KR20110128128A - 효소―３차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체， 그 제조방법 및 그 용도 - Google Patents
효소―３차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체， 그 제조방법 및 그 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 효소-3차원 네트워크 섬유 매트릭스 복합체는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을 뿐 아니라 외부충격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다.
또한, 섬유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.
또한, 섬유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.
Description
본 발명은 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체, 그 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래의 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체에 비하여 훨씬 많은 양의 효소를 3차원 네트워크 구조의 파이버에 고정시키고 이를 장기간 안정적으로 유지할 수 있는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체, 그 제조방법 및 이를 이용한 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등의 용도를 제공하는 것이다.
종래에 3차원 네트워크 구조를 갖는 섬유에 효과적으로 효소를 고정하기 위한 여러 가지 방법들이 제안되어 왔으며 그 방법들에는 운반물 결합, 가교결합 그리고 흡착 등이 제안되어 왔다. 그러나 1990년대 후반부터 나노테크놀로지의 발전과 나노바이오테크 전자기기 요구의 증가로 인하여 새로운 효소고정화방법이 필요하게 되었고 그들의 여러 결과들이 발표되었다. 그리고 이를 통하여 나노구조 물질의 발전에 따른 효소고정화는 전기화학적 트랜지스터, 재사용 전지, 바이오전기기기 그리고 바이오센서, 바이오 전환, 바이오정화, 효소컬럼, 단백질가수분해, 제약합성, Antifouling 용 도료 (방오제), 결정성 이부프로펜 제조 및 정량분석법 (ELISA) 등의 활용에서 충분한 관심을 받고 있다.
그런데, 3차원 네트워크 구조의 파이버에 대한 효소 고정화가 상업화되기 위하여 달성하여야 할 목표로는 얼마나 효소의 안정성을 유지할 수 있는지와 높은 전기적 수행을 나타낼 수 있는지가 중요한 열쇠 중에 하나이다. 그 결과 다양한 나노구조 물질이 고려되었는데 구체적으로 높은 표면적을 가진 나노세공성 물질, 전기방사 나노섬유 그리고 나노입자와 같은 나노구조 물질의 사용으로 효소가 고정화 되었을 때 새어나오거나 떨어져 나오는 것을 방지하여 효소 담지량을 극대화시키는 방법이 모색되었다.
한편, 다공성 실리카를 이용한 효소 고정화 방법은 효소 흡착방법과 효소 흡착 후 가교결합 방법이 있다. 공극을 가지고 있는 세공성 실리카안에 효소를 단순 흡착시키는 방법과 흡착 후 효소 간에 가교결합하는 방법은 흡착 후 효소간의 가교결합하는 방법이 안정성 측면에서는 단순흡착에 비해 좋은 결과를 보여주지만 흡착되는 효소의 양이 비슷하기 때문에 활성에 있어서 그 차이는 거의 없다. 고정되는 효소의 양을 늘리기 위하여 종래 나노섬유에 사용했던 효소코팅은 표면에 존재하는 작용기를 이용하여 효소와 공유결합시킨 후 가교결합제를 이용하여 효소코팅을 하는 방법이었다. 그러나 상기 방법은 효소의 고정량에 한계가 있을 뿐 아니라, 효소가 변성되는 문제가 발생하였다. 또한 섬유표면에 효소와 공유결합을 수행할 수 있는 작용기가 없는 나노섬유에는 적용되기 어려운 문제가 있었다.
결국, 종래의 3차원 네트워크 구조의 파이버에 효과적으로 효소를 고정하는 방법은 모두 수율이 너무 낮을 뿐 아니라 장기간 사용할 경우 안정성이 크게 떨어지게 되어 이를 상업화하기는 지극히 곤란한 문제가 있었다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 현저하게 많은 효소를 안정적으로 고정화시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 3차원 네트워크 섬유의 표면에 효소와 공유결합할 수 있는 작용기가 거의 존재하지 않더라도 현저하게 많은 효소를 안정적으로 고정화시킬 수 있는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여, (1) 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 효소를 흡착시키는 단계; (2) 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유출을 방지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 단계; 및 (3) 상기 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효소집적체를 형성하는 단계를 포함하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크로 섬유 또는 나노섬유일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리(스티렌-co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 효소집적체의 직경이 공극의 입구 크기보다 클 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유의 표면에 효소를 포함하는 쉘이 형성되며, 상기 효소와 섬유간에 공유결합이 실질적으로 형성되지 않을 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유의 표면이 개질되지 않을 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것 일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계 이후 상기 석출화제 및 가교결합제를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여, 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스; 상기 매트릭스의 공극내부에 담지되며 직경이 공극의 입구 크기보다 큰 가교결합된 효소집적체; 및 상기 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘러싼 효소를 포함하는 쉘을 포함하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크로 섬유 또는 나노섬유일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리(스티렌-co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 쉘은 효소들의 가교결합으로 형성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 섬유의 표면과 쉘은 공유결합이 실질적으로 형성되지 않을 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상술한 본 발명의 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체를 포함하는 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치를 제공한다.
