KR20150025158A - 페디오코쿠스 펜토사세우스 kft-18 및 이를 이용하여 세포외다당류를 대량 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EPS를 대량 생산하는 신규한 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주 및 이를 이용하여 EPS를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18은 EPS를 대량 생산하는 성질을 가지며, 생산된 EPS는 우수한 면역력 증진 활성이 있다. 따라서, 본 발명의 방법으로 생산한 EPS는 이를 함유한 다양한 약학 또는 식품 조성물로 활용할 수 있다.

Description

페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18 및 이를 이용하여 세포외다당류를 대량 생산하는 방법{PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS KFT-18 AND MASS PRODUCTION METHOD OF EXOPOLYSACCHARIDES USING THE SAME}

본 발명은 EPS를 대량 생산하는 신규한 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주 및 이를 이용하여 EPS를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

점질물은 식품의 물성뿐만 아니라 생리 기능 소재로서도 주목받고 있다. 천연 식품 소재를 이용하여 점질물을 생성하는 미생물을 선별하고, 최적의 점질물 생산 조건을 파악한다면 미생물을 이용한 고기능성 조성물을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

점질물 형태의 다당류(polysaccharide)는 구성 당의 종류에 따라 호모다당류(homopolysaccharide)와 헤테로다당류(heteropolysaccharide)로 나뉜다.

호모다당류는 주로 프룩토오스나 글루코오스와 같은 한 가지 형태의 당으로만 구성되어 있는데, 대표적으로 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)와 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 의한 프룩탄(fructan) 유형의 레반(levan) 및 이눌린(inulin)과, 글루칸 유형으로 류코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides)와 류코노스톡 메센테로이데스 아종 덱스트라니쿰(Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum)에 의한 덱스트란(dextran) 및 류코노스톡 메센테로이데스에 의한 알테르난(alternan) 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스와 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)에 의한 뮤탄(mutan) 등이 알려져 있다. 이들 중 류코노스톡이 생산하는 덱스트란은 점착성, 흡습성 및 열 안정성을 가지면서 식품의 물성 조절에 관여할 수 있어, 유화제, 점착제, 물성 조절제, 혈장 증량제 및 시럽과 캔디의 보습성 증진 및 설탕 결정 방지, 껌과 젤리의 겔화, 아이스크림의 빙결 방지 및 유체 식품의 물성 조절 등 다양한 식품 공업 분야에서 사용될 수 있다.

헤테로다당류는 두 가지 이상의 단당 즉, 주로 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 람노오스 등이 서로 다른 비율로 구성되어 있으며, 경우에 따라 N-아세틸-아미노당, 포스페이트, 아세틸, 글리세롤과 같은 당이 아닌 물질들이 존재하기도 한다. 주로 류코노스톡 락티스 아종 락티스(Leuconostoc lactis subsp. lactis), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 등의 중온성 젖산균과, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 델부뤼키 아종 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgalicus), 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 등의 고온성 젖산균들에서 생산되는데, 일반적으로 호모다당류에 비해 낮은 생산성을 보이며, 점질물 생산이 일시적인 특성을 보인다.

젖산균 등의 미생물이 생산하는 점질물은 식품의 물성뿐만 아니라 생리 기능소재로서도 주목받고 있다. 젖산균 중 비피도박테리아의 점질물과 락토바실러스 델부뤼키 아종 불가리쿠스와 락토바실러스 헬베르티쿠스 변종 주구르티(Lactobacillus helverticus var. jugurti)로부터 유래한 점질물은 항암효과가 있다고 보고되어 있으며, 스트렙토코쿠스로부터 생산된 점질물도 면역학적 효과가 있고, 항궤양 효과와 콜레스테롤 저하 활성에 대해 보고된 바가 있다.

일부의 미생물속은 세포외다당류(exopolysaccharides, EPS)를 생합성하여 제품의 조직과 점성 향상에도 기여하고 있다. EPS는 세포벽의 일부로서 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 세포벽 외부에 슬라임(slime)형태로서 발효 중에 축적되는 미생물 다당류로서, 1 차 또는 2 차 대사 산물이다. 특히, 유산균 생성 EPS는 유산균 발효유 제품에서 큰 문제점이었던 유청 분리 현상을 완화시키고 점성을 증가시키며 조직을 부드럽게 하여 섭취 시 구강 내 포만감과 조직감을 부여해준다.

