KR20150036812A

KR20150036812A - 인간 항-뮐러 호르몬 타입 ⅱ 수용체에 대한 단일클론 항체

Info

Publication number: KR20150036812A
Application number: KR1020157006311A
Authority: KR
Inventors: 이사벨 뚜롱; 앙드레 펠레그린
Original assignee: 인썸(인스티튜트 내셔날 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰메디칼르)
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2007-10-31
Publication date: 2015-04-07
Also published as: JP2010508810A; CN103396491A; JP5903717B2; KR101686000B1; EP2097453A2; CN101573382B; US8278423B2; CA2667970A1; WO2008053330A2; PL2097453T3; CN101573382A; JP2014076992A; WO2008053330A3; DK2097453T3; KR20090101897A; US20130164300A1; US20100135996A1; CA2667970C; EP2097453B1; DE602007013282D1

Abstract

본 발명은 인간 항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체(AMHR-II)에 대한 단일클론 항체 및 그의 단편, 및 난소암 등의 암 질환의 치료 및 진단을 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

인간 항-뮐러 호르몬 타입 Ⅱ 수용체에 대한 단일클론 항체 {MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE HUMAN ANTI-MULLERIAN HORMONE TYPE II RECEPTOR (AMHR-II)}

본 발명은 인간 항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체(AMHR-II)에 대한 단일클론 항체 및 그의 단편과, 난소암과 같은 암 질환을 치료 및 진단하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

난소암은 부인과 종양의 주된 요인으로, 여성의 암 관련 사망 원인의 5번째를 차지하고 있다. 평균 발병율은 100,000명 당 10건으로, 일생을 통해 어떤 시기에 난소암이 존재하는 경우가 유럽 여성의 경우 전체 1-2%이다(Black RJ et al. 1997).

과립막 세포종(GCT: Granulosa cell tumour)은 난소의 악성 종양의 약 5%를 차지하며, 성 기삭-간질 난소 종양(ovarian sex cord-stromal tumour)의 70%를 차지한다. 이것의 악성 가능성은 질병 첫해에는 비교적 낮지만, 원발성 종양을 수술로 제거한 후 최대 30년까지는 재발할 수 있다(Singh-Ranger G et al. 2004). 종양이 복막 전체로 퍼지기 전에 초기에 진단이 이루어진다면, 완전한 수술에 의한 제거로 재발 예후를 상당히 개선시킬 수 있다(Dutertre M. et al., 2001).

상피 난소암은 전체 난소암의 약 80%를 차지하고 있다. 이러한 암을 초기 단계에서 진단하는 경우, 그 생존율은 약 90%이다. 그러나, 공교롭게도, 진단 시점에 이미 약 75%의 여성들은 복부내 질환으로 진행된 상태이다(American Cancer Society Facts and Figures. 2001, www.cancer.org). 이러한 사례들에서, 적절한 치료에도 불구하고 생존율은 약 20-25%에 불과하다(Rapkiewicz AV. et al. 2004).

상피 난소암에 대해서, 특히 이러한 종양들의 약 80%에서 과다 발현되는 암 항원 125(CA125 또는 MUC16)의 순환성 형태 등의 몇가지 분자 마커들이 제안되었다. 그러나, 이의 농도 상승은 월경 및 자궁내막증이나 간 질환과 같은 양성 병태와 연관되어 있을 수 있다.

상피 난소암에 사용되는 주된 치료 전략은 수술과 화학요법이다. 예로, 난소암은 일반적으로 시스플라틴을 기본으로 하는 화학요법으로 치료되고 있지만, 시스플라틴 내성 획득으로 인해 자주 재발하는 편이다(Yahata, H. et al., 2002). 대부분의 환자들은 처음에는 플라티늄 및 파클리탁셀 화학요법에 완전 관해(complete response) 등으로 반응할 수 있지만, 재발율이 대략 85%에 이르고 있다(Gordon AN et al. 2004). 호르몬, 항-혈관신생 인자 및 단일클론 항체를 기초로한 새로운 타겟화된 요법들이 빠르게 개발되고 있다. 단일클론 항체로는, 현재 면역치료제로서 임상 시험중에 있는 CA125에 대한 뮤라인 단일클론 시험 항체인 오레고보맵(oregovomab, OvaRex, AltaRex)(Berek JS et al. 2004), 상피 난소암의 30 내지 70%에서 발현되는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대한 세투시맵(cetuximab)(Ozols RF et al. 2004)이 있다.

따라서, 난소암의 치료를 위한 새로운 치료제가 매우 필요한 실정이다. 또한, 살아있는 개체에서 난소암을 진단하기 위한 민감하고 특이적인 바이오마커로서 사용하기 위한, 새로운 난소암-관련 단백질을 동정할 필요성이 명백한 실정이다.

항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체는 수컷의 생식계 발생과 연관되어 있는 뮐러관 퇴화에 관여한다. 상기 수용체는 인간 상피 난소암 세포에서 빈번하게 발현된다. 난소암 세포의 증식을 저해하는 AMH의 능력이 확인되었으므로, AMHR-II가 항체를 기반으로 한 면역요법의 유용한 타겟이 될 수 있다.

마우스 생식 계통 세포(germ line)의 유전자 조작을 통해 동물 모델에서 AMHR-II 발현이 연구되었다. Dutertre 등(2001)은, AMH 프로모터 SV40 온코진 구조체를 이용한 타겟화된 발암에 의해 형성된, 형질전환성 마우스 유래의 과립막 세포 난소암에서, 기능성 AMHR-II의 발현을 보고하였다. 최근 개발된 마우스 모델에서, Conolly 등(2003)은, AMHR-II의 5' 상류 조절 서열의 통제 하에 놓인 동일한 온코진 구조체를 이용하여, 암컷 마우스의 약 50%에서 상피 난소암이 발생한다는 것을 입증하였다. 또한, Masiakos 등(1999)은, 난소암 환자의 고형 종양과 환자로부터 분리한 복수 세포 샘플인 인간 상피 난소암 세포주에서의 AMHR-II의 발현을 확인하였다. 이들 연구자들은 또한, 유방(Segev DL et al; 2000)이나 전립선(Segev DL et al. 2002)과 같이 다른 조직으로부터 유래된 암 세포주에서의 AMHR-II 발현도 보고하였다. 이러한 데이타는, 인간 암, 특히 난소암에서의 AMHR-II의 매우 특이적인 프로파일을 제시한다.

2004년에, Salhi 등은, 인간 AMHR-II에 대한 단일클론 항체(mAb)를 개발 및 특정화하였고, 인간 과립막 세포 종양(GCT)에서의 강력한 AMHR-II 발현과 인간 고환의 Sertoli 및 Leydig 세포에서의 강력한 AMHR-II 발현을 면역조직화학(IHC)으로 입증하였다. 이들은 또한, 과립막 세포 종양에서 mAb 12G4의 비-경쟁적 결합이 천연 리간드(AMH)를 높은 수준으로 발현하고, 그에 따라 AMHR-II를 발현하는 종양에서 mAb 12G4를 생체내적으로 사용할 수 있다는 것을, 명확하게 입증하였다.

최근 들어, Yuan 등(2006)은, 인간 비-면역 scFv 파지-제시 라이브러리로부터 AMHR-II 특이적인 인간 scFv(단쇄 가변성 단편)룰 선별하는 것에 대해 기술하였다. 또한, 이들은, 항체-기반의 구조체가 이러한 질환을 진단 및 치료하기 위한 목적으로 인간 난소암 세포 상의 AMHR-II를 타겟팅하는 매우 특이적인 수단을 제공할 수 있음을 제시하였다.

본 발명은 인간 항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체(AMHR-II)에 대한 단일클론 항체 및 그의 단편, 및 난소암 등의 암 질환의 치료 및 진단을 위한 이의 용도를 제공한다.

본 발명은 Salhi 등(2004)에 의해 개발된 특이적인 단일클론 항체에 대한 공개적으로 이용가능한 소스를 제공하며, 본 발명자들은 이를 mAb 12G4라고 칭한다. 실제, mAb 12G4를 생산하는 하이브리도마는, 2006년 9월 26일에, 부다페스트 조약에 따라, CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 기탁되었다. 기탁된 하이브리도마의 CNCM 기탁 번호는 I-3673이다. 본 발명자들은 또한 상기 mA 12G4의 경쇄 및 중쇄의 가변성 도메인을 클로닝하고 특정화하였으며, 이에 상기 항체의 상보성 결정 영역(CDR)이 결정되었다.

또한, 본 발명자들은 mAb 12G4를 이용한 면역조직화학에 의해 다양한 종양 유래의 조직 단편에서의 AMHR-II의 발현을 조사하였다. 그 결과, 상피 난소암 뿐만 아니라 각각 악성 상피 증식 및 성 기삭 기질 종양에 속하는, 심각하고 명백한 선암종 및 성체 과립막 세포 종양 등의 특별한 서브타입의 난소암에서 AMHR-II의 특이적인 발현 프로파일이 확인되었다. 이에, 본 발명자들은 AMHK-II가 양성 난소암에 대한 새로운 진단 마커일 수 있으며, mAb 12G4 또는 그 유도체를 이용한 면역요법의 타겟으로서 이용될 수 있음을 입증하였다.

최근, 본 발명자들은 AMHR-II로 안정적으로 형질감염된 GCT 세포주(COV434-pIRES-EGFP-AMHR-II)에서 mAb 12G4가 효율적인 내재화(internalization)를 보임을 면역형광 실험을 통해 입증하였다(Zhang H et al. 2000). 상기 세포주는 약 10⁴ 수용체/세포를 발현한다. 또한, 본 발명자들은, AMHR-II를 발현하는 COV434 세포의 증식을 저해하는 상기 항체의 시험관내 능력을 확인하였다. 또한, 생체내 실험도 수행하여, mAb 12G4가 COV434-pIRESEGFP-AMHR-II 세포로 이종이식된 무흉선 누드 마우스의 모델에서 종양의 증식을 지연시킬 수 있음을 입증하였다.

본 발명의 제1 측면은, 가변성 도메인이 CDR-1에 대한 서열번호 2 또는 6, CDR-2에 대한 서열번호 3 또는 7, 및 CDR-3에 대한 서열번호 4 또는 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄에 관한 것이다.

본 발명의 제2 측면은, 하기 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체(AMHR-II)에 대한 단일클론 항체 또는 그 단편에 관한 것이다:

- 가변성 도메인이 CDR-H1에 대한 서열번호 2, CDR-H2에 대한 서열번호 3 및 CDR-H3에 대한 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진, 하나 이상의 CDR을 포함하는, 중쇄; 및/또는

- 가변성 도메인이 CDR-L1에 대한 서열번호 6, CDR-L2에 대한 서열번호 7 및 CDR-L3에 대한 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진, 하나 이상의 CDR을 포함하는, 경쇄.

본 발명의 제3 측면은, 본 발명에 따른 단일클론 항체나 그의 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 제4 측면은, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 제5 측면은, 전술한 핵산 및/또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 제6 측면은, (i) 전술한 형질전환된 숙주 세포를 항체 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (ii) 발현되는 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제7 측면은 전술한, 항체, 핵산, 벡터 및/또는 숙주 세포와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제8 측면은, 항암 물질이나 증식 저해 물질이 접합된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

본 발명의 제9 측면은 검출가능한 분자나 물질로 표지된 본 발명에 따른 항체에 관한 것이다.

본 발명의 제10 측면은 난소암을 치료하기 위한 목적의 약제 제조를 위한 전술한 항체, 약학 조성물 또는 면역접합체의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 제11 측면은 난소암을 진단 및/또는 모니터링하는 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다.