본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
용어 '섬유와 효소간의 공유결합이 실질적으로 형성되지 않은'이라 함은 섬유의 표면에 자연적으로 형성된 효소와 공유결합이 가능한 작용기(예 : 섬유의 중합 및 방사과정에서 반응하지 않고 섬유표면에 남아있는 아미노기 등)와 효소간의 공유결합이 형성되는 것을 제외하고는 섬유표면의 개질 등을 통해 섬유 표면에 작용기를 형성하지 않으며, 섬유 표면의 자연적으로 형성된 작용기와의 공유결합을 제외하고는 섬유와 효소간의 공유결합이 형성되지 않은 것을 의미한다.
본 발명의 효소-3차원 네트워크 섬유 매트릭스 복합체는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을 뿐 아니라 외부충격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다.
또한, 섬유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.
도 1은 폴리아닐린나노섬유의 제조하는 공정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 섬유 매트릭스에 효소를 고정화시키는 공정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 제조예 1을 통해 제조한 폴리아닐린 나노섬유(PANFs)를 촬영한 SEM 사진이다.
도 4는 비교예 1을 통해 제조한 효소 흡착을 이용한 효소고정방법(Enzyme adsorption, EA)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
도 5는 비교예 2를 통해 제조된 효소 흡착 및 가교결합방법(Enzyme adsorption and crosslinking, EAC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
도 6은 실시예 1의 효소흡착, 석출화 및 가교결합방법(Enzyme adsorption, precipitation, and crosslinking, EAPC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
도 7은 UV spectrophotometer을 이용한 EA, EAC, 그리고 EAPC의 활성을 측정한 그래프이다.
도 8a는 실온에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜주면서 그 활성을 측정한 그래프이고, 도 8b는 열적 안정성을 알아보기 위한 50 ℃에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜 주면서 그 활성을 측정한 그래프이다.
도 9a는 실시예 4의 카본종이를 음극으로 사용한 통상의 연료전지의 개략도이고, 도 9b는 이를 구체적으로 나타낸 사시도이다.
도 10은 본 발명의 바이오 연료전지의 분극곡선 그래프이다.
도 11은 본 발명의 바이오 연료전지의 초기 최대 전력밀도를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 바이오 연료전지의 electrochemical impedance spectroscopy (EIS)실험을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 사시도 및 단면도이다.
도 2는 섬유 매트릭스에 효소를 고정화시키는 공정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 제조예 1을 통해 제조한 폴리아닐린 나노섬유(PANFs)를 촬영한 SEM 사진이다.
도 4는 비교예 1을 통해 제조한 효소 흡착을 이용한 효소고정방법(Enzyme adsorption, EA)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
도 5는 비교예 2를 통해 제조된 효소 흡착 및 가교결합방법(Enzyme adsorption and crosslinking, EAC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
도 6은 실시예 1의 효소흡착, 석출화 및 가교결합방법(Enzyme adsorption, precipitation, and crosslinking, EAPC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
도 7은 UV spectrophotometer을 이용한 EA, EAC, 그리고 EAPC의 활성을 측정한 그래프이다.
도 8a는 실온에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜주면서 그 활성을 측정한 그래프이고, 도 8b는 열적 안정성을 알아보기 위한 50 ℃에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜 주면서 그 활성을 측정한 그래프이다.
도 9a는 실시예 4의 카본종이를 음극으로 사용한 통상의 연료전지의 개략도이고, 도 9b는 이를 구체적으로 나타낸 사시도이다.
도 10은 본 발명의 바이오 연료전지의 분극곡선 그래프이다.
도 11은 본 발명의 바이오 연료전지의 초기 최대 전력밀도를 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명의 바이오 연료전지의 electrochemical impedance spectroscopy (EIS)실험을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 사시도 및 단면도이다.
이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래의 3차원 네트워크 구조의 파이버에 효과적으로 효소를 고정하는 방법은 모두 수율이 너무 낮을 뿐 아니라 장기간 사용할 경우 안정성이 크게 떨어지게 되어 이를 상업화하기는 지극히 곤란한 문제가 있었다. 또한 섬유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 폴리아닐린 나노섬유의 등의 경우에는 효소의 고정화가 거의 이루어지지 않는 문제가 있었다.
이에 본 발명에서는 (1) 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 효소를 흡착시키는 단계; (2) 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유출을 방지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 단계; 및 (3) 상기 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효소집적체를 형성하는 단계를 포함하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법을 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을 뿐 아니라 외부충격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다. 또한, 섬유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.
먼저 (1) 단계로서 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 효소를 흡착시킨다. 본 발명에 사용되는 파이버는 방사 시 3차원 네트워크가 형성되어 섬유와 섬유사이에 공극이 형성할 수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있으며 섬유의 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리(스티렌-co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 비용 및 효율을 고려하여 폴리아닐린 섬유를 사용하는 것이 유리하나 이에 제한되지 않는다.
섬유를 제조하기 위한 방사의 종류 역시 섬유와 섬유간에 3차원 네트워크 구조를 갖는 것이면 통상의 중합 및/또는 방사공정을 활용할 수 있고, 전기방사, 용융방사 등을 모두 사용할 수 있다. 섬유의 직경 역시 나노섬유, 마이크로 섬유에 모두 적용될 수 있으나, 후술하는 효소집합체의 크기와 섬유와 섬유사이에 형성되는 공극의 크기를 고려할 때 나노섬유를 사용하는 것이 보다 유리할 수 있다. 하지만, 탄소나노튜브의 경우 이를 섬유로 제직한다 하더라도 3차원 네트워크를 형성할 수 없으므로 본 발명의 범위에 속하지 않는다.
