KR20150036361A - 췌장암 환자용 dna 백신 - Google Patents

췌장암 환자용 dna 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR20150036361A
KR20150036361A KR1020157002939A KR20157002939A KR20150036361A KR 20150036361 A KR20150036361 A KR 20150036361A KR 1020157002939 A KR1020157002939 A KR 1020157002939A KR 20157002939 A KR20157002939 A KR 20157002939A KR 20150036361 A KR20150036361 A KR 20150036361A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
vaccine
leu
dna
val
ser
Prior art date
Application number
KR1020157002939A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102090612B1 (ko
Inventor
헤인즈 루벤나우
Original Assignee
백심 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 백심 아게 filed Critical 백심 아게
Publication of KR20150036361A publication Critical patent/KR20150036361A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102090612B1 publication Critical patent/KR102090612B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001109—Vascular endothelial growth factor receptors [VEGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/852—Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 약독화된 돌연변이 살모넬라 균주에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 암 면역요법에서의 상기 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주의 용도에 관한 것이다.

Description

췌장암 환자용 DNA 백신 {DNA VACCINE FOR USE IN PANCREATIC CANCER PATIENTS}
본 발명은 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 암 면역요법에서의 상기 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주의 용도에 관한 것이다.
약독화된 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) 유도체는 종양 항원 또는 종양 기질 항원과 같은 이종의 항원을 포유류 면역 시스템으로 전달하는 매력적인 비히클이다. 살모넬라 엔테리카 균주는 잠재적으로 점막 면역화 경로, 예컨대 경구 또는 코를 통해 전달되므로, 비경구 투여에 비해 간단하고 안전한 이점을 제공해줄 수 있다. 아울러, 살모넬라 균주는 전신 수준과 점막 구획들에서 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으킨다. 배치 제조 단가가 상대적으로 저렴하며, 살아있는 바이러스 백신 제형들은 안정성이 우수하다. 약독화는 병독성, 조절성 및 대사성 유전자 등의 다양한 유전자들을 제거함으로써 달성될 수 있다.
aro 돌연변이에 의해 약독화된 수종의 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 균주들은 동물 모델에서 이종 항원을 전달하기 위한 안전하고 효과적인 전달 비히클인 것으로 알려져 있다.
항원, 특히 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 DNA 구조체를, 약독화된 살모넬라 티피무리움 생 균주를 통해, 마우스 타겟 세포로 전달하는 방식은 WO　03/073995에 개시되어 있다. Niethammer et al. (Nature Medicine 2002, 8(12), 1369)은, 뮤라인 혈관 내피 성장인자 수용체 2 (VEGFR-2 또는 FLK-1)를 코딩하는 발현 벡터를 보유한 약독화된 살모넬라 티피무리움 aroA 균주 SL7207와 이의 암 백신으로서의 용도를 개시하고 있다.
그러나, 인간에게의 그 사용이 허가된 약독화된 살모넬라 엔테리카 혈청형 (serovar) 균주는 오직 한종, 즉 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 Ty21a (약자: S. typhi Ty21a) 뿐이다.
허용성이 우수한 상기한 장티푸스 경구 생 백신은 야생형의 병독성 박테리아 분리주 S. typhi Ty2에 화학적으로 돌연변이를 유발함으로써 유래된 것으로, galE 유전자에 기능 상실 돌연변이 뿐만 아니라 그 외 명확히 정의되지 않은 다른 돌연변이들을 가지고 있다. 이 백신은 현장 실험에서 효능과 안전성이 확인된 이래로, 많은 국가들에서 장티푸스 백신으로서 허가되었다.
혈관신생은 고형 종양의 증식과 전이에 기여한다. 베박시주맵 (bevacizumab) 등의 화합물, 예를 들어 특이적으로 종양의 신혈관구조를 타겟으로 하는 서니티닙 (Sunitinib) 및 액시티닙 (axitinib)과 같은 소형 분자들은 다양한 종양 증상들에서 효능을 나타내었다 (Powles et al., Br J Cancer 2011,104(5):741-5); Rini et al., Lancet 2011, 378:1931-1939).
종양의 신혈관구조는 혈관 내피 성장인자 수용체 (VEGFR) 2를 과다발현하는 내피 세포로 라이닝되어 있으며, 혈류를 통해 쉽게 접근할 수 있다. 이들 세포의 유전적 안정성과 내피 세포 하나 당 수백개의 종양 세포를 유지하는 능력으로 인해 이들 세포들은 항체, 티로신 키나제 저해제 또는 백신에 의한 항암 요법의 주된 타겟이 될 수 있다 (Augustin, Trends Pharmacol Sci 1998,19:216-222). 최근들어, T-세포성 면역요법은 전립선암에서 일부 임상적인 성공을 거두고 있으며, 항암 백신 접종 가능성이 확인되었으며, 종종 증상 발현 전에 효과가 있었다 (Sharma et al., Nat Rev Cancer 2011,11:805-812). 암 세포에 대한 면역계의 활성화는 여러가지 문제에 직면하고 있다. 예를 들어, 암성 병소는 대개 다클론성이며, 암 세포가 돌연변이되는 경향을 보인다. 항원 특이 요법은 대개는 항원 비-보유 세포를 선별하는 것에 불과하다. 나아가, 종양의 캡슐화 및 MHC 분자의 소거 또는 하향-조절 등에 어려움이 있다. 종양 신혈관구조를 타겟으로 하는 백신화 방식은 이론적으로 이러한 난제들을 극복하여야 한다.
종래 기술 측면에서, 본 발명의 목적은 VEGF 수용체를 타겟으로 하는 새롭고 안전한 경구 암 백신을 제공하는 것이다. 이러한 VEGF 수용체를 타겟으로 하는 암 백신은 암 환자에 대한 치료 옵션을 개선하는 상당한 이점을 제공해줄 것이다.
본 발명은, 새로운 백신 (VXM01)을 이용하여 VEGFR-2를 타겟으로 하는, 항-혈관신생 요법과 백신접종의 조합으로서, 상기 백신은 VEGF 수용체 단백질 2를 코딩하는 플라스미드를 포함하는 약독화되고 재조작된 박테리아 균주 살모넬라 티피 Ty21a이다.
VXM01은, 종양 세포-체류 항원이 아닌, 종양 신혈관구조의 비-악성 내피 세포에 의해 과다 발현되는 종양 기질 (tumor stroma)-체류 항원을 타겟으로 하는, 새로운 전략을 제시한다.
본 발명의 산물은, 유전적으로 안정적이며 쉽게 접근가능한 내피 세포를 타겟으로 함으로써, 종양 세포 이종성, MHC-상실, 세포 수준의 면역억제 및 종양 캡슐화 뿐만 아니라 혈액 뇌 장벽 등의 생리학적 장벽과 같이, 종양 세포를 직접 타겟으로 하는 백신이 기존에 안고 있던 한계들을 극복하는 것을 목표로 한다. 아울러, 치료 타겟은 종양 타입과는 독립적이기 때문에, 백신은 잠재적으로 여러가지 다양한 고형 악성 종양에 대해 활성을 나타낼 수 있다. 생성물은, 환자-독립적인 "기성품 (off-the-shelf)" 경구 백신으로서, 보관할 수 있으며 사용시 임상 부위에 전달가능하다. 소분자 또는 항체에 의한 항-혈관신생 요법은 이미 유효한 것으로 입증되어 있지만, 본 발명에 따른 방식은 종양 신혈관구조에 대해 환자 자신의 면역계를 활성화한다는 점에서 현저한 차이가 있으며, 이와 같이 장기간의 효능을 제공하는 T 세포 기억 효과를 잠재적으로 구축한다. 베박시주맵 (bevacizumab)을 이용한 대장암과 난소암 실험에서, 장기간 유익한 치료 효과를 유지하기 위해서는 지속적인 항-혈관신생 압력이 필요한 것으로 시사되었다 (Allegra et al., J Clin Oncol 2011, 29:11-16; Burger et al., N Engl J Med 2011, 365:2473-2483; Perren et al., N Engl J Med 2011, 365:2484-2496).
본 발명자가 아는 한, 본 발명은 경구 암 백신에 대한 최초의 임상 실험이다. 아울러, 본 백신은 복수의 종양 타입에 대해 효과적일 수 있다.
최초의 임상 실험에서, 본 발명에 따른 백신 (VXM01)은 환자에서 종양 증식에 유의한 영향을 미치는 면역 반응을 도출하는데 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 이러한 면역 반응이 경구 투여된 매우 극소량의 VXM01에 의해 촉발될 수 있다는 것은 주목할 만한 것이며, 놀라운 일이다. 본 백신은 이미 1x105 또는 1x106 - 1x107 콜로니 형성 단위 (CFU)로 출발한 투여량들에서 효과적이다. 1차 결과는, VXM01의 백신 접종이 기존의 종양 신혈관구조를 파괴시킬 수 있으며, 증식성 내피 세포에 대한 면역 기억 형성을 뒷받침해줄 수 있다는 것을 보여준다.
본 백신은 단일요법으로도, 그리고 표준 화학요법, 방사선치료 및/또는 생물학적 암 요법과의 조합 요법으로도 유효하다.
현행 임상 실험에서, IV 기 환자는 화학요법제인 겜시타빈과 VXM01으로 미리 및/또는 동시에 치료된다. 그러나, 환자가 화학요법에 대해 내성 (화학-불응 환자)이 발생한 경우에도, VXM01 치료 역시 효과적이다.
일 측면에서, 본 발명은, 백신으로서 사용하기 위한, VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자를 1 카피 이상 포함하는, 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주에 관한 것이다.
특정 구현예에서, VEGF 수용체 단백질은 인간 VEGFR-2 및 약 80% 이상의 상동성을 가진 인간 VEGFR-2의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, VEGF 수용체 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 인간 VEGFR-2이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주를 포함하는 DNA 백신에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주는 살모넬라 티피 Ty21a이다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 진핵 생물에 대한 발현 카세트이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 DNA 백신은 암 면역요법에 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, DNA 백신은 서열번호 1의 VEGFR-2 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 약독화된 살모넬라 티피 균주 Ty21a를 포함한다.
특정 구현예에서, DNA 백신은 항-혈관신생의 암 면역요법에 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 플라스미드는 도 2에 도시된 7580bp pVAX10.VR2-1이며, 서열번호 3에 기재된 서열을 가지며, DNA 백신은 VXM01으로 명명된다.
특정 구현예에서, 암은 췌장암이다.
특정 구현예에서, 췌장암은 IV 기 또는 국소 진행성 췌장암이다.
특정 구현예에서, 암은 전이를 포함한다.
특정 구현예에서, 치료는 화학요법 및/또는 방사선치료를 수반한다.
특정 구현예에서, 화학요법제는 겜시타빈이다.
특정 구현예에서, 백신을 이용한 면역요법 치료는 화학요법 치료 사이클 중에 이루어진다.
특정 구현예에서, 백신은 경구 투여된다.
특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 1x 105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 또는 1x1011 콜로니 형성 단위 (CFU)이다.
특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 1x109 CFU 미만이다. 특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 1x108 내지 1x109 CFU이다.
특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 1x108 CFU 미만이다. 특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 1x105 내지 1x108 CFU이며, 보다 구체적으로는 백신의 1회 투여량은 1x106 내지 1x107 CFU이다.
특정 구현예에서, 1회 투여량은 약 105 - 약 1011, 바람직하게는 약 106 - 약 1010, 보다 바람직하게는 약 106 - 약 109, 보다 더 바람직하게는 약 106 - 약 108, 가장 바람직하게는 약 106 - 약 107 콜로니 형성 단위 (CFU)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1의 VEGFR-2 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 약독화된 살모넬라 티피 균주 Ty21a를 포함하는, DNA 백신 VXM01에 관한 것으로서, 상기 플라스미드는 7580 bp 플라스미드 DNA이며, 이는 CMV 프로모터의 통제를 받는 VEGFR-2의 cDNA, 카나마이신 내성 유전자 및 pMB1 ori를 포함하며, pVAX10.VR2-1으로서 명명된다.
도 1: 플라스미드 pVAX10.VR2-1에 클로닝된 VEGFR-2 cDNA의 아미노산 서열
도 2: pVAX10.VR2-1의 플라스미드 지도
도 3: 백신 VXM01의 투여량 증량 설계
도 4: 전체 실험 계획
도 5: VXM01 특이적인 T 세포 반응
도 6: 종양 관류에 대한 VXM01의 효과
도 7: VEGF A 혈청 수준에 대한 VXM01의 효과
도 8: 콜라겐 IV 혈청 수준에 대한 VXM01의 효과
도 9: 혈압에 대한 VXM01의 효과
도 10: VXM01-유발성 항-담체 면역성
도 11: VXMO1 배출에 대한 분석 케스케이드
도 12: VXM01 배출
표 1: 환자 선정 기준
표 2: VMX01 특이적인 T 세포 반응
본 발명은 본 발명의 하기 상세한 설명과 설명에 포함된 실시예들을 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자를 1 카피 이상 포함하는 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주에 관한 것이다.
본 발명에서, 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주는, 재조합 DNA 분자를 타겟 세포에 전달하기 위한 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자의 박테리아 담체로서 기능한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "약독화된"은 약독성 돌연변이를 보유하지 않은 박테리아 모 균주와 비교해 병독성이 감소된 박테리아 균주를 지칭한다. 약독화된 박테리아 균주는 바람직하게는 자신의 병독성은 상실하지만, 예방 면역을 유도하는 능력은 유지한다. 약독화는 병독성, 조절성 및 대사성 유전자 등의 다양한 유전자의 결손에 의해 달성될 수 있다. 약독화된 박테리아는 천연적으로 발견되거나, 또는 예를 들어 새로운 배지 또는 세포 배양물에 적응시킴으로써 실험실에서 인위적으로 제조하거나, 또는 재조합 DNA 기법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "돌연변이 균주"는 게놈에 돌연변이를 가지고 있는 박테리아 균주를 지칭한다. 이런 맥락에서, 용어 "돌연변이"는 점 돌연변이, 삽입, 결손, 전위 및 역전 등의 핵산 서열에서의 변화를 지칭한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 "비제한적인 예로 ~를 포함하여"의 의미이다. 이 용어는 임의의 언급된 특징, 요소, 정수, 단계 또는 구성의 존재를 명시하기 위한 제약이 없는 형태를 지칭하지만, 하나 이상의 다른 특징, 요소, 정수, 단계, 구성 또는 이들의 그룹의 존재나 추가를 배제하지 않는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "포함하는"은 보다 제한적인 용어인 "로 구성된" 및 "본질적으로 구성된"을 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서 전체와 특히 청구항에서 사용되는 용어 "포함하는"은 용어 "로 구성된"으로 치환될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "재조합 DNA 분자"는 조작된 DNA 구조체, 바람직하게는 다른 기원의 DNA 조각들로 구성된 조작된 DNA 구조체를 지칭한다. 재조합 DNA 분자는 선형 핵산, 또는 바람직하게는 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프래임을 발현 벡터 플라스미드에 도입함으로써 제조된 환상의 재조합 DNA 플라스미드일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "발현 카세트"는 발현을 통제하는 조절 서열의 통제 하에 적어도 VEGF 수용체 단백질을 포함하는 핵산 유닛을 의미한다. 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주에 포함되는 발현 카세트는 바람직하게는 타겟 세포에 포함된 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프래임의 전사를 매개할 수 있다. 발현 카세트는 전형적으로 프로모터, 하나 이상의 오픈 리딩 프래임 및 전사 종결 신호를 포함한다.
VEGF 수용체 단백질은, 리간드인 혈관 내피 성장인자 (VEGF)와 결합하여 이량체화되고, 트랜스인산화를 통해 활성화되는, 내피 세포-특이적인 수용체-티로신 키나제이다. VEGF 패밀리의 성장인자 (Kd 75-760 pM)는 6가지 유형의 멤버, 즉 VEGF-A (VEGF라고도 함)에서 E와 PLGF (태반 성장인자, 이는 PGF 또는 PIGF-2라고도 함)를 망라한다. VEGF 성장인자는 혈관 시스템의 복수의 구성 요소들, 특히 혈액과 림프관의 증식과 분화를 조절한다. VEGFR의 주 아종으로는 3종, 즉 VEGFR-1 (또는 FLT1), VEGFR-2 (또는 KDR, FLK1) 및 VEGFR-3 (또는 FLT4)가 있다. 막-결합형 VEGF 수용체는 7개의 면역글루불린 유사 도메인, 단일한 막관통 스패닝 영역과, 스플릿 티로신-키나제 도메인을 함유한 세포내 영역으로 이루어진 세포외 영역을 가지고 있다. VEGFR 전사체는 또한 가용성 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 대안적인 스플라이스 변이체를 만든다.