도 1은 해당 VH 또는 Vκ 유전자 패밀리에 해당되는 적절한 불변부 프라이머와 시그날 프라이머의 조합을 이용한 mAb 12G4의 (A) VH 및 (B) Vκ 영역의 PCR 증폭 산물을 나타낸 것이다. 효과적인 프라이머 세트는 VH 증폭의 경우 450 bp 산물을 증폭시켜야 하며, Vκ 증폭의 경우 390 bp 산물을 증폭시켜야 한다.
도 2는 mAb 12G4의 VL 영역의 핵산 서열과 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 mAb 12G4의 VH 영역의 핵산 서열과 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 안정적으로 형질감염된 COV434-pIRES-EGFP-AMHR-II 1F3 세포주에서 HER2 발현(회색선) 및 AMHR-II 발현(검정선)에 대한 유세포 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 MTS 테스트로 측정한, COV434-pIRES-EGFP-AMHR-II 1F3 세포주에 대한 mAb12G4, 특이적인 mAb 35A7 및 항-HER2 트랜스투주맵 및 FRP5 mAb의 시험관내 항-증식 효과를 나타낸 것이다. 대표적인 2가지 실험을 나타내었다.
도 6은 흉선이 제거된 누드 마우스에서 COV434-AMHRII-1F3 이종이식체의 증식에 대한 생체내 mAb12G4 효과에 대한 예비 실험을 나타낸 것이다. 종양이 결정한 체적 1200 mm³가 되는데 걸리는 시간을 이용하여 Kaplan-Meier 곡선을 그렸다.
도 7은 COV434-AMHRII-1F3 이종이식체에서 AMHR-II 발현을 확인한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다.

정의

"코딩 서열" 또는 예컨대 RNA, 폴리펩타이드, 단백질 또는 효소와 같은 발현 산물을 "코딩하는" 서열은, 발현되었을 때, RNA, 폴리펩타이드, 단백질 또는 효소의 생산을 발생시키는 뉴클레오타이드 서열이며, 즉, 뉴클레오타이드 서열은 폴리펩타이드, 단백질 또는 효소에 대한 아미노산 서열을 코딩한다. 단백질에 대한 코딩 서열은 개시 코돈(일반적으로 ATG)과 중지 코돈을 포함할 수 있다.

본원에서, 특정 단백질(예, 항체나 AMHR-II)이란, 천연 아미노산 서열 뿐만 아니라 그것의 기원 또는 제조 방식과는 상관없이 변이체 및 변형된 형태를 가진 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 천연 아미노산 서열을 가지는 단백질은, 천연으로부터 수득되는 바와 동일한 아미노산 서열(예, 자연적으로 형성되는 AMHR-II)을 가지는 단백질이다. 이러한 천연 서열 단백질은 표준적인 재조합 방법 및/또는 합성 방법을 이용하여 제조하거나, 또는 천연으로부터 분리할 수 있다. 천연 서열 단백질은 특히 자연적으로 형성되는 절단형(truncated form) 또는 가용성 형태(soluble form), 자연적으로 형성되는 변이체 형태(예, 또는 스플라이싱된 형태), 자연적으로 형성되는 대립유전자 변이체 및 번역 후 변형을 포함하는 형태를 망라한다. 천연 서열 단백질은 당화, 인산화 등의 번역 후 변형 또는 일부 아미노산 잔기의 그외 변형을 거친 단백질을 포함한다.

용어 "유전자"는 하나 이상의 단백질 또는 효소 전체 또는 일부를 포함하는 특정 아미노산 서열을 코딩하거나, 이에 대응하는 DNA 서열을 의미하며, 예컨대 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 DNA 조절 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 구조 유전자(structural gene)가 아닌 일부 유전자들은 DNA에서 RNA로 전사될 수는 있지만, 아미노산 서열로 번역되진 않는다. 그외 유전자들은 구조 유전자의 조절자로서 또는 DNA 전사의 조절자로서 기능할 수 있다. 특히, 유전자라는 용어는 단백질을 코딩하고 있는 게놈 서열, 즉 조절자, 프로모터, 인트론 및 엑손 서열을 포함하는 서열을 의미할 수 있다.

본원에서, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 10개 이상의, 바람직하기로는 12개 이상의, 더 바람직하기로는 15개 이상의, 보다 더 바람직하기로는 20개 이상의, 바람직하게는 100개 이하의, 더 바람직하게는 70개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 의미한다.

"기능-보존적 변이체(function-conservative variant)"는, 예를들어, ㅇ떤 아미노산을 비슷한 성질(예, 극성, 수소 결합 가능성, 산성, 염기성, 소수성, 방향족 등)을 가진 아미노산으로 치환하는 등의, 폴리펩타이드의 전체 구조(conformation)와 기능을 변형시키지 않으면서, 단백질이나 효소의 해당 아미노산 잔기가 바뀐 것이다. 보존된 것으로 표시된 것 이외의 아미노산들은 단백질에서 상이하여, 유사한 기능을 가진 임의의 2종의 단백질들 간에 단백질 또는 아미노산 서열의 유사성 %는 달라질 수 있으며, 예컨대 클러스터 방법에 의한 것과 같은 정렬 방법에 따라 측정할 때 70% 내지 99%일 수 있으며, 유사성은 MEGALIGN 알고리즘을 기초로 한다. "기능-보존적 변이체"는 또한 BLAST 또는 FASTA 알고리즘에 의해 측정할 때 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 85% 이상, 보다 더 바람직하기로는 90% 이상, 더욱 더 바람직하기로는 95% 이상의 아미노산 동일성을 가지며, 비교되는 천연 단백질이나 모 단백질과 동일하거나 실질적으로 유사한 특성 또는 기능을 가진, 폴리펩타이드를 포함한다.

2종의 아미노산 서열들에서, 더 짧은 서열의 전체 길이에서 아미노산의 80% 이상이, 바람직하기로는 85% 이상이, 바람직하기로는 90% 이상이 동일하거나, 약 90% 이상이, 바람직하기로는 95% 이상이 유사할(기능적으로 동일한) 경우, 이들 2종의 아미노산 서열은 "실질적으로 상동"하거나 또는 "실질적으로 유사"하다. 바람직하기로는, 유사하거나 또는 상동한 서열은 예컨대 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 연쇄 프로그램(pileup program)이나, 또는 BLAST, FASTA 등의 임의의 서열 비교 알고리즘을 이용한 정렬을 통해 동정된다.

본 발명에서, "항체" 또는 "면역글로불린"은 동일한 의미이며, 본 발명에서 동급으로 사용된다. 항체는, 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항원 결합부를 포함하는 분자를 의미한다. 이처럼, 항체라는 용어는 전체 항체 분자 뿐만 아니라 항체의 단편과 항체의 변이체(유도체 포함) 및 항체 단편을 망라한다. 천연 항체에서는, 2개의 중쇄가 서로 이황화 결합으로 연결되어 있으며, 각 중쇄는 이황화 결합에 의해 경쇄와 연결되어 있다. 경쇄는 람다(λ) 및 카파(κ) 2가지 타입이 있다. 항체 분자의 기능적인 활성을 결정하는 5가지의 주요 중쇄 클래스: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 있다. 각 쇄는 개별 서열 도메인을 포함한다. 경쇄는 2개의 도메인, 가변성 도메인(VL)와 불변 도메인(CL)을 포함한다. 중쇄는 4개의 도메인, 하나의 가변성 도메인(VH)과 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3, 합쳐서 CH라 함)을 포함한다. 경쇄와 중쇄의 가변성 영역(VL, VH)은 결합 인지와 항원 특이성을 결정한다. 경쇄 및 중쇄의 불변 영역 도메인은 항체 쇄의 조립, 분비, 경-태반 이동성, 보체 결합 및 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. Fv 단편은 면역글로불린의 Fab 단편의 N-말단 부분이며, 하나의 경쇄의 가변성 영역과 하나의 중쇄의 가변성 영역으로 이루어진다. 항체의 특이성은 항체 조합 부위(antibody combining site)와 항원 결정부(antigenic determinant) 간의 구조적 상보성(structural complementarity)에 존재한다. 항체 조합 부위는 본래 초가변부 또는 상보성 결정부(complementarity determining region: CDR)로부터 유래된 잔기들로 구성된다. 가끔, 비-초가변부 또는 프래임워크 영역(FR) 유래 잔기들이 전체 도메인 구조, 따라서 조합 부위에 영향을 미친다. 상보성 결정부 또는 CDR은, 함께 천연 면역글로불린 결합부의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 규정하는, 아미노산 서열을 나타낸다. 각 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 및 H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3으로 나타내는 3가지의 CDR을 가지고 있다. 따라서, 항원-결합부는 각 중쇄 및 경쇄 V 영역으로부터 유래된 CDR 세트를 포함하는, 6가지의 CDR을 포함한다.

프래임워크 영역(FR)은, CDR 사이에 개입되어 있는 아미노산 서열, 즉 Kabat, et al (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)에 의해 정의된 바에 따르면, 단일 종에서 상이한 면역글로불린들 사이에서 비교적 보존되어 있는 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 가변성 영역의 일부분을 의미한다. 본 명세서에서, "인간 프래임워크 영역"은 자연적으로 형성되는 인간 항체의 프래임워크 영역과 실질적으로 동일한(약 85% 이상, 특히 90%, 95%, 또는 100% 이상) 프래임워크 영역이다.

용어 "단일클론 항체" 또는 "mAb"는 본원에서 하나의 아미노산 조합으로 이루어진 항체 분자, 즉 하나의 B 세포 클론 또는 하이브리도마에서 제조되며, 특이적인 항원에 대한 항체 분자를 의미한다.

용어 "키메라 항체"는 인간 이외의 동물로부터 유래된 항체의 VH 도메인과 VL 도메인, 다른 항체, 특이적인 인간 항체의 CH 도메인과 CL 도메인을 포함하는, 조작된 항체를 의미한다. 인간을 제외한 동물로서, 마우스, 랫, 햄스터, 토끼 등의 모든 동물을 사용할 수 있다.

용어 "인간화된 항체"는 프래임워크 또는 "상보성 결정 영역(CDR)"이 모체 면역글로불린과 비교하여 특이성이 상이한 공여 면역글로불린으로부터 유래된 CDR을 포함하도록 변형된, 항체를 의미한다. 바람직한 예에서, 마우스 CDR을 인간 항체의 프래임워크 영역에 이식하여 "인간화된 항체"를 제조한다.

"항체 단편"은 온전한 항체, 바람직하기로는 온전한 항체의 항체 결합 영역 또는 가변성 영역의 일부분을 포함한다. 항체 단편의 예로는, 항체 단편으로부터 만들어지는 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, 다이아바디(diabody) 및 다중 특이적인 항체를 포함한다. 용어 "Fab"는 약 50,000 분자량을 가지며 항원 결합 활성이 있는 항체 단편으로, IgG를 프로테아제인 파파인으로 처리하여 수득한 단편들 중에서 H 체인의 N 말단 측의 대략 절반과 전체 L 체인이 이황화 결합을 통해 서로 결합된 형태이다.

용어 "F(ab')2"는 분자량이 약 100,000이고 항원 결합 활성을 가지고 있는 항체 단편으로, IgG를 프로테아제인 펩신으로 처리하여 수득한 단편들 중에서 힌지 영역의 이황화 결합을 통해 결합되어 있는, Fab 보다 조금 더 큰 단편이다.

용어 "Fab'"은 분자량이 약 50,000이고 항원 결합 활성을 가지고 있는 항체 단편으로, F(ab')2의 힌지 영역의 이황화 결합의 절단에 의해 수득된다.

단쇄 Fv("scFv") 폴리펩타이드는 펩타이드-코딩 링커에 의해 연결된 유전자를 코딩하는 VH 및 VL를 포함하는 유전자 융합체로부터 일반적으로 발현되는, 공유 결합으로 연결된 VH::VL 헤테로다이머이다. 본 발명의 인간 scFv 단편은 바람직하기로는 유전자 재조합 기법을 이용하여 적절한 구조를 취하는 CDR을 포함한다.

"dsFv"는 이황화 결합에 의해 안정화된 VH::VL 헤테로다이머이다. 2가 및 다가 항체 단편은 1가 scFv들의 조립에 의해 자발적으로 형성될 수 있으며, 또는 2가 sc(Fv)₂등과 같이 펩타이드 링커에 의해 1가 scFv들의 커플링에 의해 만들어질 수 있다.