본 발명의 일구현예에 따른 다공성 매트릭스는 3차원 네트워크 섬유를 일부 또는 전부를 포함하여 구성될 수 있으며, 이 때 다공성은 3차원 네트워크를 형성하는 섬유와 섬유간의 공간(공극)을 의미한다.
본 발명의 섬유는 3차원상의 네트워크를 형성하며 이를 통해 파이버 매트릭스 구조를 가질 수 있게 되며, 상기 매트릭스 구조는 섬유가 복잡하게 얽힌 무정형의 구조일 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 효소는 사용하려는 목적에 따라 상기 파이버 매트릭스의 표면에 흡착될 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 목적에 따라 키모트립신, 트립신, 서브틸리신, 파파인, 리파아제, 홀세라디쉬 페록시다아제, 소이빈 페록시다아제, 클로로 페록시다아제, 망가네이제 페록시다아제, 티로시나아제, 락카아제, 셀룰라아제, 사일라네이즈, 락타아제, 수크라아제, 오가노포스포히드로라아제, 클로리네스테라아제, 글루코스 옥시다아제, 알코올 데히드로제나아제, 글루코스 데히드로제나아제, 히드로제나아제, 글루코스 이소머라아제 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 파이버 매트릭스는 그 표면에 상기 효소와 공유결합될 수 있는 어떠한 작용기(예 : 아미노기)를 실질적으로 포함하고 있지 섬유에도 적용될 수 있으므로, 파이버의 표면과 효소간에 공유결합으로 결합된 것이 아니라 섬유의 표면 또는 섬유와 섬유간에 형성되는 공극(공간) 사이에 흡착하게 된다. 따라서, 단순히 효소가 매트릭스의 표면에 흡착된 상태에서 수세 등의 외부충격이 가해지는 경우 흡착된 효소 중 대부분이 매트릭스에서 떨어져나가게 되므로 결과적으로 효소의 고정률이 현저하게 감소하게 되는 것이다.
다음 (2) 단계로서 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유출을 방지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가(enzyme precipiatation)한다.
흡착된 효소는 그 크기가 매우 작으므로 육안으로 거의 관찰되지 않는다. 이에 상기 흡착된 효소를 석출시키기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 경우 흡착된 효소들이 서로 뭉치게 되어 그 크기가 커지게 되어 결국 섬유의 표면 또는 섬유와 섬유간에 형성되는 공극(공간) 사이에서 석출하게 된다. 이 때 사용될 수 있는 석출화제는 효소의 활성에 거의 영향을 미치지 않으면서 효소를 석출시킬 수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있지만 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
다음, (3) 단계로서 상기 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효소집적체를 형성한다. 구체적으로 섬유와 섬유사이에 형성된 공극(공간)의 크기에 비하여 석출된 효소의 크기가 상대적으로 작으므로 수세 등의 외부충격에 의하여 석출된 효소가 공극의 외부로 유출될 수 있다. 그러나, 가교결합제를 첨가하여 석출된 효소와 효소간에 가교결합을 형성하는 경우 가교결합된 효소들이 집합체를 형성하게 되고 상기 형성된 효소 집합체는 공극 내부를 거의 채우게 된다. 그 결과 공극의 입구보다 형성된 효소 집합체의 크기가 더 커지게 되므로 가교결합된 효소집합체는 수세 등의 외부충격에 의해서도 쉽게 공극의 외부로 유출되지 않게 된다. 그 결과 시간이 경과하여도 상기 공극 내부에 효소 집합체가 위치하게 되므로 섬유과 효소간의 공유결합과 같은 직접적인 결합관계가 형성되지 않는다 하더라도 효소집합체가 섬유 매트릭스 내부에 장기간 구비될 수 있는 것이다. 또한 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스간에 형성된 복합체는 종래의 복합체에 비하여 고정된 효소의 양이 월등하게 많기 때문에 이를 바이오 센서 또는 바이오 연료전지 등에 활용하는 경우에도 그 성능이 종래의 복합체를 사용하는 경우에 비하여 현저하게 개선될 수 있는 것이다.
한편, 석출화제를 처리한 후 가교결합제를 첨가하는 것이, 가교결합제만 첨가하는 경우에 비하여 그 효과가 현저하게 증진된다. 이는 효소의 흡착 후 가교결합제를 첨가하는 경우 섬유와 섬유간에 형성된 공극의 내부를 상당부분 채우지 못하게 되거나 가사 이를 채웠다 하더라도 효소들의 농도는 주위 농도와 같아지게 된다. 주위와 같은 농도의 효소가 가교결합을 하여 나노섬유안의 공극에서 공극의 입구보다 더 큰 덩어리를 이루지 못하여 수세과정에서 가교결합된 효소가 외부로 유출되는 경우가 발생할 확률이 높다. 하지만 본 발명의 경우 효소의 흡착 후 석출을 통해 효소들이 강제적으로 나노섬유 안의 공극을 더욱 조밀하게 메우게 되며 공국에 채워진 효소들은 가교결합을 통해 큰 덩어리를 이루기 때문에 병목현상 혹은 ship in a bottle 현상으로 수세과정에서 손실이 EAC 보다 덜하게 되는 것으로 예상된다.