VEGFR-2는 키나제-인서트-도메인-함유 수용체 (KDR)로도 알려져 있으며, VEGF에 대한 공지된 세포성 반응 거의 대부분을 매개하는 것으로 보인다. 예를 들어, 혈관신생에서 VEGF의 역할은 이 단백질과 VEGFR-2의 상호작용을 통해 매개되는 것으로 보인다. VEGFR-2는 1356개의 아미노산 길이에, 분자량은 200-230 kDa이며, VEGF 뿐만 아니라 VEGF-C 및 VEGF-D에 대해 높은 친화성을 가진 수용체이다. 티로신 키나제 수용체에 대한 내피 세포의 cDNA 스크리닝을 통해, 인간에서, VEGFR-2가 기존에 발견된 마우스 태아 간 키나제 1 (Flk-1)과 85%의 서열 동일성을 공유한다는 것이 확인되었다. VEGFR-2는 정상적으로는 내피 전구 세포 및 조혈 전구 세포 뿐만 아니라 내피 세포, 발생기 조혈 줄기 세포 및 제대혈 기질에서도 발현된다. 하지만, 휴지기 성체 혈관구조에서는 VEGFR-2 mRNA는 하향 조절되는 것으로 보인다.
VEGFR-2의 세포외 도메인은 잠재적인 N-연결된 당화 부위를 18개 포함한다. VEGFR-2는 먼저 150 kDa 단백질로 합성된 다음 신속하게 200 kDa인 중간 형태로 당화되고, 다시 보다 느린 속도로 성숙한 230 kDa 단백질로 당화되어 세포 표면 상에서 제시된다.
pVAX10.VR2-1 플라스미드에 클로닝된 cDNA 서열을 코딩하는 인간 VEGFR-2의 아미노산 서열은 도 1에 제시된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주는 약제로 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주는 백신으로 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "백신"은 투여시 개체에 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 지칭한다. 백신은 바람직하게는 질환을 예방, 완화 또는 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주, 바람직하게는 살모넬라 티피 Ty21a를 포함한다. 본 발명에 따른 백신은 VEGF 수용체 단백질, 바람직하게는 인간 VEGFR-2 또는 이와 약 80% 이상의 서열 동일성을 공유하는 단백질로부터 선택되는 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는, 발현 카세트, 바람직하게는 진핵 발현 카세트를 포함하는, 재조합 DNA 분자를 1카피 이상 더 포함한다.
VEGF 수용체를 코딩하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 본 발명에 따른 약독화된 살모넬라 돌연변이 생 균주는 상기 재조합 DNA 분자를 경구 전달하기 위한 비히클로서 이용될 수 있다. VEGF 수용체 단백질과 같은 이종 항원을 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 이러한 전달 벡터는 DNA 백신으로 지칭된다.
유전자 면역화는 종래 백신 접종 보다 유리할 것이다. 타겟 DNA는 상당 기간 동안 검출될 수 있어, 항원의 저장소로서 작용할 수 있다. 일부 플라스미드에서 GpC 아일랜드와 같은 서열 모티프는 면역자극성이므로, LPS 및 그외 박테리아 성분으로 인한 면역자극에 의해 더욱 촉진되는 보강제로서 기능할 수 있다. 생 박테리아 벡터는 리포폴리사카라이드 (LPS) 등의 자신의 면역조절 인자를 인 시추에서 생산하므로, 마이크로캡슐화 등의 다른 투여 형태들에 비해 이점이 될 수 있다. 아울러, 천연적인 도입 경로의 사용이, 살모넬라와 같은 수많은 박테리아들을 장 루멘 (gut lumen)으로부터 페이에르판 (Peyer's patch)를 통해 탈출시켜 궁극적으로 림프절과 비장으로 이동하게 하고, 따라서 백신을 면역 시스템 유도 부위들로 타겟팅할 수 있기 때문에, 효과적인 확인된다.
아울러, 살모넬라 엔테리카 균주는 잠재적으로 점막 면역화 경로, 즉, 비경구 투여에 비해 간단하고 안전한 이점을 제공해주는 경구 또는 코를 통해 전달될 수 있기 때문에, 살모넬라 엔테리카의 약독화된 유도체는 이종 항원을 포유류 면역 시스템에 전달하기 위한 비히클로서 매력적이다. 아울러, 살모넬라 균주는 전신 수준과 점막 구획 수준에서 강력한 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으킨다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주는 살모넬라 티피 Ty21a이다. 백신 균주 Ty21a는 지금까지 우수한 안전성 프로파일을 가지는 것으로 입증되고 있다. M 세포를 통한 장 루멘으로부터 탈출시, 박테리아는 대식세포 및 수지상 세포와 같은 식균 세포에 의해 흡수된다. 이들 세포는 병원체에 의해 활성화되어, 분화되기 시작하고, 어쩌면 림프절과 비장으로 이동하게 된다. 약독성 돌연변이로 인해, 살모넬라 티피 Ty21a 균주 박테리아는 이들 식균 세포내에서 생존할 수 없으므로, 이 때 죽게 된다. 재조합 DNA 분자는 방출된 후, 특이적인 수송 시스템을 통해 또는 엔도솜 누출 (endosomal leakage)에 의해 면역 식균 세포의 사이토졸로 운반된다. 최종적으로, 재조합 DNA 분자는 핵으로 들어가 그곳에서 전사되고, 식균 세포의 사이토졸에서 VEGF 수용체가 발현되게 된다. VEGFR 수용체 단백질에 특이적인 세포독성 T 세포가 활성화된 항원 제시 세포 (APC)에 의해 유도된다.
지금까지, 살모넬라 티피 Ty21a가 혈류를 통해 전신으로 유입될 수 있음을 시사해주는 데이타는 없는 실정이다. 따라서, 약독화된 살모넬라 티피 Ty21a 생 백신 균주는 우수한 안전성 프로파일을 가지면서도 면역 시스템의 특이적인 타겟팅이 가능하다.
특정 구현예에서, VEGF 수용체 단백질은 인간 VEGFR-2 및 이와 약 80% 이상의 서열 상동성을 공유하는 이의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이 문장에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위에서의 95% - 105%를 포함하여, 80% -120%, 다른 예로 90% - 110%를 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "인간 VEGFR-2와 약 80% 이상의 서열 상동성을 가지는 단백질"은 인간 VEGFR-2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열과 상이한 단백질을 지칭한다. 단백질은 천연 기원, 예컨대 여러 종의 VEGFR-2 상동체이거나 또는 조작된 단백질, 예컨대 조작된 VEGFR-2 유도체일 수 있다. 코돈의 용법은 종간에 상이한 것으로 알려져 있다. 따라서, 타겟 세포에서 이종의 단백질을 발현시키는 경우, 타겟 세포의 코돈 용법에 맞게 핵산 서열을 조정하는 것이 필수적이거나 또는 적어도 도움이 될 수 있다. 해당 단백질의 유도체를 정의하고 구축하는 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
인간 VEGFR-2와 약 80% 이상의 서열 동일성을 공유한 단백질은, 하나 이상의 아미노산에 대한 부가, 결손 및/또는 치환을 포함하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 교시 내용에 따라, 이러한 결손, 부가 및/또는 치환된 아미노산은 보존적인 아미노산이거나 또는 인간 VEGFR-2와 약 80% 이상의 서열 동일성을 공유한 단백질의 아미노산 서열 길이 전체에 배치될 수 있다. 본 발명의 교시 내용에 따라, 인간 VEGFR-2와의 서열 동일성이 약 80% 이상인 한에서, 여러 개의 아미노산이 부가, 결손 및/또는 치환될 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 VEGFR-2와의 서열 동일성은 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상 또는 가장 바람직하게는 약 95% 이상이다. 모 단백질과 모 서열에 비해 결손, 부가 및/또는 치환을 가진 이의 유도체의 비교를 비롯하여, 서열 동일성을 결정하는 방법과 알고리즘은 당해 기술 분야의 실무자들에게 잘 공지되어 있다. 인간 VEGFR-2와 약 80% 이상의 서열 동일성을 가진 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 유전자 코드의 축중 (degeneracy)으로 인해 DNA 수준에서 상당히 상이할 수 있다.
특정 구현예에서, VEGF 수용체 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 인간 VEGFR-2이다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주를 포함하는 DNA 백신에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주는 살모넬라 티피 Ty21a이다. 약독화된 살모넬라 티피 Ty21a 균주는 Vivotif® (Berna Biotech Ltd., a Crucell Company, Switzerland)라는 Typhoral L®의 활성 성분이다. 이것이 현재 허가받은 유일한 장티푸스 경구 생 백신이다. 이 백신은 광범위하게 조사되었으며, 환자 독성에 대한 안전성과 제3자 환자로의 전염이 입증되었다 (Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295). 이 백신은 40개국 이상에서 허가되어 있다. Typhoral L®의 품목 허가 번호는 1996년 12월 16일자로 PL 15747/0001이다. 백신의 1회 용량은 살아있는 S. typhi Ty21a를 2x109 콜로니 형성 단위 이상으로, 비-생존 S. typhi Ty21a를 5x109 콜로니 형성 단위 이상으로 포함한다.
살모넬라 티피 Ty21a 박테리아 균주의 생화학적 특성들 중 한가지는 갈락토스 대사 불능이다. 약독화된 돌연변이 균주는 또한 야생형 살모넬라 Ty2 균주와는 달리 황산염을 아황산염으로 환원시키지 못한다. 혈청학적 특징과 관련하여, 살모넬라 티피 Ty21a 균주는 박테리아의 외막 다당류인 09-항원을 포함하고 있으며, 살모넬라 티피무리움의 특징적인 구성 성분인 05-항원이 결핍되어 있다. 이러한 혈청학적 특징으로 인해 출하 승인 (batch release)을 위한 동일성 검사 (identity test) 패널에 해당 검사를 포함시킨다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 진핵 생물에 대한 발현 카세트이다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "진핵 생물에 대한 발현 카세트"는 진핵생물 세포에서 오픈 리딩 프래임의 발현을 허용하는 발현 카세트를 지칭한다. 알맞은 면역 반응을 유도하는데 필요한 양의 이종 항원은 박테리아에게 독성이어서, 세포가 사멸되거나, 과다-약독화되거나 또는 이종 항원의 발현이 소실될 수 있는 것으로 확인되었다. 박테리아 벡터에서는 발현되지 않고 타겟 세포에서만 발현되는 진핵 생물에 대한 발현 카세트를 이용하여, 이러한 독성 문제를 극복할 수 있으며, 발현되는 단백질은 진핵 생물의 당화 패턴을 보일 수 있다.
진핵 발현 카세트는 진핵 생물 세포에서 오픈 리딩 프래임의 발현을 통제할 수 있는 조절 서열, 바람직하게는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 본 발명의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주에 포함되는 재조합 DNA 분자에 포함된 프로모터와 폴리아데닐화 신호는, 바람직하게는, 면역화할 개체의 세포 안에서 기능하도록 선택된다. 특히 인간용 DNA 백신 제조에 적합한 프로모터의 예로는, 비제한적으로, 강력한 CMV 최초기 프로모터와 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 유래 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) 유래 프로모터, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 유래 프로모터, 예컨대 HIF 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 유래 프로모터, 엡스테인 바르 바이러스 (EBV) 유래 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 (RSV) 유래 바이러스 뿐만 아니라 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인 등의 인간 유전자 유래 프로모터를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 진핵 생물에 대한 발현 카세트는 CMV 프로모터를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "CMV 프로모터"는 강력한 최-초기 사이토메갈로바이러스 프로모터이다.
특히 인간용 DNA 백신 제조에 적합한 폴리아데닐화 신호의 예로는, 비제한적으로, 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 부위, SV40 폴리아데닐화 신호 및 LTR 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주에 포함되는 재조합 DNA 분자에 포함된 진핵 발현 카세트는 BGH 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
재조합 DNA 분자에는, 프로모터 및 폴리아데닐화 신호와 같은 VEGF 수용체 단백질의 발현에 필요한 조절 인자들 외에도, 다른 인자들도 포함된다. 이러한 추가적인 인자들로는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 예를 들어 인간 액틴 인핸서, 인간 미오신 인핸서, 인간 헤모글로빈 인핸서, 인간 근육 크레아틴 인핸서 및 바이러스 인핸서, 예컨대 CMV, RSV 및 EBV 유래 인핸서를 포함한다.
조절 서열과 코돈은 단백질 생산을 최대화하기 위해 일반적으로 종 의존적이며, 조절 서열과 코돈은 바람직하게는 면역화할 종에게 유효하도록 선정된다. 당해 기술 분야의 당업자는 주어진 대상 종에서 기능하는 재조합 DNA 분자를 생산할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 DNA 백신은 암 면역요법에 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, DNA 백신은 서열번호 1의 VEGFR-2 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 약독화된 살모넬라 티피 균주 Ty21a를 포함한다.
특정 구현예에서, DNA 백신은 항-혈관신생 암 면역요법에 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 재조합 DNA 분자는 CMV 프로모터의 통제 하에 카나마이신 항생제 내성 유전자, pMB1 ori, 및 인간 VEGFR-2 또는 이와 80% 이상의 서열 상동성을 공유한 단백질을 코딩하는 진핵 발현 카세트를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 VEGFR-2는 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 가진다.
진핵 사이토메갈로바이러스 (CMV) 최초기 프로모터는 숙주 세포에서 VEGFR-2 단백질의 효율적인 번역을 보장해주며, 원핵 생물의 복제 오리진 (ori)은 박테리아 숙주내에서의 증폭을 매개한다.
특정 구현예에서, 재조합 DNA 분자는 상업적으로 이용가능한 pVAX1TM 발현 플라스미드 (Invitrogen, San Diego, California)로부터 유래된다. 이 발현 벡터는 고카피 pUC 복제 오리진을 pBR322의 저카피 pMB1 복제 오리진으로 치환함으로써 변형시킨 것이다. 저카피 변형물은 대사 부담을 줄여 구조체를 보다 안정적으로 만들기 위해 행해졌다. 플라스미드 pVAX10.VR2-1 구조체에 대한 상세 내용은 도 2에 도시되어 있다. 제조된 발현 벡터 벡본은 pVAX10로 명명되었다. 이 발현 벡터 벡본에 서열번호 2에 기재된 핵산 서열의 인간 VEGFR-2가 삽입되어, 발현 플라스미드 pVAX10.VR2-1이 제조되었다.
발현 플라스미드 pVAX10.VR2-1은 도 2에 개략적으로 도시되어 있다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 도 2에 도시된 7580bp pVAX10.VR2-1이며, 서열번호 3에 기재된 서열을 가지며, DNA 백신은 VXM01으로 명명된다. VXM01은, 인간 혈관 내피 성장인자-수용체 2 (VEGFR-2)의 진핵 발현 카세트를 코딩하는, 플라스미드 DNA, pVAX10.VR2-1을 1카피 이상 포함하는, 약독화된 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 Ty21a 균주로 구성된, 경구 암 백신이다.
특정 구현예에서, 암은 췌장암이다.
특정 구현예에서, 췌장암은 IV기 또는 국소 진행성 췌장암이다.
특정 구현예에서, 암은 전이를 포함한다.
특정 구현예에서, 암 면역요법은, 종양 항원 및/또는 종양 기질 항원을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자를 1 카피 이상 포함하는, 추가의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주(들)를 1종 이상 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 1종 이상의 추가의 살모넬라 돌연변이 균주(들)는 진핵 발현 카세트를 포함하는 살모넬라 티피 Ty21a이다. 특정 구현예에서, 상기 1종 이상의 추가의 살모넬라 균주(들)는 인간 WT1을 코딩하는 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주를 포함한다.
본 발명의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는, 제2 종양 기질 항원 또는 종양 항원을 코딩하는 DNA 분자를 포함하는 제2의 약독화된 돌연변이 균주와 조합됨으로써, 상승적인 항종양 효과를 가질 수 있다. 특히, 종양 및 종양 기질의 동시 타겟팅은 종양의 탈출 위험성을 최소화할 수 있다. VEGFR-2를 이용한 면역요법과 WT1을 이용한 암 면역요법의 조합은, WT1을 과다발현하는 인간 세포 및 종양 혈관구조를 동시에 공격하게 되므로, 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는 상기 추가의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주(들) 1종 이상과 공동-투여된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "공동-투여" 또는 "공동-투여한다"는 2종의 다른 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주를 3일 이내에, 보다 구체적으로는 2일 이내에, 보다 구체적으로는 동일한 날에, 보다 구체적으로는 12시간 이내에 투여하는 것을 의미한다. 가장 구체적으로는, 본 발명의 맥락에서, 용어 "공동-투여"는 2종 이상의 다른 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주의 동시 투여를 의미한다.
특정 구현예에서, 치료는 화학요법, 방사선 치료 및/또는 생물학적 암 치료법에 의해 수반된다. 암의 치유를 위해, 암 줄기 세포의 완전한 제거가 필연적일 수 있다. 효능 극대화를 위해, 여러가지 요법들의 조합도 유익할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "생물학적 암 치료법" 또는 "암 면역요법"은 악성 종양 세포나 종양 기질을 공격하도록 환자의 면역 시스템을 자극하는 것을 의미한다. 생물학적 암 치료법은 종양 항원의 전달, 치료 항체의 약물로서의 전달, 면역자극성 사이토카인의 투여 및 면역 세포의 투여를 포함한다.