용어 "다이아바디"는 2개의 항원 결합부를 가지고 있으며, 단편이 동일한 폴리펩타이드(VH-VL)에서 경쇄 가변성 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변성 도메인(VH)를 포함하고 있는, 소형 항체 단편들을 지칭한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인들 간에 쌍 형성을 허용할 만큼 짧은 링커를 이용하여, 도메인이 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원 결합부를 만들게 한다.

용어 "하이브리도마"는, 인간을 제외한 포유류를 항원으로 면역화하여 제조한 B 세포를, 항원 특이성을 가진 원하는 단일클론 항체를 생산하는 마우스 등으로부터 유래된 골수종 세포와 세포 융합시켜, 만든 세포이다.

용어 "AMHR-II"는 항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체이다. AMHR-II 유전자는, 랫(Baarends WM et al. 1994), 토끼(di Clemente N. et al. 1994), 인간(hAMHR-II) (Imbeaud S et al. 1995) 및 마우스(mAMHR-II)(Behringer RR et al. 1990)에서 분리되었다. 상기 유전자는, 11개의 엑손을 포함하고 있으며, 엑손 1-3은 인간 수용체에서 127개의 아미노산으로 구성된, 세포외 도메인을 코딩하며, 엑손 4는 26개의 아미노산으로 구성된 트랜스멤브레인 도메인을 코딩한다. 예측되는 AMHR-II의 서열은 TGF-베타 패밀리의 다른 타입 II 수용체와 대략 30%의 전체 유사성을 공유하고 있다. AMHR-II는 천연 조직 타겟인 생식 장기와 생식선에서 특이적으로 발현된다. AMH(항-뮐러 호르몬)가 파라크린 기전에 의해 퇴화를 유도하는 뮐러관에서, AMHR-II는 간엽 조직에서 발현된다(Tsuji M et al. 1992). AMHR-II 또는 AMH에서의 변이는 형질전환된 수컷 마우스에서 수컷의 성적 이상, 예컨대 가성 반응양증(pseudohermaphroditism)(인간에서는 영구적인 뮐러관 증후군(PMDS)이라고 함)을 초래한다(Behringer RR et al. 1990). 여성에서는, AMHR-II 발현은 뮐러관의 길이를 따라 유지되며, 정상 자궁과 임신중인 자궁에서 검출된다(Teixeira J et al. 1996). AMHR-II- 또는 AMH-결핍성 암컷 마우스는 정상이며 젊은 성체와 같이 번식력을 가진다. AMH 및 AMHR-II는 고환의 Sertoli 및 난소의 과립막 세포와, 각각 Smat-1(Dutertre M et al. 1997) 및 AT29C(Racine C et al. 1998)와 같이 유래된 세포에서 함께 발현된다. AMHR-II의 단독 발현은 설치류의 Leydig 세포에서 검출되지만, 뮤라인 난소 표면 상피에서는 검출되지 않는다(di Clemente et al. 1994; Baarends WM et al. 1995). 인간 AMHR-II의 폴리펩타이드 서열은 기탁번호 U29700로 유전자은행 데이타베이스에 기탁되어 있다.

"정제된" 및 "분리된"은 폴리펩타이드(즉, 본 발명의 항체 단편)나 뉴클레오타이드 서열을 언급할 때, 지칭한 분자가 동일한 타입의 다른 생물학적 마크로분자가 실질적으로 없는 상태로 존재하는 것을 의미한다. 본원에서, "정제된"이라는 용어는 바람직하게는 동일한 타입의 생물학적 마크로분자가 75 중량% 이상으로, 더 바람직하기로는 85 중량% 이상으로, 보다 더 바람직하기로는 95 중량% 이상으로, 가장 바람직하기로는 98 중량% 이상으로 존재하는 것을 의미한다. 특정 폴리펩타이드를 코딩하는 "분리된" 핵산 분자는, 대상 폴리펩타이드를 코딩하지 않는 다른 핵산 분자는 실질적으로 없지만, 조성물의 기본적인 특성에 유해하게 작용하지 않는 일부 부가적인 베이스나 모이어티를 포함할 수 있는, 핵산 분자를 의미한다.

본원에서, "개체"라는 용어는 설치류, 고양이, 개 및 영장류와 같은 포유류를 의미한다. 바람직하기로는, 본 발명에서 대상은 인간이다.

본 발명의 항체, 면역글로불린 쇄 및 폴리펩타이드 :

본 발명은 인간 AMHR-II에 대한 분리된 단일클론 항체 또는 그의 단편을 제공하다. 특히, 본 발명자들은 2006년 9월 26일자로 부다페스트 조약에 근거하여, CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)에 mAb 12G4를 생산하는 하이브리도마를 기탁하였다. 기탁된 하이브리도마의 CNCM 기탁 번호는 I-3673이다. 본 발명자들은 상기 mAb 12G4의 경쇄와 중쇄의 가변성 도메인을 클로닝하고 특정화하여, 표 1과 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이 상기 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 도메인을 결정하였다:

MAb 12 G4 도메인	서열
VH	QVQLQ QSGPE LVKPG ASVRM SCKAS GYTFT SYHIH WVKQR PGQGL EWIGW IYPGD DSTKY NEKFK GKTTL TADKS SSTAY MLLSS LTSED SAIYF CTRGD RFAYW GQGTL VTVSA (서열번호 1)
VH CDR1	GYTFT SYH (서열번호 2)
VH CDR2	IYPGD DST (서열번호 3)
VH CDR3	TRGD R FAY (서열번호 4)
VL	QIVLT QSPAI MSASL GEGIT LTCSA SSSVR YIHWY QQKSG TSPKL LIYST SNLAS GVPSR FSGSG SGTFH SLTISS VEAED AADYY CLQWS SYPWT FGGGT KLEIK (서열번호 5)
VL CDR1	SSVRY (서열번호 6)
VL CDR2	STS (서열번호 7)
VL CDR3	LQWSS YPWT (서열번호 8)

이에, 본 발명은, 가변성 도메인이 CDR-H1에 대한 서열번호 2, CDR-H2에 대한 서열번호 3 및 CDR-H3에 대한 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 중쇄를 포함하며, 인간 AMHR-II에 대한 특이성을 가지고 있는 단일클론 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 가변성 도메인이 CDR-L1에 대한 서열번호 6, CDR-L2에 대한 서열번호 7 및 CDR-L3에 대한 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 경쇄를 포함하며, 인간 AMHR-II에 대한 특이성을 가지고 있는 단일클론 항체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은, 가변성 도메인이 CDR-H1에 대한 서열번호 2 또는 서열번호 6, CDR-H2에 대한 서열번호 3 또는 서열번호 7 및 CDR-H3에 대한 서열번호 4 또는 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 중쇄; 및/또는 가변성 도메인이 CDR-H1에 대한 서열번호 2 또는 서열번호 6, CDR-H2에 대한 서열번호 3 또는 서열번호 7 및 CDR-H3에 대한 서열번호 4 또는 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 경쇄를 포함하며, 인간 AMHR-II에 대한 특이성을 가지고 있는 단일클론 항체에 관한 것이다.

본 발명의 단일클론 항체는, 가변성 도메인이 CDR-H1에 대한 서열번호 2, CDR-H2에 대한 서열번호 3 및 CDR-H3에 대한 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 중쇄; 및/또는 가변성 도메인이 CDR-L1에 대한 서열번호 6, CDR-L2에 대한 서열번호 7 및 CDR-L3에 대한 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 경쇄를 포함할 수 있다.

본 발명의 단일클론 항체는, 가변성 도메인이 CDR-H1에 대한 서열번호 2, CDR-H2에 대한 서열번호 3 및 CDR-H3에 대한 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 경쇄; 및/또는 가변성 도메인이 CDR-L1에 대한 서열번호 6, CDR-L2에 대한 서열번호 7 및 CDR-L3에 대한 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 중쇄를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명은, 하기 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체(AMHR-II)에 대한 단일클론 항체를 제공한다:

- 가변성 도메인이

a) CDR-H1 영역에 대한 서열번호 2, CDR-H2 영역에 대한 서열번호 3 및 CDR-H3 영역에 대한 서열번호 4; 또는

b) CDR-H1 영역에 대한 서열번호 6, CDR-H2 영역에 대한 서열번호 7 및 CDR-H3 영역에 대한 서열번호 8을 포함하는, 중쇄

및/또는

- 가변성 도메인이

c) CDR-L1 영역에 대한 서열번호 6, CDR-L2 영역에 대한 서열번호 7 및 CDR-L3 영역에 대한 서열번호 8; 또는

d) CDR-L1 영역에 대한 서열번호 2, CDR-L2 영역에 대한 서열번호 3 및 CDR-L3 영역에 대한 서열번호 4를 포함하는, 경쇄.

특정 예에서, 상기 항체의 중쇄 가변성 도메인은 서열번호 1 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 가지며, 및/또는 경쇄 가변성 도메인은 서열번호 5 또는 1로 기재된 아미노산 서열을 가진다.

상기 항체들은 당업계에 잘 알려져 있는 모든 기법들에 의해 제조할 수 있다. 특히, 상기 항체는 하기에 기술된 기법에 의해 제조된다.

일 예에서, 본 발명의 단일클론 항체는 뮤라인 항체이다. 특히, 상기 뮤라인 항체는 CNCM 기탁번호 I-3673으로 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있다.

다른 예에서, 본 발명의 단일클론 항체는 키메라 항체, 바람직하기로는 키메라 마우스/인간 항체이다. 특히, 상기 마우스/인간 키메라 항체는 CNCM -I-3673으로 기탁된 하이브리도마로부터 수득가능한 항체의 가변성 도메인을 포함할 수 있다.

다른 예에서, 본 발명의 단일클론 항체는 인간화된 항체이다. 특히, 상기 인간화된 항체에서, 가변성 도메인은 인간 어셉터 프래임워크 영역과, 선택적으로 존재한다면 인간 불변 도메인, 및 상기에서 정의된 바와 같이 마우스 CDR 등의 인간을 제외한 유기체의 공여 CDR을 포함한다.

본 발명은, 비제한적으로, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디 등을 포함하는 상기 단일클론 항체의 단편; 및 항체 단편으로부터 만들어진 다중 특이적인 항체를 추가적으로 제공한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은, 가변성 도메인이 CDR-1에 대한 서열번호 2 또는 서열번호 6, CDR-2에 대한 서열번호 3 또는 서열번호 7 및 CDR-3에 대한 서열번호 4 또는 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 하나 이상의 CDR을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 가변성 도메인이 하기를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄에 관한 것이다:

- CDR-1에 대한 서열번호 2, CDR-2에 대한 서열번호 3 및 CDR-3에 대한 서열번호 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 하나 이상의 CDR; 또는

- CDR-1에 대한 서열번호 6, CDR-2에 대한 서열번호 7 및 CDR-3에 대한 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 하나 이상의 CDR.

바람직한 예에서, 본 발명은 가변성 도메인이 하기를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄에 관한 것이다:

- CDR-1에 대한 서열번호 2, CDR-2에 대한 서열번호 3 및 CDR-3에 대한 서열번호 4; 또는

- CDR-1에 대한 서열번호 6, CDR-2에 대한 서열번호 7 및 CDR-3에 대한 서열번호 8.

일 예에 있어서, 본 발명에 따른 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄는 서열번호 1 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 가지는 가변성 도메인을 포함한다.

일 예로, 본 발명에 따른 면역글로불린 쇄는 중쇄 또는 경쇄이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 면역글로불린에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 면역글로불린은 상기에서 정의된 중쇄 또는 경쇄를 포함할 수 있다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5; 서열번호 6; 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가진 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 분리된(예, 정제된) 형태로 사용될 수 있으며, 또는 막이나 지질 비히클(예, 리포좀) 등과 같이 벡터에 포함될 수 있다.

핵산, 벡터 및 재조합 숙주 세포

본 발명의 다른 과제는 본 발명의 단일클론 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다.