미생물에 의해 생성된 EPS는 에너지원으로 이용되는 것은 아니고 건조, 식균 작용, 원생동물의 습식, 항생제, 독성 화합물, 삼투압 스트레스 등과 같은 외부 환경으로부터 자신을 보호하는 작용을 한다. 또한, EPS는 물에 녹거나 분산되는 긴 사슬의 고분자 중합체로서 식가공품에서 농후제나 겔링화에 중요한 역할을 한다.

EPS는 세포벽 밖에 위치하며 협막 형태로 세포벽에 흡착하거나 슬라임 형태로 세포외 환경으로 분비되는데, 이것의 중합체는 우유의 점도를 증가시키고 시너레시스(syneresis)와 입상성(graininess)을 억제하고 제품에 천연 탁도를 주어 발효유의 유동 작용 및 조직에 중요한 역할을 하므로 발효유의 안정제 대체제로 널리 사용되고 있다. 또한 유산균 배양액에서 분리한 EPS는 항암 활성도 있는 것으로 알려져 있다.

EPS는 실제적 측면에서 미생물이 가장 다량으로 생성하는 다당류이며, 배양액으로부터 회수가 쉽고, 정제 비용이 적게 들어가므로 상업적인 잠재력이 매우 높다. 유산균에 의해 생성된 EPS는 그 균종에 따라 구성당의 종류와 비율이 서로 다르다는 것이 이미 보고된 바 있다.

미생물의 EPS 생성량은 화학적 발효 조건(배지 조건, 초기 유당 함량, 탄소와 질소 비율)과 물리적 발효 조건(온도, pH, 산소 분압)이 중요하게 작용한다.

한국 공개특허공보 제10-2011-0122048호에는 김치로부터 세포외다당류 생성능을 가지는 바실러스 리케니포미스 균주에 대해 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 김치와 같은 전통 식품 유래의 미생물 자원을 활용하여, 살아있는 개체의 생체 방어 기전을 증강할 수 있는, 면역력 증진 활성이 있는 미생물 유래의 다당 성분을 발굴함과 함께, 이의 생산성과 효능을 증가시킬 수 있는 기술을 개발하기 위한 것이다.

본 발명에서는 김치에서 분리한 다당류 고생산성 미생물 균주를 선별 및 동정하고 이들의 생산성 증진 방법과 그들의 구성 성분을 분석하여 각 균주의 다당류생산을 위한 배양 최적 조건을 검토하여 이들의 응용 가능성을 조사하였다. 또한 당 종류에 따라 다르게 발현되는 미생물의 특징과 다당체 생성량을 조사하였다. 그 결과 EPS를 다량으로 생산할 수 있는 신규 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주를 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 신규 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18은 EPS를 대량 생산하는 성질을 가지며, 생산된 EPS는 우수한 면역력 증진 활성이 있다. 따라서, 대량 생산한 EPS는 이를 함유한 다양한 약학 또는 식품 조성물로 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 고체 배지에서 배양된 미생물 균주의 콜로니 형태를 18 개의 형태로 구분한 것이다.
도 2 내지 도 8은 도 1에서 구분한 콜로니 형태별로 균주 및 이용 당을 나타낸 것이다.
도 9 내지 도 24는 선별된 16 종의 균주에 대한 점도 측정 결과를 나타낸다.
도 25는 총당 정량 분석을 위한 표준 검량선을 나타낸다.
도 26 내지 도 33은 미생물 배양액의 당 분석 결과를 나타낸다.
도 34는 본 발명에 따라 선별된 김치 분리균 6 종을 이용하여 생산한 EPS의 산화질소 생성량을 측정한 결과이다.
도 35는 16S rRNA 염기 서열 간의 상동성 비교를 위한 계통학적 검출 접근법을 나타낸 계통도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 김치에서 새롭게 분리 및 동정된 신규 균주 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18(Pediococcus pentosaceus KFT-18, 수탁번호 KCCM11309P)에 관한 것이다.