본 발명의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주와 조합하여 사용할 수 있는 화학요법제로는, 예를 들어, 아미포스틴 (amifostine) (ethyol), 카바지탁셀 (cabazitaxel), 시스플라틴 (cisplatin), 다카르바진 (dacarbazine) (DTIC), 닥티노마이신 (dactinomycin), 도세탁셀 (docetaxel), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 스트렙토족신 (streptozocin), 사이클로포스파미드, 카르누스틴 (carrnustine) (BCNU), 로무스틴 (lomustine) (CCNU), 독소루비신 (아드리아마이신 (adriamycin)), 독소루비신 lipo (doxil), 폴린산 (folinic acid), 겜시타빈 (gemcitabine) (gemzar), 다우노루비신 (daunorubicin), 다우노루비신 lipo (daunoxome), 프로카바진 (procarbazine), 케토코나졸 (ketokonazole), 미토마이신 (mitomycin), 시타라빈 (cytarabine), 에토포시드 (etoposide), 메토트렉세이트 (methotrexate), 5-플루오로우라실 (5-FU), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 블레오마이신 (bleomycin), 파클리탁셀 (탁솔 (taxol)), 도세탁셀 (docetaxel) (taxotere), 알데스루킨 (aldesleukin), 아스파라기나제, 부설판 (busulfan), 카보플라틴 (carboplatin), 클라드리빈 (cladribine), 캄프토테신 (camptothecin), CPT-11, 10-하이드록시-7-에틸-캄프토테신 (캄프토테신 (camptothecin)) (SN38), 다카르바진 (dacarbazine), 플록스우리딘 (floxuridine), 플루다라빈 (fludarabine), 하이드록시우레아, 이포스파미드 (ifosfamide)), 이다루비신 (idarubicin), 메스나 (mesna), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 이리노테칸 (Irinotecan), 미톡산트론 (mitoxantrone), 토포테칸 (topotecan), 루프롤라이드, 메게스테롤 (megestrol), 멜팔란 (melphalan), 머캅토푸린, 옥살리플라틴 (Oxaliplatin), 필카마이신 (plicamycin), 미토탄 (mitotane), 페가스파르게이즈 (pegaspargase), 펜토스타틴 (pentostatin), 피포브로만 (pipobroman), 필카마이신 (plicamycin), 스트렙토족신 (streptozocin), 타목시펜 (tamoxifen), 테니포시드 (teniposide), 테스토락톤 (testolactone), 티오구아닌, 티오테파 (thiotepa), 우라실 머스타드, 비노렐빈 (vinorelbine), 클로람부실 (chlorambucil) 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에 따른 VXM01와 조합하는데 가장 바람직한 화학요법제는 카바지탁셀, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 도세탁셀, 겜시타빈, 독소루비신, 파클리탁셀 (탁솔), 이리노테칸, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 폴린산, 5-플루오로우라실 및 블레오마이신이며, 특히 겜시타빈이다.
특정 구현예에서, 화학요법제는 겜시타빈이다.
또한, 항생제 또는 항-염증제를 이용한 치료를 포함하는 것이 잠재적인 부작용 발생에 따라 우호적일 수도 있다.
히스타민, 루코트리엔 또는 사이토카인에 의해 매개되는 과민성 반응과 비슷한 부작용이 발생할 것이므로, 열, 아나필랙스 (anaphylaxis), 혈압 불안정, 기관지 경련 및 호흡곤란 (dyspnoea)에 대한 치료 옵션이 이용가능하다. 원치않은 T 세포 유래 자가-공격의 경우, 치료 옵션은 줄기 세포 이식 후에 적용되는 급성 및 만성 이식 편대 숙주 질환의 표준 치료 계획으로부터 유래된다. 사이클로스포린과 글루코코르티코이드가 치료 옵션으로 제시된다.
있을 법하지 않은 살모넬라 티피 Ty21a 타입의 전신 감염의 경우, 적절한 항생제 요법이 권고되며, 예를 들어 시플로플록사신 또는 오플록사신을 비롯한 플루오로퀴놀론을 이용한 항생제 요법이 권고된다. 위장관의 박테리아 감염은 리파시민 등의 관련 제제로 치료된다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는 화학요법 또는 방사선 치료 사이클 중에 또는 생물학적 암 치료 동안에 투여된다. 특정 구현예에서, 백신을 이용한 면역치료학적 치료는 화학요법의 치료 사이클 중에 수행된다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는 화학요법 또는 방사선 치료 사이클 이전에 또는 생물학적 암 치료 전에 투여된다. 이런 방식은 화학요법 또는 방사선 치료를 암 면역성이 보강된 조건에서 수행될 수 이게 하므로, 유용할 수 있다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는 화학요법 또는 방사선 치료 사이클 이후에 또는 생물학적 암 치료 이후에 투여된다.
특정 구현예에서, 백신은 경구로 투여된다. 경구 투여는 비경구 투여 보다 간단하고, 안전하며, 보다 편안하다. 비경구, 피하 또는 진피내 투여에 따른 부작용은 본 발명의 DNA 백신을 경구 투여함으로써 해결할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는 임의의 다른 적합한 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 바람직하게는, 치료학적 유효량이 개체에게 투여되며, 이 용량은 구체적인 용도, 악성 종양의 타입, 개체의 체중, 연령, 성별 및 건강 상태, 투여 방식과 제형 등에 따라 결정된다. 투여는 필요에 따라 1회이거나 다회일 수 있다.
본 발명의 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는 용액, 현탁물, 동결건조물 또는 임의의 다른 적정 형태로 제공될 수 있다. 이는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합하여 제공될 수 있다. pH 값을 적정하기 위한 물질, 완충제, 독성 조절제 등도 포함될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 생리학적으로 허용가능하며 전형적으로 포유류 (예, 인간)에게 투여시 적절하지 않은 반응을 발생시키지 않는, 약학 조성물의 분자 물질 (molecular entity)과 그외 성분들을 지칭한다. 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 또한 포유류, 보다 구체적으로 인간에 사용하기 위해 미국 약전 또는 그외 일반적으로 인지된 약전에 열거되거나 연방 또는 주정부 규제 기관으로부터 승인받은 수단일 수 있다.
본 발명의 백신은 비교적 저용량에서 놀랍게도 효과를 나타낸다. 특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 약 1x105, 약 1x106, 약 1x107, 약 1x108, 약 1x109, 약 1x1010, 또는 약1x1011 콜로니 형성 단위 (CFU)이다. 이 박테리아 생 백신의 저용량 투여는 배출 위험성을 최소화하고, 제3의 환자에게로의 전염을 최소화한다.
이 문장에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 소정의 값 또는 범위의 1.5배 이내를 비롯하여, 3배 이내, 다른 예로 2배 이내를 의미한다.
특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 약 1x109 CFU 미만이다. 특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 1x108 내지 1x109 CFU이다.
특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 약 1x108 CFU 미만이다. 특정 구현예에서, 백신의 1회 투여량은 1x105 - 1x108 CFU이고, 보다 구체적으로는 백신의 1회 투여량은 1x106 - 1x107 CFU이다.
특정 구현예에서, 1회 용량은 약 105 - 약 1011, 구체적으로 약 106 - 약 1010, 보다 구체적으로 약 106 - 약 109, 보다 구체적으로 약 106 - 약 108, 가장 구체적으로는 약 106 - 약 107 콜로니 형성 단위 (CFU)를 포함한다.
특정 구현예에서, 약독화된 살모넬라 돌연변이 균주는 개별 맞춤형 암 면역요법에 사용하기 위한 것이다. 개별 맞춤형 암 면역요법은 환자의 종양 기질 항원 발현 패턴 또는 종양 항원 발현 패턴을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 개별 맞춤형 암 면역요법은 또한 종양 기질 항원 또는 종양 항원에 대한 프리-면역 반응, 바람직하게는 VEGFR-2에 대한 프리-면역 반응을 평가하는 단계를 포함할 수도 있다. 이런 맥락에서, 기존에 존재하는 VEGFR-2에 대한 면역 반응은 VXM01의 양성 임상 반응, 특히 종양 관류 (tumor perfusion) 감소와 상당한 상호관련있는 것으로 입증되었다.
VXM01은 - 그 자체로 또는 진핵 발현 시스템을 포함하는 다른 살모넬라 티피 Ty21a계 암 백신과 조합하여 - 다양한 암 타입들을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, VXM01은 개별 맞춤형 환자 특이 암 치료에 사용될 수 있다. 이러한 목적으로, 환자의 기질 및/또는 종양 항원 발현 패턴은, 예를 들어, 환자의 특이 기질 및/또는 종양 항원 패턴을 타겟으로 하는 동반 진단에 의해 제1 단계에서 평가할 수 있다. 다른 예로, 기질 및/또는 종양 항원에 대한 기-존재하는 면역 반응을 평가할 수 있다. 환자의 기질 및/또는 종양 항원 발현 패턴에 따라, VMX01은 단독으로 또는 진핵 발현 시스템을 포함하는 1종 이상의 적합한 다른 살모넬라 티피 Ty21a계열의 암 백신(들)과 조합하여 투여될 수 있다. VXM01과 1종 이상의 다른 살모넬라 티피 Ty21a 계열의 암 백신(들)은 또한 고정 조합제 (fixed combination)로서 투여될 수 있다. 2종 이상의 살모넬라 티피 Ty21a계열의 암 백신(들)을 조합한 이러한 칵테일은 개별 기성품 (off the shelf product)들로 구성될 수 있다. 조합제는 고정형 또는 개별형일 수 있으며, 항-혈관신생계 치료제로서 VXM01을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 서열번호 1의 VEGFR-2 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 약독화된 살모넬라 티피 균주 Ty21a를 포함하며, 상기 플라스미드는 7580 bp 플라스미드 DNA이며 CMV 프로모터의 통제를 받는 VEGFR-2의 cDNA와, 카나마이신 내성 유전자 및 pMB1 ori을 포함하며, pVAX10.VR2-1으로 명명되는 것인, DNA 백신 VXM01에 관한 것이다.
실시예
실시예 1 살모넬라 티피 Ty21a 균주 제조 및 플라스미드 제조
연구 시드 lot (RSL) 제조의 제1 단계는, 약독화된 살모넬라 티피 Ty21a 균주의 분리 및 이후의 이 약독화된 박테리아에 플라스미드 DNA (pVAX10.VR2-1)를 형질전환하는 단계로 구성된다.
액체 배양 배지에 살모넬라 티피 Ty21a 분리주를 접종하고, 단일 박테리아 콜로니를 분리하기 위한 목적으로 액체 배양물을 아가 배지 상에 도말하였다. 단일 콜로니를 취하여, 액체 배양 배지에서 배양하였다. 배양물 2종, 즉 VAX.Ty21-1과 VAX.Ty21-2를 글리세롤로 제형화하고, 분액 (1　ml)하고, 사용시까지 -75℃ ± 5℃에서 보관하였다. 2종의 배양물 각각의 아이덴터티는 이후에 검증하였다.
플라스미드 합성 원칙은 하기 단계를 이용하여 시험관내 이중 가닥 유전자 합성을 기반으로 하였다:
- pVAX10-VR2.1 플라스미드 전체 서열 7.58　kb을 (소프트웨어 분석에 의해) ~1.5　kb 씩 5개의 섹션으로 나누었다. 각 섹션은 40-50 bp 올리고뉴클레오티드로 다시 나누고, 이들 각각은 양쪽 가닥의 올리고뉴클레오티드 간에 중첩되는 영역을 가진다.
- 시험관내에서 합성한 올리고뉴클레오티드를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 인큐베이션하여 인산화하였다.
- 적정 조건 하에 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 대상으로 어닐링 공정을 수행한 다음, Taq DNA 리가제 효소로 정렬된 올리고뉴클레오티드를 연결시켰다.
- 연결 단계 종료시, 밖으로 향하는 위치에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여, 연결된 플라스미드 단편들의 수율을 증가시켰다 (~1.5　kb).
- 분취용 아가로스 겔 전기영동을 수행하여, PCR 산물을 분리하였다.
- 분리된 PCR 산물을 TOPO 벡터 (Invitrogen K#4575-40)에 클로닝하고, 이를 증폭을 위해 TOP10 E. coli 세포로 형질전환하였다.
- TOPO 플라스미드를 분리한 후, 제한 효소 및 서열 검증을 수행하였다.
- 분리된 정렬된 단편들을 중첩 PCR을 이용하여 조립하였다. 이 공정은 pVAX10.VR2-1 플라스미드로 선형 조립함으로써 이행하였다.
- XhoI 제한효소로 절단하고 (하나의 제한효소 부위가 pVAX10.VR2-1 플라스미드에 존재함, 도 2 참조) T4 리가제를 이용하여 공유 결합시킨 후, 증폭을 위해 환상 플라스미드로 E. coli을 형질전환하였다.
- 최종 플라스미드 서열을 검증한 후, pVAX10.VR2-1 플라스미드를 S. typhi Ty21a 박테리아 균주에 형질전환시켰다.
따라서, 플라스미드 pVAX10.VR2-1이 성공적으로 합성되었다 (참조 서열에서 이탈되지 않음). 이 플라스미드를 다시 사용하여 S. typhi Ty21a 박테리아 균주를 형질전환시켰다.
실시예 2 VXM01 - I 상 임상 실험; 실험 설명
본 I 상 임상 실험에서는 VXM01에 대한 안전성, 허용성, 면역 반응 및 임상 반응을 조사하였다. 무작위, 위약-대조군, 이중 맹검의 용량-증가형 실험으로, 국소 진행형 또는 IV기의 췌장암 환자 45명을 참여시켰다. 환자들에게는 4가지 용량으로 VXM01 또는 위약을 제공하였으며, 아울러 표준 치료로서 겜시타빈을 제공하였다. VXM01 용량 106 CFU에서 최대 1010 CFU를 본 실험에서 조사하였다. 용량-증가 결정에 독립적인 DSMB (data safety monitoring board)를 관여시켰다. 일차 엔드포인트로서 안전성 외에도, VXM01-특이 면역 반응과 임상 반응 파라미터를 평가하였다.
전임상 효능 평가:
본 발명자들은 동물을 대상으로 본 방식의 효능과 안전성을 여러번 검증하였다. 본 발명자들은 추가적인 실험들을 통해 2가지 다른 췌장암 모델에서 본 백신의 활성을 입증하였다.
본 실험에 사용된 백신인 VXM01은 사전에 마우스에서 검사한 항-VEGFR-2 백신의 인간화된 버전이다. 이는 인간의 전장 VEGFR-2를 코딩하고 있으며, 담체로서 살모넬라 티피무리움 대신 허가된 살모넬라 티피 균주 Ty21a를 이용한다. 본 백신은, 장의 M 세포를 통해 페이에르판으로 VXM01이 도입되고 항원-제시 세포에 내재화된 후 코딩된 DNA가 번역됨으로써, 단핵세포 및 수지상 세포에서 VEGFR-2 단백질이 발현되게 유발하는 것으로 추정된다.
전임상 안전성 평가:
수반된 마우스에서의 전임상 독성 실험은 인간 백신 VXM01으로 수행된 마우스에서의 1회 용량 독성 실험으로 한정되지 않았다. VXM01은 인간 숙주에 특이적이므로, 마우스를 대상으로 한 인간 백신의 실험은 공정 관련 불순물에 대한 잠재적인 효과와 심혈관, 호흡 또는 중추 신경계 손상에 대한 잠재적인 관련성에 해당되는 신호 및 징후들에 집중하였다. 항-VEGFR-2 T 세포 반응의 독성 프로파일을 조사하기 위해, 마우스에서 용량-의존적인 T 세포 반응을 유도하는 VXM01의 뮤라인 유사체 구조체를 이용하여 반복적인 용량 독성 실험을 수행하였다. 발명자의 이전 관찰 결과에 따르면, 치료-관련 사망 및 독성학적으로 중요한 임상 신호들은, 우수 실험실 운영 기준 (Good Laboratory Practice: GLP)에 따라 수행된 본 실험들에서 관찰되지 않았다.
본 실험에서 사용된 벡터 살모넬라 티피 Ty21a는 백신 VXM01을 경구 전달할 수 있는 약독화된 생 박테리아 담체이다. 이는 그 자체로서 장티푸스 백신 (Vivotif®, Crucell, formerly Berna Biotech Ltd., Switzerland)으로 허가받았으며, 이는 광범위하게 평가되었으며, 환자 독성과 제3의 환자로의 전염에 대한 안전성이 입증되었다 (Wahdan et al., J. Infectious Diseases 1982, 145:292-295). VXM01은 유전자 전이 의약 산물로서 분류되며, 해당 지침과 규제에 따른다.
실험 설명 및 목적:
수행된 실험은 수술 불가 또는 IV기 췌장암 환자를 대상으로 한 실험 백신 VXM01에 대한 단일 센터, 위약 대조군, 이중 맹검의 용량 증가 실험이다. 백신은 표준 치료제인 겜시타빈 치료와 더불어 제공하였다.
목적은 조사용 항-VEGFR-2 백신 VXM01에 대한 안전성, 허용성, 면역 반응 및 임상 반응을 조사하고, VXM01의 최대 허용 용량 (MTD)을 결정하기 위한 것이었다. MTD는 VXM01 치료중인 환자 최대 6명 중에서 1명 이하가 용량-제한 독성 (DLT)을 경험하는 최고 용량 수준으로서 정의된다.
안전성 및 허용성에 대한 일차 엔드포인트는 다음과 같다: 국립 암 연구소의 이상 반응에 대한 표준 용어 기준 (CTCAE)에 따라, 4 등급 이상 또는 3 등급 이상의, 위장 누공, 설사, 위장 천공, 다-장기 부전, 아나필랙시스, 임의의 자가-면역 장애, 사이토카인-방출 증후군, 장 출혈, 신부전, 단백뇨, 혈전색전성 사례 (thromboembolic event), 발작, 심부전 또는 혈관염에 대한 약물 실험과 관련된, DLT로 정해진 임의의 이상 반응 (AE)의 수.
VEGFR-2에 대해 특이 면역 반응을 유발하는 실험 백신의 효능을 평가하는 이차 엔드포인트는 면역 양성 환자의 수를 포함하였다.
추가적인 이차 엔드포인트는 임상 반응이었다: 고정 종양에서의 반응 평가 기준에 따른 종양의 단계 (RECIST), 전체 반응율, 무진행성 생종 (progression free surviva), 전체 생존율 및 종양 관류의 변화. 종양 관류는 1.5 테슬라 시스템 (Magnetom Aera, Siemens, Erlangen, Germany)의 다이나믹 컨트라스트-보강된 자기 공명 영상화 (DCE-MRI: dynamic contrast-enhanced Magnetic Resonance Imaging)에 의해 측정하였다.
VXM01은 우수 제조 실무 (GMP)에 따라 제조되었으며, 완충화된 용액 중에 제공되었다. 위약 대조군은 소듐 클로라이드 등장 용액으로 구성되었다.
환자 선별과 임상 실험 설계:
본 실험에는 국소 진행형 및 수술 불가 또는 IV기 췌장암 환자 최대 45명이 참여하였다. 적격 기준은 표 1에 요약 개시한다.
포함 기준
1. 서면 형태의 사전 동의를 받고, 사인과 날짜가 기재됨
2. 컴퓨터-단층 (CT)을 이용한 진단 영상화 또는 조직학적 검사를 기반으로 하는 UICC에 따른, 국소 진행된, 수술불가한 및 IV기 췌장암 환자
3. 남성 또는 폐경기 여성
4. 8세 이상
5. 겜시타빈 치료를 제외하고는 스크리닝 방문하기 전 60일이내에 화학요법을 받지 않음
6. 카르노프스티 인덱스 (Karnofsky index) >70
7. 예상 수명 >3 개월
8. 신장, 간 및 골수의 기능 부전
9. 호중구 절대치 >1500/㎕
10. 헤모글로빈 >10　g/dL
11. 혈소판 >75000/㎕
12. 프로트롬빈 시간 (Prothrombin time) 및 국제 정상화 비율 (international normalized ratio, INR)이 정상 상한치 (ULN) (항응고 처리를 제외함)의 <1.5 배임