나아가, 섬유의 표면에 효소와 공유결합할 수 있는 작용기가 거의 없는 폴리아닐린나노섬유 등의 경우 섬유의 표면에 효소가 고정화되기 매우 어렵다. 하지만, 본 발명에서는 섬유의 표면에서 석출된 효소들이 가교결합되어 섬유의 표면을 감싸는 쉘을 형성하게 되므로 마치 핫도그와 같이 섬유와 효소간에 공유결합이 실질적으로 형성되지 않는 경우에도 섬유의 표면에 많은 양의 효소가 쉘을 형성하여 고정화될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 가교결합제는 효소의 활성을 저해하지 않고서 효소간에 가교결합을 형성할 수 있는 것이면 종류의 제한없이 사용될 수 있지만 바람직하게는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하여 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 글루타르알데하이드를 사용할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 공지된 가교결합제를 제한없이 사용하는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
한편, 상기 (3) 단계 이후 바람직하게는 상기 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 수세하여 첨가된 가교결합제 및 석출화제를 제거하는 공정을 더 수행할 수 있다. 상기 수세단계를 거치면서 통상의 제조방법으로 제조된 매트릭스 복합체의 경우 공극사이에 고정된 효소가 상당부분 공극 밖으로 유출되지만, 본 발명에 의해 제조된 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체는 공극 내부에 형성된 효소 집합체의 크기가 공극의 입구보다 크게 되므로 상기 효소 집합체는 수세공정에도 불구하고 외부로 유출되지 않고 공극의 내부에 고정될 수 있게 되는 것이다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스; 상기 매트릭스의 공극내부에 담지되며 직경이 공극의 입구 크기보다 큰 가교결합된 효소집적체; 및 상기 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘러싼 효소를 포함하는 쉘을 포함하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체를 제공한다.
도 13은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 사시도 및 단면도이다. 이를 살펴보면 3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스의 공극 내부에 직경이 공극의 입구 크기보다 큰 가교결합된 효소집적체가 담지되어 있다. 또한, 3차원 네트워크 섬유의 표면을 효소 집적체를 포함하는 쉘이 감싸고 있다. 도 13의 우하단의 EPCs 는 3차원 네트워크 섬유의 표면을 효소 집적체를 포함하는 쉘이 감싸는 부분에 대한 단면도로서 섬유와 쉘을 형성하는 효소집적체 사이에는 공유결합이 실질적으로 형성되지 않으면서 마치 핫도그처럼 효소집적체를 포함하는 쉘이 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘러싸고 있다.
결국, 본 발명의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체는 섬유와 섬유간에 형성된 공극에서 외부로 유출되지 않을 정도로 상기 공극의 내부에 형성된 효소 복합체의 크기가 충분히 크게 되므로 종래의 효소 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 고정되어 복합체를 형성할 수 있게 된다. 다시 말해 섬유와 섬유간에 형성된 공극에서 외부로 유출되는 통로인 공극의 입구의 크기보다 공극 내부에 형성된 효소 복합체의 크기가 더 크게 되어 결국 수세 등의 외부 자극이 있는 경우에도 효소 복합체가 상기 공극의 내부에 구비될 수 있게 되며, 이는 효소와 매트릭스간에 직접적인 결합관계가 형성되지 않고서도 상기 복합체가 장기간 유지될 수 있게 되는 것이다.
나아가, 섬유의 표면에 효소와 공유결합할 수 있는 작용기가 거의 없는 폴리아닐린나노섬유 등의 경우 섬유의 표면에 효소가 고정화되기 매우 어렵다. 하지만, 본 발명에서는 섬유의 표면에서 석출된 효소들이 가교결합되어 섬유의 표면을 감싸는 쉘을 형성하게 되므로 마치 핫도그와 같이 섬유와 효소간에 공유결합이 실질적으로 형성되지 않는 경우에도 섬유의 표면에 많은 양의 효소가 쉘을 형성하여 고정화될 수 있다.
최종적으로 제조된 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체에서 사용된 섬유의 양에 대한 고정된 효소의 양으로 표현할 수 있는데, 종래의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체가 사용된 파이버 1g 당 효소 5000 ~ 6000unit가 고정되는데 반하여, 본원발명의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체는 파이버 1g 당 효소 50000 ~ 60000unit가 고정될 수 있으므로 고정된 효소의 양이 비약적으로 증가하게 되는 것이다.
그러므로, 본 발명의 효소-3차원 네트워크 섬유 매트릭스 복합체는 종래의 복합체에 비하여 현저하게 많은 양의 효소가 매트릭스에 담지 및 고정될 수 있을 뿐 아니라 외부충격으로부터 고정된 효소가 쉽게 유출되지 않으므로 장기간 경과한 경우에도 그 안정성이 유지된다.
또한, 섬유의 표면에 효소와 공유결합을 수행하는 작용기가 거의 존재하지 않는 섬유의 경우에도 많은 양의 효소를 안정적으로 고정화할 수 있다.
따라서, 본 발명의 효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체를 사용하는 경우에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.
<제조예> 3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스의 제조
도 1과 같은 방법으로 3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스를 제조하였다.