본 발명자들은 다양한 김치로부터 수많은 미생물 균주를 분리한 후 EPS 생산량, 생산된 EPS에 의한 산화질소(NO) 생성량 등을 종합적으로 평가하여 최적의 미생물을 선별하였으며, 선별된 미생물을 동정하여 페디오코쿠스 펜토사세우스임을 확인하였다. 이를 KFT-18 균주라고 명명하고, 2012년 10월 17일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11309P로 기탁하였다.

다른 측면에서, 본 발명은 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18을 이용하여 세포외다당류(EPS)를 대량 생산하는 방법 및 이를 통해 생산된 EPS가 함유된 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 면역 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물일 수 있다. 상기 면역 관련 질환은 감염, 염증 또는 자가 면역 질환일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 면역력 증진용 건강기능식품일 수 있다.

NO는 각종 세포에 의해 생산되어 이들 세포에 작용하고, 염증 및 자가 면역이 중재된 조직의 파괴에 관여하는 다기능 중재자인 것으로 알려져 있다. 이러한 NO는 생체 내에서 일산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의하여 생성된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상적인 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 멸균 주사용액, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제의 형태 또는 동결건조(lyophilized)된 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 유효 성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제도 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 비만의 정도, 질병의 종류, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 건강기능식품은 식품용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 식품용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제는 특별히 제한되지 않으며 식품에 배합될 수 있는 통상적인 성분, 예를 들어 물, 풍미제, 향미제, 착색제, 안정화제, 방부제, 알코올, 탄산화제, 과육, 증점제, 비타민, 식물 추출물, 유기산, 미네랄, 영양제 등일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품의 형태는 특별히 제한되지 않으나, 음료, 껌, 차, 과자, 비타민 복합체 및 건강 보조식품으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형태일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 화장용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 화장용으로 허용되는 하나 이상의 첨가제는 특별히 제한되지 않으며 일반 화장료에 배합되는 통상적인 성분, 예를 들어 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 알코올, 증점제, 색소, 방부제, 향료, 킬레이트제, 부형제, 희석제, 자외선 차단제, 지방산 등일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 특별한 제한 없이, 스킨, 로션, 크림, 젤, 에센스, 파운데이션, 화장수, 패치, 팩, 비누, 세안제 및 세정제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

균주의 선별 및 EPS 생성량 측정

균주의 선별

김치에서 99 종의 균주를 분리하여 KFT-01 내지 KFT-99라 명명하였다. 미동정 젖산균, 엔테로코쿠스(Enterococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코쿠스(Pediococcus), 바이셀라(Weissella) 등이 포함되어 있었다(표 1 내지 표 4).

고체 배지에 첨가한 당은 API kit 50 CHL의 구성당 및 Bergey 매뉴얼(Bergey's manual)을 참고하여, 단당류 아라비노오스, 프룩토오스, 글루코오스, 만노오스, 람노오스 및 리보오스와 이당류인 락토오스, 말토오스, 수크로오스 및 트레할로오스, 삼당류로 라피노오스를 사용하였고, 당알코올은 에리트리톨, 말티톨, 만니톨, 소르비톨 및 자일리톨 등 총 16 종을 사용하였다. 이들은 API kit 50 CHL에 명시되어 있는 것을 토대로 기질로서 당을 50% 이상 이용하는 당과, Bergey 매뉴얼에 의하여 90 % 이상 기질로서 이용하는 당을 중심으로 선별한 것이다(표 5 및 표 6).

-70℃에서 보관한 99 종의 미생물을 MRS broth(Merck사 제조)에 2 회 계대 배양하여 충분히 활성화시켜 실험에 사용하였다. 젖산균의 다당체 생성 여부는 하기 표 7과 같이 MRS agar(Merck사 제조)의 구성 성분을 바탕으로 당의 종류를 치환하여 고체 배지를 제조한 후 젖산균을 접종하여 발생하는 콜로니의 특징을 조사하였다.

우선 당을 제외한 MRS(de Man Rogosa and Sharpe, complex medium) agar 구성 성분을 증류수에 용해하여 121℃에서 15 분 동안 고압 증기 멸균하고, 각각의 멸균한 증류수에 당을 용해한 후 멸균된 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 MRS agar 용액에 최종 농도가 2 %가 되도록 첨가하였다. 이 후 배지 용액을 골고루 교반한 후 멸균된 agar 플레이트에 굳혀 배지를 제조하였고, 미생물 접종은 지름 2 mm의 멸균한 나무 봉에 균체 배양액을 적신 후 각각의 배지에 찍고 30℃에서 48 시간 동안 배양하였다.

콜로니의 형태는 색상, 형태, 투명도, 환생성 및 점질 정도 등에 따라 18 가지로 구분하였다(도 1). 미생물이 만드는 점질물은 흘러내리는 형태(liquid form) 뿐만 아니라 응집되어 윤택이 나는 형태(dry crystalline form)로도 만들어지며 끈적임, 윤택 및 흐르는 정도를 구별하여 균주와 당을 구별하였다. 콜로니의 형태적인 특징을 파악한 결과, 응집형의 광택이 나는 콜로니(dry crystalline form)는 5, 6, 11 및 15 번 형태였으며, 흐르는 형태를 가진 콜로니는 14, 16 및 17번으로 나타났다.

미생물에서 EPS는 주로 글루코오스나 락토오스 같은 저분자 당을 사용하여 생성되는데 이는 증식 배지의 구성 성분에 따라 차이가 날 수 있다. 젖산균 배양에 주로 쓰이는 MRS의 경우 글루코오스뿐만 아니라 비프 추출물(beef extract), 펩톤(peptone) 및 효모 추출물(yeast extract)과 같은 복합 당류와 tween 80과 같은 유화제의 첨가로 인하여 영향을 받는다는 보고가 있다(Stacy A. Kimmel. et al, 1998). 본 실시예에서는 MRS 구성 성분을 대조군으로 하여 당 종류에 따라 생성되는 EPS 및 군집 형태를 우선 조사하여 EPS가 생성하는 당의 종류를 탐색하였다.

고체 배지에서의 EPS 생성은 콜로니 형태에 따라 비-슬라임 형태(non-slime form), 응집형 투명환 생성(dry crystalline form) 및 흐르는 형태의 콜로니 생성(liquid slime form)의 세 종류로 나누고 콜로니 크기를 나누어 4 mm이하 (+). 4 내지 6 mm (++) 및 6 mm 이상 (+++)으로 나누어 분류하였다.

원형의 콜로니 형태를 유지하면서 표면이 투명하고 윤기가 흐르는 균주 및 당을 선별하였다. 당의 경우 말토오스, 만노오스, 리보오스, 라피노오스 및 트레할로오스를 사용하였을 때 응집형 투명환 생성의 EPS가 생성되었으며 이 밖에 아라비노오스, 락토오스 및 글루코오스를 사용할 때 생성되는 균주가 있었다.

도 2는 도 1의 분류 중 5 번에 해당되는 응집형 투명환 생성을 나타낸 균주를 나타낸 것이고, 도 3은 도 1의 분류 중 6 번에 해당되는 응집형 투명환 생성을 나타낸 균주를 나타낸 것이고, 도 4는 도 1의 분류 중 11 번에 해당되는 응집형 투명환 생성을 나타낸 균주를 나타낸 것이며, 도 5는 도 1의 분류 중 15 번에 해당되는 응집형 투명환 생성을 나타낸 균주를 나타낸 것이다.

다량의 EPS 생성으로 콜로니의 형태가 일정하지 않고 6 mm 이상의 크기를 갖는 균주와 당을 선별하였는데 당의 경우 수크로오스를 사용하였을 때 흐르는 형태(liquid form)가 형성되는 것으로 확인되었으며, 이때의 균주는 대부분 류코노스톡, 페디오코쿠스 및 바이셀라였고, 일부 락토바실러스가 선별되었다.