13. 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제: ULN의 <4 배임
14. 알라닌 아미노트랜스퍼라제: ULN의 <4 배임
15. 총 빌리루빈: ULN의 <3 배임
16. Cockcroft-Gault에 따른 크레아티닌 예상 소거율 > 30 mL/min임
17. 단백뇨: 24시간 뇨 수집시 단백질 <1 g임
제외 기준
18. 췌장 절제 (완전 또는 일부)한 상태
19. 절제가능한 질환
20. 스크리닝 방문 전 60일이내에 약물 시험에 참여함
21. 기저 또는 평편 세포 피부 암, 인 시추 경부 암 또는 임의의 기타 암을 제외한 , 다른 이전의 또는 현재 악성 암에 대해 환자는 2년 미만으로 무 질환 상태임
22. 췌장 (전체 또는 일부) 절제 후 Ty21a로 이전에 백신 접종 받음
23. 절제가능한 질환
24. 스크리닝 방문 전 60일이내에 약물 시험에 참여함
25. 기저 또는 평편 세포 피부 암, 인 시추 경부 암 또는 임의의 기타 암을 제외한 , 다른 이전의 또는 현재 악성 암에 대해 환자는 2년 미만으로 무 질환 상태임
26. Ty21a로 이전에 백신 접종 받음
27. 아래와 같이 정의되는 심혈관 질환:
통제되지 않는 고혈압 (수축기 혈압 >160　mmHg 또는 이완기 혈압 >100 mmHg)
무작위화하기 전 6개월 이내에 하기를 포함한 동맥 혈전색전 질환 발생:
- 심근 경색
- 불안정한 협심증
- 뇌혈관 발작
- 일과성 허혈성 발작
28. 울혈성 심부전이 뉴욕 심장학회에 따르면 III - IV 등급임
29. 약물 요법이 필요한 중증 심실성 부정맥
30. 임상적으로 유의한 말초 동맥 질환이 폰테인에 따르면 2b 등급 보다 높음
31. 무작위화하기 전 6개월 이내에 객혈
32. 식도 정맥류
33. 무작위화하기 전 6개월 이내에 상부 또는 하부 위장 출혈
34. 무작위화하기 전 4주 이내에 유의한 외상성 상해
35. 비-치유성 병변, 포함하기 전 3년 이내에 골절 또는 임의의 위장 궤양 병력, 또는 포함하기 전 3년 이내에 위경검사에서 양성
36. 위장 누공
37. 무작위화하기 전 4주 이내에 혈전용해 치료
38. 스크리닝 방문하기 30일 이내에 장 폐쇄
39. 간경변이 Child-Pugh Score-Classification에 따르면 B 등급 이상임
40. 임의의 급성 또는 만성 전신 감염이 존재함
41. 무작위화하기 전 4주 이내에 방사선 치료
42. 무작위화하기 전 4주 이내에 주요 외과 시술 또는 개복 생검 검사
43. 무작위화하기 전 7일 이내에 미세 바늘 흡입
44. 하기를 이용한 이중 맹검 실험하기 2주 전부터 실험 기간 동안의 만성적인 병용 요법:
- 코르티코스테로이드 (부신 부전에 대한 스테로이드는 제외) 또는 면역억제제
- 항생제
- 베박시주맵
- 임의의 상피 성장 인자 수용체 저해제
45. 10일 다약제 내성의 그람 음성균 이전의 겜시타빈을 제외한 화학요법
46. 임신
47. 수유
48. 실험 및/또는 추적을 완료할 수 없음
49. 조사 약물의 사용이 금지된 질환 또는 병태로 합리적으로 의심하게 하거나, 실험 결과 해석에 영향을 미칠 수 있거나 또는 환자에게 치료 합병증 발병 위험성을 높이는, 다른 질환 병력, 대사 부전, 신체 검사 결과 또는 임상적인 실험 결과
50. 임신 가능 여성
51. 약물 과민 병력
52. 실험 동안에 환자에게 부적절한 위험성을 발생시키는 모든 병태
본 실험에서 환자 총 371명을 스크리닝하였다. 제외시킨 의학적 요법 (179), 환자의 의료 병력에서 기 존재하는 의학적인 병태 (129) 및 개인적인 사유 (18)로 인해 326명의 환자가 부적격이었다. 환자 45명이 참여하였으며, 무작위화하고, 하이델베르그 임상 대학의 임상 연구 유닛 (KliPS)에서 실험 프로토콜에 맞게 인-하우스 실험 단계로 10일간 성공적으로 완료하였다. 환자의 인구 통계 베이스라인 질환 특징들은 2가지 그룹들에서 유의하게 다르지 않았지만, 진단이 VXM01 그룹에서 더 오래걸려 (8 대 6개월), VXM01 그룹의 환자들은 포함 시기에는 보다 진행된 종양 단계를 가지고 있었다 (40%에서 CA19.9 > 1000 vs. 20%, 전이 질환 83% vs. 53%).
남성 환자와 폐경기 여성 환자들이 본 실험에 참여하였다. 하지만, 2 성별 간의 차이는 조사하지 않았다. 본 실험에 참여한 환자들의 평균 생존 기간은 6개월 미만이었다. 그러나, 미리 정해진 프로토콜에 따른 환자의 추적 기간은 최대 24개월이었다. 실험 치료는 표준 치유에 부가하는 형태로 제1선으로 제공되었다. 복수의 일차 및 이차 약물동력 전임상 실험들에서의 다른 인자들을 추가로 고려하면, 위험-이익 분석에서 선별된 환자 개체군에 우호적인 결과를 가지는 것으로 추정되었다.
출발 용량은 VXM01 106 콜로니 형성 단위 (CFU)를 포함하는 용액 또는 위약으로 구성되었다. VXM01 용량은 안전성의 이유로 선정되었으며, 면역 반응을 도출하는 최소 유효 용량 보다 적은 것으로 추정되었다. 이와 비교해, 허가된 장티푸브 백신인 Typhoral®의 1회 용량은 살모넬라 티피 Ty21a를 2x109 - 6x109 CFU로 포함하고 있는데, 이는 VXM01 출발 용량의 대략 1000배에 해당된다. 이 용량을 10배 로그 스케일로 증가시켰으며, 이는 박테리아 생 백신에 합당한 것으로 보인다. 용량 증가 계획은 도 3에 도시된다.
인간 실험에서 먼저 지침에 따라, 코포트에서 한가지 용량 그룹에 속하는 환자에게 처리하였다. 임의 용량 그룹에서 1차 VXM01 투여는 환자 1명에게 위약을 제공하는 것과 동시에 1명의 환자에게만 제공되었다. 각 용량 그룹의 제2 코호트는 VXMO1 복용 환자 2명과 위약 복용 환자 1명으로 구성되었다. 프런트-러너 (front-runner)와의 이러한 엇갈리게 배치된 투여는, 즉, 오직 한명의 환자에게만 VXMO1을 1차 투여하는 것은, 위험성을 낮추기 위한 것이었다.
3차 환자 코호트 (3명은 VXMO1 복용, 1명은 위약 복용)에는 108, 109 및 1010 용량 그룹들을 포함시켰다. 이 방법은 준-치료적인 것으로 추정되는 VXMO1 용량에 대한 노출을 최소화한다. 3차 코호트와 다음 번 고용량 처리 그룹의 첫번째 2개의 코호트를 명확하게 규정된 무작위 방법으로 토대로 병행 처리하였다. 이 방법은 유용 환자의 모집을 가능하게 하며, 고용량 그룹과 저용량 그룹에서 병행 처리되는 환자에 대한 선택 편중 (selection bias)을 방지한다. 106 및 107 용량 그룹에서, 해당 용량 그룹의 처음 3명의 VXMO1 투여 환자들 중 1명이 DLT를 겪게 되고 데이타 안전성 모니터링 보드 (DSMB)의 결정을 통해 검증이 필요한 경우에만, 3차 환자 코호트를 포함시켰다.
환자들 모두 어떠한 용량 감소도 없이 프로토콜에 따라 2일 마다 투여하여 7일간 4번의 백신 접종 코스를 완료하였다. 용량 제한 독성 (DLT)는 관찰되지 않아, 최대 허용 용량에는 도달하지 못하였다. VXM01은 모든 용량 수준들에서 원활하게 허용되었다. AE와 SAE는 양쪽 그룹들에서 동일한 수준이었으며, 용량 의존적인 효과에 대한 명확한 신호는 그룹들에서 나타나지 않았다.
경구 백신의 고유한 환경적인 위험성은 환경으로 배출될 가능성과 그로 인해 타겟 집단 이외의 사람에게서 백신화될 가능성이 있다는 것이다. 실험 환자들 모두 백신 접종을 수행하는 기간과 이후 3일 동안 실험실 (KliPS)에만 있게 하였다. 실험 환자들의 변은 모두 수집하여, 소각하였다. 체액과 변 샘플에서 VXMO1 배출을 조사하였다. 변으로의 VXMO1의 배출은 환자 2명에서 관찰되었는데, 이중 한명은 109 용량 그룹이고, 다른 한명은 1010 용량 그룹이었다. 이들 환자들에서의 VXM01의 변으로의 배출은 1차 및 2차 투여 후 각각 1회로 일시적이었으며, 항생제 처리없이 사라졌다. 다른 체액에서는 배출이 검출되지 않았다.
실험실 직원이 우발적으로 흡수하지 않도록 보호하기 위해 보건적인 예방을 적용하였다. 실험실 직원은 이러한 실험 측면에 대해 특수 훈련을 받았다.
환자는, 실험 약물을 마지막 투여받은 후 백신의 배출이 음성으로 판명난 경우에만 병원에서 퇴소하였다. 마지막 투여받은 후 환자에서 배출 양성으로 판명난 경우에는, 환자를 퇴소시키기 전에 위장관에서 항생제 정화를 수행하였다. 결과가 음성으로 나올때까지 배출을 추적 조사하였다. 이러한 조처들은 발산 프로파일이 해명될 때까지 환경과 실험실 직원을 VXMO1에 노출되지 않게 예방하는데 합당하고 충분한 것으로 보인다.
VXM01은 도 4에 도시된 (전체 실험 계획) 겜시타빈 백그라운드 요법에 병행하여 적용하였다. 간략하게는, 겜시타빈은 28일간의 화학요법 사이클에서 1일, 8일 및 15일에 제공되었다. 백신은 겜시타빈을 마지막 투여한 후 3일째부터 시작하여 1일, 3일, 5일 및 7일에 4번 제공되었다. 마지막 환자가 최종 투여를 제공받은지 31일째에 이중 맹검 실험을 종료하였다.
이러한 I 상 실험 (진행성 또는 IV기 췌장암 환자)을 위해, 예후가 나쁘고 비교적 면역억제와 관련된 표준 치유에 반응이 없는 환자 개체군을 선택하였다. 화학요법제 겜시타빈과 종양 백신 접종의 공동-용법이 상승 작용을 할 수도 있다. 아울러, 특이적인 T 세포 활성화를 이들 환자 조건에서 측정하여, 백신 VXMO1의 효능을 입증하였다. 위약 대조군은 활성 백신 대 백그라운드 치료와 관련된 구체적인 안전성 문제에 대한 추가적인 지식을 얻기 위해 본 실험에 포함시켰다. 또한, 특이적인 면역 활성화와 그외 임상 효능 신호를 평가하기 위해 모은 위약 환자들을 적법한 비교인자로서 사용하였다. II 상으로 진행되게 되면, 기대 수명이 좀더 긴 다른 환자를 관찰되는 안전성 프로파일에 따라 고려해 불 수 있다. 또한, 이들 실험은 항-혈관신생 치료에 대해 더욱 감수성인 것으로 보이는 종양 타입들도 포함할 것이다.
실시예 3 VXM01 특이적인 T 세포 반응
VXM01 처리 환자와 위약 처리 환자의 말초혈에서, 백신화 실시 중과 백신 처리 후 여러 시점에, VEGFR2 특이 T 세포의 수를 모니터링하기 위해 VXMO1 반응을 분석하고, INFγ ELISpot로 검출하였다.
마지막으로, T 세포 및 펩타이드 펄스형 DC를 항-INFγ 항체로 코팅된 웰에 첨가하였다. 인큐베이션 기간 후, 세포를 방출된 INFγ로 제거하고, 코팅 항체는 결합둔 채 두었다. 그런 후, 검출 항체를 첨가하여 결합된 INFγ를 검출하였으며, 신호 증폭 후 최종 수율을 "컬러 스팟"으로 볼 수 있었으며, 스팟은 단일 활성화된 특이 T 세포이다.
ELISpot 샘플의 양성도 (positivity)는 샘플 당 0-3 등급으로 신호 증가에 따라 평가하는 사전 결정된 규칙에 따라 등급을 매겼다:
증가 없음: 0 등급
명확한 증가, < 3x: 1 등급
≥ 3x, < 5x 증가: 2 등급
≥ 5x 증가: 3 등급
실험 환자의 ELISpot 면역 반응을 표 2에 나타낸다:
표 2: VEGFR-2 특이 T-세포 반응 (환자 w/ 평가 등급 ≥ 3)
위약 106 CFU/투여 107 CFU/투여 108 CFU/투여 109 CFU/투여 1010 CFU/투여
1/11 2/6 3/5 1/6 0/6 2/6
실험 환자에 대한 ELISpot 면역 반응 결과는 도 5에 그래프로 도시한다.
실시예 4 종양 관류 효과
종양 관류는 다이나믹 콘트라스트 보강된 자기 공명 이미징 (DCEMRI) 수행시 콘트라스트 미디어 트랜지트 시간 (Ktrans)에 의해 평가하여, 처리 반응을 특정화하였다. 다이나믹 콘트라스트-보강된 T1-가중 이미징 (Dynamic Contrast-Enhanced T1-weighted imaging)을 수행하였다. 0일 및 처리 후 38일 및 3개월 후에 DCE-MRI를 1.5 Tesla System (Magnetom Aera, Siemens, Erlangen, Germany)으로 평가하였다. 다이나믹 콘트라스트-보강된 MR-이미징을 VIBE (volumetric interpolated breath-hold) 시퀀스로 수행하였다. 이를 위해, 8　ml Gadovist을 주입하였다.
매 실험마다, 종양 조직에서 대상 영역을 수동으로 표시하고, 시멘스 소프트웨어 패키지 (Tissue 4D)를 이용하여 픽셀 (pixel-by-pixel)로 분석하였다. ROI-모델링은 assumed T10 (1000ms) 및 Parker AIF를 이용한 Tofts 모델을 기초로 하였다. 종양 관류 평가를 위해, Ktrans를 일차 엔드포인트로서 간주하였다.
평균 종양 관류 변화는 VXM01 그룹 (n=26)에서 -9%이고, 위약 그룹 (n=11)은 +18%이었다. 종양 관류가 33% 초과로 감소된 경우는 VXMO1 처리 환자는 35%이고, 위약 그룹은 10%로 검출되었다. 가장 크게 반응한 환자는 서브그룹 분석으로 추가로 분석하였다. 최대 평균 표화는 d38 시점에 검출되었다. 종양 관류에 대한 다양한 VXMO1 투약 효과는 도 6에 그래프로 도시한다.
실시예 5 혈관신생 바이오마커
혈관신생 바이오마커인 VEGF A에 변화를 수반하는, VXMO1의 VEGFR-2 특이 T 세포 매개, 항혈관신생 활성을 추가로 특정화하기 위해, 인간 콜라겐 IV와 혈압을 모니터링하였다.
VEGF A:
시판 분석 키트 (ELISA Kit Quantikine Human VEGF A Immunoassay, R&D Systems, Cat.-No.: DVE00)를 이용한 ELISA에 의해, 인간 혈청 샘플에서 VEGF A를 측정하였다. 본 분석은 패키지 인서트에 기재된 바와 같이, 그리고 선행 검증 실험 580.132.2786에 따른 본 실험 계획의 일부로서 변형하여 사용하였다.
본 분석은 정량적인 샌드위치 효소 면역분석 기법을 채택한다. 인간 VEGF A 특이 단일클론 항체를 미리 마이크로플레이트 위에 코팅하였다. 표준 정성 대조군 (시판 구입)과 샘플을 웰에 파이펫팅하고, 존재하는 모든 VEGF A를 고정시킨 항체에 결합시켰다. 캘리브레이터, 품질 관리 샘플 및 샘플을 2세트로 분석하였다. 임의의 비결합된 기질을 세척한 후, 효소-연계된 VEGF A 특이 다클론 항체를 웰에 첨가하였다. 결합되지 않은 항체-효소 제제를 모두 제거하기 위해 세척한 후, 기질 용액을 웰에 첨가하였으며, 첫 단계에 결합시킨 VEGF A의 양에 비례하여 발색되었다. 발색을 정지시키고, 색 밀도를 스펙트로포토미터 마이크로타이터 플레이트 리더에서 450 nm에서 측정하였다. 각 표준물의 해당 VEGF A 농도에 대해 흡광도를 그래프로 작성하여, 표준 그래프를 수득하였다. 샘플내 VEGF A 농도를 이 그래프로부터 직접 결정하였다.
VXMO1 그룹의 경우 VEGF-A 혈청 수준은 d38 및 m3일에 모두 235%까지 증가하였고, 위약 그룹의 경우 17% 및 31%까지 증가하였다 (p=0.05, m3). 환자 혈청 샘플내 VEGF A의 정량 결과를 도 7에 그래프로 도시한다.
콜라겐 IV:
인간 콜라겐 IV는 시판 분석 키트 (Human Collagen IV ELISA, Serum, KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY, Cat.-No.: KT-035)를 이용한 ELISA로 측정하였다. 본 분석은, 패키지 인서트에 기재된 바와 같이, 그리고 선행 검증 실험 580.132.3645에 따른 본 실험 계획의 일부로서 변형하여 사용하였다.
인간 콜라겐 IV ELISA는 고상의 한단계 샌드위치 ELISA이다. 샘플내 콜라겐 IV는 각각 다른 항원성 부위에 특이적인 고상 단일클론 항체 및 단일클론 항체-효소 접합체에 의해 동시에 결합시켰다. 이로써, 고상과 효소-표지된 항체 사이에 콜라겐 IV 분자가 샌드위치된다. 비결합된 효소-표지된 항체와 샘플을 제거한 후, 플레이트를 발색 기질 (TMB)과 함께 인큐베이션하였다. 나타나는 발색은 샘플내 콜라겐 IV의 양에 직접 비례하였다.
VXMO1 그룹의 경우 혈청내 콜라겐 IV 수준은 d38 및 m3일에 평균 각각 7% 및 22%까지 증가하였고, 위약 그룹의 경우 2% 및 -7%로 변하였다 (p=0.02, m3). 환자 혈청 샘플내 콜라겐 IV의 정량 결과를 도 8에 그래프로 도시한다.
혈압:
항-혈관신생 효능에 대한 약동학적 마커로서 혈압 (수축기 및 이완기) 및 맥박수를 반듯이 누운 자세로 5분 휴식 후 측정하였다. 평균 수축 혈압 변화는 처리군 대 위약군이 +3.6mmHg 및 +3.9mmHg 대 -8.8mHg 및 9.1mmHg이었다 (p=0.08, d38). 1차 백신 투약 후 평균 혈압 효과를 도 9에 그래프로 도시한다.
실시예 6 항-담체 면역성
박테리아 비히클에 대한 면역 반응을 분석하기 위해, 항-살모넬라 티피 IgG 및 IgM 면역글루불린을 2개의 시판 분석 키트 (Salmonella typhi IgG ELISA, Cat. No. ST0936G and Salmonella typhi IgM ELISA, Cat. No. ST084M; Calbiotech. Inc., 10461 Austin Dr, Spring Valley, CA 91978, USA)를 이용한 ELISA에 의해 검출하였다. 이들 분석은 정성 분석이었다. 본 분석은 각각 패키지 인서트에 기재된 바와 같이, 그리고 선행 검증 실험 580.132.2785에 따른 본 실험 계획의 일부로서 변형하여 사용하였다.
이들 2가지 분석에서는 효소-연계된 면역흡착 분석 기법을 채택하였다. 캘리브레이터, 음성 대조군, 양성 대조군 및 샘플은 2세트로서 분석하였다. 희석한 환자 혈청 (희석 1:101)을 정제 항원으로 코팅된 웰에 첨가하였다. IgG 또는 IgM 특이 항체는, 존재한다면, 항원에 결합하였다. 비-결합된 물질들은 모두 세척 제거하고, 효소 접합체를 첨가하여 존재한다면 항체-항원 복합체에 결합시켰다. 과량의 효소 접합체는 세척 제거하고, 기질을 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이션하여, 효소로 기질을 가수분해시켰다. 발색된 색의 강도는 샘플내 IgG 또는 IgM 특이 항체의 양에 비례하였다. 색 강도는 스펙트로포토미터 마이크로플레이트에서 450 nm에서 측정하였다. 컷 오프는 다음과 같이 계산하였다:
캘리브레이터 OD x 캘리브레이터 팩터 (CF: Calibrator Factor).
각 측정에서 항체 인덱스는 각 샘플의 OD 값을 컷 오프 값으로 나누어 구하였다.
항체 인덱스 해석:
<0.9 ELISA에서 살모넬라 티피 IgG 또는 IgM에 대한 항체 검출안됨
0.9-1.1 경계 양성
>1.1 ELISA에서 살모넬라 티피 IgG 또는 IgM에 대한 항체가 검출됨
검출가능한 항-살모넬라 티피 IgG 면역글로불린을 가진 환자의 수를 도 10에 나타낸다.
실시예 7 배출
변 및 체액, 눈물, 타액, 뇨 및 혈액으로의 박테리아의 발산을 확립된 센트럴 서비스 실험실 (Huntingdon Life Sciences, Huntingdon, UK)의 GLP에 따라 기존에 검증된 바와 같이 변형시킨 검증 방법에 따라 실험 VXM01-01-DE에서 모니터링하였다. VXMO1의 체액내 발산과 생물학적 분배 (biodistribution)를 플레이트 및 농화 배양에 의해 측정하였다. VXMO1 담체 박테리아의 아이덴터티는 혈청 응집 및 PCR 방법에 의해 확인하였다.
시험 샘플 (혈액, 눈물, 뇨, 타액 및 변)을 하이델버그의 시험소에서 채집하고, 백신 접종 이후의 샘플을 독일 카를수루에에 위치한 MicroMol GmbH에 당일 이송시켰다. 박테리아 벡터 발산과 생물학적 분배 분석 케스케이드는 VXMO1의 생 CFU 또는 수평적인 플라스미드 이동을 검출하도록 설계되었다. 2개의 별개의 분석 브랜치 (브랜치 I 및 브랜치 II)로 구성된다:
브랜치 I: 모든 수평적인 플라스미드 이동을 검출하기 위한 도말 방법 (Plating method)
브랜치 II: VXMO1의 생 CFU를 측정하기 위한 액체 농화 배양
분석 케스케이드 이후에, 생 바이러스 VXMO1의 배출을 측정하거나 수평적인 플라스미드 이동을 관찰하기 위해 결정 배열 (matrix decision)을 수행하였다. 케스케이드는 도 11에 개략 도시한다.
수평적인 플라스미드 이동을 검출하기 위한 브랜치 I 분석:
- 0일: 3 TSA (+ 카나마이신) 플레이트 3개 각각에 테스트 샘플 5종을 도말한 다음, 37℃에서 밤새 배양
- 1일: 선별적인 플레이트에서의 VXM01 (Ty21a) 및 비-VXM01의 시각적인 형태 식별. 비-VXM01 형태 (각 콜로니 9개)를 선택하여, 응집을 위해 아가 플레이트(+ 카나마이신)에 스트리킹하고, 다음날 PCR 분석을 위해 각각 모은 형태 타입들을 병렬로 액체 배양한다