구체적으로 효소고정화를 위한 전기전도성 나노섬유 폴리아닐린 나노섬유는 산화제인 ammonium persulfate를 개시제로 하여 산화 중합을 통해 제조하였다. 산화중합은 ammonium persulfate의 양을 조절하여 폴리아닐린의 과성장을 막아 주는 rapidly mixing reaction 방법을 사용하였다. Ammonium persulfate를 1 M HCl 용액에 0.1 M이 되도록 녹여 준비하였다. 아닐린 1.5 ml를 1 M HCl 8.5 ml에 넣고 잘 섞어 준다. 준비한 ammonium persulfate 용액 10 ml을 아닐린과 HCl이 섞인 10 ml 용액에 넣고 잘 섞어주었다. 잘 섞인 용액을 24시간동안 실온에서 200 rpm으로 교반시켜주었다. 이렇게 중합과정이 끝난 후 용액을 centrifuge down하여 상등액을 버린 후 DI용액을 넣어준 후 잘 교반하여 씻어주는 과정을 여러 번 거친 후 4℃ 에서 보관하였다. 제조된 폴리 아닐린 나노섬유는 과성장을 막기 위해 ammonium persulfate의 양을 조절하여 합성되었다. 나노섬유는 서로서로 산호처럼 복잡하게 연결되어 3차원 네트워크 구조를 형성하고 아닐린의 농도에 따라 나노섬유의 바깥가지 부분의 공극뿐만 아니라 안쪽에서 많은 공극을 가지고 있다. 나노섬유의 공극(섬유와 섬유간에 형성된 공간)은 효소 고정화에서 큰 역할을 한다. 폴리아닐린 나노섬유의 BET 표면적은 58.4 m2/g이고 평균 공극 지름은 12.26 nm이었다. 전체 공극부피는 0.179cm3 /g(p/p0=0.990)이었다.
<비교예 1> 효소 흡착을 이용한 효소고정방법(Enzyme adsorption, EA)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조
도 2의 효소 흡착을 이용한 효소고정방법(Enzyme adsorption, EA)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조하였다. 구체적으로 상기 제조예에서 제조된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 5 mg을 100 mM PB buffer (pH 7.0)에 녹인 글루코스 옥시다제(glucose oxidase, GOx) 용액 10 mg/ml 1 ml를 넣어 2시간동안 150 rpm으로 교반시켰다. 그 뒤 GOx를 흡착시킨 매트릭스 복합체를 포함하는 용액을 100mM Tris buffer pH 7.4를 이용해 30분 동안 200 rpm에서 교반시켜준 후 다시 100 mM PB를 이용하여 씻어주었다. 모든 처리가 끝난 효소고정화 물질들은 4 ℃에서 보관하여 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체(EA)를 제조하였다.
<비교예 2> 효소 흡착 및 가교결합방법(Enzyme adsorption and crosslinking, EAC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조
도 2의 효소 흡착 및 가교결합방법(Enzyme adsorption and crosslinking, EAC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조하였다. 구체적으로 상기 제조예에서 제조된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스를 수세한 후 10mg/ml GOx 1ml 용액과 혼합한 후 흡착이 잘되도록 2시간동안 150rpm에서 교반하였다. 그 뒤 가교결합제로서 25%의 글루타르알데하이드 20.4㎕를 첨가하여 용액속의 글루타르알데하이드의 농도가 0.5% v/v가 되도록 하였다. 그 뒤 가교결합제의 충분한 반응을 위하여 4℃의 냉장고에서 17시간동안 반응시켰다. 그 뒤 매트릭스 복합체를 포함하는 용액을 100mM Tris buffer pH 7.4를 이용해 30분 동안 200 rpm에서 교반시켜준 후 다시 100 mM PB를 이용하여 씻어주었다. 모든 처리가 끝난 효소고정화 물질들은 4 ℃에서 보관하여 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체(EAC)를 제조하였다.
<실시예 1> 효소흡착, 석출화 및 가교결합방법(Enzyme adsorption, precipitation, and crosslinking, EAPC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조
도 2의 EAPC에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 제조하였다. 구체적으로 상기 제조예에서 제조된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스를 수세한 후 10mg/ml GOx 용액과 혼합한 후 흡착이 잘되도록 2시간 동안 150rpm에서 교반하였다. 그 뒤 석출화제로서 60% w/v 1.4ml 암모늄 설페이트용액을 첨가하여 용액속에 암모늄설페이트용액 농도가 35%v/v가 되도록 하였다. 효소의 석출이 용이하도록 하기 위해 실온에서 150 rpm으로 30 분동안 교반시켰다. 그 뒤 가교결합제로서 25%v/v의 글루타르알데하이드를 첨가하여 용액속의 글루타르알데하이드의 농도가 0.5%가 되도록 한다. 그 뒤 가교결합제의 충분한 반응을 위하여 4℃의 냉장고에서 17시간동안 반응시켰다. 그 뒤 매트릭스 복합체를 포함하는 용액을 100mM Tris buffer pH 7.4를 이용해 30분 동안 200 rpm에서 교반시켜준 후 다시 100 mM PB를 이용하여 씻어주었다. 모든 처리가 끝난 효소고정화 물질들은 4 ℃에서 보관하여 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체(EAPC)를 제조하였다.
<실시예 2> 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 효소 고정화 정도 확인
상기 실시예 1 및 비교예 1, 2에서 제조된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 효소고정화 정도를 확인하기 위하여 SEM 사진을 촬영하였다.
구체적으로 도 3은 제조예 1을 통해 제조한 폴리아닐린 나노섬유(PANFs)를 촬영한 SEM 사진이다. 도 4는 비교예 1을 통해 제조한 효소 흡착을 이용한 효소고정방법(Enzyme adsorption, EA)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다. 도 5는 비교예 2를 통해 제조된 효소 흡착 및 가교결합방법(Enzyme adsorption and crosslinking, EAC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다. 도 6은 실시예 1의 효소흡착, 석출화 및 가교결합방법(Enzyme adsorption, precipitation, and crosslinking, EAPC)에 따라 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 SEM 사진이다.