도 6은 도 1의 분류 중 14 번에 해당되는 흐르는 형태의 콜로니 생성을 나타낸 균주를 나타낸 것이고, 도 7은 도 1의 분류 중 16 번에 해당되는 흐르는 형태의 콜로니 생성을 나타낸 균주를 나타낸 것이며, 도 8은 도 1의 분류 중 17 번에 해당되는 흐르는 형태의 콜로니 생성을 나타낸 균주를 나타낸 것이다.

고체 배지에서 점질물을 생산하거나 특이적인 콜로니 양상을 나타내었던 16 균주와 12 가지의 당을 선별하였다(표 8).

배지의 점도 조사

고체 배지에서 콜로니의 형태 및 크기를 확인한 후 EPS를 생성하면서 4 mm 이상의 크기를 보이며 2 개 이상의 당을 기질로 이용하는 균주를 선별하여 액체 배양액에서의 점도를 조사하였다. MRS broth(Merck사 제조)의 구성 성분 중 글루코오스를 제외한 모든 물질을 첨가하여 액체 배지를 제조한 후 총량의 2 %가 되도록 각각의 당 용액을 여과 멸균하여 첨가하였다(표 9).

완성된 액체 배지에 0.5 %의 미생물 액을 첨가하고 30℃에서 배양하였다. 배양액은 0 시간, 12 시간 및 24 시간 마다 30 mL씩 튜브에 담아 점도계 (Brookfield사 제조 LVDV-Ⅱ)로 측정하여 점성도(cP)를 측정하였다. 점도 측정은 배양액의 온도가 25℃ 일때 spindle No. 1을 이용하여 100 rpm으로 15 초 측정한 값을 나타내었다.

제조된 액체 배지에 선별된 16 종의 미생물을 접종하여, 30℃에서 48 시간 배양하면서 12 시간 단위로 액체 배지를 채취하여 점도를 측정했다. 또한 각 액체 배지를 멸균된 50 mL 팔콘 튜브(Falcon tube)에 각각 30 mL씩 분주하여 측정하였으며, 26±1℃의 온도에서 100 rpm으로 15 초 간 회전시킨 후의 값을 측정하였다. 선별된 16 개 균주의 점도성 분석 결과를 도 9 내지 도 24에 나타내었다.

EPS 생성능 측정

각각의 미생물 배양액 30 mL를 시료로 하여 배양액 안에서 생성된 다당체를 회수하고 그 양을 측정하였다. 다당류 침전은 에탄올 침전법을 이용하였다. 균주 배양액의 세포를 제거하기 위하여 12,000 xg에서 15 분간 원심분리(Beckman사 제조 J-251) 후 침전물을 제거하고, 분리하여 얻은 상등액을 취하여 2 배 부피의 95% 에탄올(Daejung사 제조)을 첨가한 후 4℃에서 24 시간 동안 침전시켰다. 침전된 다당류는 12,000 xg에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 회수하였으며 초기 배양액과 동일한 부피의 증류수(DW)로 희석하여 실험 용액으로 사용하였다.

회수한 다당류의 생산량 측정은 페놀-황산 분석법(phenol-sulfuric acid method; Dubois et al. 1956)을 이용하여 당 분석을 실시하였다. 먼저 실험 용액을 2 배로 희석한 후 150 ㎕를 취하고 동량의 5 % 페놀 용액을 첨가한 후 750 ㎕ 진한 황산(96% 농도)을 첨가하여 교반 후 상온에서 30 분간 반응시키고 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총당 정량 분석을 위한 표준 검량선을 도 25에 나타내었고, 미생물의 배양액의 당 분석 결과를 도 26 내지 도 33에 나타내었다.

배양액의 점질물 생성량 측정결과, KFT-09 균주 배양액은 락토오스, 람노오스 및 수크로오스를 기질로 하였을 때 배양 후 EPS　유래 당 생성 함량이 높은 것으로 확인되었다. KFT-15 균주의 경우 수크로오스를 기질로 하였을 때 EPS 유래 당 생성 생성이 매우 우수한 것으로 확인되었다(도 26).

KFT-16 균주의 경우 당 생성량이 다른 균주 배양액에 비하여 상대적으로 낮게 측정되었으며, 이 중에서 람노오스와 수크로오스를 기질로 하였을 때 EPS　유래 당 생성 생성량이 활발한 것으로 확인되었다. KFT-18의 경우 수크로오스를 기질로 하였을 때 EPS　유래 당 생성 생성량이 가장 높게 측정되었다(도 27).

KFT-19 배양액의 경우 람노오스와 수크로오스를 기질로 하였을 때 EPS 유래 당 생성 생성량이 가장 높았으며, KFT-22의 경우 락토오스, 람노오스 및 수크로오스 배양액의 EPS　유래 당 생성 함량이 높았지만 대체로 낮은 생성량을 나타내었다(도 28).

KFT-30과 KFT-51의 경우 유의적으로 높은 EPS　유래 당 생성 생성량을 나타내는 배양액은 없었다. 하지만 KFT-30의 경우 만니톨, 라피노오스 및 소르비톨에서에서, KFT-51은 람노오스에서에서 EPS　유래 당 생성 함량이 높은 것으로 측정되었다(도 29).

KFT-63 역시 유의적으로 높은 EPS 유래 당 생성 함량을 갖는 배양액은 없었다. 하지만 KFT-69의 경우 수크로오스에서 EPS 유래 당 생성 생성능이 매우 높은 것으로 확인되었다(도 30).

KFT-10의 경우 라피노오스, 람노오스, 리보오스 및 수크로오스를 기질로 하였을 때 EPS　유래 당 생성 함량이 높게 측정되었으며, KFT-84의 경우 모든 배양액내 EPS 유래 당 생성 함량이 낮았다(도 31).

KFT-87과 KFT-88의 경우 전반적으로 EPS 유래 당 생성 함량이 높게 측정되지 않았지만 람노오스를 기질로 하였을 때 EPS 유래 당 생성 함량이 높게 측정되었다(도 32).

KFT-90에서는 락토오스, 람노오스 및 수크로오스를 기질로 하였을 때 EPS　유래 당 생성 함량이 높게 측정되었으며, KFT-95는 당 종류별로 큰 차이가 없이 낮은 EPS 유래 당 생성 함량을 보였다(도 33).

면역력 탐색을 위한 균주로 김치에서 분리한 미생물 중 KFT-09, KFT-15, KFT-16, KFT-18, KFT-19 및 KFT-22 균주를 선별하였다. 이들 균주는 활성화 되어 있는 상태에서 100 mL MRS broth에 1 %가 되도록 접종한 후 30℃에서 24 시간 동안 배양하여 원심분리하여 점질물을 얻었다. 이때 사용한 기질은 락토오스, 말토오스, 람노오스 및 수크로오스를 사용하였으며 생성량은 페놀-황산 분석법으로 확인하였다.

구체적으로, 균주를 활성화시켜 각 균주를 멸균된 MRS broth(Merck사 제조) 5 mL에 24 시간 동안 100 mL씩 배양하였다. 또한, MRS의 구성 성분을 기본으로 하여 글루코오스 대신에 2 %(w/w)의 락토오스, 말토오스, 람노오스, 수크로오스로 당을 치환하였다. MRS broth 및 치환된 MRS 배지에 배양된 균주 용액 0.5 %(v/v)를 접종하여 30℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 10,000 rpm으로 15 분 동안 원심분리 후 균체를 제거하고, 배양액과 동량의 95 % 에탄올을 첨가 후 4 ℃에서 24 시간 동안 침전시켰다. 11,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하여 침전물을 수거하고, 1 mL의 증류수(DW)에 용해하여 2 mL로 희석하고 -20 ℃에서 보관하였다. 배양된 균주도 2 mL로 희석하여 바이알에 보관하였다. EPS의 정량 분석은 페놀-황산 분석법(phenol-sulfuric acid method)을 이용하였다. 470 nm에서 OD 값을 측정 후 검량선을 이용하여 EPS 함량을 계산하였다.

6 종의 김치 유래 균주의 다당체 생성량(mg/mL)을 하기 표 10에 나타내었다.

대부분의 김치 유래 미생물은 수크로오스를 첨가하였을 때 슬라임 유형의 점질물을 다량으로 생산하는 것을 확인하였으며, 수크로오스 외에 말토오스, 라피노오스, 트레할로오스, 람노오스 및 락토오스 첨가 배지에서 주로 다당체 생성이 확인되었다.

6 종류 균주의 EPS 당 함량(mg/mL) 측정결과는 하기 표 11과 같다. 수크로오스에서 다당체 생성량이 가장 높았으며 당알코올류는 상대적으로 적은 함량을 보였다. 균주마다 다당 생성능이 달랐는데, 30 mg/mL 이상 생산하는 균주와 당을 선별하면 KFT-09 균주가 락토오스, 말토오스, 람노오스 및 수크로오스, KFT-15 균주가 람노오스, KFT-16 균주가 수크로오스, KFT-18 균주가 람노오스 및 수크로오스, KFT-19 균주가 락토오스, 람노오스 및 수크로오스, KFT-22 균주가 만니톨, 라피노오스 및 소르비톨로 확인되었다. MRS의 구성 성분을 기본으로 하여 글루코오스 대신에 2 %(w/w)의 수크로오스로 당을 치환하여 KFT-18을 배양한 것이 117.39 mg/mL로 가장 많은 양의 EPS를 생산함을 확인할 수 있었다.

NO (산화질소) 생성 측정

배양액에서의 NO 생성은 NO의 산화물인 아질산의 측정을 통해 평가하였다. Griess 분석 방법을 이용하였으며 Raw 264.7 세포를 96-웰 플레이트 2 x 10⁵ cells/mL 농도로 분주하고 24 시간 배양한 뒤, Raw 264.7 세포에 500 μg/mL으로 제조해 놓은 시료를 각각 50 μg/mL 농도로 처리한 다음, 20 시간 배양하였다. 배양 후 상등액 100 μL를 새로운 96-웰 플레이트에 옮긴 후 Griess 시약(Sigma-Aldrich사 제조)와 1 : 1로 혼합하여 넣고, 쉐이커에서 10 분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 곡선(standard curve)은 아질산 나트륨을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 12 및 도 34에 나타내었다. 대조구는 인터페론-γ(IFN-γ)와 지질다당류(LPS)를 사용하였다.

EPS 생성능이 활발했던 말토오스, 수크로오스, 람노오스, 락토오스를 탄소원으로 배양한 균주의 EPS를 동결건조하여 Raw 264.7 세포에서의 NO 생성능을 관찰한 결과, 6 균주 중 4 균주가 말토오스를 탄소원으로 하여 생성한 EPS에서 대조구(LPS) 대비 70% 전후 수준의 NO 생성능을 나타내었다. 그 중 KFT-18의 EPS는 67.3±5.3 %로 조사 대상 시료 중 가장 높은 NO 생성 유도능을 보였다.

균주의 동정

-70℃에 보관되어 있는 김치 분리균 8 종을 TS broth(Merck사 제조)에 2 회 계대 배양하여 충분히 활성화시키고 30℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 동정한 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

16S rRNA 염기 서열 간의 상동성 비교를 위한 계통학적 검출 접근법을 통해 상기 8 종의 균주의 위치를 파악하였다(도 35).

한국미생물보존센터 KCCM11309P 20121017

Claims (6)

1. 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18(Pediococcus pentosaceus KFT-18, 수탁번호 KCCM11309P).
2. 페디오코쿠스 펜토사세우스 KFT-18을 이용하여 세포외다당류(exopolysaccharide, EPS)를 생산하는 방법.
3. 제 2 항의 방법에 따라 생산된 세포외다당류를 함유하는 면역 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,
   면역 관련 질환이 감염, 염증 또는 자가 면역 질환인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 제 2 항의 방법에 따라 생산된 세포외다당류를 함유하는 면역력 증진용 건강기능식품.
6. 제 2 항의 방법에 따라 생산된 세포외다당류를 함유하는 화장료 조성물.

Images