KR20150044207A - Has2 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방사선 민감성을 증진시키기 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HAS2(Hyaluronan Synthase 2) 저해제, 특히 HAS2 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물, 및 이를 이용하여 암세포, 특히 방사선 저항성을 가지게 된 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 HAS2 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 암세포의 방사선 민감성을 증진시킴으로써 방사선 저항성이 증대되어 있는 다양한 암 치료시 방사선 요법의 효과를 증대시킬 수 있다.

Description

HAS2 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물{Composition comprising HAS2 inhibitor for enhancing radiation sensitivity}

본 발명은 방사선 민감성을 증진시키기 위한 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HAS2(Hyaluronan Synthase 2) 저해제, 특히 HAS2 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물, 및 이를 이용하여 암세포, 특히 방사선 저항성을 가지게 된 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

암의 치료법은 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있는데, 미국의 경우 약 2/3의 환자가 통증완화치료를 포함하여 궁극적으로는 방사선 치료를 받고 있으며, 국내에서는 전체 암 환자의 1/3 정도가 방사선치료를 받고 있다. 현재 국내에서 방사선치료를 받는 암 환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세에 있어 암 치료에 있어 방사선 치료의 중요성 또한 증가하고 있다.

방사선 치료는 현재 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법으로 알려져 있으나, 암세포의 방사선 내성 획득, 고선량의 방사선 치료 시 정상조직의 손상 등이 방사선치료의 효율을 저하시키는 문제점으로 지적되어 왔다. 따라서,방사선 치료의 효율을 증진시키기 위한 방사선 치료 민감제에 대한 연구가 시도되고 있으나, 현재까지 보고된 방사선 치료 민감제는 주로 항암제들로서, 예를 들어 탁솔(Taxol)과 시스플라틴cisplatin) 등이 보고되어 있다. 또한, 항암제로서의 성질은 지니지 않고 방사선 치료에만 사용되는 방사선 치료효과 증진제로는 티라파자민(tirapazamine)이 있으나 저산소증의 종양세포에만 효과가 있으며, 저산소상태 특유의 종양 내부 압력 때문에 종양 조직 내부로의 약물전달이 미흡하여 임상적 방사선 치료에서 효과가 미약하다고 알려져 있다.

그러나, 상기와 같이 방사선치료 효과를 증진시키기 위해 사용되는 항암제들을 방사선 치료와 병용할 때, 항암제의 독성이 방사선 치료시 나타나는 부작용, 즉, 방사선 치료부위의 염증, 위장장애, 오심, 구토, 설사 등과 복합적으로 나타날 수 있기 때문에 사용에 제한이 있다는 단점이 있다.

한편, 방사선치료는 많은 종류의 암에 대해 특히 전이를 일으키지 않는 국부 암에 대해 가장 중요하고 강력한 치료법 중 하나이다. 그러나, 방사선요법에 의해 치료될 종양들 중에서 오직 소수만이, 이를테면 림프종과 정상 상피종만이 방사선요법에 반응성이 있다. 다른 많은 고체성 종양, 예를 들면 흑색종, 신경아교세포종, 및 전립선암 등은 전형적으로 방사선에 대해 매우 내성적이며, 매우 많은 양의 방사선 처리가 필요하다. 방사선치료가 실패하는 이유는 흔히 복합적이고 가변적이다. 종양 인자들, 예컨대 위치, 크기 및 부적절한 혈관 공급(산소결핍)은 모두 이온화 방사선(IR)에 대한 신생물의 반응성의 결핍에 중요한 역할을 할 수 있다. 아마도 가장 중요한 것은 방사선-민감성 조절에 관련된 세포 및 유전적 인자들, 예를 들면 차등적인 조직-특이적 유전자 발현인데, 그것은 방사선-내성 세포 표현형을 유발할 수 있다. 과학자들은 IR에 대한 종양세포 민감성을 증가시키기 위한 다양한 방법을 개발하기 위해 오랫동안 노력해 왔다. 일례로, 저산소성 방사선 민감성 증강물질, 고농도의 산소가 있고, 보다 최근에는 방사선 민감성에 관련된 많은 유전적 인자들을 표적화하는 것이 포함된다. 그러나 지난 수십 년 동안 분자 생물학과 생화학분야에서 과학적으로 큰 발전이 있었음에도 불구하고, 암 유전학과 분자 방사선 생물학 분야에서는 효과적이고 특이한 방사선 민감성 증강물질 개발의 진전이 제한적으로 이루어져 왔을 뿐이다.