상기 도 3 ~ 도 6을 살펴보면, 폴리 아닐린 나노섬유, EA, 그리고 EAC는 SEM 사진상 큰 차이를 보이지 않는다. 하지만 EAPC는 다른 것들과는 다르게 폴리 아닐린 나노섬유의 지름이 크게 증가한 것을 볼 수 있다 (도 6). 이는 EA와 EAC에서는 GOx가 효소코팅을 이루지 못하고 폴리 아닐린 나노섬유의 공극에 들어가 고정화 되지만 EAPC의 경우 효소 침전에 의해 폴리 아닐린 나노섬유의 표면에 많이 존재하다가 가교결합에 의해 표면을 감싸는 효소코팅이 이루어졌다고 해석할 수 있다. 이는 EAPC가 효소 고정화 정도에 중요한 역할을 수행하는 것을 보여주는 것이다.
<실시예 3> 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 효소활성 및 안정성 측정
상기 비교예 1, 2 및 실시예 1을 통해 제조된 각각의 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체의 효소활성을 UV-1800 UV spectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 구체적으로 우선 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 100mM PB buffer에 0.1mg/ml로 희석시켜 준비하였다. 그리고 10mg o-dianisidine (ODS)를 1.52ml의 DI에 녹인 후 100mM PB buffer를 이용하여 ODS용액이 0.21mM이 되도록 희석시켰다. 준비된 ODS 용액에 D-glucose를 넣어 용액 안의 D-glucose의 농도가 1.724% w/v 용액을 만들었다. Peroxidase (POD)는 100mM PB buffer에 녹여 3.79mg/ml이 되도록 제조하였다. 이렇게 만들어진 세가지 용액을 가지고 효소의 활성을 측정하였다. 효소의 활성을 측정하기 위해 980ul ODS 용액, 10ul POD 용액 그리고 10ul의 GOx가 고정화된 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체용액을 섞어 500nm에서 UV spectrophotometer에서 흡광도를 측정하였다.
도 7은 UV spectrophotometer을 이용한 EA, EAC, 그리고 EAPC의 활성을 측정한 그래프로서, EA, EAC, 그리고 EAPC의 활성은 각각 0.040, 0.091, 그리고 0.382 A500/min이다. EAPC의 활성이 EA보다 9.6 배 크고 EAC보다 4.2 배 더 크게 나왔다. 이와 같은 활성의 증가는 상기 도 3 ~6의 SEM 사진을 통해 알 수 있듯이 GOx의 담지량 증가로 설명할 수 있다. 효소 침전에 의해 폴리 아닐린 나노섬유 표면에 많은 양의 효소를 존재하고 하고 가교결합제를 통해 효소코팅을 이루어 더 많은 양의 효소를 고정화 할 수 있는 것이다.
각각의 샘플의 활성면에서도 EAPC는 다른 것들에 비해 확연히 좋은 결과를 보여준다. 도 8a는 실온에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜주면서 그 활성을 측정한 그래프로서 56일후에 EA와 EAC의 활성이 각각 초기 활성 대비 22 % 그리고 19 %인 반면, EAPC는 그 초기 활성의 거의 90 %대를 유지하는 것을 볼 수 있다. 또한 도 8b는 열적 안정성을 알아보기 위한 50 ℃에서 100 mM PB 안에서 200 rpm으로 교반시켜주면서 그 활성을 측정한 그래프이다. 4시간 후에 EA와 EAC의 활성이 50 %대로 떨어지는 반면, EAPC는 거의 100 %대를 유지하고 있다.
이러한 결과들은 폴리 아닐린 나노섬유에 GOx의 다른 고정화 전략에 의해 설명될 수 있다.단순 흡착 (EA)나 흡착 후 결합 (EAC)은 폴리아닐린 나노섬유에 높은 담지량을 이루어 낼 수 없을 뿐만 아니라 고정화된 효소들이 안정선 실험을 하는 동안 폴리아닐린 나노섬유표면에서 쉽게 떨어진다. 반면에 (EAPC)의 경우 폴리아닐린 나노섬유 안의 공극에 효소 집합체가 꽉 차있기 때문에 높은 담지량을 보여주고 또한 꽉 들어찬 효소 집합체들은 폴리아닐린 나노섬유 밖으로 쉽게 유출되지 않는다. 이를 통해 본 발명의 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 사용한 바이오 연료전지 등은 그 성능이 크게 개선될 것이 예상된다.
<실시예 4> 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체를 이용한 바이오 연료전지용 전극의 제조
상기 비교예 1, 2 및 실시예 1을 통해 제조된 각각의 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체 용액 3mg/ml 안에 5% nafion 용액을 넣어 용액 속에 nafion의 농도가 0.3%가 되도록 하였다. 그 뒤 nafion 용액과 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체 용액이 잘 섞이도록 교반시켜주면서 4에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 용액 안에 carbon paper두께 : 370 ㎛, 면적 : 0.332 cm2)를 한 개씩 넣어 carbon paper에 용액이 흡착이 잘 되도록 하였다. carbon paper가 들어간 용액을 안정된 흡착을 위해 10분 동안 실온에 놓아두었다. carbon paper의 두께는 370 ㎛ 이고 넓이는 0.332 cm2이다. carbon paper는 사용하기 전에 황산과 질산의 3:1 비율의 용액에 의해 산처리를 하였다. 상기 용액에 효소-3차원 네트워크 구조의 폴리아닐린 나노섬유 매트릭스 복합체가 흡착된 carbon paper를 꺼낸 후 실온에서 1시간동안 말려주었다. 잘 말린 후 100mM PB buffer를이용하여 여러번 잘 씻어준 후 4℃에 보관하였다.