- 2일: 각 액체 형태형 풀의 PCR
VXM01을 검출하기 위한 브랜치 II 분석:
- 0일: 5종의 시험 샘플 각각에 대해 액체 농화 배양물 (+ 카나마이신) 확보
- 1일: 각 액체 농화 배양물에 대한 직접 PCR. PCR에서 플라스미드 양성인 경우, 다음날 혈청학적 분석을 위해, 아가 플레이트 (+ 카나마이신)에 각 농화 배양물 스트리킹함
- 2일: VXM01 (Ty21a) 존재에 대한 혈청학적 검증
임의의 시험 샘플의 PCR은 생 CFU 및/또는 자유 부유성 플라스미드 또는 Ty21a 게놈 DNA를 식별할 수 없고, 응집은 시험 샘플 상에 직접 적용할 수 없기 때문에, PCR 방법과 응집 방법은 도말 방법을 적용한 후 제2 방법으로서 사용하였다. 카나마이신-함유 플레이트에서 증식한 동정된 생 콜로니들을 이러한 방법들로 추가로 특정화하였다. 도말 방법은 오직 살아있는 세포와 죽은 세포 (수평적인 플라스미드 이동으로 인한 VXMO1 또는 외래 비-VXMO1 플라스미드 형질전환체)을 구별할 수 있다.
2명의 환자에서 VXMO1의 변으로의 배출이 관찰되었는데, 한명은 109 투약군이고, 다른 한명은 1010 투약군이었다. 양쪽 환자에서 변내 VXMO1의 배출은 1차 또는 2차 투여후 각각 1회로 일시적이었으며, 항생제 처리없이도 사라졌다. 다양한 투약군에서의 VXMO1 배출 환자의 수를 도 12에 그래프로 도시한다.
요컨대, VXM01은 다양한 종양 타입을 타겟팅하여, 다른 현행 암 백신 방법들이 직면한 많은 문제점들을 극복할 수 있는 잠재성을 가지고 있다. 매력적인 전망은 본 발명의 백신을 다른 항암 및 면역조절제와 조합할 수 있다는 가능성이다. 본원에 제시된 실험의 결과는 본 발명자들이 이러한 매우 흥미로운 접근법을 진행해가게 하는 동기가 된다.
SEQUENCE LISTING <110> VAXIMM AG <120> DNA Vaccine for Use in Pancreatic Cancer Patients <130> 109313P855PC <140> not yet assigned <141> 2013-06-26 <150> EP 12004995.2 <151> 2012-07-05 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1356 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro 20 25 30 Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr 35 40 45 Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60 Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser 65 70 75 80 Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn 85 90 95 Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser 100 105 110 Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser 115 120 125 Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys 130 135 140 Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser 145 150 155 160 Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg 165 170 175 Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile 180 185 190 Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser 195 200 205 Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr 210 215 220 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 225 230 235 240 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 245 250 255 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 260 265 270 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 275 280 285 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 290 295 300 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met 325 330 335 Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala 340 345 350 Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly 355 360 365 Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr 370 375 380 Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu 385 390 395 400 Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val 405 410 415 Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val 420 425 430 Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr 435 440 445 Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu 450 455 460 Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr 465 470 475 480 Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys 485 490 495 Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys 500 505 510 Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr 515 520 525 Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser 530 535 540 Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln 545 550 555 560 Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser 565 570 575 Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro 580 585 590 Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr 595 600 605 Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile 610 615 620 Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr 625 630 635 640 Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val 645 650 655 Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn 660 665 670 Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys 675 680 685 Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn 690 695 700 Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg 705 710 715 720 Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr 725 730 735 Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe 740 745 750 Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu 755 760 765 Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile 770 775 780 Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly 785 790 795 800 Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu His 805 810 815 Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp 820 825 830 Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val 835 840 845 Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr 850 855 860 Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg 865 870 875 880 Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu 885 890 895 Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu 900 905 910 Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu 915 920 925 Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg 930 935 940 Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys 945 950 955 960 Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly 965 970 975 Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro 980 985 990 Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr 995 1000 1005 Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys 1010 1015 1020 Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu 1025 1030 1035 Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile 1040 1045 1050 Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro 1055 1060 1065 Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr 1070 1075 1080 Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 1085 1090 1095 Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu 1100 1105 1110 Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro 1115 1120 1125 Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp 1130 1135 1140 His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu 1145 1150 1155 His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys 1160 1165 1170 Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu 1175 1180 1185 Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu 1190 1195 1200 Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215 Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro 1220 1225 1230 Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu 1235 1240 1245 Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val 1250 1255 1260 Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu 1265 1270 1275 Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser 1280 1285 1290 Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly 1295 1300 1305 Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu 1310 1315 1320 Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser 1325 1330 1335 Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser 1340 1345 1350 Pro Pro Val 1355 <210> 2 <211> 4071 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgcagagca aggtgctgct ggccgtcgcc ctgtggctct gcgtggagac ccgggccgcc 60 tctgtgggtt tgcctagtgt ttctcttgat ctgcccaggc tcagcataca aaaagacata 120 cttacaatta aggctaatac aactcttcaa attacttgca ggggacagag ggacttggac 180 tggctttggc ccaataatca gagtggcagt gagcaaaggg tggaggtgac tgagtgcagc 240 gatggcctct tctgtaagac actcacaatt ccaaaagtga tcggaaatga cactggagcc 300 tacaagtgct tctaccggga aactgacttg gcctcggtca tttatgtcta tgttcaagat 360 tacagatctc catttattgc ttctgttagt gaccaacatg gagtcgtgta cattactgag 420 aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 480 ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 540 agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 600 gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg 660 tataggattt atgatgtggt tctgagtccg tctcatggaa ttgaactatc tgttggagaa 720 aagcttgtct taaattgtac agcaagaact gaactaaatg tggggattga cttcaactgg 780 gaataccctt cttcgaagca tcagcataag aaacttgtaa accgagacct aaaaacccag 840 tctgggagtg agatgaagaa atttttgagc accttaacta tagatggtgt aacccggagt 900 gaccaaggat tgtacacctg tgcagcatcc agtgggctga tgaccaagaa gaacagcaca 960 tttgtcaggg tccatgaaaa accttttgtt gcttttggaa gtggcatgga atctctggtg 1020 gaagccacgg tgggggagcg tgtcagaatc cctgcgaagt accttggtta cccaccccca 1080 gaaataaaat ggtataaaaa tggaataccc cttgagtcca atcacacaat taaagcgggg 1140 catgtactga cgattatgga agtgagtgaa agagacacag gaaattacac tgtcatcctt 1200 accaatccca tttcaaagga gaagcagagc catgtggtct ctctggttgt gtatgtccca 1260 ccccagattg gtgagaaatc tctaatctct cctgtggatt cctaccagta cggcaccact 1320 caaacgctga catgtacggt ctatgccatt cctcccccgc atcacatcca ctggtattgg 1380 cagttggagg aagagtgcgc caacgagccc agccaagctg tctcagtgac aaacccatac 1440 ccttgtgaag aatggagaag tgtggaggac ttccagggag gaaataaaat tgaagttaat 1500 aaaaatcaat ttgctctaat tgaaggaaaa aacaaaactg taagtaccct tgttatccaa 1560 gcggcaaatg tgtcagcttt gtacaaatgt gaagcggtca acaaagtcgg gagaggagag 1620 agggtgatct ccttccacgt gaccaggggt cctgaaatta ctttgcaacc tgacatgcag 1680 cccactgagc aggagagcgt gtctttgtgg tgcactgcag acagatctac gtttgagaac 1740 ctcacatggt acaagcttgg cccacagcct ctgccaatcc atgtgggaga gttgcccaca 1800 cctgtttgca agaacttgga tactctttgg aaattgaatg ccaccatgtt ctctaatagc 1860 acaaatgaca ttttgatcat ggagcttaag aatgcatcct tgcaggacca aggagactat 1920 gtctgccttg ctcaagacag gaagaccaag aaaagacatt gcgtggtcag gcagctcaca 1980 gtcctagagc gtgtggcacc cacgatcaca ggaaacctgg agaatcagac gacaagtatt 2040 ggggaaagca tcgaagtctc atgcacggca tctgggaatc cccctccaca gatcatgtgg 2100 tttaaagata atgagaccct tgtagaagac tcaggcattg tattgaagga tgggaaccgg 2160 aacctcacta tccgcagagt gaggaaggag gacgaaggcc tctacacctg ccaggcatgc 2220 agtgttcttg gctgtgcaaa agtggaggca tttttcataa tagaaggtgc ccaggaaaag 2280 acgaacttgg aaatcattat tctagtaggc acggcggtga ttgccatgtt cttctggcta 2340 cttcttgtca tcatcctacg gaccgttaag cgggccaatg gaggggaact gaagacaggc 2400 tacttgtcca tcgtcatgga tccagatgaa ctcccattgg atgaacattg tgaacgactg 2460 ccttatgatg ccagcaaatg ggaattcccc agagaccggc tgaagctagg taagcctctt 2520 ggccgtggtg cctttggcca agtgattgaa gcagatgcct ttggaattga caagacagca 2580 acttgcagga cagtagcagt caaaatgttg aaagaaggag caacacacag tgagcatcga 2640 gctctcatgt ctgaactcaa gatcctcatt catattggtc accatctcaa tgtggtcaac 2700 cttctaggtg cctgtaccaa gccaggaggg