일례로 뇌종양 치료법 중 방사선 요법은 방사선에 의한 DNA 손상에 대하여 세포 주기를 지연(DNA damage checkpoint)시키거나 세포사멸(apoptosis)을 유도하여 비정상 세포를 제거하는 방법이다. 그러나 방사선 요법의 문제점은 암세포의 내재적인 방사선 저항성과 방사선 치료에 따른 내성증가로 인해서 방사선 저항성 암세포들이 암의 재발을 유발시키며 방사선 저항성 세포는 항암제에도 내성을 가진다.

따라서, 방사선에 대해서 내재적인 방사선 저항성을 가진 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방사선 민감성 증진제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, Hyaluronan은 인체에서 존재하는 긴, 선형 탄수화물 중합체로써 많은 세포의 표면에 코팅을 형성하고, 태아 발달과 일반적인 조직 균형의 정비에서 핵심 역활을 담당한다. Hyaluronan은 3개의 세포막 히알루로난 생성효소 (HAS1, HAS2 및 HAS3)에 의해 합성될 뿐만 아니라 hyaluronidases에 의해 분해되기도 한다. 그 중에서 HAS2의 존재여부는 쥐 태아치사와 밀접한 연관성을 가지고 있으며, 특히 HAS2의 발현억제는 전립선암과 유방암의 침식과 전이를 억제하는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, HAS2 저해제를 이용하여 방사선 민감성을 증진시키는 것을 직접적으로 개시한 보고는 현재까지 없다. 암치료 및 방사선 민감성을 증진시키는 것은 전혀 다른 기작으로 본 발명자들은 HAS2 저해제의 방사선 민감성 증진 용도를 처음 발견하였다.

이에, 본 발명자들은 HAS2의 저해제가 암 치료를 위한 방사선 요법에서 암세포의 방사선 민감성을 효과적으로 증진시킨다는 것을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 HAS2(Hyaluronan synthase 2) 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 사용하여 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 위한 방사선 요법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 HAS2(Hyaluronan Synthase 2) 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 용어, "HAS2(Hyaluronan Synthase 2)"는 Hyaluronan, 즉 HA(Hyaluronic acid)를 생성하는 히알루로난 생성효소인 HAS의 하나로 특히 포유류에서 발견되는 HAS isoform들(HAS1, HAS2 및 HAS3) 중에서 가장 중요한 효소로 알려져 있다. 본 발명의 HAS2는 암이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 HAS2일 수 있으며, 특히 인간 유래의 HAS2일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GenBank 등에서 그 서열 정보를 알 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 HAS2는 서열번호 1의 핵산 서열을 가지는 것일 수 있으며, NCBI GenBank Accession No.NM_005328.2에 해당하는 서열을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "HAS2 저해제"는 세포 내에서 HAS2의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로서, 구체적으로는 HAS2에 직접적으로 작용하거나 또는 HAS2의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 HAS2의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 HAS2의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써, HAS2의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 뜻하나, 세포 내 HAS2의 발현 또는 활성을 감소시켜서 암의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는 제제는 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 이용할 수 있는 HAS2 저해제는 HAS2 저해활성을 가진 물질이라면, 특별히 제한되지 않으나, 당업계에 공지된 표준 기법을 통해 세포에 처리될 수 있는 핵산 또는 폴리펩티드 같은 생물학적 분자, 화합물, 세균이나 식물 또는 동물로부터 분리된 추출물일 수 있다.