<실시예 5> 바이오 연료전지의 제작 및 분극 곡선과 전기화학적 임피던스 측정
상기 실시예 4를 통해 제조된 각각의 carbon paper를 음극으로 한 것을 제외하고는 통상의 바이오 연료전지의 구성을 가지는 연료전지를 제작하였다. 구체적으로 도 9a, 9b의 구성을 갖는 바이오 연료전지를 제작하였다. 도 9a는 실시예 4의 카본종이를 음극으로 사용한 통상의 연료전지의 개략도이고, 도 9b는 이를 구체적으로 나타낸 사시도이다. 구체적으로 carbon paper를 포함하는 효소음극, 음극 공간, 전류 수용체와 그리고 맴브레인 전극 (MEA)로 이루어져 있다. 양성자 교환 맴브레인, 에어펌프 그리고 Pt 양극 전극은 Fuel Cell Store (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. 바이오연료전지 성능을 측정하기 위해 200 mM glucose 용액이 연료로서 20 ml/min의 속도로 펌프에 의해 공급되고 양극에서 충분한 공기가 공급된다. 전자전달속도를 위한 mediator로서 1,4-benzoquinone(BQ)이 10 mM이 되도록 glucose 용액에 넣어주었다. constant load discharge(CLD)모드를 이용하여 polarization curve를 얻을 수 있고 이를 통해 최대 전력밀도를 구할 수 있다. CLD 모드는 저항박스로부터 바이오연료전지 셀로 외부저항을 걸어주며 각각의 저항은 안정화된 전류와 전압을 얻기 위해 3분 간격으로 걸어준다. 얻어진 파워는 효소 전극의 표면적(0.33 cm2)으로 나누어 최대 전력밀도를 계산하였다.
고정화된 샘플의 시스템을 분석하기 위해 Bio-Logic SP-150를 이용하여 Electrochemical impedence spectroscopy (EIS)실험을 하였다. Imperdence spectra는 25mV를 걸어준 후 주파수를 20 Hz에서 10 mHz까지 10초마다 10단계로 변화시키면서 저항을 측정한다. EIS 실험의 결과를 표시하기 위해 Nyquist plot이 사용되었다. Nyquist plot에서 나오는 반원의 지름은 음극에서의 electron transfer resistance(Rct)이고 x축의 절편은 electrolyte resistance(Rs)이다. 이러한 값을 얻기 위한 모델은 Faradaic impedance의 reaction kinetic을 이용하였다. EIS측정은 polarization curve를 구할 때와 같은 반응조건을 사용하였다. EIS측정을 위해서는 양극 저항의 효과를 제거 하기 위해 공기대신에 수소가스가 공급되어야 하지만 전제저항 대시 양극저항은 무시할 수 있는 정도이기 때문에 수소 대신에 공기를 공급하여 실험하였다
바이오연료전지의 성능은 200 mM glucose 용액을 연료로 하여 분극곡선(polarization curve)를 구함으로써 최대전력밀도를 측정하였다(도 10). 각각의 샘플 EA, EAC, 그리고 EAPC의 초기 최대 전력밀도는 57, 206, 292 μW/cm2로 측정 되었다 (도 11). EAPC의 최대 전력밀도는 EA보다 5 배 높고 EAC에 비해 1.5 배가 높게 나왔다. 각각의 활성 값과 최대 전력밀도를 비교해볼 때 어느 정도 상관관계는 있지만 EAPC가 활성 측정에서 보여주었던 만큼 최대 전력밀도는 증가하지 않았다. 최대 전력 밀도가 효소의 양에 따른 전자 생성량과 전자 전달속도에 의해 결정되는데 반해 효소 활성은 효소의 양과 상관이 있다.
바이오연료전지 실험을 통해 전자 전달속도에 영향을 미치는 저항을 측정하기 위해 electrochemical impedance spectroscopy (EIS)실험을 수행하고 그 결과를 도 12에 나타내었다. EIS 측정을 통해 얻게 되는 Nyquist plot통해 electrolyte resistance (Rs)와 charge transfer resistance (Rct)를 구할 수 있다. Nyquist plot에 따르면 모든 샘플에서의 electrolyte resistance는 거의 비슷하다. 하지만 charge transfer resistance는 EA와 EAC, 그리고 EAPC는 각각 20.8, 18.3, 그리고 43.4를 보여주고 있다. 가장 큰 charge transfer resistance를 보여주고 있는 EAPC는 높은 효소의 담지량으로 설명할 수 있다. 효소는 단백질의 일종으로 저항이 크기 때문에 전극에 많은 양의 효소가 고정화 되어 있을수록 charge transfer resistance는 증가하게 되는 것이다. EAPC의 charge transfer resistance는 EA보다 약 2 배 더 높은 값을 나타내고 최대전력 밀도에서는 약 5 배 더 높은 값을 보여주고 있다. 이것은 효소 활성에 있어서 EAPC가 EA보다 9.6 배 더 높은 것과 맞아 떨어지는 결과이다. 다시 말해 EAPC의 큰 charge transfer resistance는 빠르게 생산하는 전자의 전달을 방해하는 역할을 하지만 전자 전달의 방해보다 더 큰 양의 전자를 생산해 내기 때문에 그 최대전력밀도는 세 가지의 효소 고정화 방법 중에서 가장 큰 값을 보여주고 있다.
