50 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6))에 배양하였다. 탄산무수화 효소 용액과 나노섬유가 들어있는 바이알(vial)을 30분간 200 rpm으로 쉐이킹(shaking) 한 후, 탄산무수화 효소를 나노섬유에 공유결합을 이용해 고정화하기 위해 4℃ 에서 2시간 동안 배양하였다(CA-CA/EtOH-NF).
효소 석출 코팅(Enzyme precipitate coating of carbonic anhydrase, EPC-CA)의 합성을 위해서, 생촉매 나노섬유(CA-CA/EtOH-NF)에 45% 황화암모늄(ammonium sulfide)을 넣어 1시간 반응한 후, 가교결합제인 글루타르알데히드(glutaraldehyde) 용액(0.5% w/v)을 넣은 후, 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다(EPC-CA/EtOH-NF).
하룻밤 동안 배양한 생촉매 나노섬유(CA-CA/EtOH-NF, EPC-CA/EtOH-NF)는 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)로 씻어준 후, 나노섬유에 남아있는 반응하지 않은 알데히드(aldehyde)기을 막아주기 위해 100 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)을 이용해 30분 동안 쉐이킹(shaking) 시켰다. 이렇게 완성된 생촉매 나노섬유는 50 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)로 완전히 씻어준 후 4 ℃에 보관하였다.
[시험예 1]
안정화된 금속 단백질의 활성 및 안정성 측정
탄산무수화 효소 활성의 측정은 수용액 버퍼 내에서의 탄산무수화 효소의 반응기질인 파라 나이트로페닐 아세테이트(para-nitrophenyl acetate, NPA)의 가수분해를 통해 측정하였다. 활성측정을 위한 NPA 용액은 NPA를 용매인 아세토니트릴(10.9 mg/ml in acetonitrile)을 이용해 용해시킨 후, 이 용액을 50 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)을 이용하여 1/100로 희석시켜 사용하였다. 나노 구조물에 고정화된 효소의 경우에는 실시간으로 측정이 불가능하므로 20 mL의 NPA 용액에 생촉매 나노섬유를 넣어 200 rpm으로 반응시킨 후, 시간별로 1 mL씩 샘플을 취하여 측정하는 방법을 사용하였다. 그 후, 50 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 7.6)을 이용해 1/10로 희석한 후 생성물의 농도를 348 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하였다. 효소의 안정성 측정은 활성 측정후 고정화된 샘플은 200 rpm 교반조건에서 배양한 후, 시간에 따라 같은 샘플을 재사용하여 위와 같은 방법으로 활성을 측정하여 초기활성과 비교하였다.
초기 활성 측정 결과, 공유결합된 탄산무수화효소(CA-CA/EtOH-NF), 효소석출코팅된 탄산무수화효소(EPC-CA/EtOH-NF)의 초기 활성은 각각 0.23, 10.2 uM/min으로 측정되었다 (도 2). 즉, 같은 양의 나노섬유를 이용해 고정화하였을 때, 효소석출코팅에 의한 탄산무수화효소 고정화 방법이 공유결합에 의한 산무수화효소 고정화 방법이 비해 약 45 배 활성이 높은 것을 의미한다. 이는 무수히 많은 양의 효소응집체가 나노섬유에 고정화되어 있음을 의미한다.
다음으로 안정성 측정 결과, 공유결합된 탄산무수화효소는 수일 내에 효소의 활성을 잃어버리는 반면, 효소석출코팅된 탄산무수화효소의 경우 790일 동안 효소의 활성을 잃지 않고, 초기 활성 대비 80%를 유지하는 것을 볼 수 있다(도 2). 이를 통해 효소석출코팅의 통한 효소응집체는 외부 환경 변화에도 효소의 활성을 잃지 않고 유지하는 것을 증명하는 것이다.
[시험예 2]
안정화된 금속 단백질 내의 금속이온의 누출에 대한 저항성 확인
에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)은 유기화합물의 일종으로, 화학식은 C10H16N2O8이다. 여섯 자리 리간드로 작용할 수 있으며 금속 이온과 결합하여 카이랄성을 가진 킬레이트 화합물을 만든다. 여섯 자리 리간드로 작용할 수 있으며 금속 이온과 결합하여 카이랄성을 가진 킬레이트 화합물을 만든다. EDTA는 금속 이온을 중심으로 하는 팔면체의 여섯 꼭지점에 동시에 배위할 수 있으며, 그 결과 중심 금속은 리간드에 의해 둘러쌓여지게 된다. 따라서 EDTA는 특정 금속 이온에 대하여 강한 친화력을 가진다. 생화학이나 분자생물학에서는 DNA나 단백질에 관련된 실험을 할 때, 시료가 효소로 인하여 손상되는 것을 막기 위해 효소가 필요로 하는 금속 이온을 제거할 목적으로 EDTA를 사용한다.
금속효소 내에 금속이온이 빠져나갈 경우, EDTA가 금속이온과 결합하여 금속효소 내의 금속이온이 제거되기 때문에 금속효소의 활성을 유지할 수 없게 된다. 따라서 본 실험에서는 효소 내 금속 이온 탈착을 위해 탈찰된 금속 이온이 다시 효소에 들어가지 못하도록 에틸렌다이아민테트라아세트산을 다양한 농도로 첨가하여 교반조건에서 배양한 후, 시간에 따라 고정화된 탄산무수화 효소를 재사용하여 효소의 안정성을 측정하였다. 안정성 측정 결과, 공유결합된 탄산무수화 효소는 효소 내 금속 이온이 쉽게 탈착되어 탈착된 금속이온이 에틸렌다이아민테트라아세트산에 결합하여 다시 효소에 들어가지 못하기 때문에 24시간 내에 효소의 활성 대부분을 잃어버리는 반면, 가교결합된 탄산무수화 효소의 경우 약간의 효소의 활성이 감소하지만 그 안정성을 유지하는 것을 볼 수 있다(도 2). 이를 통해 가교결합된 금속 단백질-고분자 나노섬유 복합체는 효소 내의 금속의 탈착을 방지함으로써 외부 환경 변화에도 금속 단백질의 활성을 잃지 않고 유지하는 것을 증명하는 것이다.
[시험예 3]
다양한 환경에서의 안정화된 금속 단백질 내의 안정성 확인
바닷물은 자연계에 풍부하게 존재하며 고농도의 염을 포함하고 있어, 경제적일 뿐만 아니라 충분한 완충효과를 보일 것으로 기대된다. 따라서 본 발명에서는 바닷물 조성을 갖춘 유사바닷물 용액을 사용하여 효소의 안정성을 확인하였다. 실험 결과, 200 rpm 교반 조건 에서의 안정성 및 이산화탄소를 직접 주입하면서 performance stability를 측정하였을 때 모두 효소의 안정성이 유지됨을 확인하였다(도 4). 또한 일반적인 생물화학공정에서 사용되는 완충 용액의 경우 비용적인 측면에서 공정의 경제성을 크게 저해할 수 있어, 이를 해결하기 위한 방안으로 다양한 수용액에서 효소의 안정성 확보가 필요하다. 따라서 증류수(DI water), 수돗물(tap water), pH에 따른 효소안정성을 확인하였다. 실험 결과 효소석출코팅 방법으로 고정화한 탄산무수화효소의 경우, 다양한 조건에서도 안정성을 보임을 확인할 수 있었다(도 4).