한편, 본 발명에서 이용할 수 있는 HAS2 저해제로서, HAS2염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자, HAS2에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머 또는 리보자임 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "상보적"은 뉴클레오티드 서열과 다른 뉴클레오티드 서열의 각 염기가 매치되는, 즉 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍을 형성할 수 있는 경우를 의미한다.

본 발명에서 HAS2 저해제로 이용할 수 있는 siRNA는 HAS2 에 특이적으로 작용하여 HAS2를 발현하는 mRNA를 절단(cleavage)하여 RNA 간섭 (RNAi: RNA interference)현상을 유도할 수 있는 이중사슬 RNA를 말한다. 본 발명의 siRNA는 HAS2 핵산 서열의 일부 또는 전부와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되어 세포 내에서 HAS2 mRNA에 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 HAS2에 특이적인 siRNA는 이들은 세포에 도입되었을 때, HAS2의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성인 것일 수 있다. 본 발명에서 HAS2에 특이적인 siRNA는 HAS2 유전자로부터 전사된 mRNA에 상보적인 서열을 가지고 있으며, 해당 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있게 된다.

본 발명의 HAS2에 특이적인 siRNA는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 증폭, 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 HAS2에 특이적인 siRNA는 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된다.

본 발명에서 HAS2 저해제로 이용할 수 있는 RNA 앱타머는 특정의 3차원 입체형태를 채택하는 능력에 의해 HAS2 mRNA와 결합하여 이에 대해 길항 효과를 갖는 핵산 리간드 분자를 의미한다. 전형적으로 앱타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 앱타머는 10^-6, 10^-8, 10^-10, 또는 10^-12 보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 앱타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 앱타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 HAS2 저해제로 이용할 수 있는 리보자임은 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 예를 들면 햄머헤드 리보자임, 헤어핀 리보자임 및 테트라히메나 리보자임이다. 또한, 천연 시스템에서는 발견되지 않지만, 생체내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.

본 발명에서 HAS2 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 세포 내의 HAS2 mRNA 분자의 단일 가닥 단편에 상보적으로 결합하여 HAS2 mRNA의 프로세스 효율을 감소시킴으로써, 이들의 발현을 억제하고, 기능을 저해시킬 수 있게 된다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 RNA-RNA, RNA-DNA, RNA-PNA(단백질 핵산) 상호작용에 의해 HAS2 mRNA 분자에 결합하여 이들의 활성을 변이시키는 비효소적 핵산 화합물이며, 이들은 하나의 연속서열이 HAS2 염기서열에 상보적일 수 있다.

또한, 본 발명의 HAS2 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자는 안티올리고뉴클레오티드 형태인 것이 바람직하며, 이들은 세포에 도입되었을 때, HAS2의 발현을 저해시킬 수 있으며, 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제에 내성이며, 생체 내에서 안정적인 선택적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다.

본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연 발생적인 염기, 당 및 당간(intersugar) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 또한, 이 용어는 유사하게 기능하는 비-자연 발생적인 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 올리고머를 포함한다. 치환된 올리고머의 혼입은 세포 흡수 증대 또는 뉴클레아제 내성 증가를 비롯한 인자에 기초하며, 당업계에 공지된 바와 같이 선택된다. 전체 올리고뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 치환된 올리고머를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 이들의 표적에 대한 친화성을 증가시키고 표적 서열의 미스매치(mismatch)에 대한 내성을 제공하도록 당업계에 공지된 방법으로 변형된 올리고머 모방체, 예를 들어 펩티드 핵산(PNA) 및 고정(locked) 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 천연형 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 메틸포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 포스포르아미데이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, H-포스포네이트형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 트리에스테르형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 알파-아노머형 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 그외 인조 핵산 및 핵산-변형된 화합물을 포함한, 변형된 올리고뉴클레오티드 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 안티올리고뉴클레오티드는 HAS2 단일 가닥 염기서열에 상보적인 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당업계에 알려져 있고, 올리고뉴클레오티드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 당 변형의 예로는, 1-6 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 -O-저급 알킬기, 또는 2-6 탄소 원자를 포함하는 -O-아릴, 또는 알릴기로 2'-O-치환된 것을 포함하는, 리보스 모이어티의 2' 위치에 변형이 있으며, 상기 -O-알킬, 아릴 또는 알릴기는 아미노 또는 할로기(예, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸 시아노, 니트로 아실 아실옥시, 알콕시, 카르복시, 카르브알콕실 또는 아미노기)로 비치환 또는 치환될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예로는, 3', 5' 또는 3' 및 5' 말단에 2'-O-알킬화된 리보뉴클레오티드를 가지며, 적어도 4개 또는 5개의 연속 뉴클레오티드가 그렇게 변형된다. 2'-O-알킬화된 기의 예로는, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필 및 2'-0-부틸이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 핵산으로 이루어지는 HAS2 억제제는 세포 내 전달을 위해 발현벡터에 포함되어 제공될 수 있다. 이러한 경우, HAS2에 특이적인 shRNA 등을 발현하는 벡터일 수 있다.