Polarization curve와 EIS 실험을 통해 고정화한 샘플들의 바이오연료전지의 성능을 알아보았고 효소 고정화된 샘플들과 마찬가지로 각각 효소 전극들의 안정성도 실험을 하였다. Nafion과 고정화된 샘플을 섞어 carbon paper에 흡착시켜 만든 각각의 효소 전극을 100 mM PB에서 보관하면서 안정성 실험을 하였다.
표 1은 상온에서 초기최대 전력밀도 및 2개월 경과 후 최대 전력밀도의 측정결과이다. 상온에서 2 개월 후 측정하였을 때 모든 효소 전극은 거의 초기 최대 전력밀도를 유지하였다. 이는 효소 고정화된 샘플들이 nafion과 같이 carbon paper에 흡착되면서 효소가 변성이 되는 것을 어느 정도 막아 주었다고 할 수 있다.
표 2는 열적 안정성을 알아보기 위해 50℃에서 초기최대 전력밀도 및 4시간 경과 후 최대 전력밀도의 측정결과이다. 그 결과 효소 전극은 모든 샘플에서 초기 최대 전력밀도를 유지하였다.
표 3은 표 2는 열적 안정성을 알아보기 위해 60℃에서 초기최대 전력밀도 및 4시간 경과 후 최대 전력밀도의 측정결과이다. EAPC는 초기 최대 전력밀도를 거의 유지한 반면 EA는 최대 전력밀도가 50 %로 떨어졌고 EAC는 25 %로 떨어졌다. 이 실험에서도 역시 EAPC를 이용해 만든 효소전극이 더 좋은 안정성을 보여주고 있는 것을 확인할 수 있다.
효소-3차원 네트워크 파이버 매트릭스 복합체를 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치 등에 사용하는 경우 종래의 매트릭스 복합체에 비하여 그 성능을 현저하게 개선시킬 수 있다.
Claims (15)
- (1) 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스에 효소를 흡착시키는 단계;
(2) 상기 매트릭스의 공극내부에 흡착된 효소들의 유출을 방지하기 위하여 상기 매트릭스에 석출화제를 첨가하는 단계; 및
(3) 상기 효소들간의 가교결합을 형성하기 위하여 가교결합제를 첨가하여 효소집적체를 형성하는 단계를 포함하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크로 섬유 또는 나노섬유인 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제2항에 있어서,
3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리(스티렌-co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 효소집적체의 직경이 공극의 입구 크기보다 큰 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 3차원 네트워크 섬유의 표면에 효소를 포함하는 쉘이 형성되며, 상기 효소와 섬유간에 공유결합이 실질적으로 형성되지 않은 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 3차원 네트워크 섬유의 표면이 개질되지 않은 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 석출화제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 부틸알콜, 아세톤, PEG, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 소듐 포스페이트, 포타슘 클로라이드, 포타슘 설페이트, 포타슘 포스페이트 및 이들의 수용액을 단독 또는 혼합한 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 가교결합제는 디이소시아네이트, 디안히드라이드, 디에폭사이드, 디알데하이드, 디이미드, 1-에틸-3-디메틸 아미노프로필카보디이미드, 글루타르알데하이드, 비스(이미도 에스테르), 비스(석신이미딜 에스테르) 및 디애시드 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (3) 단계 이후 상기 석출화제 및 가교결합제를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체의 제조방법. - 3차원 네트워크 섬유를 포함하는 다공성 매트릭스;
상기 매트릭스의 공극내부에 담지되며 직경이 공극의 입구 크기보다 큰 가교결합된 효소집적체; 및
상기 3차원 네트워크 섬유의 표면을 둘러싼 효소를 포함하는 쉘을 포함하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체. - 제10항에 있어서,
상기 3차원 네트워크 섬유는 마이크로 섬유 또는 나노섬유인 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체. - 제11항에 있어서,
3차원 네트워크 섬유는 상기 폴리비닐알콜, 폴리아크릴로니트릴, 나일론, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 셀룰로우즈, 키토산, 폴리락틱산, 폴리락틱-co-글리콜산, 폴리글리콜산 폴리카프로락톤, 콜라겐, 폴리피롤, 폴리아닐린 및 폴리(스티렌-co-무수말레산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체. - 제10항에 있어서,
상기 쉘은 효소들의 가교결합으로 형성되는 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체. - 제10항에 있어서,
상기 섬유의 표면과 쉘은 공유결합이 실질적으로 형성되지 않는 것을 특징으로 하는 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체. - 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 효소-3차원 네트워크 구조의 섬유 매트릭스 복합체를 포함하는 바이오 센서, 바이오 연료전지, 효소컬럼, ELISA 장치, 바이오 정화기기, Antifouling 용 도료 (방오제)제조 장치 및 결정성 이부프로펜 제조장치로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 장치.
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