구체적인 예로, 본 발명은 mAb 12G4의 VH 도메인 또는 mAb 12G4의 VL 도메인을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

전형적으로, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA 분자이며, 이는, 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같이 임의의 적합한 벡터에 포함될 수 있다.

용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주에 형질전환되어 도입된 서열의 발현(예, 전사 및 번역)을 촉매하도록, DNA 또는 RNA 서열(예, 외래 유전자)를 숙주 세포에 도입시킬 수 있는 비히클을 의미한다.

따라서, 본 발명의 다른 과제는 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

이러한 벡터는 개체에 투여시 상기 폴리펩타이드의 발현을 초래하거나 지시하기 위해 프로모터, 인핸서, 종결자 등과 같은 조절 요소를 포함할 수 있다. 동물 세포용 발현 벡터에 사용되는 프로모터 및 인핸서의 예로는, SV40의 초기 프로모터 및 인핸서(Mizukami T. et al. 1987), 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 LTR 프로모터 및 인핸서(Kuwana Y et al. 1987), 면역글로불린 H 쇄의 프로모터(Mason JO et al. 1985) 및 인핸서(Gillies SD et al. 1983) 등이 있다.

인간 항체 C 영역을 코딩하는 유전자가 삽입되어 발현될 수만 있다면, 모든 동물 세포용 발현 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터의 예로는, pAGE107(Miyaji H et al. 1990), pAGE103(Mizukami T et al. 1987), pHSG274(Brady G et al. 1984), pKCR(O'Hare K et al. 1981), pSG1 beta d2-4-(Miyaji H et al. 1990) 등이 있다.

플라스미드의 다른 예로는, 예컨대 pUC, pcDNA, pBR 등과 같이, 복제 오리진을 포함하는 복제성 플라스미드(replicating plasmid)나 통합성 플라스미드(integrative plasmid)가 있다.

바이러스 벡터의 다른 예로는, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 및 AAV 벡터가 있다. 이러한 재조합 바이러스는, 패키징 세포를 형질감염시키거나 또는 헬퍼 플라스미드나 바이러스를 일시 형질감염시킴으로써 등과 같이, 당업계에 공지된 기법으로 제조할 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예로는 PA317 세포, PsiCRIP 세포, GPenv+ 세포, 293 세포 등이 있다. 이러한 복제-결함성 재조합 바이러스에 대한 상세한 제조 프로토콜은, 예컨대 WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 및 WO 94/19478에서 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 과제는, 본 발명의 핵산 및/또는 벡터로 형질감염, 감염 또는 형질전환된, 세포에 관한 것이다.

용어 "형질전환"은 "외래"(즉, 외인성 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열이 숙주 세포에 도입되어, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여, 원하는 물질, 전형적으로는 도입된 유전자나 서열에 의해 코딩되는 단백질이나 효소를 생산하게 되는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하여 발현하는 숙주 세포는 "형질전환"된 것이다.

본 발명의 핵산을 사용하여 적합한 발현 시스템에서 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 용어 "발현 시스템"은 예컨대 벡터에 의해 운반되어 숙주 세포에 도입된 외래 DNA에 의해 코딩된 단백질을 발현하는데 적합한 조건 하에 있는 숙주 세포 및 적합한 벡터를 의미한다.

일반적인 발현 시스템으로는 E. coli 숙주 세포 및 플라스미드 벡터, 곤충 숙주 세포와 베큘로바이러스 벡터, 및 포유류 숙주 세포와 벡터가 있다. 숙주 세포의 다른 예로는, (박테리아 등의) 원핵생물의 세포 및 (효모, 포유류, 곤충, 식물 세포 등의) 진핵생물의 세포가 있으나, 이들로 한정되는 것으로 아니다. 구체적인 예로는, E. coli, 클루베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 효모, 포유류 세포주(예, Vero 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등) 뿐만 아니라 일차 또는 확립된 포유류 세포 배양물(예, 림프모세포, 섬유모세포, 배아세포, 상피 세포, 신경 세포, 지방세포 등)이 있다. 또한, 그 예로는, 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8.653 세포(ATCC CRL1580), 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(이하, "DHFR 유전자"라 함)에 결함이 있는 CHO 세포(Urlaub G et al; 1980), 랫 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(ATCC CRL1662, 이하 "YB2/0 세포"라 함) 등이 있다. YB2/0 세포는, 키메라 또는 인간화된 항체의 ADCC 활성이 세포에서 발현되었을 때 강화되기 때문에, 바람직하다.

본 발명은 또한, (i) 전술한 재조합 핵산이나 벡터를 컴피턴트 숙주 세포에 시험관내 또는 생체외 도입하는 단계, (ii) 수득되는 재조합 숙주 세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양하는 단계 및 (iii) 선택적으로, 항체 또는 폴리펩타이드를 발현하거나/하며 분비하는 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 본 발명의 항체나 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 그러한 재조합 숙주 세포는 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드의 제조에 이용될 수 있다.

본 발명의 항체 제조 방법:

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 비제한적으로 모든 화학적, 생물학적, 유전학적 또는 효소적 기법 등의 당업계에 공지된 모든 기법들을 단독으로 또는 조합함으로써 제조할 수 있다.

원하는 서열의 아미노산 서열을 알고 있다면, 당업자는 폴리펩타이드의 제조를 위한 표준적인 기법에 의해 상기 항체나 폴리펩타이드를 쉽게 제조할 수 있다. 예를 들면, 당업자는 바람직하기로는 상업적으로 이용가능한 펩타이드 합성 장치(예, Applied Biosystems, Foster City, California)를 이용하여 제조사의 지시에 따라, 공지된 고상 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 당업계에 잘 알려진 바와 같은 재조합 DNA 기법에 의해 합성할 수 있다. 예를 들면, 이들 단편들은, 원하는 (폴리)펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터에 삽입한 후, 상기 벡터를 나중에 공지된 기법을 이용하여 이를 분리할 수 있는, 원하는 폴리펩타이드를 발현시킬 적합한 진핵 또는 원핵 숙주에 도입한 후, DNA 발현 산물로서 수득할 수 있다.

구체적으로, 본 발명은, (i) 본 발명에 따른 형질전환된 숙주 세포를 항체 또는 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (ii) 발현된 항체 또는 폴리펩타이드를 회수하는 단계로 이루어진 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 예컨대 단백질 A-세파로스, 하이드록시아파티트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피 등의 통상적인 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지로부터 적절하게 분리한다.

구체적인 예로, 본 발명의 인간 키메라 항체는, 전술한 바와 같이 VL 및 VH를 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 이를 인간 항체 CH 및 인간 항체 CL을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 동물 세포용 발현 벡터에 삽입하여 인간 키메라 항체 발현 벡터를 구축하는 단계, 및 상기 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 코딩 서열을 발현시킴으로써, 제조할 수 있다.

인간 키메라 항체의 CH 도메인으로서, 인간 면역글로불린에 속하는 모든 영역일 수 있으며, IgG 클래스의 CH 도메인이 적합하며 gG1, IgG2, IgG3 및 IgG4와 같은 IgG 클래스에 속하는 서브클래스들 중 어느 하나도 사용할 수 있다. 또한, 인간 키메라 항체의 CL로서는, Ig에 속하는 모든 영역일 수 있으며, 카파 클래스나 람다 클래스의 CL을 사용할 수 있다.

키메라 항체의 제조 방법은 통상적인 재조합 DNA를 포함하며, 유전자 형질감염 기법들은 당업계에 잘 알려져 있다(Morrison SL. et al. (1984), 특허문헌 US 5,202,238; 및 US 5,204, 244).

본 발명의 인간화된 항체는, 전술한 CDR 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, 이를 (i) 인간 항체와 동일한 중쇄 불변부 영역과 (ii) 인간 항체와 동일한 경쇄 불변부 영역을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 동물 세포의 발현 벡터에 도입하여 인간화된 항체 발현 벡터를 구축하는 단계, 및 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 유전자를 발현시킴으로써, 제조할 수 있다.

인간화된 항체 발현 벡터는 항체 중쇄를 코딩하는 유전자와 항체 경쇄를 코딩하는 유전자가 개별 벡터에 존재하는 타입으로, 또는 상기 유전자들 모두가 동일한 벡터에 존재하는 형태(텐덤 타입)일 수 있다. 인간화된 항체 발현 벡터의 구축의 용이성, 동물 세포로의 도입 용이성, 및 동물 세포에서의 항체 H 및 L 쇄의 발현 수준 간의 균형성 측면에서, 텐덤 타입의 인간화된 항체 발현이 바람직하다(Shitara K et al. 1994). 텐덤 타입의 인간화된 항체 발현 벡터의 예로는 pKANTEX93(WO 97/10354), pEE18 등이 있다.

통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질전환 기법을 기초로 하여 인간화된 항체를 제조하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다(예, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985). 항체는, 예컨대 CDR-그래프팅(EP 239,400; PCT 공개 WO 91/09967; 미국 특허 5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089), 버니어링(veneering) 또는 리서르피스(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan EA (1991); Studnicka GM et al. (1994); Roguska MA. et al. (1994)), 및 쇄 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 5,565,332) 등의 당업계에 공지된 다양한 기법을 이용하여 인간화할 수 있다. 상기한 항체를 제조하기 위한 일반적인 재조합 DNA 기법 역시 알려져 있다(예, 유럽 특허 출원 EP 125023 및 국제 특허 WO 96/02576).

본 발명의 Fab는 인간 AMHR-II와 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제인 파파인으로 처리함으로써 수득할 수 있다. 또한, Fab는, 원핵 발현 시스템용 벡터나 또는 진핵 발현 시스템용 벡터에 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 삽입하고, 이 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 생물에 도입하여 Fab를 발현시킴으로써, 제조할 수 있다.

본 발명의 F(ab')2는 AMHR-II와 특이적으로 반응하는 항체를 프로테아제인 펩신으로 처리함으로써 수득할 수 있다. 또한, F(ab')2는 티오에테르 결합이나 이황화 결합을 통해 후술되는 Fab'와 결합시킴으로써, 제조할 수 있다.

본 발명의 Fab'은 hAMHR-II에 특이적으로 반응하는 F(ab')2를 환원제인 디티오트레이톨로 처리함으로써 수득할 수 있다. 또한, Fab'은 항체의 Fab' 단편을 코딩하는 DNA를 원핵 또는 진핵용 발현 벡터에 삽입하고, 이를 (적절한) 원핵 또는 진핵 생물에 도입하여 발현을 수행함으로써, 제조할 수 있다.

본 발명의 scFv는 전술한 VH 및 VL를 코딩하는 DNA를 수득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, DNA를 원핵 또는 진핵 발현 벡터에 삽입한 다음, 이 발현 벡터를 (적절한) 원핵 또는 진핵 생물에 도입하여 scFv를 발현함으로써, 제조할 수 있다. 인간화된 scFv 단편을 제조하기 위해, CDR 그래프팅이라고 하는 잘 알려져 있는 기법을 이용할 수 있으며, 이러한 기법은 공여체 scFv 단편 유래의 상보성 결정 영역(CDR)을 선택하는 단계 및 이를 3차 구조가 알려져 있는 인간 scFv 단편 프래임워크 상에 그래프팅하는 단계를 포함한다(예, W0 98/45322; WO 87/02671; US 5,859,205; US 5,585,089; US 4,816,567; EP 0173494 참조).