ccactcatgg tgattgtgga attctgcaaa 2760 tttggaaacc tgtccactta cctgaggagc aagagaaatg aatttgtccc ctacaagacc 2820 aaaggggcac gattccgtca agggaaagac tacgttggag caatccctgt ggatctgaaa 2880 cggcgcttgg acagcatcac cagtagccag agctcagcca gctctggatt tgtggaggag 2940 aagtccctca gtgatgtaga agaagaggaa gctcctgaag atctgtataa ggacttcctg 3000 accttggagc atctcatctg ttacagcttc caagtggcta agggcatgga gttcttggca 3060 tcgcgaaagt gtatccacag ggacctggcg gcacgaaata tcctcttatc ggagaagaac 3120 gtggttaaaa tctgtgactt tggcttggcc cgggatattt ataaagatcc agattatgtc 3180 agaaaaggag atgctcgcct ccctttgaaa tggatggccc cagaaacaat ttttgacaga 3240 gtgtacacaa tccagagtga cgtctggtct tttggtgttt tgctgtggga aatattttcc 3300 ttaggtgctt ctccatatcc tggggtaaag attgatgaag aattttgtag gcgattgaaa 3360 gaaggaacta gaatgagggc ccctgattat actacaccag aaatgtacca gaccatgctg 3420 gactgctggc acggggagcc cagtcagaga cccacgtttt cagagttggt ggaacatttg 3480 ggaaatctct tgcaagctaa tgctcagcag gatggcaaag actacattgt tcttccgata 3540 tcagagactt tgagcatgga agaggattct ggactctctc tgcctacctc acctgtttcc 3600 tgtatggagg aggaggaagt atgtgacccc aaattccatt atgacaacac agcaggaatc 3660 agtcagtatc tgcagaacag taagcgaaag agccggcctg tgagtgtaaa aacatttgaa 3720 gatatcccgt tagaagaacc agaagtaaaa gtaatcccag atgacaacca gacggacagt 3780 ggtatggttc ttgcctcaga agagctgaaa actttggaag acagaaccaa attatctcca 3840 tcttttggtg gaatggtgcc cagcaaaagc agggagtctg tggcatctga aggctcaaac 3900 cagacaagcg gctaccagtc cggatatcac tccgatgaca cagacaccac cgtgtactcc 3960 agtgaggaag cagaactttt aaagctgata gagattggag tgcaaaccgg tagcacagcc 4020 cagattctcc agcctgactc ggggaccaca ctgagctctc ctcctgttta a 4071 <210> 3 <211> 7580 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> sequence of expression vector pVAX10.VR2-1 <400> 3 tgggcttttg ctggcctttt gctcacatgt tcttgactct tcgcgatgta cgggccagat 60 atacgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 120 ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 180 gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 240 caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 300 cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 360 ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 420 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 480 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 540 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 600 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 660 taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 720 cccaagctgg ctagcaggat gcagagcaag gtgctgctgg ccgtcgccct gtggctctgc 780 gtggagaccc gggccgcctc tgtgggtttg cctagtgttt ctcttgatct gcccaggctc 840 agcatacaaa aagacatact tacaattaag gctaatacaa ctcttcaaat tacttgcagg 900 ggacagaggg acttggactg gctttggccc aataatcaga gtggcagtga gcaaagggtg 960 gaggtgactg agtgcagcga tggcctcttc tgtaagacac tcacaattcc aaaagtgatc 1020 ggaaatgaca ctggagccta caagtgcttc taccgggaaa ctgacttggc ctcggtcatt 1080 tatgtctatg ttcaagatta cagatctcca tttattgctt ctgttagtga ccaacatgga 1140 gtcgtgtaca ttactgagaa caaaaacaaa actgtggtga ttccatgtct cgggtccatt 1200 tcaaatctca acgtgtcact ttgtgcaaga tacccagaaa agagatttgt tcctgatggt 1260 aacagaattt cctgggacag caagaagggc tttactattc ccagctacat gatcagctat 1320 gctggcatgg tcttctgtga agcaaaaatt aatgatgaaa gttaccagtc tattatgtac 1380 atagttgtcg ttgtagggta taggatttat gatgtggttc tgagtccgtc tcatggaatt 1440 gaactatctg ttggagaaaa gcttgtctta aattgtacag caagaactga actaaatgtg 1500 gggattgact tcaactggga atacccttct tcgaagcatc agcataagaa acttgtaaac 1560 cgagacctaa aaacccagtc tgggagtgag atgaagaaat ttttgagcac cttaactata 1620 gatggtgtaa cccggagtga ccaaggattg tacacctgtg cagcatccag tgggctgatg 1680 accaagaaga acagcacatt tgtcagggtc catgaaaaac cttttgttgc ttttggaagt 1740 ggcatggaat ctctggtgga agccacggtg ggggagcgtg tcagaatccc tgcgaagtac 1800 cttggttacc cacccccaga aataaaatgg tataaaaatg gaatacccct tgagtccaat 1860 cacacaatta aagcggggca tgtactgacg attatggaag tgagtgaaag agacacagga 1920 aattacactg tcatccttac caatcccatt tcaaaggaga agcagagcca tgtggtctct 1980 ctggttgtgt atgtcccacc ccagattggt gagaaatctc taatctctcc tgtggattcc 2040 taccagtacg gcaccactca aacgctgaca tgtacggtct atgccattcc tcccccgcat 2100 cacatccact ggtattggca gttggaggaa gagtgcgcca acgagcccag ccaagctgtc 2160 tcagtgacaa acccataccc ttgtgaagaa tggagaagtg tggaggactt ccagggagga 2220 aataaaattg aagttaataa aaatcaattt gctctaattg aaggaaaaaa caaaactgta 2280 agtacccttg ttatccaagc ggcaaatgtg tcagctttgt acaaatgtga agcggtcaac 2340 aaagtcggga gaggagagag ggtgatctcc ttccacgtga ccaggggtcc tgaaattact 2400 ttgcaacctg acatgcagcc cactgagcag gagagcgtgt ctttgtggtg cactgcagac 2460 agatctacgt ttgagaacct cacatggtac aagcttggcc cacagcctct gccaatccat 2520 gtgggagagt tgcccacacc tgtttgcaag aacttggata ctctttggaa attgaatgcc 2580 accatgttct ctaatagcac aaatgacatt ttgatcatgg agcttaagaa tgcatccttg 2640 caggaccaag gagactatgt ctgccttgct caagacagga agaccaagaa aagacattgc 2700 gtggtcaggc agctcacagt cctagagcgt gtggcaccca cgatcacagg aaacctggag 2760 aatcagacga caagtattgg ggaaagcatc gaagtctcat gcacggcatc tgggaatccc 2820 cctccacaga tcatgtggtt taaagataat gagacccttg tagaagactc aggcattgta 2880 ttgaaggatg ggaaccggaa cctcactatc cgcagagtga ggaaggagga cgaaggcctc 2940 tacacctgcc aggcatgcag tgttcttggc tgtgcaaaag tggaggcatt tttcataata 3000 gaaggtgccc aggaaaagac gaacttggaa atcattattc tagtaggcac ggcggtgatt 3060 gccatgttct tctggctact tcttgtcatc atcctacgga ccgttaagcg ggccaatgga 3120 ggggaactga agacaggcta cttgtccatc gtcatggatc cagatgaact cccattggat 3180 gaacattgtg aacgactgcc ttatgatgcc agcaaatggg aattccccag agaccggctg 3240 aagctaggta agcctcttgg ccgtggtgcc tttggccaag tgattgaagc agatgccttt 3300 ggaattgaca agacagcaac ttgcaggaca gtagcagtca aaatgttgaa agaaggagca 3360 acacacagtg agcatcgagc tctcatgtct gaactcaaga tcctcattca tattggtcac 3420 catctcaatg tggtcaacct tctaggtgcc tgtaccaagc caggagggcc actcatggtg 3480 attgtggaat tctgcaaatt tggaaacctg tccacttacc tgaggagcaa gagaaatgaa 3540 tttgtcccct acaagaccaa aggggcacga ttccgtcaag ggaaagacta cgttggagca 3600 atccctgtgg atctgaaacg gcgcttggac agcatcacca gtagccagag ctcagccagc 3660 tctggatttg tggaggagaa gtccctcagt gatgtagaag aagaggaagc tcctgaagat 3720 ctgtataagg acttcctgac cttggagcat ctcatctgtt acagcttcca agtggctaag 3780 ggcatggagt tcttggcatc gcgaaagtgt atccacaggg acctggcggc acgaaatatc 3840 ctcttatcgg agaagaacgt ggttaaaatc tgtgactttg gcttggcccg ggatatttat 3900 aaagatccag attatgtcag aaaaggagat gctcgcctcc ctttgaaatg gatggcccca 3960 gaaacaattt ttgacagagt gtacacaatc cagagtgacg tctggtcttt tggtgttttg 4020 ctgtgggaaa tattttcctt aggtgcttct ccatatcctg gggtaaagat tgatgaagaa 4080 ttttgtaggc gattgaaaga aggaactaga atgagggccc ctgattatac tacaccagaa 4140 atgtaccaga ccatgctgga ctgctggcac ggggagccca gtcagagacc cacgttttca 4200 gagttggtgg aacatttggg aaatctcttg caagctaatg ctcagcagga tggcaaagac 4260 tacattgttc ttccgatatc agagactttg agcatggaag aggattctgg actctctctg 4320 cctacctcac ctgtttcctg tatggaggag gaggaagtat gtgaccccaa attccattat 4380 gacaacacag caggaatcag tcagtatctg cagaacagta agcgaaagag ccggcctgtg 4440 agtgtaaaaa catttgaaga tatcccgtta gaagaaccag aagtaaaagt aatcccagat 4500 gacaaccaga cggacagtgg tatggttctt gcctcagaag agctgaaaac tttggaagac 4560 agaaccaaat tatctccatc ttttggtgga atggtgccca gcaaaagcag ggagtctgtg 4620 gcatctgaag gctcaaacca gacaagcggc taccagtccg gatatcactc cgatgacaca 4680 gacaccaccg tgtactccag tgaggaagca gaacttttaa agctgataga gattggagtg 4740 caaaccggta gcacagccca gattctccag cctgactcgg ggaccacact gagctctcct 4800 cctgtttaaa aggaactcga gtctagaggg cccgtttaaa cccgctgatc agcctcgact 4860 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 4920 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 4980 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 5040 gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctac tgggcggttt 5100 tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc 5160 cctgcaaagt aaactggatg gctttctcgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa 5220 gctctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg 5280 caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa 5340 tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg 5400 tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt 5460 ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 5520 gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc 5580 ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg 5640 ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg 5700 aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 5760 aactgttcgc caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg 5820 gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact 5880 gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg 5940 ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc 6000 ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attattaacg 6060 cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 6120 tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 6180 acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatagca 6240 cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 6300 catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc cccatcagtg 6360 accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg 6420 cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt 6480 cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 6540 aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 6600 agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 6660 acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 6720 ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 6780 accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 6840 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 6900 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 6960 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 7020 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 7080 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 7140 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 7200 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 7260 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 7320 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 7380 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 7440 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 7500 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 7560 ctcaagaaga tcctttgatc 7580