Claims (13)

  1. (a) 불용성 담체에 금속 단백질을 고정화시키는 단계; 및
    (b) 상기 고정화된 금속 단백질 간에 가교결합을 형성시키기 위해 가교결합제를 첨가하는 단계
    를 포함하는 금속 단백질의 안정화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 후에,
    상기 고정화된 금속 단백질을 석출시키기 위하여 상기 불용성 담체에 석출화제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 금속 단백질의 안정화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계 후에,
    가교결합제를 제거하는 단계를 더 포함하는 금속 단백질의 안정화 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계 후에,
    석출화제 및 가교결합제를 제거하는 단계를 더 포함하는 금속 단백질의 안정화 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 불용성 담체는 고분자 나노섬유, 탄소나노섬유, 세라믹 멤브레인, 활성탄, 실리카계 담체, 알루미나계 담체, 세라이트계 담체 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상인 금속 단백질의 안정화 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 고분자 나노섬유는 폴리(스티렌-co-무수말레산), 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리비닐알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 또는 그 이상인 금속 단백질의 안정화 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 금속 단백질은 탄산무수화 효소, 헴(heme) 단백질, 트랜스페린, 메탈로티오네인, 포름산탈수소효소, 포름알데히드탈수소효소, 알콜탈수소효소, 글리세롤탈수소효소, 질소고정화효소, 칼모듈린, 트로포닌, 펄프알부민 및 칼파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 또는 그 이상의 금속 단백질인 금속 단백질의 안정화 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 가교결합제는 글루타르알데하이드, 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 또는 그 이상의 화합물인 금속 단백질의 안정화 방법.
  9. 제2항에 있어서,
    상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알코올, 아세톤, 폴리에틸렌글리콜, 암모늄 설페이트, 암모늄 설파이드, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것인 금속 단백질의 안정화 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 따라 안정화된 금속 단백질.
  11. 불용성 담체; 및 상기 불용성 담체에 고정화되어 있는 금속 단백질을 포함하고, 상기 금속 단백질 간에 가교결합이 형성되어 금속 이온의 탈리를 방지하는 것을 특징으로 하는 가교결합된 금속 단백질 복합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 불용성 담체는 고분자 나노섬유, 탄소나노섬유, 세라믹 멤브레인, 활성탄, 실리카계 담체, 알루미나계 담체, 세라이트계 담체 및 제올라이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상인 가교결합된 금속 단백질 복합체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 금속 단백질은 탄산무수화 효소, 헴(heme) 단백질, 트랜스페린, 메탈로티오네인, 포름산탈수소효소, 포름알데히드탈수소효소, 알콜탈수소효소, 글리세롤탈수소효소, 질소고정화효소, 칼모듈린, 트로포닌, 펄프알부민 및 칼파인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 이상인 가교결합된 금속 단백질 복합체.

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