본 발명의 각종 핵산들은 당업계에 알려진 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 siRNA는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 핵산으로 이루어지는 HAS2 억제제는 세포 내로 도입시켜 암세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는데, 여기서 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 "방사선 민감성 증진"이란 방사선을 이용한 질병 치료에 있어서, 방사선에 대한 세포의 민감성을 증진시키는 것을 의미한다. 이를 통해 방사선 치료효율을 상승시킬 수 있는데, 특히, 암 치료시 병행처리되면 암세포의 방사선 민감성이 증진되어 암세포의 살상 효과 및 증식 억제효과를 낼 수 있게 된다.

본 발명의 HAS2 저해제는 세포 내에서 HAS2 mRNA 등에 작용하여 이들의 발현율을 감소시키는 등, HAS2 기능을 저해함으로써 세포의 방사선 저항성을 낮추어 방사선에 대한 민감성을 증진시킨다. 본 발명의 HAS2 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 방사선 치료를 적용할 수 있는 모든 세포에 적용이 가능하며, 특히 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 데 이용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 방사선 저항성이 증가된 모든 암세포에 적용이 가능하며, 특히 HAS2의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가된 경우에 적용될 수 있다. 바람직하게는 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 전립선압, 췌장암, 자궁암, 위암 및 만성 림프구 백혈병 등의 암세포에 적용가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 HAS2 저해제를 포함하는 조성물은 DNA 복구기전을 억제하는 것을 통해 방사선 민감성을 증진시킬 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명자들은 HAS2의 발현과 방사선 손상과의 상관관계를 알아보기 위해서 다양한 암세포주(사람 결장암 세포주 HCT116, 폐암 세포주(H460, Calu-1) 및 골육종암세포주)에 방사선을 조사한 뒤 조사 시간에 따른 HAS2의 발현을 확인한 결과, 방사선 조사 시간과 HAS2의 발현량이 비례하는 것을 확인함으로써 HAS2가 방사선 반응성 유전자임을 확인하였다(도 1).

또한, 본 발명자들은 HAS2 저해제의 방사선 저항성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 결장세포주(HCT116)에 HAS2의 siRNA(50 mM, 서열번호 2)를 처리하고, 0 내지 4 Gy 방사선을 조사한 다음 콜로니 형성 분석 또는 세포 고사율 측정 실험을 진행하여 세포 생존율을 확인하였다. 이를 통하여, HAS2에 대한 siRNA를 처리하여 HAS2을 저해한 실험군에서 방사선 조사량 증가에 따라 암세포의 방사선 민감성이 대조군에 비하여 상대적으로 증가되며, 세포 고사율이 유의하게 증가되는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3).