Claims (16)

  1. 백신으로서 사용하기 위한 약독화된 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) 돌연변이 균주로서,
    VEGF 수용체 단백질, 특히 인간 VEGFR-2 및 약 80% 이상의 상동성을 공유한 인간 VEGFR-2의 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 VEGF 수용체 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 DNA 분자를 1 카피 이상으로 포함하며,
    상기 인간 VEGFR-2는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주.
  2. 암 면역요법에 사용하기 위한 DNA 백신으로서,
    제1항에 따른 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주를 포함하며,
    상기 약독화된 살모넬라 티피 돌연변이 균주는 살모넬라 티피 (Salmonella typhi) Ty21a이며,
    상기 발현 카세트는 진핵 생물에 대한 발현 카세트인 것을 특징으로 하는, DNA 백신.
  3. 제2항에 있어서, 상기 DNA 백신은, 항-혈관신생 타입의 암 면역요법 (anti-angiogenic cancer immunotherapy)에 사용하기 위한, 서열번호 1의 VEGFR-2 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 약독화된 살모넬라 티피 균주 Ty21a를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 플라스미드는 도 2에 도시된 7580bp의 pVAX10.VR2-1이며, 서열번호 3에 기재된 서열을 가지며,
    상기 DNA 백신은 VXM01으로 명명된 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  6. 제5항에 있어서, 상기 췌장암은 IV기이거나 또는 국소 진행성 췌장암인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 암은 전이 암을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 화학요법 및/또는 방사선치료가 수반되는 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  9. 제8항에 있어서, 상기 화학요법에 이용되는 제제는 겜시타빈인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 백신을 이용한 면역요법 치료가 화학요법의 치료 사이클 중에 수행되는 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 상기 백신은 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 백신의 1회 투여량이 1x 105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010 또는 1x1011 콜로니 형성 단위 (CFU)인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  13. 제9항에 있어서, 상기 백신의 1회 투여량은 1x109 CFU 미만이며, 바람직하게는 상기 백신의 1회 투여량은 1x108 내지 1x109 CFU인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  14. 제9항에 있어서, 상기 백신의 1회 투여량은 1x108 CFU 미만이며, 바람직하게는 상기 백신의 1회 투여량은 1x105 내지 1x108 CFU이며, 더 바람직하게는 상기 백신의 1회 투여량은 1x106 내지 1x107 CFU인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 1회 투여량은 약 105 - 약 1011, 바람직하게는 약 106 - 약 1010, 더 바람직하게는 약 106 - 약 109, 보다 더 바람직하게는 약 106 - 약 108, 가장 바람직하게는 약 106 - 약 107 콜로니 형성 단위 (CFU)인 것을 특징으로 하는 DNA 백신.
  16. DNA 백신 VXM01으로서,
    서열번호 1의 VEGFR-1 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 약독화된 살모넬라 티피 균주 Ty21a를 포함하며,
    상기 플라스미드는 7580 bp의 플라스미드 DNA이고, CMV 프로모터의 통제를 받는 VEGFR-2의 cDNA, 카나마이신 내성 유전자 및 pMB1 ori를 포함하며, pVAX10.VR2-1으로 명명된 것임을 특징으로 하는, DNA 백신 VXM01.
KR1020157002939A 2012-07-05 2013-06-26 췌장암 환자용 dna 백신 KR102090612B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12004995 2012-07-05
EP12004995.2 2012-07-05
PCT/EP2013/001882 WO2014005683A1 (en) 2012-07-05 2013-06-26 Dna vaccine for use in pancreatic cancer patients