본 발명의 항체의 변형

본원에 기술된 아미노산 서열 변형(들)을 고려한다. 예컨대, 항체의 결합 친화성 및/또는 그외 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 인간화된 항체를, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에, 인간을 제외한 동물로부터 유래된 항체의 VH 및 VL의 CDR만 간단하게 이식하여 제조하였을 때, 항원 결합 활성은 인간을 제외한 동물로부터 유래된 오리지날 항체의 활성에 비해 감소된다는 것은 공지된 사실이다. CDR과 FR에서 인간을 제외한 항체의 VH 및 VL의 수개의 아미노산 잔기는, 항원 결합 활성과 직접 또는 간접적으로 연관되어 있는 것으로 생각된다. 그래서, 이들 아미노산 잔기를 인간 항체의 VH 및 VL의 FR 유래의 아미노산 잔기로 치환하면, 이러한 결합 활성은 감소될 것이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열들에서, 인간 CDR로 그래프트된 항체에서, 항체의 결합과 직접 관련있거나, CDR의 아미노산 잔기와 상호작용하거나, 항체의 3차 구조를 유지하고, 항원의 결합과 직접 관련있는, 아미노산 잔기를 동정하기 위한 시도를 수행하여야 한다. 감소된 항원 결합 활성은 동정된 아미노산을 인간을 제외한 동물 유래의 오리지날 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써 증가시킬 수 있었다.

변형 및 변경은 본 발명의 항체의 구조, 및 이를 코딩하는 DNA 서열에서 행해질 수 있으며, 원하는 특성을 가진 항체 및 폴리펩타이드를 코딩하는 기능성 분자를 여전히 수득할 수 있다.

아미노산 변경은 표 2에 따라 DNA 서열에서 코돈을 바꿈으로써 달성할 수 있다.

아미노산			코돈
알라닌	Ala	A	GCA, GCC, GCG, GCU
시스테인	Cys	C	UGC, UGU
아스파르트산	Asp	D	GAC, GAU
글루탐산	Glu	E	GAA, GAG
페닐알라닌	Phe	F	UUC, UUU
글리신	Gly	G	GGA, GGC, GGG, GGU
히스티딘	His	H	CAC, CAU
이소루신	Ile	I	AUA, AUC, AUU
라이신	Lys	K	AAA, AAG
루신	Leu	L	UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
메티오닌	Met	M	AUG
아스파라긴	Asn	N	AAC, AAU
프롤린	Pro	P	CCA, CCC, CCG, CCU
글루타민	Gln	Q	CAA, CAG
아르기닌	Arg	R	AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
세린	Ser	S	AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
트레오닌	Thr	T	ACA, ACC, ACG, ACU
발린	Val	V	GUA, GUC, GUG, GUU
트립토판	Trp	W	UGG
타이로신	Tyr	Y	UAU

폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변경하는데 있어, 아미노산의 수상 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는데 있어 수상 아미노산 인덱스의 중요성은 당업계에서 일반적으로 인지되어 있다. 아미노산의 상대적인 수상 특성이 제조되는 단백질의 2차 구조에 기여하며, 단백질과 다른 분자, 예컨대 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 규정하는 것으로 받아들여지고 있다. 각 아미노산에는 그것의 소수성을 기초로 수상 인덱스가 할당되며, 전하 특성은 다음과 같다: 이소루신 (+4.5); 발린 (+4.2); 이소루신 (+3.8) ; 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (<RTI 3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

또한, 본 발명의 다른 과제는 본 발명의 항체의 기능-보존적 변이체를 포함한다.

예컨대, 활성을 인지할 수 있을 정도로 감소시키지 않으면서 단백질 구조상에 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있다. 단백질의 상호작용력과 특성은 생물학적 기능적 활성을 규정하므로, 특정 아미노산 치환을 단백질 서열과 이의 DNA 코딩 서열에 가할 수 있지만, 그래도 유사한 특성을 가진 단백질이 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 서열 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 해당 DNA 서열에, 이의 생물학적 활성에 인지가능한 수준의 소실없이, 다양한 변화를 가할 수 있는 것으로 생각된다.

특정 아미노산을, 비슷한 수상 인덱스 또는 값을 가진 다른 아미노산으로 치환할 수 있으며, 유사한 생물학적 활성을 가진 단백질로 여전히 제조되며, 즉 생물학적 기능적으로 동급의 단백질을 여전히 수득할 수 있는 것으로 알려져 있다.

상기에서 개략적으로 기술한 바와 같이, 아미노산 치환은 따라서 일반적으로 아미노산 측쇄 치환의 상대적인 유사성을 기초로, 예컨대 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기초로 한다. 고려되는 전술한 다양한 특징을 취하는 치환의 예들은 본 발명이 속하는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발신, 루신 및 이소루신이 있다.

작동자 기능(effector function), 예컨대 항체의 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC: antigen-dependent cell-mediated cytotoxicity) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity)을 강화하기 위한 측면에서, 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 다르게는 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입하여, 이 영역에서 쇄간 이황화 결합 형성을 허용할 수 있다. 그래서 제조되는 동형이량체 항체는 개선된 내재화 능력(internalization capability) 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다(Caron PC. et al. 1992; 및 Shopes B. 1992).

본 발명의 항체의 다른 타입의 아미노산 변형이, 항체의 오리지날 당화 패턴을 변형시키는데 유용할 수 있다.

"변이"는 항체에서 확인되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결손 및/또는 항체에 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부분의 부가를 의미한다.

항체의 당화는 전형적으로 N-연결된다. "N-연결된"은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩타이드 서열, 아스파라긴-X-세린과 아스파라긴-X-트레오닌(상기 X 둘다는 프롤린을 제외한 모든 아미노산임)은, 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인지 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드에서 이들 트리펩타이드 중 어느 하나의 존재는, 잠재적인 당화 부위를 만든다. 항체에 당화 부위의 부가는, (N-연결된 당화 부위를 위한) 전술한 트리펩타이드 서열들 중 하나 이상을 포함하도록 아미노산 서열을 변이시켜, 편리하게 달성한다.

다른 타입의 공유 변형은 항체에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링을 포함한다. 이러한 과정은 N- 또는 O-연결된 당화를 위해 당화 능력이 있는 숙주 세포에서 항체를 생산할 필요가 없는 이점이 있다. 사용하는 커플링 모드에 따라, 당(들)을 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복시기, (c) 유리 설프하이드릴기, 예컨대 시스테인의 유리 설프하이드릴기, (d) 세린, 트레오닌, 오르하이드록시프롤린의 기와 같은 유리 하이드록시기, (e) 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 기와 같은 방향족 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 부착할 수 있다. 예로, 그러한 방법은 WO 87/05330에 기술되어 있다.

항체에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소학적으로 달성할 수 있다. 화학적 탈당화에는 화합물 트리플루오로메탄설폰산이나 이와 유사한 화합물에 항체를 노출시켜야 한다. 이러한 처리는 연결성 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외하고는 대부분의 또는 전체 당의 절단을 야기하며, 항체가 온전하게 되게 한다. 화학적 탈당화는 Sojahr H. et al. (1987) 및 Edge, AS. et al. (1981)에 기술되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은, Thotakura, NR. et al. (1987)에 기술된 바와 같이, 다양한 엔도- 및 엑소-당화효소를 사용하여 달성할 수 있다.

항체의 다른 타입의 공유 변형은, 미국 특허 4,640, 835; 4,496, 689; 4,301, 144; 4,670, 417; 4,791, 192 또는 4,179,337에 기재된 방식으로, 비단백질 분해성 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나를 항체와 연결시키는 단계를 포함한다.

면역접합체:

본 발명은 세포독성 물질이나 증식 저해 물질과 같은 항암 물질이 접합된 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

본원에서 "증식 저해 물질"은 세포, 특히 난소암 세포의 증식을 실험관내 또는 생체내에서 저해하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 증식 저해 물질의 예로는, G1 정지 및 M-단계 정지를 유도하는 물질과 같이 세포 주기 진행을 차단시키는 물질을 포함한다. 고전적으로, M-단계 차단제는 빈카스(vincas)(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁센, 및 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드 및 블레오마이신과 같은 토포이소머라제 II 저해제를 포함한다. 또한, 이들 G1을 정지시키는 물질은 S-단계 정지로 이어지며, 그 예로는 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 등의 DNA 알킬화제가 있다. 탁센(파클리탁셀 및 독세탁셀)은 둘다 주목 나무(yew tree)에서 유래한 항암제이다. 독세탁셀(TAXOTERE^®, Rhone-Poulenc Rorer)은 유럽산 주목으로부터 유래된 것으로, 파클리탁셀(TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀과 독세탁셀은 튜불린 이량체로부터 마이크로튜불의 조립을 촉매하며, 탈중합화를 방지함으로써 마이크로튜불을 안정화시키고, 그 결과 세포에서 유사 분열이 저해된다.

본원에서, "세포독성 물질"이라는 용어는 세포 기능을 저해 또는 방해하거나/하며 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 이 용어는 방사성 동위원소(예 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학치료제, 예컨대 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아미신(adriamicin), 빈카 알카로이드(vinca alkaloid)(빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide)), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신 C(mitomycin C), 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 그외 다른 인터칼레이팅 물질(intercalating agent), 핵분해성 효소와 같은 효소 및 그의 단편, 항생제, 소분자 독소나 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소와 같은 독소, 그것의 단편 및/또는 변이체, 예컨대, 겔로닌(gelonin), 리신(ricin), 사포린(saporin), 및 후술되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다. 다른 세포독성 물질들은 하기에 기술되어 있다. 살종양제는 종양 세포의 파괴를 야기한다.

본 발명의 항체의 세포독성 물질이나 증식 저해성 물질과의 접합은, 비제한적으로, N-숙신이미딜(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 2중 기능성 유도체들(예, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예, 디숙신이미딜 서베레이트), 알데하이드(예, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예, 톨리엔 2,6 디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물(예, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠) 등의, 다양한 2중 기능성 단백질 커플링제를 이용하여 만들 수 있다. 예컨대, 리신 면역독소는 Vitetta et al (1987)에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소가 표지된 1-이소티오시아나토벤질 메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오타이드를 접합하기 위한 킬레이팅제의 예이다(WO 94/11026).

링커는 세포에서 세포독성 물질의 분비나 증식 저해성 물질의 분비를 촉진시키는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예컨대, 산-적응성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광적응성 링커, 디메틸 링커나 이황화-함유성 링커가 사용될 수 있다(예, 미국 특허 5,208,020).

다른 예로, 항체와, 세포독성 물질이나 증식 저해성 물질을 포함하는 융합 단백질은, 재조합 기법이나 펩타이드 합성에 의해 만들 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 또는 접합체의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩타이드를 코딩하는 영역에 의해 분리되어 있는, 접합체의 2 부분을 코딩하는 각 영역을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 항체를 프로드럭(예, 펩티딜 화학치료제, WO 81/01145)을 활성형의 항암제로 변형시키는, 프로드럭-활성화성 효소에 접합시킴으로써, 의존성 효소 매개 프로드럭 요법에 사용할 수 있다(WO 88/07378 및 미국 특허 4,975,278). ADEPT에 사용가능한 효소 성분은, 프로드럭을 보다 활성이고 세포독성인 형태로 변환시키는 방식으로 프로드럭에 작용할 수 있는 모든 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용가능한 효소로는, 포스페이트-함유성 프로드럭을 유리 약물로 변환시키는데 유용한 알카리 포스파타제; 설페이트-함유성 프로드럭을 유리 약물로 변환시키는데 유용한 아릴설파타제; 무독성 플루오로사이토신을 항암제 5-플루오로우라실로 변환시키는데 유용한 사이토신 탈아미나제; 펩타이드-함유성 프로드럭을 유리 약물로 변환시키는데 유용한, 세라티아 프로테아제, 써몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신(예, 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환기를 포함하고 있는 프로드럭의 변환에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 당화된 프로드럭을 유리 약물로 변환시키는데 유용한, O-갈락토시아제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단성 효소; P-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 변환시키는데 유용한 P-락타마제; 및 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같이, 아민 니트로겐에 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 각각 유도체화된 약물을 유리 약물로 변환시키는데 유용한, 페니실린 아미다제가 있다. 효소는 전술한 헤테로 2중 기능성의 가교 시약을 이용하는 등과 같이 당업계에 공지된 기법에 의해 항체에 공유 결합으로 결합시킬 수 있다.

진단 방법 및 용도:

본 발명의 다른 과제는, AMHR-II 발현과 연관된 암 질환을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 본 발명의 항체의 용도에 관한 것이다. AMHR-II 발현과 연관된 암 질환으로는 전형적으로 난소암을 포함한다. 바람직한 예에서, 본 발명의 항체는 과립막 세포 종양 및 상피 난소암 등의 난소암을 진단하는데 사용가능하다.

바람직한 예에서, 본 발명의 항체는 플루오레센트 분자, 방사성 분자나 그외 당업계에 공지된 모든 표지물질 등의 검출가능한 분자 또는 기질로 표지될 수 있다. 표지 물질은 일반적으로 신호를 (직접 또는 간접적으로) 제공하는 것으로 당업계에 공지되어 있다.

본원에서, 항체와 관련하여 "표지된"이라는 용어는 방사성 물질이나 형광체(예, 플루오레세인 이소티아시아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE) 또는 인도시아닌(Cy5)) 등의 검출가능한 물질을 항체에 커플링함으로써 항체를 직접 표지하는 것 뿐만 아니라, 검출가능한 물질과의 반응성에 의한 항체의 간접 표지를 망라하는 것으로 의도된다.

본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의 방법에 의해 방사성 분자로 표지될 수 있다. 예로, 방사성 분자로는, I¹²³,I¹²⁴,In¹¹¹, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸ 등의 신티그래프 연구용 방사성 원자가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 I-123, I-131, 인듐-111, F-19, C-13, N-15, O-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같이, 핵 자기공명(NMR) 이미징(또한, 자기 공명 이미징, mri라고도 함)을 위해 스핀 라벨로 표지될 수 있다.

"생물학적 샘플"은 개체로부터 수득된 다양한 샘플 타입을 망라하며, 진단 또는 모니터링 분석에 사용할 수 있다. 생물학적 샘플로는, 혈액과 그외 생물 장기의 액체 샘플, 생검 표본과 같은 고형 조직, 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포, 및 그의 자손이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 예로, 생물학적 샘플은 AMHR-II 발현과 연관된 암 질환을 가지고 있을 것으로 의심되는 개체로부터 취한 조직 샘플, 바람직한 예로 난소로부터 취한 조직 샘플로부터 수득되는 세포이다. 따라서, 생물학적 샘플은 임상 샘플, 배양 세포, 세포 현탁물, 세포 용혈물, 혈청, 혈장, 생물 유액 및 조직 샘플을 망라한다.

본 발명의 항체는 AMHR-II 발현과 연관된 암 질환의 단계를 측정하는데 (예, 방사성영상화) 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항체는 난소암의 단계를 판단하는데 사용할 수 있다. 이는 단독으로 또는 비제한적으로 CAl 25, HE4 및 메조텔린 등의 다른 난소암 마커와 조합하여 사용할 수 있다.

본원에서, "검출"이라는 용어는 대조군을 참조 또는 무참조한 형태의 질적 및/또는 양적 검출(수준 측정)을 포함한다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항체를 이용하여 개체의 세포에서 AMHR-II를 검출함으로써 개체에서 AMHR-II 발현과 연관된 암 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 진단 방법은,

(a) 항체가 AMHR-II를 발현하는 생물학적 샘플 세포와 복합체를 형성하는데 충분한 조건에서 본 발명에 따른 항체를 AMHR-II 발현과 연관된 암 질환을 앓고 있을 가능성이 있는 개체의 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;

(b) 상기 복합체를 검출 및/또는 정량하여, 복합체의 검출이 AMHR-II 발현과 연관된 암 질환을 나타내는 것을 특징으로 하는 단계를 포함할 수 있다.

암 질환을 모니터링하기 위해, 본 발명에 따른 진단 방법을 샘플에 항체 결합이 증가 또는 감소되는 지를 검출하기 위해 여러 시간 간격으로 반복할 수 있으며, 그로 인해 암 질환이 진행되거나 또는 퇴행되는지를 결정한다.

치료 방법 및 용도

본 발명의 항체, 단편 또는 면역접합체는, 인간 AMHR-II의 발현과 연관된 모든 암 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 항체는 단독으로 또는 적합한 모든 물질과 조합하여 사용할 수 있다.

치료성 단일클론 항체가 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원을 가지고 있는 세포의 고갈(depletion)을 유도할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 고갈은 적어도 3가지 기전, 항체 매개 세포성 세포독성(ADCC), 보체 의존성 용혈, 및 항체에 의해 타겟화된 항원을 통해 주어진 신호로 종양 증식의 직접적인 항-종양 저해를 통해 매개될 수 있다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재시에 타겟 세포의 용혈을 의미한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분에 동족 항원이 결합되어 있는 항체가 결합됨으로써 개시된다. 보체 활성화를 조사하기 위해, 예컨대 Gazzano-Santoro et al. (1997)에 개시된 바와 같이 CDC 분석을 수행할 수 있다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포(예, 자열 살상(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된 분비된 항체가 이들 세포독성 작동자 세포가 항원-보유성 타겟 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하여 궁극적으로 타겟 세포를 사멸시키는, 형태의 세포독성을 의미한다. 대상 분자의 ADCC 활성 분석을 위해, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 개시된 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다.

다른 예로, 본 발명의 항체는 전술한 증식 저해성 물질, 세포독성 물질이나 프로드럭-활성화 효소와 접합될 수 있다. 본 발명의 항체는 상기 증식 저해성 물질, 세포독성 물질이나 프로드럭을 AMHR-II를 발현하는 종양 세포로 타겟화하는데 정말 유용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 과제는 치료학적 유효량의 본 발명의 항체, 단편 또는 면역접합체를 이를 필요로하는 개채에게 투여하는 단계를 포함하는 AMHR-II의 발현과 연관된 암 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

인간 AMHR-II의 발현과 연관있는 암 질환은 전형적으로 난소암이다. 바람직한 예로, 본 발명의 항체는 과립막 세포 종양 및 상피 난소암 등의 난소암을 치료하는에 유용하다.

본 발명에서, "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 본원에서, 이러한 용어가 적용된 장애 또는 병태나, 또는 그러나 장애나 병태의 한가지 이상의 증상의 퇴화, 완화, 진행 저해 또는 예방을 의미한다. "난소암을 치료하는"이라는 말은 본원에서 난소암 세포의 증식 저해를 의미한다. 또한, 바람직하기로는, 치료는 종양 증식의 퇴화, 즉 측정가능한 종양의 크기 감소이다. 가장 바람직하기로는, 상기한 치료는 종양의 완전한 퇴화이다.

본 발명에 있어서, "환자" 또는 "이를 필요로하는 환자"는 AMHR-II 발현과 연관있는 암 질환에 걸린 또는 걸릴 가능성이 있는 인간 또는 인간을 제외한 포유류를 의미한다.

본 발명의 폴리펩타이드의 "치료학적 유효량"은 항체가 어떠한 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 효과/위험비로, 암 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 항체 및 조성물의 매일 총 사용량은 유효한 의학적 판단 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것으로 이해된다. 특정 개별 환자에 대한 특이적인 치료학적 유효량은 치료중인 장애 및 장애의 심각도; 사용하는 구체적인 항체의 활성; 사용하는 구체적인 조성물, 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강 상태, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로 및 사용되는 구체적인 항체의 배출율; 치료 기간; 사용하는 구체적인 폴리펩타이드와 조합 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려져 있는 그외 인자 등의 다양한 인자들에 의해 결정될 것이다. 예로, 화합물의 시작 용량은 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 양 보다 적으며, 원하는 효과를 달성할 때까지 서서히 용량을 증가시킨다는 것은 당업자들에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 다른 과제는, AMHR-II의 발현과 연관된 암 질환을 치료하기 위한 목적의 약제 제조에 있어 본 발명의 항체, 단편 또는 면역접합체 중 하나 이상의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 항체는 난소암을 치료하기 위한 그외 모든 치료 전략(예, 외부 방사선요법, 화학요법 또는 사이토카인)과 조합하여 사용할 수 있다.

약학 조성물:

본 발명의 폴리펩타이드, 핵산 또는 접합체는 약학적으로 허용가능한 부형제와, 선택적으로 서방성 매트릭스, 예컨대 생분해성 폴리머와 조합하여, 치료 조성물을 형성할 수 있다.

"약학적으로" 또는 "약학적으로 허용가능한"은 포유류, 특히 인간에게 적절하게 투여되었을 때 부작용, 알레르기 또는 그외 바람직하지 않은 문제점을 발생시키지 않는, 분자 실체 및 조성물을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형체는 무독성 고상, 반고상 또는 액상의 필러, 희석제, 엔캡슐화성 물질 또는 임의 타입의 제형화 보조제를 의미한다.

약학 조성물의 형태, 투여 경로, 투여량 및 요법은 본래 치료하고자 하는 병태, 질환의 심각도, 환자의 나이, 체중 및 성별 등에 따라 결정된다.

본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 코내, 정맥내, 근육내, 피하 또는 안구내 투여 등의 용도로 제형화될 수 있다.

바람직하기로는, 약학 조성물은 주입가능한 제형에 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함한다. 이것으로는, 개별 등장성, 살균성, 염수 수용액(모노소듐 또는 디소듐 포스페이트, 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 이의 염 혼합물), 또는 건조, 특히 경우에 따라, 살균수나 생리 식염수의 첨가시 주사용액의 형성을 가능하게 하는 동결-건조된 조성물 형태일 수 있다.

투여에 사용되는 투여량은 다양한 파라미터, 특히 사용되는 투여 방식, 관련된 병리, 또는 바람직한 치료 기간의 함수로써 적정화될 수 있다.

약학 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 항체를 약학적으로 허용가능한 담체나 수성 매질에 용해 또는 분산시킬 수 있다.

주사 용도로 적합한 약학 형태는 살균 수성 용액이나 분산액; 참기름, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜 등의 제형; 및 살균한 주사용 용액이나 분산액의 즉석 제조용 살균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 제형은 살균성이어야 하며, 용이하게 주사가능한 범위로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균 등의 미생물의 오염 작용에 대해 보호되어야 한다.

유리 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 수 중에서 제조될 수 있다. 분산액 역시 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물, 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 이용 조건 하에서, 이러한 조제물은 미생물의 증식을 예방하기 위해 보존제를 포함한다.

본 발명의 항체는 중성 또는 염 형태로 조성물로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염으로는 산 부가 염(단백질의 유리 아미노기와 형성됨)을 포함하며, 이는 예컨대 염산 또는 인산 등의 무기 산, 또는 초산, 옥살산, 주석산, 만델산 등의 유기 산과 형성된다. 유리 카르복시기와 형성된 염은 또한 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철 등의 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 파생될 수 있다.

또한, 담체는 예컨대 물, 에탄올 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일 등을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예컨대 렉시틴 등의 코딩제의 사용, 분산액에 경우 입자의 필수 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용 예방은, 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이룰 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예컨대 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 장시간 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물로 사용함으로써 이룰 수 있다.

주사용 살균 용액은 활성 화합물은 상기에서 나열한 다양한 그외 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 함량으로 투입하고, 필요에 따라 필터 살균함으로써 제조한다. 일반적으로, 분산액은 살균된 다양한 활성 성분들을 기본적인 분산 매질과 상기에 나열된 그외 필수 성분이 포함된 살균 비히클에 투입함으로써 제조한다. 주사용 살균 용액의 제조용 살균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조 기법이며, 이들은 전술한 이의 살균 여과된 용액으로부터 활성 성분 과 임의의 부가적인 바람직한 성분을 분말로 수득하는 방법이다.

직접 주사를 위한 보다 또는 고도로 농축화된 용액의 제조 역시 포함되며, 이 경우 작은 종양 면적에 활성 물질을 고 농도로 전달하는 매우 신속한 침투를 위해, DMSO를 용매로 사용하는 것이 고려된다.

제형화시, 용액은 투약 제형에 알맞은 방식으로, 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 전술한 주사용 용액 타입 등의 다양한 투약 형태로 쉽게 투여되지만, 약물 분비 캡슐 등도 채택될 수 있다.

수용액으로의 비경구 투여를 위해, 예컨대 용액은 필요에 따라 적합하게 완충화되어야 하며, 액상 희석제는 먼저 충분한 식염수나 글루코스와 등장성이 되어야 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용할 수 있는 수성 살균 매질은 본 발명의 내용에 비추어 당업자들이 잘 숙지하고 있을 것이다. 예컨대, 1회 투여량은 등장성 NaCl 용액 1 ml에 용해될 수 있으며, 1000 ml의 피하주입(hypodermoclysis) 유액에 첨가되거나 또는 주입할 부위에서 주입될 수 있다(예, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580). 처료되는 개체의 병태에 따라 반드시 투여량의 일부 변형이 수반될 것이다. 투여를 담당하는 사람이, 어떤 경우에서도, 각 개체에 적합한 투여량을 결정할 것이다.

본 발명의 항체는 1회 투약 당 약 0.0001 - 1.0 mg, 또는 약 0.001 - 0.1 mg, 또는 약 0.1 - 1.0, 또는 심지어 약 10 mg을 포함하도록 치료 혼합물내로 제형화될 수 있다. 다중 투약으로도 투여될 수 있다.

정맥내 또는 근육내 주사와 같이 비경구 투여용으로 제형화된 조성물 뿐만 아니라, 그외 약학적으로 허용가능한 형태는, 예컨대 정제나 경구 투여용의 그외 고형물; 시간에 따라 분비되는 캡슐; 및 현재사용되는 다른 형태이다.

특정 예에서, 리포좀 및/또는 나노입자의 이용은 항체의 숙주 세포로의 도입을 고려한다. 리포좀 및/또는 나노입자의 제조 및 이용은 당업자들에게 공지되어 있다.

나노입자는 일반적으로 안정적이며 재현가능한 방식으로 화합물을 포착할 수 있다. 세포내 폴리머 과다 부하로 인한 부작용을 방지하기 위해, 일반적으로 생체내에서 분해될 수 있는 폴리머를 이용하여 초미세 입자(크기 약 0.1 ㎛)를 제작한다. 이러한 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에 사용이 고려되며, 이러한 입자는 쉽게 제조할 수 있다.

리포좀은 수성 매질중에 분산되는 인지질로부터 만들어지며, 자발적으로 동심성의 다층으로 이루어진 이중층의 소낭체(또한 다층 소낭(MLV)이라고도 함)를 형성한다. MLV는 일반적으로, 직경이 25 nm 내지 4 ㎛이다. MLV을 음파 처리하면, 토어에 수용액이 있는 200 내지 500 Å의 직경을 가진 작은 단일층의 소낭(SUV)가 형성된다. 리포좀의 물리적 특성은 pH, 이온 세기 및 이가 양이온의 존재에 결정된다.

키트

마지막으로, 또한 본 발명은 본 발명의 항체 1종 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 키트는 AMHR-II 발현 검출 또는 치료적 또는 잔단적 분석에서 이용된다. 본 발명의 키트는 항체를 고체 지지체, 예컨대 조직 배양 플레이트나 비드(예, 세파로스 비드)에 커플링된 형태로 포함할 수 있다. 시험관내, 예컨대 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 AMHR-II의 검출 및 정량화를 위한 항체를 포함하는 키트를 제공할 수 있다. 검출에 이용가능한 상기 항체는 플루오레센트 또는 방사성표지 등의 표지물질과 함께 제공될 수 있다.

본 발명은 하기 도면과 실시예를 들어 더욱 설명된다.

실시예 1:

A - 재료 및 방법:

마우스 하이브리도마로부터 VH 및 Vκ 유전자의 cDNA 합성 및 PCR 증폭: RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 제조사가 기술한 방법에 따라 사용하여, 5 x 10⁶12G4 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 추출한 후, 총 RNA 제조물 중 소량을 취하여 샘플의 질과 총 RNA 수율을 확인하였다. 컨트롤을 UV 분광분석으로 수행하여, RNA 농도 및 순도를 검증하였다. 총 RNA의 프로파일을, Agilent RNA 6000 Nano LabChipa 키트와 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 이용하여 분석하여, 양과 완전성(integrity)을 결정하였다. RT-PCR용 Superscript 제1 가닥 합성 시스템(Invitrogen life Technologies)을 제조사의 지침에 따라 사용하여, 총 RNA 280 ng(1 ㎕)으로 cDNA를 합성하였다. 제1-cDNA 합성 반응을 올리고(dT)를 이용하여 프라이밍하여, 3' 폴리(A) 테일에 혼성화시켰다. cDNA는 사용하기 전까지 -20 ℃에 두었다.

PCR 증폭은, 1 ㎕의 cDNA 합성 반응물, 10 μM dNTPs, 2 ㎕의 10X PCR 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)을 포함하는 최종 부피 20 ㎕로 수행하였다. 패밀리-특이적인 5' 프라이머 및 경쇄 또는 중쇄 불변 영역 RevCkSaII 및 RevCγSaII 프라이머 각각에 일치(matching)되는 적절한 3'-올리고뉴클레오타이드 프로브로 이루어진 각 그룹을 이용하여, 14 VH 및 18 Vκ PCR 반응을 확립하였다. 사용한 프라이머는 Chardes et al. (1999)(표 1 및 2)에 기재된 것이다.

모두 VH 또는 Vκ 5' 프라이머를 포함하는, 2가지 혼합물을 또한 만들었다. PCR 반응은, 이 패밀리에 대해서만 지정되어 있는 보고된 일원은 PC3609의 비-기능성 대립 유전자이기 때문에, VH13 (3609N) 유전자 패밀리에 특이적인 프라이머로는 PCR 반응을 수행하지 않았다. 사용한 각 프라이머의 양은 처음에는 10 pM이었다. 반응 혼합물을 94 ℃에서 5분간 열처리한 다음, 2 U Vent DNA 중합효소(New England Biolabs)를 첨가하고, 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 2분으로 이루어진 증폭 사이클을 30회 수행하였다. 72 ℃에서 10분 연장 단계를 수행한 다음, PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤에서 분획화하고, SYBR 그린으로 염색하였다. Vκ 증폭에 대해 390 bp의 산물, VH 증폭시 450 bp의 산물을 증폭시키는 5' 프라이머 및 3' 프라이머 세트를, 이러한 패밀리-특이적인 PCR 스크리닝으로부터 선택하였다. 선택한 동일한 프라이머를 이용한 5번의 반복 결과물을 이용하여 상기와 같이 새로운 PCR을 수행하였다. PCR-증폭된 DNA 산물을 1.5% 저융점 아가로스 겔(Gibco)에서 겔 정제하였다.

증폭된 V 유전자의 직접 뉴클레오타이드 서열 분석: MWG Biotech (Munchen, Germany)의 표준 서열분석 반응을 위한 밸류 리드 서비스를 이용하여, 각 PCR 산물 500 ng으로부터 직접 서열분석을 수행하였다..

B - 결과

mAb 12G4의 VH 및 VL 영역이 서열은, 효율적인 증폭 방법과 임의의 면역글로불린 유전자 패밀리 유래 마우스 가변성 영역의 직접 서열 분석을 이용하여 결정하였다(Strohal et al. 1987). 간략하게는, 뮤라인 V 유전자는 아미노산 및/또는 뉴클레오타이드 서열 유사성을 기초로 15개의 VH 및 18개의 Vκ 유전자 패밀리로 분류하였다. 모든 V 유전자 패밀리로부터 면역글로불린(Ig)을 잠재적으로 증폭시키기 위해, Strohal 등은 각 중쇄 및 경쇄 유전자 패밀리의 비교적 보존된 신호 서열에 혼성화하는 2가지 오리지날 리더 프라이머 세트를 명기하였다. 이러한 프라이머는 통상적으로 실험실에서, 7가지의 상이한 Vκ 및 5가지의 상이한 VH 유전자 패밀리에 속하는 도메인 등의, 9종의 뮤라인 단일클론 항체(mAb)로부터 전장 가변성 영역을 증폭시키고 직접 서열 분석하는데, 사용되고 있다. 이러한 방법은 Ig 유전자 패밀리로부터 가변성 영역의 신속하고 정확한 서열 분석을 가능하게 하고, 임상 대상의 키메라 항체의 제작을 용이하게 한다.

총 RNA 분석: Agilent RNA 6000 Nano LabChipa 키트와 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용하여, 총 RNA 프로파일을 분석하여, 이의 양과 완전성을 측정하였다. 유전자 패밀리-특이적인 신호 프라이머를 이용한 마우스 하이브리도마 12G4로부터 V 유전자의 PCR 증폭: 도 1은 주어진 VH 또는 Vκ유전자 패밀리에 해당되는 적합한 불변 프라이머와 신호 프라이머의 조합을 이용한, mAb 12G4의 (A) VH 및 (B) Vκ쇄 영역에 대한 PCR 증폭 산물을 나타낸 것이다. 유효한 프라이머는 VH 증폭의 경우 450 bp 산물을 증폭시켜야 하며, Vκ 증폭의 경우 390 bp 산물을 증폭시켜야 한다. 항-AMHR-II mAb 12G4 (IgG1/κ)를 분비하는 하이브리도마 세포의 cDNA에서, 예상되는 크기에서의 주 밴드가 수득되었다(도 1):

- 중쇄 증폭용 VH 1-J558 / RevCγSaII 프라이머 세트를 이용. 프라이머 VH9 (VGam 3-8), VH10, VH11, VH12, VH14 및 VH15를 이용해서는 증폭되지 않았다

- Vκ증폭용 Vκ4/5/RevCκSaII 또는 Vκ21/RevCκSaII 프라이머 세트 이용

mAb12G4 로부터 가변성 영역의 유전자 특정화 및 이후의 증폭 산물의 직접 서열 분석: 증폭 산물의 직접 서열분석에 의한 조립된 유전자의 추가적인 분석으로, VH 유전자가 메이저 VH 유전자 패밀리(VH1)에 속하는 것으로 확인되었다. Vκ4/5 유전자 패밀리는, Vκ 12G4 유전자를 코딩하는 유전자 패밀리인 것으로 확인되었다. Vκ21 프라이머로 증폭시킨 Vκ PCR 산물은, 오리지날 MOPC21 종양으로부터 유래된 NS1처럼 골수종 세포주에서 전사되는 비-기능적으로 재배렬된 카파 경쇄에 해당된다(Chardes et al. 1999). 각 유전자 패밀리 내에서, IMGT 데이타베이스를 이용하여 서열분석한 가변성 영역에 대해서 가장 밀접한 생식세포 유전자(germ line gene)를 동정하였다. VL 및 VH 영역의 서열은 각각 도 2 및 3에 나타내었다.

실시예 2:

A - 재료

단일클론 항체:

항- AMHR -II mAb 12 G4 : 박테리아에서 발현되며 His-텍 융합 단백질(Gouedard L. et al., 2000)로서 정제된, 인간 AMHR-II (ECD-hAMHR-II)의 재조합 세포외 도메인을 면역원으로 사용하였다. BALB/c 마우스에 1차는 완전한 프레운드 보강체(시그마) 중에, 이후의 주사에는 불완전 프레운드 보강체(시그마) 중에서 단백질 20 ㎍을 3주 간격으로 4번, 복막내로 면역화하여, 마우스 하이브리도마를 제조하였다. 4차 면역화한 다음 3주째에 ECD-hAMHR-II의 정맥내 부스터 주사를 실시하였다. 3일 후, 면역화된 마우스에서 취한 비장 세포를 마우스 골수종 세포주인 P3-X63-Ag.8.653과 융합시켰다. 새롭게 제조된 클론의 상층물을 ECD-hAMHR-II를 이용한 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 상층물의 hAMHR-II에 대한 특이성을, AMHR-II 양성 세포의 플루오레센스-활성화 세포 분류(FAC: fluorescence-activated cell sorting)로 검증하였다.

항- HER2 MAb : 뮤라인 mAb FRP5 (Harweth I. et al., 1992) 및 인간화된 트라스투주맵(Herceptin^®)을 사용하였다. 트라스투주맵(Herceptin^®)은 Genentech, Inc. (San Francisco, CA, USA) 사에서 구입하였다.

대조군으로서 사용한 MAb : 대조군 실험에서, 항-CEA 단일클론 항체 35A7(CEA Gold 2 에피토프(Haskell C. et al. 1983; Hammarstrom S. et al., 1989) 및 PX(마우스 골수종 P3-X63로부터 정제한 정상 마우스 IgG1 (Kohler G. 1975)에 특이적임)를, 관련없는 항체로 사용하였다. 모든 뮤라인 IgG1 MAb는, 암모늄 설페이트 침강(4 ℃에서 45% 포화) 및 이후의 CD52 셀룰로스에서의 이온-교환 크로마토그래피(Whatman, Balston, United Kingdom)에 의해, 마우스 하이브리도마 복수액으로부터 정제하였다.

세포주 및 배양 조건: Van den Berg-Bakker (van den Berg-Bakker C. et al., 1993) 팀으로부터 인간 과립막 종양 세포주인 COV434를 기꺼이 제공받았다. AMHR-II-양성의 형질전환된 COV434-AMHR-II 1F3 세포주를 수득하기 위해, GCT 종양 세포주 COV434에 인간 human AMHR-II에 대한 코딩 cDNA를 pIRES-EGFP 벡터(FuGENE 6 형질감염 키트, Roche Diagnostics)를 이용하여 안정적으로 형질감염시킨 다음 COV434-AMHR-II 1F3 세포주를 서브-클로닝하였다.

모든 세포주는 10% 열처리에 의해 불활성화시킨 우 태아 혈청, 스트렙토마이신(0.1 mg/mL), 페니실린(0.1 IU/mL) 및 암포테리신 B(0.25 ㎍/mL)가 포함된 DMEM F12 배지에서 배양하였다. 세포는 37 ℃, 5% CO2 대기에서 배양하였고, 매주 2번씩 배지를 교체하였다. 세포의 회수는 트립신(0.5 mg/mL) EDTA (0.2 mg/mL)를 이용하여 수행하였다. 배양 배지 첨가물 모두 Life Technologies, Inc.(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에서 구입하였다. 형질감염된 세포는, 배지에 제네티신(0.67 %)을 첨가하였다.

B - 방법 및 결과

시험관내 및 생체내 연구에 있어 COV434 - AMHR -II 1F3 세포주의 유세포 분석: 뮤라인 항-AMHR-II(12G4) 및 항-HER2(FRP5) 항체 각각을 이용한 유세포 측정(FAC)에 의해 COV434-AMHR-II 1F3을 분석하였다. 세정한 다음, 단일클론 항체가 접합되어 있는 항-마우스 FITC(Sigma Aldrich)를 첨가하여, 1차 항체를 검출하였다. 백그라운드 측정을 위해 2차 항체와 세포의 직접 인큐베이션을 수행하였다. 샘플은, 최소 20000회로 관찰하여, FACScan II(Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)에서 분석하였다. 음성 대조군으로는 야생형(wt) COV434 세포주를 사용하였다(도 4). 이러한 기법에 의해, QIFIKIT(Dako, Danemark)를 이용하여, 발현율 약 10⁴ AMHR-II 수용체/세포 및 10³ HER2 수용체/세포를 평가할 수 있었다.

COV434 - AMHR -II-1F3-형질감염된 세포주에서의 mAb 12 G4 의 내재화에 대한 면역형광 연구: COV434-AMHRII-1F3 세포에 항체가 내재화하는 능력을 면역형광을 이용하여 가시화하였다. 각 분석에서, 5.10⁴ 세포를 35-mm 페트리 디쉬에 둔 22-mm의 사각 유리 커버 슬립 상에서 RPMI로 배양하였다. 2일 후, 대수 증식기 동안에, 세포는 PBS-BSA(1 mg/mL)에서 10 ㎍/mL 항체(관련없는 mAb(PX), 항-AMHR-II(12G4), 항-HER2(FRP5) 또는 무 항체 중 어느 한가지)와 함께 인큐베이션하고, 4 ℃(비-내재 조건)에 두거나 또는 37 ℃ 인큐베이터(내재화 조건)로 이동시켰다. 180분째에, 상층물을 제거하고, 세포를 PBS-BSA로 2번, PBS로 1번 세정하였다. 포르말린(PBS 중의 3.7% p-포름알데하이드)에서 20분간 인큐베이션한 후, -20 ℃에서 아세톤 에서 세포를 30초간 투과화하였다. 용액을, PBS 양을 증가시켜, 연속 희석시켰다. 세포는 PBS-BSA로 2번 세정하고, 암 조건에서 FITC-표지된 염소 항-마우스 Ig F(ab')2 단편(Silenus, Eurobio, France)과 PBS-BSA 중에서 한시간 인큐베이션하였다. 그런 후, PBS-BSA로 3번, PBS로 1번 세정하고, 50 ㎕의 4,6 디아미니도-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI, Sigma, Chemical Co.)와 15분간 인큐베이션하여, Vectashield^®에 의한 형광 현미경 가시화를 준비하였다.

항-AMHR-II 12G4 및 항-HER2 FRP5 항체는 37 ℃에서 세포에 내재화될 수 있었지만, PX는 그렇지 않았다. 실제, 형광 소낭은 세포의 세포질에서 뚜렷하게 나타났다. 이에, mAb를 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 모든 활성 전달 경로를 저해하는 것으로 알려져 있는 이러한 낮은 온도에서, 특이적인 향체 2종 모두에 대해 더욱 강한 막의 표지화가 심지어 4 ℃에서 관찰되었다. 이러한 특이적인 항체들 모두 세포내에서는 발현되지 않았지만, 강력한 막 조합이 관찰되었다.

mAb12G4 의 시험관내 항-증식 효과(MTS 테스트): 세포 생육력에 대한 트라스투주맵, 12G4, FRP5 또는 35A7의 효과를, 테트라졸륨 염(MTS) 및 전자 커플링 시약(PMS) 분석으로 평가하였다. 간략하게는, 96웰 마이크로타이터 플레이트에, COV434-AMHR-II-1F3 세포를 배지 100 ㎕ 중에 5,000 세포/웰로 접종하였다. 24시간 후, 세포에 항체를 0.1 내지 1 ㎍/㎕의 농도로 처리하였다. 96시간 인큐베이션 한 후, 세포를, MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨) 시약에 노출시켜, 2시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 490 nm에서 흡광도를 측정하였고, 무처리 배양물 대비 세포의 증식율을 생육력 저해율로 계산하였다. 모든 실험은 3세트로 수행하였다.

결과는, mAb 12G4 또는 트라스투주맵을 1 ㎍/㎕으로 이용하였을 때 생육력 저해%는 20%로 관찰할 수 있었지만, 동일한 농도에서 항-CEA 35A7 mAb에서는 관찰되지 않는 것으로 나타났다(도 5). 트라스투주맵은 항-증식 효과가 널리 알려져 있어, 양성 대조군으로 사용하였다.

생체내 종양 증식 저해의 예비 연구: 모든 생체내 실험은, 실험 동물 연구에 대한 프랑스의 가이드라인에 맞게 수행하였다(Agreement No. B34-172-27). 6-8주령의 흉선이 없는 암컷 누드 마우스를 Harlan(Gannat, France) 사에서 구입하였다.

50% 배양 배지 및 50% Matrigel(BD biosciences, Le Pont De Claix, France)에 COV434-AMHRII-1F3(10.10⁶) 세포를 현탁하고, 이를 흉선이 없는 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하(s.c.) 주사하였다. 종양의 크기가 거의 동일한 크기가 되었을 때, 종양을 가지고 있는 마우스를 여러 그룹으로 무작위 분류하였다. 마우스에, 0.9% NaCl 또는 mAb 12G4를 복막내(i.p.) 주사로 처리하였다. 주사한 각 mAb의 양은 1회 주사 당 200 ㎍이며, 5주간 일주일에 2번 계속 처리하였다.

종양 크기는 캘리퍼로 매주 측정하였고, 부피는 식: D1 x D2 x D3 /2로 계산하였다.

결과는, 종양이 측정된 체적이 1200 mm³가 되는데 걸리는 시간을 이용하여 작성한 Kaplan-Meier 곡선으로 나타내었다(도 6). 지연 시간 중앙값은, 마우스의 50%가 결정한 크기에 도달한 시간으로 정하였으며, 이러한 지연 시간 중앙값은 대조군 NaCl 그룹에 비해 처리군이 14일 더 긴 것으로 나타났다.

도 7은 COV434-AMHRII-1F3 이종이식체에서 AMHR-II 발현을 확인한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 것이다.

이종이식체에서 AMHR -II 발현의 면역블롯팅 분석: 이종이식한 종양 유래 세포를 회수하여, RIPA 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% 데옥시콜레이트, 1% NP40, 2 mM EDTA, 0.1% SDS 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)로 용혈시켰다. 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후, 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(Millipore Co., Bedford, MA)으로 이동시키고, 5% 무-지방 건조 밀크가 포함된 PBS에서 포화시킨 다음, 항-AMHR-II 12G4 항체와 인큐베이션하였다.

AMHR-II는 절제한 종양의 3가지 상이한 섹션에서 강하게 발현되며, 65 kDa 위치로 이동하였다(도 7).

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COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM)

CNCMI-3673

20060926

SEQUENCE LISTING <110> INSERM <120> Monoclonal antibodies and fragment thereof directed against the human Anti-M?lerian Hormone type II receptor (AMHR-II) <130> BET 07P1281 <140> PCT/IB 2007/003301 <141> 2007-10-31 <150> EP 06291703.4 <151> 2006-11-02 <160> 8 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 His Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr His 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr 1 5 <210> 5 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe His Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Ser Val Arg Tyr 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ser Thr Ser 1 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5

Claims

가변성 도메인이 CDR-1에 대한 서열번호 2 또는 6, CDR-2에 대한 서열번호 3 또는 7, 및 CDR-3에 대한 서열번호 4 또는 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄.
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제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄인 것을 특징으로 하는, 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄.
(a) 제5항에 따른 중쇄; 및/또는 (b) 제6항에 따른 경쇄를 포함하는, 인간 항-뮐러 호르몬 타입 II 수용체(AMHR-II)에 대해 특이성을 가지는 단일클론 항체.
제7항에 있어서, (a) 제5항에 따른 중쇄; 및 (b) 제6항에 따른 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항체가 뮤라인 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제9항에 있어서, 상기 항체가 CNCM 기탁번호 I-3673으로 입수가능한 하이브리도마로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항체가 마우스/인간 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항체가 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는 단일클론 항체.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체의 단편.
제13항에 있어서, Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2 및 디아바디(diabody) 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단편.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체, 또는 제13항 또는 제14항에 따른 상기 항체의 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산.
제15항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제15항에 따른 핵산 및/또는 제16항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제17항에 있어서, 상기 세포가 ATCC 기탁번호 CRL 1662로 이용가능한 YB2/0 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
(i) 제17항 또는 제18항에 따른 형질전환된 숙주 세포를 항체의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및
(ii) 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는,
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제13항 또는 제14항에 따른 상기 항체의 단편의 제조 방법.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 및/또는 제13항 또는 제14항에 따른 상기 항체의 단편, 또는 제15항에 따른 핵산, 및/또는 제16항에 따른 벡터, 및/또는 제17항 또는 제18항에 따른 숙주 세포와, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물.
항암제가 접합된, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제13항 또는 제14항에 따른 상기 항체의 단편을 포함하는 면역접합체.
제21항에 있어서, 상기 항암제가 세포독성 물질 또는 증식 저해 물질인 것을 특징으로 하는 면역접합체.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항, 또는 제13항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 분자 또는 물질로 표지된 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.
난소암 치료 목적의 약제 제조를 위한, 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체, 제13항 또는 제14항에 따른 상기 항체의 단편, 또는 제21항 또는 제22항에 따른 면역접합체의 용도.
난소암을 진단 및/또는 모니터링하기 위한, 제7항 내지 제12항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제13항, 제14항 또는 제23항 중 어느 한 항에 따른 상기 항체의 단편의 용도.