또한, 본 발명자들은 HAS2 저해제의 DNA 손상 복구 기전에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 결장세포주(HCT116)에 감마선을 조사한 다음 시간에 걸쳐 손상 DNA에 의해 관찰되는 nuclear foci를 γ-H2AX 염색을 통하여 확인하여 DNA 손상에 대해 복구되는지를 측정하였다. 그 결과, HAS2에 대한 siRNA를 처리하여 HAS2을 저해한 실험군에서 negative control siRNA(대조군) 그룹에 비해 상대적으로 많은 세포가 DNA 손상상태를 유지한 걸로 보아 HAS2는 방사선에 의해 유도되는 DNA 복구기전을 억제하는 것으로 HCT116 세포의 방사선 민감성을 향상시키는 것을 확인하였다(도 4).

한편, 본 발명의 HAS2 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 HAS2 저해제 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥 내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 HAS2 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 사용하여 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 치료를 위한 방사선 요법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, HAS2 저해제, 예를 들어 안티센스 핵산 분자의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반을 포함한다. 본 발명의 조성물이 암 세포 내로 도입되면, HAS2의 발현 수준을 낮추거나 활성을 저해함으로써, 방사선 민감성을 증진시키게 된다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 해당 조직에 국소 투여한다.

본 발명의 암 치료를 위한 방사선 요법은 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 방사선에 대해 암세포 내의 종양의 민감성을 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감성 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 방사선 치료 효과를 포함한 항암 효과를 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방사선 요법은 방사선 저항성이 증가될 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 특히, HAS2의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가될 수 있는 경우에 적용가능하다. 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다. 또한, 본 발명의 방사선 요법은 방사선 저항성이 증가된 모든 암 치료에 이용할 수 있으며, 특히 HAS2의 발현에 기인하여 방사선 저항성이 증가된 모든 암 치료에 이용할 수 있다. 바람직하게는 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 전립선압, 췌장암, 자궁암, 위암 및 만성 림프구 백혈병 등의 암 치료에 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 방사선 요법은 암세포에 본 발명의 조성물을 투여하고, 방사선을 조사하는 것을 포함하는데, 여기서 "방사선 조사"란 이온화 방사선, 특히, 특별하게는 오늘날 통상 사용하고 있는 선형 가속기(linear accelerators) 또는 방사핵종(radionuclides)에 의해 방사된 감마 방사선을 의미한다. 방사핵종에 의한 종양에의 방사선 요법은 외부적 또는 내부적으로 이루어질 수 있다. 조성물 투여 시기는 바람직하게는, 종양에 방사선을 조사하기 한 달 전까지는, 특히 10일 또는 일주일 전까지는 본 발명의 조성물 투여를 시작하는 것이 좋다. 추가적으로, 종양의 방사선 조사를 분별하고, 최초와 최후의 방사선 조사 기간 사이에 조성물의 투여를 지속하는 것이 유리하다. 투여되는 HAS2 저해제의 양, 방사선 조사량 및 방사선 조사량의 간헐성은 암의 종류, 그것의 위치, 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 파라미터에 따라 달라진다. 또한, 본 발명의 방사선 요법은 근접치료, 방사성 핵종 치료, 외부 빛살 방사선요법(external-beam radiation therapy), 온열치료(냉동절제 치료, 고열치료), 방사선 외과, 하전입자 방사선치료(charged-particle radiotherapy), 중성자 방사선 요법 및 광역동치료 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 HAS2 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 암세포의 방사선 민감성을 증진시킴으로써 방사선 저항성이 증대되어 있는 다양한 암 치료시 방사선 요법의 효과를 증대시킬 수 있다.

도 1a는 여러 종류의 암세포(사람 결장암 세포주 HCT116, 페암 세포주(H460, Calu-1) 및 골육종암세포주 U2os)를 상대로 방사선 조사 후, 반응시간의 증가에 따라 HAS2의 발현량을 RT-PCR(reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction) 측정한 도이고, 도 1b는 사람 결장암 세포주 HCT116를 상대로 방사선 조사후, 반응시간의 증가에 따라 HAS2의 발현량을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 2a는 사람 결장암 세포주 HCT116에 negative control siRNA 또는 HAS2 siRNA를 처리하고 HAS2의 발현량이 감소되는지 여부를 RT-PCR을 통하여 확인한 도이고, 도 2b는 상기 세포에 다양한 방사선 선량을 처리한 후, 세포 생존율을 콜로니 형성 분석을 통하여 측정한 그래프이다.
도 3a는 사람 결장암 세포주 HCT116에 negative control siRNA 또는 HAS2 siRNA를 처리하고 방사선 조사 여부에 따라 Annexin V 염색을 통하여 고사 세포를 유세포 분석을 통하여 확인한 그래프이고, 도 3b는 고사 세포에 해당하는 Annecxin V 양성 세포의 비율을 확인한 그래프이다.
도 4는 HAS2가 방사선에 의해 유도되는 DNA 손상기전과 복구기전에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 감마선(gammaray)을 조사한 다음 DNA 손상 상태를 의미하는 γ-H2AX 항체로 염색하여 확인하였다. 도 4a는 면역화학염색법을 통해 확인한 도면이고, 도 4b는 이를 비율로 환원한 그래프이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 배양

사람 결장암 세포주 HCT116, 페암 세포주(H460, Calu-1) 및 골육종암세포주 U2os를 5% CO₂가 공급되는 항온항습기(humidified chamber)에서 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin Streptomycin)을 포함하는 McCoy'5A 또는 RPMI-1640에서 37℃로 배양하였다.

실시예 2: 방사선 조사

HAS2의 발현과 방사선 손상과의 상관관계를 알아보기 위해서 실시예 1에서 배양한 다양한 암세포주에 Gammacell3000 Elan 방사선 조사장치(irradiator)(137Cs A-ray source; MDS Nordin, 캐나다)를 이용하여 이온화 방사선(ionizing radiation; IR)을 4 Gy로 조사하였다. 방사선을 조사한 직후, 12시간 후, 24시간 후에 HAS2의 발현량을 p21 및 loading control인 β-action과 함께 측정하였다.

그 결과, 여러 종류의 암세포(사람 결장암 세포주 HCT116, 페암 세포주(H460, Calu-1) 및 골육종암세포주 U2os)를 상대로 방사선 조사 후, 반응시간의 증가에 따라 HAS2의 발현량이 증가되는 것을 확인하였다(도 1a 및 도 1b). 이런 결과는 HAS2 유전자는 방사선 반응성 유전자임을 시사한다.

실시예 3 : 세포 생존율 분석

HAS2 저해제의 방사선 저항성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 결장세포주(HCT116)에 negative control siRNA 또는 HAS2 siRNA(50 mM, 서열번호 2)를 처리하고, 방사선을 조사한 다음 콜로니 형성 분석을 통하여 세포 생존율을 확인하였다.

구체적으로는, 세포에 negative control siRNA 또는 HAS2 siRNA (50mM)를 48동안 처리한 후, 상기 세포를 36시간 동안 60 mm dish에서 낮은 농도로 플레이트하였다. 이에 0 또는 4 Gy 방사선을 조사한 다음, 2주 동안 적어도 50개 이상의 세포를 가지는 콜로니를 형성할 때까지 배양하였다. 이렇게 상기 콜로니는 PBS로 세척하고, 메탄올/크리스탈 바이올렛 염료로 염색한 후, 콜로니를 카운트하였다.

그 결과, siRNA Knockdown을 통하여 HAS2의 발현을 억제한 실험군에서 방사선조사량의 증가에 따라 암세포의 방사선 민감성이 상대적으로 대조군에 비해 증가되었다(도 2a 및 도 2b).

실시예 4 : Annexin V 염색을 통한 세포 고사율 측정

HAS2 저해제의 방사선 저항성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 결장세포주(HCT116)에 negative control siRNA 또는 HAS2 siRNA(50 mM, 서열번호 2)를 처리하고, 방사선을 조사한 다음 Annexin V 염색을 통하여 세포 고사율을 확인하였다.

구체적으로는, 세포에 negative control siRNA 또는 HAS2 siRNA (50mM)를 48동안 처리한 후, 상기 세포에 0 또는 4 Gy 방사선을 조사하였다. 조사 후 48시간 경과 후 추출한 세포를 2 ml의 시험관에 옮기고 여기에 PBS 1ml로 세포를 단일세포 부유액상태를 유지한 다음 annexin V-FITC kit를 사용하여 형광염색을 수행한 다음 FACS로 측정하였다. Annexin V에만 염색된 세포를 고사세포로 측정하였다.

그 결과, 4 Gy 방사선 조사 후 48시간 경과 후, siRNA Knockdown을 통하여 HAS2의 발현을 억제한 실험군에서의 고사세포가 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(도 3a 및 도 3b). 이런 결과는 HAS2 유전자는 방사선 치료법의 민감성을 높이는 데 새로운 타깃으로 활용될 수 있음을 시사한다.

실시예 5 : γ- H2AX foci 측정에 의한 DNA 손상 복구 측정

HAS2가 방사선에 의해 유도되는 DNA 손상기전과 복구기전에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, γ-H2AX foci 실험을 수행하였다. 구체적으로, 감마방사선을 비롯한 여러 가지 DNA 손상물질들에 의해 세포 내에서의 DNA 단일 가닥이나 이중이 절단되면 γ-H2AX 인산화가 일어나면서 세포핵에서 nuclear foci가 생성된다. 이를 DNA 손상 복구 능력을 평가하는 지표로 사용하여 DNA 손상 복구 능력을 평가하였다.

γ-H2AX foci 실험은 SNU-638 세포를 35 mm 접시에 분주하고 24시간 동안 18 mm 커버 슬립으로 덮은 후, 감마선(gammaray)을 조사한 다음, 상기 세포를 4% 파라 포름알데히드가 포함된 PBS에 20분 동안고정하고, 상온에서 15분 동안 0.1% NP-40이 담긴 PBS로 투과화(permeabilize)하였다. 30분 동안 블로킹 버퍼(PBS+0.1% NP-40+10% BSA)로 처리한 후, 상기 세포를 항-γ-H2AX 항체가 희석된 블로킹 버퍼(1:500)와 상온에서 2시간 동안 배양한 다음, Alexa Flour 488 항체가 희석된 블로킹 버퍼(1:500)와 상온에서 50분 동안 배양하였다. 세포는 핵을 보기 위하여 5분 동안 DAPI(100 ng/ml)로 염색하였다. 그런 다음 시료를 마운팅(mounting)하고, LSM 510 현미경(Carl Zeiss, 독일)을 이용하여 관찰하였다. 10 이상의 foci를 보이는 세포를 양성세포로 카운트하였고, 이러한 세포를 DNA 손상이 회복되지 않은 세포로 간주하였다.

그 결과, HCT116 세포를 이용하여 negative control siRNA(50 nM)를 48시간 처리한 후 4 Gy 방사선을 조사하게 되면 6시간 상태에서는 약 72% 정도의 세포에서 γ-H2AX foci가 생성되었고, 24시간 상태에서는 약 12% 정도의 세포에서 γ-H2AX foci가 생성되었으나, HAS2 siRNA(50 nM)를 처리하고 48시간 후에 4 Gy 방사선을 조사하게 되면 DNA 손상단계인 6시간 상태에서는 약 76% 정도의 세포에서 γ-H2AX foci가 생성되었고, DNA 복구단계인 24시간 상태에서는 약 36% 정도의 세포에서 γ-H2AX foci가 생성되므로 negative control siRNA(대조군) 그룹에 비해 상대적으로 많은 세포가 DNA 손상상태를 유지한 걸로 보아 HAS2는 방사선에 의해 유도되는 DNA 복구기전을 억제하는 것으로 HCT116 세포의 방사선 민감성을 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다(도 4a 및 도 4b).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA ATOMIC ENERGY RESEARCH INSTITUTE <120> Composition comprising HAS2 inhibitor for enhancing radiation sensitivity <130> PA130964KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1659 <212> DNA <213> Homo sapiens hyaluronan synthase 2-HAS2 <400> 1 atgcattgtg agaggtttct atgtatcctg agaataattg gaaccacact ctttggagtc 60 tctctcctcc ttggaatcac agctgcttat attgttggct accagtttat ccaaacggat 120 aattactatt tctcttttgg actgtatggt gcctttttgg catcacacct catcatccaa 180 agcctgtttg cctttttgga gcaccgaaaa atgaaaaaat ccctagaaac ccccataaag 240 ttgaacaaaa cagttgccct ttgcatcgct gcctatcaag aagatccaga ctacttaagg 300 aaatgtttgc aatctgtgaa aaggctaacc taccctggga ttaaagttgt catggtcata 360 gatgggaact cagaagatga cctttacatg atggacatct tcagtgaagt catgggcaga 420 gacaaatcag ccacttatat ctggaagaac aacttccacg aaaagggtcc cggtgagaca 480 gatgagtcac ataaagaaag ctcgcaacac gtaacgcaat tggtcttgtc caacaaaagt 540 atctgcatca tgcaaaaatg gggtggaaaa agagaagtca tgtacacagc cttcagagca 600 ctgggacgaa gtgtggatta tgtacaggtt tgtgattcag acactatgct tgacccagcc 660 tcatctgtgg agatggtaaa agttttagaa gaagatccca tggttggagg tgttggggga 720 gatgtccaga ttttaaacaa gtacgattcc tggatctcat tcctcagcag tgtaagatat 780 tggatggctt ttaatataga aagggcctgt cagtcttatt ttgggtgtgt tcagtgcatt 840 agtggacctc tgggaatgta cagaaactcc ttgttgcatg agtttgtgga agattggtac 900 aatcaagaat ttatgggcaa ccaatgtagc tttggtgatg acaggcatct cacgaaccgg 960 gtgctgagcc tgggctatgc aacaaaatac acagctcgat ctaagtgcct tactgaaaca 1020 cctatagaat atctcagatg gctaaaccag cagacccgtt ggagcaagtc ctacttccga 1080 gaatggctgt acaatgcaat gtggtttcac aaacatcact tgtggatgac ctacgaagcg 1140 attatcactg gattctttcc tttctttctc attgccacag taatccagct cttctaccgg 1200 ggtaaaattt ggaacattct cctcttcttg ttaactgtcc agctagtagg tctcataaaa 1260 tcatcttttg ccagctgcct tagaggaaat atcgtcatgg tcttcatgtc tctctactca 1320 gtgttataca tgtcgagttt acttcccgcc aagatgtttg caattgcaac aataaacaaa 1380 gctgggtggg gcacatcagg aaggaaaacc attgttgtta atttcatagg actcattcca 1440 gtatcagttt ggtttacaat cctcctgggt ggtgtgattt tcaccattta taaggagtct 1500 aaaaggccat tttcagaatc caaacagaca gttctaattg ttggaacgtt gctctatgca 1560 tgctattggg tcatgctttt gacgctgtat gtagttctca tcaataagtg tggcaggcgg 1620 aagaagggac aacaatatga catggtgctt gatgtatga 1659 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequences targeting HAS2 <400> 2 uuggaaccac acucuuugg 19

Claims (12)

1. HAS2(Hyaluronan Synthase 2) 저해제를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 저해제는 HAS2에 특이적인 siRNA, RNA 앱타머 또는 리보자임인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 HAS2에 특이적인 siRNA는 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 저해제는 HAS2 염기서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 안티센스 핵산 분자는 안티올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 안티올리고뉴클레오티드의 길이는 15 내지 40 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 방사선에 저항성을 가지는 암세포의 방사선 민감성을 회복 또는 증진시키는 것인, 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 암은 신경교종, 유방암, 폐암, 대장암, 전립선압, 췌장암, 자궁암, 위암 및 만성 림프구 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 HAS2 저해제는 DNA 복구기전을 억제하는 것을 통해 방사선 민감성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 안티올리고뉴클레오티드는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    

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