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150036361A true KR20150036361A (ko) 2015-04-07
KR102090612B1 KR102090612B1 (ko) 2020-03-19

Family

ID=48741047

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157002939A KR102090612B1 (ko) 2012-07-05 2013-06-26 췌장암 환자용 dna 백신

Country Status (20)

Country Link
US (3) US9415098B2 (ko)
EP (2) EP3603664A1 (ko)
JP (1) JP6325534B2 (ko)
KR (1) KR102090612B1 (ko)
CN (1) CN104519908B (ko)
AU (2) AU2013286335B2 (ko)
BR (1) BR112014033046A2 (ko)
CA (1) CA2877938A1 (ko)
DK (1) DK2869836T3 (ko)
ES (1) ES2752141T3 (ko)
HU (1) HUE046138T2 (ko)
IL (1) IL236049B (ko)
LT (1) LT2869836T (ko)
MX (1) MX359315B (ko)
PL (1) PL2869836T3 (ko)
RU (1) RU2636348C2 (ko)
SG (1) SG11201500054QA (ko)
SI (1) SI2869836T1 (ko)
WO (1) WO2014005683A1 (ko)
ZA (1) ZA201409156B (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190058482A (ko) 2016-10-07 2019-05-29 덴카 주식회사 질화 붕소 덩어리 형상의 입자, 그 제조 방법 및 이를 이용한 열전도 수지 조성물
KR20190071686A (ko) 2016-10-21 2019-06-24 덴카 주식회사 구형상 질화 붕소 미분말, 그 제조 방법 및 이를 이용한 열전도 수지 조성물

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201500054QA (en) 2012-07-05 2015-03-30 Vaximm Ag Dna vaccine for use in pancreatic cancer patients
DK3310379T3 (da) * 2015-06-18 2019-12-16 Vaximm Ag Vegfr-2-targeterende dna-vaccine til kombinationsterapi
US20180153976A1 (en) 2015-06-18 2018-06-07 Vaximm Ag Novel cmv pp65 targeting dna vaccine for cancer immunotherapy
EP3484503A1 (en) * 2016-07-13 2019-05-22 Vaximm AG Process for the production of a dna vaccine for cancer immunotherapy
BR112019009003A2 (pt) * 2016-11-04 2019-07-16 Vaximm Ag cepa atenuada de salmonela e composição farmacêutica
EP3583200A1 (en) * 2017-02-17 2019-12-25 Vaximm AG Novel vegfr-2 targeting immunotherapy approach
SG11201908528UA (en) 2017-03-17 2019-10-30 Vaximm Ag Novel pd-l1 targeting dna vaccine for cancer immunotherapy
EP3652318A1 (en) 2017-07-11 2020-05-20 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
BR112021000315A2 (pt) 2018-07-11 2021-08-03 Actym Therapeutics, Inc. cepas bacterianas imunoestimulantes modificadas geneticamente e seus usos
US20210213121A1 (en) * 2018-09-05 2021-07-15 Vaximm Ag Neoantigen targeting dna vaccine for combination therapy
CN114980871A (zh) 2020-01-13 2022-08-30 万科斯蒙股份有限公司 基于沙门氏菌的dna疫苗联合抗生素
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
AU2022208435A1 (en) 2021-01-18 2023-08-10 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
CA3238816A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Prokarium Limited Combination cancer therapy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003073995A2 (en) * 2002-03-02 2003-09-12 The Scripps Research Institute Dna vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof.

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR930001382B1 (ko) 1990-09-05 1993-02-27 보령신약 주식회사 경구용 장티프스 생균백신 및 그의 제조방법
RS20150135A1 (en) 2003-05-30 2015-08-31 Genentech Inc. TREATMENT WITH ANTI-VEGF ANTIBODIES
JP6251179B2 (ja) 2011-12-22 2017-12-20 バクシム アクチェンゲゼルシャフト 弱毒化サルモネラ株を高収量で生産する方法
SG11201500054QA (en) * 2012-07-05 2015-03-30 Vaximm Ag Dna vaccine for use in pancreatic cancer patients

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003073995A2 (en) * 2002-03-02 2003-09-12 The Scripps Research Institute Dna vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
International Journal of Medical Microbiology. 2009, 299:109-119.* *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190058482A (ko) 2016-10-07 2019-05-29 덴카 주식회사 질화 붕소 덩어리 형상의 입자, 그 제조 방법 및 이를 이용한 열전도 수지 조성물
KR20190071686A (ko) 2016-10-21 2019-06-24 덴카 주식회사 구형상 질화 붕소 미분말, 그 제조 방법 및 이를 이용한 열전도 수지 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
IL236049A0 (en) 2015-01-29
DK2869836T3 (da) 2019-11-25
AU2017258877B2 (en) 2018-11-29
SI2869836T1 (sl) 2020-01-31
BR112014033046A2 (pt) 2017-06-27
EP3603664A1 (en) 2020-02-05
ZA201409156B (en) 2016-07-27
RU2636348C2 (ru) 2017-11-22
ES2752141T3 (es) 2020-04-03
AU2013286335B2 (en) 2017-08-10
MX359315B (es) 2018-09-25
WO2014005683A8 (en) 2014-04-03
PL2869836T3 (pl) 2020-03-31
US20160250311A1 (en) 2016-09-01
WO2014005683A1 (en) 2014-01-09
US20190008936A1 (en) 2019-01-10
EP2869836A1 (en) 2015-05-13
HUE046138T2 (hu) 2020-02-28
AU2017258877A1 (en) 2017-11-30
CA2877938A1 (en) 2014-01-09
RU2015103758A (ru) 2016-08-27
US9415098B2 (en) 2016-08-16
US10293037B2 (en) 2019-05-21
US20150165011A1 (en) 2015-06-18
IL236049B (en) 2020-04-30
KR102090612B1 (ko) 2020-03-19
JP6325534B2 (ja) 2018-05-16
LT2869836T (lt) 2019-11-11
CN104519908A (zh) 2015-04-15
SG11201500054QA (en) 2015-03-30
AU2013286335A1 (en) 2015-01-29
JP2015522263A (ja) 2015-08-06
EP2869836B1 (en) 2019-09-25
MX2014015977A (es) 2015-03-20
CN104519908B (zh) 2020-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102090612B1 (ko) 췌장암 환자용 dna 백신
CN107995868B (zh) 用于联合治疗的vegfr-2靶向dna疫苗
KR20190027834A (ko) 암 면역요법용 dna 백신을 제조하기 위한 방법
JP2023160838A (ja) 新規ｖｅｇｆｒ－２ターゲット免疫療法アプローチ
CN109906087A (zh) 用于联合治疗的wt1靶向dna疫苗
KR20190125481A (ko) 암의 면역요법을 위한 신규 pd-l1 표적화 dna 백신
KR20210058825A (ko) 병용 요법용 신생항원 표적화 dna 백신
KR20220128638A (ko) 항생제와 조합되는 살모넬라-기반의 dna 백신

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant