KR20150023509A - 폴리사카라이드 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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다비드 스커니크
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더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
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Abstract

본 발명은 부분적으로 특정 PNAG-양성 병원체에 의한 감염의 예방 및 치료, 및 검출 (진단 포함) 방법에서의 폴리 N-아세틸화 글루코사민 (PNAG) 및 PNAG에 특이적인 항체의 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

폴리사카라이드 조성물 및 사용 방법{POLYSACCHARIDE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE}
관련 출원
본원은 2012년 5월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 61/653389 및 2013년 5월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 61/827661을 우선권 주장한다. 특허청구범위를 제외하고, 이들 가출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다.
정부 지원
본 발명은 NIH (NIAID)로부터 승인 번호 RO1 AI046706 하에 부분적으로 지원받았다. 미국 정부는 본 발명에 있어서 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 특정한 병원체에 의한 감염의 검출, 예방 및/또는 치료에서의 특정 폴리사카라이드 항원 및 항체 조성물의 용도에 관한 것이다.
자연에서의 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충에 관계 없이 다양한 감염에 대해 면역요법을 개발하는 것은 높은 우선 순위에 있다. 다수의 현행 면역요법은 종-특이적 항원을 통해 특정한 미생물 종을 표적화한다. 광범위한 미생물을 표적화하고 이에 대해 효과적인 면역요법은 덜 흔하다.
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 에스. 에피더미디스(S. epidermidis)는 그들의 표면에서 폴리-N-아세틸 글루코사민 (PNAG) 폴리사카라이드 항원을 발현한다. PNAG는 이들 박테리아에서 ica 유전자좌의 유전자 산물에 의해 생체내 합성된다. 유사하게, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 다른 그람-음성 박테리아는 PNAG를 합성하는데 사용될 수 있는 단백질의 합성을 또한 코딩하는 pga 유전자좌로 명명된 상동 유전자좌를 함유한다. 따라서, 무손상 ica 또는 pga 유전자좌를 갖는 박테리아는 PNAG를 생산할 수 있다. 상기 항원의 탈아세틸화된 형태는 부분적으로 옵소닌 항체의 유도를 특징으로 하는 항원-특이적 면역 반응을 자극하는데 특히 효과적인 것으로 이전에 밝혀졌다.
발명의 개요
본 발명은 부분적으로 폴리사카라이드 폴리 N-아세틸 글루코사민 (PNAG)이 상기 폴리사카라이드를 발현하는 것으로 이전에 공지되거나 또는 시사되지 않았던 다수의 다양한 병원체에 의해 발현된다는 예상치 못한 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 이들 특정한 병원체에 의한 감염을 예방 및/또는 치료하는데, 및 임의로 이러한 감염으로 인한 것일 수 있는 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 상기 폴리사카라이드 또는 상기 폴리사카라이드에 특이적인 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.
놀랍게도, 본 발명에 따라 PNAG를 발현하는 것으로 밝혀진 병원체는 다수의 부류 및 유형을 아우른다. 이들 부류 및 특정한 병원체는 하기와 같다: (a) 그람-양성 코쿠스: 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 군 A 스트렙토코쿠스, 예컨대 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 군 B 스트렙토코쿠스, 예컨대 스트렙토코쿠스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 및 군 C 스트렙토코쿠스, 예컨대 스트렙토코쿠스 디사갈락티아에(Streptococcus dysagalactiae), 및 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 백신 및 비-백신 균주; (b) 그람-양성 간균: 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 엠. 스메그마티스(M. smegmatis); (c) 그람-음성 코쿠스 및 코코바실루스: 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 엔. 고노레아에(N. gonorrhoeae), 비피막형 헤모필루스 인플루엔자에(Hemophilus influenzae), 헤모필루스 듀크레이(Hemophilus ducreyi), 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); (d) 그람-음성 간균: 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 비. 세타이오타미크론(B. thetaiotamicron), 비. 불가티스(B vulgatis), 시트로박터 로덴티움(Citrobacter rodentium), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움; (e) 진균: 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (효모), 칸디다 알비칸스 (균사), 아스페르길루스 플라부스(Aspergillus flavus), 푸사리움(Fusarium) 종, 예컨대 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) 및 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans); 및 (f) 기생충: 플라스모디움 베르게이(Plasmodium bergei) 및 피. 팔시파룸(P. falciparum) (종충 포함); 및 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis) (티. 바기날리스(T. vaginalis)). 이들 병원체에 의한 PNAG 발현은 이들 중 어느 것도 특정 박테리아에서 PNAG 및 관련된 폴리사카라이드 합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 스타필로코쿠스의 ica 유전자좌 또는 이. 콜라이의 pga 유전자좌와 관련된 확인가능한 유전자좌를 갖지 않기 때문에 특히 놀라운 것이다. 따라서, 이들 병원체는 이들이 확인가능한 ica 또는 pga 유전자좌를 갖지 않음을 가리키는 것인 비-ica/pga 병원체로서 본원에서 지칭된다.
본 발명은 또한 상기 병원체 중 임의의 것을, 예를 들어 PNAG에 특이적인 항체를 사용하여 검출하는 방법을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 비-ica/pga이지만 PNAG-양성인 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체에게, 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량의 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
Figure pct00001
상기 식에서, n은 적어도 5이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체에게, 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량의, 담체에 접합된 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
Figure pct00002
상기 식에서, n은 5 이상이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
상기 식에서, n은 적어도 5이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, 담체에 접합된 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
Figure pct00004
상기 식에서, n은 5 이상이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리사카라이드는 링커를 통해 담체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 담체는 펩티드 담체이다. 각각의 폴리사카라이드는 하나 이상의 담체에 접합될 수 있다. 담체는 폴리사카라이드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체 폴리사카라이드는 N-아세틸 베타 (β) 1-6 글루코사민이 아니다.
일부 실시양태에서, R 기의 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하는 -NH-CO-CH3이다. 일부 실시양태에서, R 기는 -NH-CO-CH3이 아니다.
일부 실시양태에서, n은 적어도 9, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500이다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리사카라이드는 100-500 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리사카라이드는 적어도 900 달톤, 적어도 2000 달톤, 적어도 2500 달톤, 적어도 5000 달톤, 적어도 7500 달톤, 적어도 10,000 달톤, 적어도 25,000 달톤, 적어도 50,000 달톤, 적어도 75,000 달톤, 적어도 100,000 달톤, 적어도 125,000 달톤, 적어도 150,000 달톤, 적어도 200,000 달톤, 적어도 250,000 달톤, 적어도 300,000 달톤, 적어도 350,000 달톤, 적어도 400,000 달톤, 적어도 450,000 달톤 또는 적어도 500,000 달톤의 분자량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리사카라이드는 아주반트와 함께 투여되거나 또는 제제화되거나, 또는 아주반트와 함께 사용된다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리사카라이드는 전신으로 투여되거나 또는 전신 투여를 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리사카라이드는 국부적으로 투여되거나 또는 국부 투여를 위해 제제화된다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리사카라이드는 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물 중에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체에게 유효량의 PNAG-특이적 항체 또는 PNAG-특이적 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, PNAG-특이적 항체 또는 PNAG-특이적 항체 단편을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스이다. 일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스는 에스. 뉴모니아, 군 A 스트렙토코쿠스, 군 B 스트렙토코쿠스, 군 C 스트렙토코쿠스 또는 엔테로코쿠스이다.
일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균이다. 일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균은 리스테리아, 클로스트리디움 디피실레, 비. 서브틸리스, 엠. 투베르쿨로시스 또는 엠. 스메그마티스이다.
일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스이다. 일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스는 네이세리아 메닌기티데스, 네이세리아 고노레아에, 비피막형 에이치. 인플루엔자에, 헬리코박터 종 또는 캄필로박터 종이다.
일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균이다. 일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균은 박테로이데스 프라길리스, 비. 세타이오타미크론, 비. 불가티스, 시트로박터 로덴티움, 비브리오 콜레라에, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움이다. 일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 비-ica/pga PNAG-양성 진균이다. 일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 진균은 칸디다 알비칸스 (효모); 칸디다 알비칸스 (균사), 아스페르길루스, 푸사리움 또는 크립토코쿠스이다.
일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 비-ica/pga PNAG-양성 기생충이다. 일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 기생충은 피. 베르게이 또는 피. 팔시파룸이다.
일부 실시양태에서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 티. 바기날리스이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 영장류, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 개 또는 고양이이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염이 발생할 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 전신으로 투여되거나 또는 전신 투여를 위해 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 국부적으로 투여되거나 또는 국부 투여를 위해 제제화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 농축된 미생물 세포체 제제로부터 조 폴리사카라이드 제제를 에탄올 침전시키고; 조 폴리사카라이드를 리소자임 및 리소스타핀으로 공동으로 소화시킨 후 뉴클레아제 및 프로테이나제 K로 순차적으로 소화시켜 소화된 폴리사카라이드 제제를 형성하고; 소화된 폴리사카라이드 제제를 크기별로 분획화하고; 아세틸화 폴리사카라이드 분획을 단리시키고; 아세틸화 폴리사카라이드 분획을 탈아세틸화하여 50% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 생성하는 것을 포함하며, 여기서 미생물 세포체 제제는 비-ica/pga PNAG-양성 미생물로부터 유도된 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드 제제는 칼럼을 사용하여 크기별로 분획화된다. 일부 실시양태에서, 방법은 40% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 생성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미생물 배양액으로부터 불순한 폴리사카라이드를 제조하고; 불순한 폴리사카라이드를 산 또는 염기와 함께 인큐베이션하여 반-순수한 폴리사카라이드 제제를 생성하고; 제제를 중화시키고; 중화된 제제를 플루오린화수소산 중에서 인큐베이션하고; 제제로부터 아세틸화 폴리사카라이드를 단리시키고; 아세틸화 폴리사카라이드를 탈아세틸화하여 50% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 생성하는 것을 포함하며, 여기서 미생물 배양액은 비-ica/pga PNAG-양성 미생물 배양액인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 40% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 생성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 미생물 배양액으로부터 불순한 폴리사카라이드를 제조하고; 불순한 폴리사카라이드를 산 또는 염기와 함께 인큐베이션하여 반-순수한 폴리사카라이드 제제를 생성하고; 제제를 중화시키고; 중화된 제제를 플루오린화수소산 중에서 인큐베이션하고; 제제로부터 50% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 단리시키는 것을 포함하며, 여기서 미생물 배양액은 비-ica/pga PNAG-양성 미생물 배양액인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 40% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드가 단리된다.
일부 실시양태에서, 방법은 단리된 폴리사카라이드에 담체를 접합시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 담체는 펩티드 담체이다.
일부 실시양태에서, 아세틸화 폴리사카라이드는 화학적으로 탈아세틸화된다.
일부 실시양태에서, 아세틸화 폴리사카라이드는 염기성 용액과 함께 인큐베이션됨으로써 탈아세틸화된다. 일부 실시양태에서, 아세틸화 폴리사카라이드는 효소적으로 탈아세틸화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 항체를 생산하기 위한 유효량의 비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 단리된 PNAG 폴리사카라이드 및 아주반트를 투여하고, 대상체로부터 항체를 단리시키는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 항체를 생산하기 위한 유효량의 비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 단리된 PNAG 폴리사카라이드 및 아주반트를 투여하고, 대상체로부터 비장 세포를 수확하고, 대상체로부터의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키고, 융합 서브클론으로부터 생산된 항체를 수확하는 것을 포함하는, 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체를 단리시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, PNAG 폴리사카라이드는 50% 미만으로 아세틸화된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 토끼이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 비-ica/pga PNAG-양성 병원체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 PNAG-특이적 항체 또는 항체 단편과 접촉시키고, 샘플에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합을 검출하는 것을 포함하며, 여기서 항체 또는 항체 단편의 결합은 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 샘플에 존재함을 가리키는 것인, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체를 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 샘플은 스타필로코쿠스 음성이다.
일부 실시양태에서, 샘플은 대상체로부터의 생물학적 샘플이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 요, 혈액, 고름, 피부, 객담, 관절액, 림프 또는 젖이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 이식가능하거나 또는 이식된 의료 장치 또는 의료 장비의 부품 또는 환자 보호 설비에서의 표면의 면봉추출물로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 인간화 항체 또는 키메라 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 F598 (ATCC PTA-5931) 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 F628 (ATCC PTA-5932) 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 F630 (ATCC PTA-5933) 항체 또는 그의 단편이다. PNAG에 대해 발생된 폴리클로날 항혈청 또한 일부 경우에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 작용제에 접합된다.
일부 실시양태, 작용제는 세포독성제, 예컨대 항생제 또는 방사성동위원소이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 검출가능한 표지이다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 방사성 표지, 효소, 비오틴 분자, 아비딘 분자 또는 형광색소이다.
본 발명의 각각의 제한사항은 본 발명의 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 따라서, 어느 하나의 요소 또는 요소의 조합을 포함하는 본 발명의 각각의 제한사항은 본 발명의 각각의 측면에 포함될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1. 감염 후 4시간째에 시작하는 복강내로 (ip) 및 국소적으로 주어진 PNAG에 대한 MAb F598의 효과. 이 도면은 최저 접종물, 48시간 실험으로부터의 데이터를 나타낸 것이다. 실험 세부사항: 접종물은 1x105/눈이었고; 200 μg의 MAb를 감염 후 4 및 24시간째에 ip 주사하였고; 20 μg MAb를 감염 후 24 및 32시간째에 국소적으로 적용하였다. 데이터 지점은 개별 마우스에 대한 값을 나타내고; 막대는 군에 대한 평균 점수를 나타낸다. P 값: 만 휘트니 U(Mann Whitney U) 검정.
도 2. 감염 후 4시간째에 시작하는 IP 및 국소적으로 주어진 PNAG에 대한 MAb F598의 효과. 이 도면은 저 접종물, 48시간 실험으로부터의 데이터를 나타낸 것이다. 실험 세부사항: 접종물은 2x105/눈이었고; 500 μg의 MAb를 감염 후 4시간째에 IP 주사하였고; 50 μg의 MAb를 감염 후 24 및 32시간째에 국소적으로 적용하였다. 데이터 지점은 개별 마우스에 대한 값을 나타내고; 막대는 군에 대한 평균 점수를 나타낸다.
P 값: 만 휘트니 U 검정.
도 3. 감염 후 4시간째에 시작하는 국소적으로 주어진 PNAG에 대한 MAb F598의 효과. 이 도면은 중간 접종물, 32시간 실험으로부터의 데이터를 나타낸 것이다. 실험 세부사항: 접종물은 5.1x106/눈이었고; MAb를 감염 후 4, 8, 24시간째에 국소적으로 적용하였다. 데이터 지점은 개별 마우스에 대한 값을 나타내고; 막대는 군에 대한 평균 점수를 나타낸다.
P 값: 만 휘트니 U 검정.
도 4. 감염 후 4시간째에 시작하는 국소적으로 주어진 PNAG에 대한 MAb F598의 효과. 이 도면은 고 접종물, 32시간 실험으로부터의 데이터를 나타낸 것이다. 실험 세부사항: 접종물: 5x107/눈; MAb를 감염 후 4, 8, 24시간째에 국소적으로 적용하였다. 실험을 32시간째에 종결하였다. 데이터 지점은 개별 마우스에 대한 값을 나타내고; 막대는 군에 대한 평균 점수를 나타낸다. P 값: 만 휘트니 U 검정.
도 5. 에스. 뉴모니아에 D39로 공격한 CBA/N 마우스의 생존 (N=12/군).
도 6. 에스. 피오게네스 (군 A 스트렙토코쿠스)로 인한 치명적인 피부 감염에 대한 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 발생된 항체의 보호 효능.
도 7. 군 B 엔. 메닌기티데스 균주 B16B6으로 공격한 2-3일령 마우스 새끼의 수막염 (뇌 내의 박테리아)에 대한 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 토끼에서 발생된 항체의 보호 효능. 데이터 지점은 개별 마우스에 대한 log10 CFU/뇌를 나타내고; 막대는 군에 대한 중앙 점수를 나타낸다. P 값: 만 휘트니 U 검정.
도 8. PBS (실험 1) 또는 HIV에 대한 인간 IgG1 MAb (MAb F105, 실험 2)와 비교한, PNAG에 대한 인간 IgG1 MAb를 투여한 마우스에서의 결장염 점수의 감소. 데이터 지점은 개별 마우스에 대한 점수를 나타내고; 막대는 군에 대한 중앙 점수를 나타낸다. P 값: 만 휘트니 U 검정.
도 9. PNAG에 대한 MAb F598 또는 HIV에 대한 대조 인간 IgG1 MAb (F105)로 처리한 TRUC 마우스에서 전체 조직학적 점수를 밝혀내는데 사용한 4개의 파라미터에 대한 개별 점수의 비교.
도 10. 엘. 모노시토게네스에 대한 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 토끼에서 발생된 항체의 보호 효능.
도 11. dPNAG-TT에 대해 발생된 토끼 항체에 의해 매개된 에스. 뉴모니아에의 4개 균주의 옵소닌성 사멸. 정상 토끼 혈청을 이용한 대조군에서 획득한 것과 비교한 사멸.
도 12. PNAG20에 대한 인간 IgG1 MAb F598에 의해 매개된 에스. 뉴모니아에의 4개 균주의 옵소닌성 사멸. 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 알기네이트에 특이적인 대조 MAb F429와 비교한 사멸.
도 13. 9GlcNH2-TT에 대해 발생된 토끼 항체에 의해 매개된 이. 파에칼리스의 3개 균주의 옵소닌성 사멸. 정상 토끼 혈청을 이용한 대조군에서 획득한 것과 비교한 사멸.
도 14. PNAG에 대한 MAb F598에 의한 군 A 스트렙토코쿠스의 옵소닌성 사멸. 피. 아에루기노사 알기네이트에 특이적인 대조 MAb F429와 비교한 사멸.
도 15. PNAG에 대한 MAb F598에 의한 칸디다 알비칸스의 옵소닌성 사멸. 피. 아에루기노사 알기네이트에 특이적인 대조 MAb F429와 비교한 사멸.
도 16. 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis) 혈청군 B 균주의 살박테리아 사멸.
도 17. 엔. 고노레아에의 살박테리아 사멸.
도 18. 엔. 메닌기티디스 살박테리아 사멸의 억제.
도 19. 엔. 고노레아에 살박테리아 사멸의 억제.
본 발명은 부분적으로 다수의 박테리아 및 비-박테리아 병원체 상에서의 PNAG 발현의 예상치 못한 발견에 관한 것이다. 상기 발견은 적어도 2가지 이유에 대하여 예상치 못한 것이었다. 첫째로, 본 발명에 따라 PNAG를 발현하는 것으로 밝혀진 병원체 중 어느 것도 ica 또는 pga 유전자좌를 갖지 않는다. ica 및 pga 유전자좌는 각각 폴리사카라이드 합성, 예컨대 PNAG 합성에 관여하는 4개의 단백질을 코딩한다. 본 발명 이전에는, 병원체가 PNAG를 합성하기 위해서는 ica 또는 pga 유전자좌를 가져야 하는 것으로 여겨졌다. ica 유전자좌는 본 발명 이전에 PNAG를 발현하는 것으로 공지된 에스. 아우레우스 및 에스. 에피더미디스에 존재하는 반면, pga 유전자좌는 일부 그람-음성 유기체에서 확인되었다. 새롭게 발견된 PNAG-양성 병원체가 이들 유전자좌의 명백한 부재 하에 PNAG를 실제로 어떻게 합성하는지는 명백하지 않다. 본 발명의 발견은 PNAG가 이러한 유전자좌 및 이것이 코딩하는 단백질의 부재 하에서도 합성될 수 있음을 시사한다. 둘째로, PNAG를 발현하는 것으로 밝혀진 병원체, 예컨대 박테리아 및 비-박테리아 병원체는 매우 다양하다. 본 발명 이전에는, 식별가능한 ica/pga 유전자좌를 발현하지 않는 병원체가 PNAG를 제조할 수 있다는 것은 고려되지 않았다. 비-박테리아 병원체가 PNAG를 발현할 수 있다는 것 또한 고려되지 않았다.
다양한 이들 박테리아 및 비-박테리아 병원체가 PNAG를 발현한다는 발견은 이러한 병원체로 인한 감염을 예방, 치료 및/또는 진단하는 신규 접근법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 특히 새롭게 기재된 PNAG-양성 병원체로부터의 PNAG 및 dPNAG의 단리 및/또는 유도, 및 면역 반응 (PNAG에 특이적인 항체를 생산하는데 요구되는 면역 반응 포함)을 자극하고, PNAG 및 PNAG-발현 병원체를 검출하고, PNAG-발현 병원체의 감염을 예방 및 치료하는데 있어서의 그의 용도를 고려한다. 이러한 PNAG-발현 병원체는 본원에 기재된 비-ica/pga PNAG-발현 병원체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
비-ica/pga PNAG-양성 병원체
PNAG를 발현하는 것으로 새롭게 발견된 병원체는 이것이 공지된 PNAG-발현 병원체, 예컨대 에스. 아우레우스, 에스. 에피더미디스 또는 이. 콜라이의 4개-유전자 ica/pga 유전자좌에 대한 임의의 유의한 유사성을 갖는 DNA-기반 유전자좌를 함유하지 않음을 가리키는 것인 비-ica/pga PNAG-양성 병원체로서 본원에서 지칭된다. ica 또는 pga 유전자좌는 4개의 단백질 (2개의 글리코실트랜스퍼라제, N-데아세틸라제, 및 합성된 폴리사카라이드의 유출을 위한 단백질)을 코딩한다. 일부 비-ica/pga PNAG 병원체는 단일 유전자좌에서 이들 4개의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하지 않는다.
예시적인 ica 유전자좌 (즉, 에스. 아우레우스로부터의 것)의 뉴클레오티드 서열은 등록 번호 AF086783 하에 진뱅크(GenBank)에 기탁되었다. 본 발명에 따라 "비-ica" 병원체로 간주되는 병원체는 식별가능한 ica 유전자좌를 보유하지 않는다. 한 예로서, 이러한 병원체는, 염색체 DNA의 동일한 인접 스트레치에서 발생하고 AF086783 하에 기탁된 ica 유전자좌의 전체 4개-유전자 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 25% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하지 않을 수 있다. 비-ica PNAG-양성 병원체는 스타필로코쿠스를 배제한다.
예시적인 pga 유전자좌 (즉, 이. 콜라이 K12 하위균주 MG1655로부터의 것)의 뉴클레오티드 서열은 AAC74106.1, AAC74107.1, AAC74108.1 및 AAC74109.1로서의 유전자좌 내의 각각의 4개의 유전자에 대한 등록 번호 하에 진뱅크에 기탁되었다. 본 발명에 따라 "비-pga" 병원체로 간주되는 병원체는 식별가능한 pga 유전자좌를 보유하지 않는다. 한 예로서, 이러한 병원체는, 염색체 DNA의 동일한 인접 스트레치에서 발생하고 AAC74106.1, AAC74107.1, AAC74108.1 및 AAC74109.1 하에 기탁된 뉴클레오티드 서열 4개 모두에 대해 적어도 25% 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하지 않을 수 있다. 비-pga PNAG-양성 병원체는 이. 콜라이, 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 비. 파라페르투시스(B. parapertussis), 비. 브론코셉티카(B. bronchoseptica), 부르크홀데리아 세노세파시아(Burkholderia cenocepacia), 비. 돌로사(B. dolosa), 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 아그레가티박터 악티노미세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 아시네토박터 바우만니이(Acinetobacter baumannii), 및 시겔라(Shigella) 속의 일부 균주를 배제한다.
비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 그람-음성 및 그람-양성 박테리아, 진균 및 기생충을 포함한다. 보다 구체적으로, 비-ica/pga PNAG-양성 박테리아는 그람-양성 코쿠스, 그람-양성 간균, 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스, 및 그람-음성 간균을 포함한다. 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스는 에스. 뉴모니아에, 군 A 스트렙토코쿠스 (스트렙토코쿠스 피오게네스), 군 B 스트렙토코쿠스 (스트렙토코쿠스 아갈락티아에), 군 C 스트렙토코쿠스 (스트렙토코쿠스 디사갈락티아에) 및 엔테로코쿠스 (이. 파에칼리스 및 이. 파에시움(E. faecium))를 포함한다. 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균은 리스테리아 모노시토게네스, 클로스트리디움 디피실레, 바실루스 서브틸리스, 미코박테리움 투베르쿨로시스 및 엠. 스메그마티스를 포함한다. 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스는 네이세리아 메닌기티데스, 네이세리아 고노레아에, 비피막형 에이치. 인플루엔자에, 헤모필루스 듀크레이, 헬리코박터 필로리 및 캄필로박터 제주니를 포함한다. 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균은 박테로이데스 프라길리스, 비. 세타이오타미크론, 비. 불가티스, 시트로박터 로덴티움, 비브리오 콜레라에, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움을 포함한다.
비-ica/pga PNAG-양성 진균은 칸디다 알비칸스 (효모), 칸디다 알비칸스 (균사), 아스페르길루스, 푸사리움 및 크립토코쿠스 종을 포함한다. 비-ica/pga PNAG-양성 기생충은 플라스모디움 베르게이 및 피. 팔시파룸을 포함한다.
비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 티. 바기날리스일 수 있다.
본 발명은 대상체에서 PNAG 폴리사카라이드에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위한 항원으로서의 PNAG 폴리사카라이드의 용도를 고려한다. 이러한 면역은 능동 면역으로서 본원에서 지칭된다. 대상체는 상기 비-ica/pga PNAG-양성 병원체 중 어느 하나로 인한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 것일 수 있다. 감염은 PNAG 폴리사카라이드의 사용을 통해 예방되거나 또는 치료될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 PNAG 폴리사카라이드에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위한 PNAG-특이적 항체 (또는 항체 단편)의 용도를 고려한다. 이러한 면역은 수동 면역으로서 본원에서 지칭된다. 대상체는 상기 비-ica/pga PNAG-양성 병원체 중 어느 하나로 인한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 것일 수 있다. 감염은 PNAG-특이적 항체 (또는 항체 단편)의 사용을 통해 예방되거나 또는 치료될 수 있다.
PNAG 및 dPNAG 폴리사카라이드
PNAG 폴리사카라이드는 폴리 N-아세틸 베타 (β) 1-6 글루코사민 (즉, 이것은 베타 (β) 1-6 연결에 의해 함께 연결되는 글루코사민 단량체 단위로 구성됨)이다. 아세틸 기는 존재하는 경우에 글루코사민 단량체에 (O-연결되는 것이 아니라) N-연결된다. PNAG는 하기 화학식의 구조를 갖는다.
Figure pct00005
상기 식에서, n은 정수이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택된다. "n"은 제한 없이 2-500의 범위일 수 있다.
PNAG는 시험관내 합성될 수 있거나 또는 자연 발생 공급원, 예컨대 예를 들어 새롭게 기재된 PNAG-양성 병원체로부터 단리될 수 있다. 그의 천연 형태에서, PNAG는 1-100%의 아세틸화 (즉, 여기서 R은 -NH-CO-CH3임) 범위를 갖는 형태의 혼합물로서 존재하고, 보다 고도의 아세틸화 형태 (즉, 50% 초과의 아세틸화를 갖는 것)가 보다 우세한 형태이다.
저 아세틸화 형태는 생체내 면역 자극 검정에서 보다 고도의 아세틸화 형태와 비교하여 고도로 면역원성이고 옵소닌 보호 항체를 보다 잘 도출할 수 있는 것으로 이전에 발견되었다. dPNAG 투여 후 도출된 항체는 dPNAG를 인식하고, 일부 경우에서는 PNAG의 고 아세틸화 형태도 인식한다. 이들 발견은 PNAG의 저 아세틸화 형태를 생체내 보호 면역 반응을 자극하기에 적합한 백신 후보로 만들었다. 그 결과, 본 발명은 대상체에서 능동 면역을 자극하기 위한 PNAG의 저 아세틸화 형태의 용도를 또한 고려한다. PNAG의 이러한 저 아세틸화 형태는 탈아세틸화 PNAG (또는 dPNAG)로서 본원에서 지칭된다. dPNAG는 R 기의 50% 미만이 -NH-CO-CH3인 것 (즉, 아미노 기의 50% 미만이 아세테이트로 치환됨)을 제외하고 상기에 나타낸 것과 동일한 구조를 갖는다. dPNAG는 완전히 또는 부분적으로 탈아세틸화될 수 있고, 단 아세틸화의 범위는 0 내지 50% 미만이다. 완전히 탈아세틸화된 dPNAG (즉, 여기서 오직 R=NH2임)는 단독중합체로서 본원에서 지칭될 수 있다. 부분적으로 탈아세틸화된 dPNAG (즉, 여기서 R은 -NH2 또는 -NH-CO-CH3일 수 있고, 단 R의 50% 미만은 -NH-CO-CH3임)는 이종중합체로서 본원에서 지칭될 수 있다. 예를 들어, R 기의 49% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만은 -NH-CO-CH3일 수 있다. 일부 경우에, 아세틸화의 수준은 40% 이하, 35% 이하, 20% 이하 또는 15% 이하이다.
본 발명은 다양한 적용에서의 PNAG의 고 아세틸화 형태 및 저 아세틸화 형태의 용도를 고려한다. 비-제한적 예로서, 고 아세틸화 PNAG는 진단제로서 또는 또 다른 비-치료 목적을 위해 사용되는 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 고 아세틸화 또는 저 아세틸화에 관계 없는 PNAG의 자연 발생 형태, 뿐만 아니라 PNAG의 합성 형태 (즉, 완전히 신생 제조된 것)의 용도를 고려한다. 인지되는 바와 같이, 이러한 합성 형태는 서로 β-1-6 연결된 공지된 수 및 서열의 글루코사민 및 N-아세틸 글루코사민 단위로 합성될 수 있다. 합성 형태는 일부 경우에서 4개의 단량체만큼 작을 수 있다.
공개된 미국 특허 출원 번호 US-2011-0150880은 합성 올리고사카라이드, 그의 합성 및 담체에 대한 그의 접합을 기재하고 있다. 상기 참고문헌의 특정한 전체 교시는 본원에 참조로 포함된다. 합성 올리고사카라이드는 일부 실시양태에서, 담체에 접합되어 사용될 수 있다. 예는
Figure pct00006
또는
Figure pct00007
인 링커를 통해 담체에 접합된 올리고사카라이드를 포함하는 올리고사카라이드-담체 접합체이고, 여기서 n은 1 초과이고, m은 1 내지 10으로부터 선택된 수이고, p는 1 내지 20으로부터 선택된 수이고, R은 H 또는 알킬 기이고, 링커는 올리고사카라이드에 O-연결되고 담체에 N-연결된다. "n"은 일부 실시양태에서, 2-10, 2-5, 또는 2, 3 또는 4일 수 있다.
또 다른 예는 O-연결된 링커를 보유하는 올리고사카라이드이고, 여기서 링커는
Figure pct00008
를 포함하고, 올리고사카라이드는 폴리글루코사민이다. 폴리글루코사민은, 예를 들어 2-20개 단량체 길이, 5-11개 단량체 길이인 β-1-6 연결된 글루코사민일 수 있다.
PNAG 및 dPNAG의 크기는 다양할 수 있고, 특정한 적용에 의해 지정될 수 있다. 전형적으로, PNAG 및 dPNAG 분자량은 약 900 달톤 (Da) 내지 750 킬로달톤 (kDa) 범위일 수 있다. 일부 측면에서, PNAG 또는 dPNAG는 2 kDa 미만의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PNAG 또는 dPNAG의 분자량은 적어도 약 2200 달톤, 또는 적어도 약 2500 달톤, 또는 적어도 약 3000 달톤일 수 있다. 일부 실시양태에서, PNAG 또는 dPNAG는 적어도 9개, 적어도 10개 단량체 단위 길이, 또는 적어도 12개 단량체 단위 길이, 또는 적어도 15개 단량체 단위 길이일 수 있다. 다른 측면에서, PNAG 또는 dPNAG는 적어도 100 kDa, 임의로는 100-500 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
본원에 보다 상세하게 논의된 바와 같이, PNAG 및 dPNAG의 보다 적은 분자량 버전을 포함하는 PNAG 및 dPNAG는 담체, 예컨대 운반 단백질에 접합될 수 있다. 담체에 접합되는 경우에, PNAG 및 dPNAG는 2-3개 단량체 단위만큼 작을 수 있지만, 바람직하게는 적어도 4-6개 단량체 단위 길이이다. 800 Da 내지 1,000 kDa의 폴리사카라이드가 전형적일 것이다. 이 크기의 PNAG 또는 dPNAG 형태는 본원에 기재된 바와 같이 신생 합성될 수 있다. 담체 화합물 없이 사용되는 경우에, PNAG 또는 dPNAG는 약 100 kDa 이상일 수 있다.
PNAG의 제조
본 발명은 dPNAG 및 PNAG의 자연 발생 및 합성 형태, 예컨대 본원에 기재된 비-ica/pga PNAG-발현 병원체로부터 단리되거나 또는 유도된 dPNAG 및 PNAG의 용도를 고려한다. 본원에 사용된 바와 같은 자연 발생 PNAG 또는 dPNAG는 자연 발생 공급원 중에 존재하고, 임의로 이로부터 단리되거나 또는 유도될 수 있는 것이다.
PNAG 및 dPNAG 항원은 단리된 형태로 제공되고/거나 사용될 수 있다. 단리된 폴리사카라이드, 예컨대 단리된 dPNAG는, 이것이 통상적으로 존재하거나 또는 합성된 환경으로부터 적어도 부분적으로 제거됨으로써 분리된 것이다. 일부 경우에, 단리된 폴리사카라이드는 구조적으로 또는 기능적으로 특성화되기에 충분하게 다른 화합물로부터 분리된다. 예를 들어, 단리된 폴리사카라이드는 그의 화학적 조성을 결정하기 위해 "서열분석"될 수 있다.
dPNAG는 천연 PNAG로부터 단리될 수 있거나 또는 본원에 기재된 탈아세틸화 방법을 사용하여 보다 고도의 아세틸화 자연 발생 PNAG로부터 유도될 수 있다. 시험관내 합성된 dPNAG는 또한 그의 합성 반응 혼합물로부터 단리될 수 있으며, 이로써 이것은 반응 기질, 효소, 보조-인자, 촉매 또는 허위 반응 생성물로부터 분리될 수 있다.
PNAG 및 dPNAG는 ica 유전자좌를 보유하는 임의의 미생물 (박테리아 포함) 균주로부터 제조될 수 있다. 이들 ica-보유 균주는 ica 유전자좌를 자연적으로 발현하는 것, 예컨대 비제한적으로 에스. 에피더미스(S. epidermis) 및 에스. 아우레우스를 포함한다. 구체적인 균주는 에스. 에피더미스 RP62A (ATCC 번호 35984), 에스. 에피더미스 RP12 (ATCC 번호 35983), 에스. 에피더미스 M187, 에스. 아우레우스 RN4220 (pCN27) 및 에스. 아우레우스 MN8 뮤코이드를 포함한다. ica-보유 균주는 또한 ica 유전자좌에서의 유전자로 형질전환시킨 것 (예를 들어, 에스. 카르노수스 TM300 (pCN27))을 포함한다.
천연 PNAG는 미생물 배양액, 예컨대 세포 및 세포 무함유 배양 상청액으로부터 조 천연 PNAG 제제를 추출하고, 조 PNAG 제제로부터 고분자량의 천연 PNAG-풍부 물질을 단리시키고, 고분자량의 PNAG-풍부 물질을 함유하는 불순한 PNAG를 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 수용액으로부터의 폴리사카라이드의 침전을 야기할 수 있는 것으로서 당업자에게 공지된 임의의 다른 유기 용매로 침전시킴으로써 먼저 획득하는 것을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 조 천연 PNAG 제제를 추출하고 불순한 천연 PNAG 제제를 단리시키고 침전시키는 단계는 당업계에 공지된 방법 및 공개된 미국 출원 번호 US-2005-0118198-A1에 기재된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
이어서, 상기 불순한 PNAG 물질을 정제하고 탈아세틸화하여 dPNAG를 생성할 수 있다. 탈아세틸화는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈아세틸화는, 일부 경우에 불순한 PNAG 제제를 염기 또는 산과 함께 인큐베이션하여 반-순수한 PNAG 제제를 생성하고, 제제를 중화시키고, 중화된 제제를 추가로 처리하여 dPNAG를 생성하는 것을 포함할 수 있다.
효소적 탈아세틸화는 전형적으로 불순한 PNAG를 생물학적 물질을 소화시키는 효소, 예컨대 박테리아 효소, 예컨대 세포벽 붕괴제, 예컨대 리소자임, 리소스타핀 및 프로테이나제 K, 및 뉴클레아제 효소, 예컨대 DNA 및 RNA를 소화시키는 DNase 및 RNase와 함께 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이어서, PNAG를 용액 외부로 침전시키는 용매를 첨가하고, 침전물을 수집하고, NaOH와 같은 염기 또는 HCl과 같은 산 중에 PNAG를 재-용해시킨 후 중화시킨다. 중화는 인큐베이션 단계가 산과 함께 수행되는 경우에는 염기를 사용하고, 인큐베이션 단계가 염기와 함께 수행되는 경우에는 산으로 달성될 수 있다. 이어서, 중성 물질로부터의 불용성 분획을, 예를 들어 플루오린화수소산 중에서 인큐베이션에 의해 처리하여 순수한 천연 PNAG 항원을 생성하거나 또는 pH < 4.0을 갖는 완충제 중에 재-용해시킨 후 분자체 및/또는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 처리한다.
또 다른 단리 방법은 배양액을 강염기 또는 산과 함께 인큐베이션함으로써 미생물 (박테리아 포함) 배양액으로부터 조 PNAG 현탁액을 추출하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 배양액을 적어도 2시간, 보다 바람직하게는 적어도 5, 10, 15, 18 또는 24시간 동안 강염기 또는 산 중에서 교반한다. 강염기 또는 산은 임의 유형의 강염기 또는 산일 수 있지만, 바람직하게는 적어도 1 M NaOH 또는 HCl의 농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 강염기 또는 산은 5 M NaOH 또는 5 M HCl이다. 이어서, 산 또는 염기 용액을 원심분리에 적용하여 세포체를 수집한다. 일부 실시양태에서는, 추출 절차를 수회 반복한다. 생성된 산 또는 염기 용액을 대략 pH 7로 중화시킨 다음, 투석하여 불용성의 불순한 PNAG를 생성한다.
dPNAG는 또한 신생 합성될 수 있다. dPNAG의 신생 합성 방법은 공개된 미국 특허 출원 번호 US-2005-0118198-A1 및 US-2011-0150880-A1에 기재되어 있다.
일부 방법은 출발 물질, 예컨대 비제한적으로 폴리글루코스 (즉, 덱스트란), 폴리글루코사민, 예컨대 키틴 또는 키토산, 폴리글루코사미노우론산으로부터 dPNAG를 유도할 수 있고, 폴리갈락토사미노우론산을 사용하여 본 발명의 dPNAG 항원을 생성할 수도 있다.
PNAG 및 dPNAG 제제는 다양한 순도의 것일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 순수한 PNAG 또는 dPNAG 제제는 92% 초과의 오염물 무함유인 PNAG 또는 dPNAG 제제이다. 이들 오염물은 갈락토스, 포스페이트, 테이코산 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, PNAG 및 dPNAG 조성물은 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 오염물 무함유이거나, 또는 100% 오염물 무함유이다. 일부 실시양태에서, dPNAG 조성물은 고 아세틸화 PNAG 무함유이다.
PNAG 또는 dPNAG 조성물의 순도의 정도는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 순도는 화학적 분석 검정 뿐만 아니라 물질의 구조적 측면을 검증하기 위한 기체 크로마토그래피 및 핵 자기 공명에 의해 평가될 수 있다.
담체
신생 합성되거나 또는 자연 발생 공급원으로부터 유도된 것에 관계 없이, PNAG 및 dPNAG는 접합되거나 또는 접합되지 않은 형태로 사용될 수 있다. 접합된 형태에서, PNAG 또는 dPNAG는 직접적으로 또는 링커를 통해 담체 (또는 본원에 상호교환적으로 사용된 용어로서의 담체 화합물)에 접합될 수 있다. 접합은 폴리사카라이드에서의 임의의 위치, 예컨대 그의 한쪽 또는 양쪽 단부에서 수행될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "담체"는 직접적으로 또는 링커의 사용을 통해 폴리사카라이드에 접합될 수 있는 화합물이다. 담체는 면역학적으로 활성 (즉, 면역원성)일 수 있거나 또는 불활성일 수 있다. 생체내 사용되는 경우에, 담체는 대상체에게 투여하기에 안전한 것이 이해되어야 한다.
담체는 단백질 또는 펩티드, 폴리사카라이드, 핵산, 또는 다른 중합체, 지질 및 소분자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 운반 단백질은, 예를 들어 혈장 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 이뮤노글로불린, 아포지단백질 및 트랜스페린; 박테리아 폴리펩티드, 예컨대 TRPLE, β-갈락토시다제, 폴리펩티드, 예컨대 헤르페스 gD 단백질, 알레르겐, 디프테리아 및 파상풍 톡소이드, 살모넬라 플라젤린, 헤모필루스 필린, 헤모필루스 15 kDa, 28-30kDa 및 40 kDa 막 단백질, 에스케리키아 콜라이, 열 표지 장독소 ltb, 콜레라 독소, 및 바이러스 단백질, 예컨대 로타바이러스 VP 및 호흡기 세포융합 바이러스 f 및 g 단백질을 포함한다.
면역화에 특히 유용할 수 있는 운반 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제를 포함한다. 면역화되는 대상체에서 면역원성인 임의의 다른 화합물이 담체로서 사용될 수 있다.
단백질에 폴리사카라이드를 접합시키기 위한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 폴리사카라이드는 활성화되거나 또는 달리 접합될 수 있게 개량되어야 한다 (즉, 적어도 하나의 모이어티가 단백질 또는 다른 분자에 공유적으로 결합할 수 있게 되어야 함). 이러한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 공개된 미국 특허 출원 번호 US-2005-0118198-A1 및 US-2011-0150880-A1 및 미국 특허 번호 4356170, 4663160, 4619828, 4808700, 4711779를 참조할 수 있다.
담체는 링커 또는 스페이서를 통해 PNAG 또는 dPNAG에 접합될 수 있다. 폴리사카라이드는 당업계에 공지된 임의의 수단, 예컨대 예를 들어 폴리사카라이드의 유리 환원 단부를 사용하여 스페이서 또는 링커와 공유 결합을 생성시킴으로써 링커 또는 스페이서에 커플링될 수 있다. 공유 결합은 PNAG 또는 dPNAG의 유리 환원 단부를 유리 1-아미노글리코시드로 전환시키고, 이를 후속적으로 아실화에 의해 스페이서에 공유적으로 연결시킴으로써 생성될 수 있다 (Lundquist et al., J. Carbohydrate Chem., 10:377 (1991)). 대안적으로, PNAG 또는 dPNAG는 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르를 스페이서 상의 활성화된 기로서 사용하여 스페이서에 공유적으로 연결될 수 있다 (Kochetkow, Carbohydrate Research, 146:C1 (1986)). PNAG 또는 dPNAG의 유리 환원 단부는 또한 아이오딘 및 수산화칼륨을 사용하여 락톤으로 전환될 수 있다 (Isebell et al., Methods of Carbohydrate Chemistry, Academic Press, New York (1962)). 락톤은 스페이서 또는 링커 상의 1급 아미노 기에 의해 스페이서에 공유적으로 연결될 수 있다. PNAG 또는 dPNAG의 유리 환원 단부는 또한 환원성 아미노화를 사용하여 링커 또는 스페이서에 공유적으로 연결될 수 있다.
항체
본 발명은 PNAG 및/또는 dPNAG에 결합하는 항체를 포함한다. 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. dPNAG에 결합하는 항체는 또한 고 아세틸화 형태의 PNAG의 형태에 결합할 수 있다. 항체는 임의로 담체에 접합되고/거나 아주반트와 함께 사용되는, dPNAG 또는 PNAG, 또는 글루코사민 또는 N-아세틸 글루코사민의 >3 모노사카라이드 단위로 구성된 합성 올리고사카라이드를 사용하여 제조될 수 있다. 항체는 비-ica/pga PNAG-양성 병원체 또는 ica-보유 또는 pga-보유 병원체로부터 유도된 PNAG 또는 dPNAG를 사용하여 생산될 수 있다.
폴리클로날 항체는 일반적으로 항원 및 아주반트의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 동물에서 발생된다. PNAG 또는 dPNAG 또는 접합된 합성 올리고사카라이드에 대한 폴리클로날 항체는, 단독으로 또는 아주반트와 조합하여, 접합되거나 또는 접합되지 않은 형태인 PNAG 또는 dPNAG 또는 접합된 형태인 합성 올리고사카라이드를 주사함으로써 생성될 수 있다. 이러한 폴리클로날을 제조하는 방법은 공개된 미국 특허 출원 번호 US-2005-0118198-A1에 기재되어 있다.
간략하게, dPNAG 또는 접합되거나 또는 접합되지 않은 형태의 dPNAG 또는 접합된 올리고사카라이드를 아주반트, 예컨대 프로인트(Freund) 불완전 아주반트와 조합하고 (예를 들어, 프로인트 1-3 부피 중 토끼 또는 마우스에 대한 접합체 100 μg), 다중 부위에서 피내로 주사한다. 대략 1개월 후에, 동물을 다중 부위에서 피하 주사에 의해 아주반트 중 항원 또는 항원 접합체의 원래의 양의 1/5 내지 1/10로 부스팅한다. 1 내지 2주 후에 동물을 채혈하고, 항체의 존재에 대해 혈청을 검정한다. 동물은 항체 역가 정체기까지 반복해서 부스팅할 수 있다. 동물은 아주반트와 함께 또는 이것 없이, PNAG 또는 dPNAG 또는 합성 올리고사카라이드 접합체 단독, PNAG 또는 dPNAG 접합체 또는 합성 올리고사카라이드 접합체, 또는 상이한 담체 화합물에 접합된 PNAG 또는 dPNAG, 또는 합성 올리고사카라이드 접합체로 부스팅할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부스트는 dPNAG가 아닌 PNAG를 포함할 수 있거나, 또는 dPNAG 및 PNAG의 혼합물을 함유할 수 있다.
폴리클로날 항체의 공급원을 공급하는 것 이외에, 면역화 동물은 PNAG-특이적 및 dPNAG-특이적 모노클로날 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 이뮤노글로불린의 균질 (즉, 단일 클론) 집단을 지칭한다. 모노클로날 항체는 동일한 Ig 유전자 재배열을 가지고 있고, 따라서 동일한 결합 특이성을 나타낸다. dPNAG 또는 합성 올리고사카라이드 접합체가 항체를 생성하는데 사용되는 경우에, 에피토프는 고 아세틸화 PNAG 뿐만 아니라 dPNAG에 존재할 수 있고, 따라서 dPNAG에 대해 발생된 항체는 PNAG에도 결합할 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 한 방법에서는, 면역화 동물로부터 단리된 비장 세포를 골수종 세포와의 융합 또는 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 형질전환에 의해 불멸화하고, 목적 항체를 발현하는 클론을 스크리닝하고 확인한다. 다른 방법은 재배열된 Ig 유전자 서열의 단리 및 불멸화 세포주로의 클로닝을 포함한다. 이러한 방법은 공개된 미국 특허 출원 번호 US-2005-0118198-A1 및 US-2011-0150880-A1에 매우 상세하게 기재되어 있고, 이러한 교시는 본원에 참조로 포함된다.
PNAG에 특이적인 항체는, 제한 없이, 뮤린, 인간 또는 키메라 항체, 예컨대 비제한적으로 인간화 항체일 수 있다.
인간 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 미국 특허 번호 5567610, 미국 특허 번호 5565354, 미국 특허 번호 5571893, 문헌 [Kozber, J. Immunol. 133: 3001 (1984), Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, new York, 1987), 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86-95 (1991)]에 개시되어 있는 것 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는 관심 항원 (예를 들어, dPNAG 또는 PNAG)에 대한 항체를 생산하는 인간의 혈액 또는 다른 조직으로부터 항체-생산 림프구를 회수함으로써 획득할 수 있다. 이들 림프구를 처리하여 실험실에서 적절한 배양 조건 하에 스스로 성장하는 세포를 생성할 수 있다. 세포 배양액을 관심 항원에 대한 항체의 생산에 대해 스크리닝한 다음 클로닝할 수 있다. 클론 배양액을 사용하여 dPNAG 또는 PNAG에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있거나, 또는 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 부분을 코딩하는 유전자 요소를 클로닝하고 다양한 유형의 항체의 생산을 위한 핵산 백터에 삽입할 수 있다. 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 통상의 방법 이외에, 이러한 항체는 또한 인간 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물을 면역화함으로써 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., PNAS USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)] 및 론버그(Lonberg)에게 허여된 미국 특허 번호 5569825).
본원에 사용된 바와 같은 "인간화 모노클로날 항체"는 비-인간 종으로부터의, 모노클로날 항체, 또는 적어도 인간 불변 영역 및 항원-결합 영역, 예컨대 1, 2 또는 3개의 CDR을 갖는 그의 기능적 활성 단편이다. 인간화 항체는 이것이 특이적으로 관심 항원을 인식하지만, 인간에서 항체 자체에 대한 면역 반응을 유발하지 않을 것이라는 점에서 특정한 임상적 유용성을 갖는다. 예로서, 뮤린 CDR을 인간 항체의 프레임워크 영역 내에 이식하여 인간화 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [L. Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988); M. S. Neuberger et al., Nature 314, 268 (1985)] 및 EPA 0 239 400을 참조한다. 대안적으로, 인간화 모노클로날 항체는 본래 항체의 에피토프 특이성을 유지하면서 비-인간 항체의 비-CDR 영역을 인간 항체의 유사한 영역으로 대체함으로써 구축될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 CDR 및 임의로 프레임워크 영역의 일부를 인간 FR 및/또는 Fc/pFc' 영역에 공유적으로 결합하여 기능적 항체를 생산할 수 있다. 특이적 뮤린 항체 영역으로부터 인간화 항체를 합성하는 미국 내 상업적 독립체, 예컨대 프로테인 디자인 랩스(Protein Design Labs) (마운틴 뷰 캘리포니아(Mountain View California)), 아브게닉스(Abgenix) 및 메다렉스(Medarex)가 존재한다. 또한, EP 특허 출원 번호 0239400을 참조할 수 있다.
항원-결합 항체 단편이 또한 본 발명에 의해 포함된다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 단지 항체 분자의 작은 부분인 파라토프가 항체의 그의 에피토프에 대한 결합에 관여한다 (일반적으로 문헌 [Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford] 참조). 예를 들어, 항체의 pFc' 및 Fc 영역은 보체 캐스캐이드의 이펙터이지만, 항원 결합에는 관여하지 않는다. F(ab')2 단편으로 지정된, pFc' 영역이 효소적으로 절단된 항체, 또는 pFc' 영역 없이 생산된 항체는 무손상 항체의 항원 결합 부위 둘 다를 보유한다. 단리된 F(ab')2 단편은 그의 2개의 항원 결합 부위 때문에 2가 모노클로날 단편으로서 지칭된다. 유사하게, Fab 단편으로 지정된, Fc 영역이 효소적으로 절단된 항체, 또는 Fc 영역 없이 생산된 항체는 무손상 항체 분자의 항원 결합 부위 중 하나를 보유한다. 더 나아가, Fab 단편은 공유적으로 결합된 항체 경쇄 및 Fd (중쇄 가변 영역)로 나타낸 항체 중쇄의 일부로 이루어진다. Fd 단편은 항체 특이성의 주요 결정기이고 (단일 Fd 단편은 항체 특이성의 변경 없이 10개 이하의 상이한 경쇄와 회합될 수 있음), Fd 단편은 단리 시 에피토프-결합능을 보유한다.
용어 Fab, Fc, pFc', F(ab')2 및 Fv는 표준 면역학적 의미로 사용된다 [Klein, Immunology (John Wiley, New York, NY, 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)]. 익히 공지되어 있는 기능적 활성 항체 단편은 항체의 F(ab')2, Fab, Fv 및 Fd 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 무손상 항체의 Fc 단편이 결여된 이들 단편은 순환으로부터 보다 신속하게 제거되며, 무손상 항체보다 적은 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다 (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). 예를 들어, 단일-쇄 항체는 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 방법에 따라 구축될 수 있다. 이러한 단일-쇄 항체는 유동성 링커 잔기에 의해 결합된 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 또한, 단리된 가변 중쇄 단일 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체 ("Fd")를 획득하는 방법이 보고되어 있다 (예를 들어, 단리된 형태에서 그의 표적 에피토프에 충분한 친화도로 결합하는 항체 중쇄 가변 영역 (VH 단일 도메인 항체)을 확인하는 스크리닝 방법을 개시하고 있는 문헌 [Ward et al., Nature 341:644-646 (1989)] 참조). 공지된 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 기반으로 재조합 Fv 단편을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 4,462,334 (Moore et al.)에 기재되어 있다. 항체 단편의 사용 및 생성을 기재하고 있는 다른 문헌은, 예를 들어 Fab 단편에 관한 문헌 (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)), Fv 단편에 관한 문헌 (Hochman et al., Biochemistry 12: 1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15: 1591 (1976); 미국 특허 번호 4,355,023 (Ehrilch et al.)) 및 항체 분자의 일부에 관한 문헌 (미국 특허 번호 4,470,925 (Audilore-Hargreaves))을 포함한다. 따라서, 당업자는 dPNAG 에피토프에 대한 항체의 특이성을 파괴하지 않으면서 무손상 항체의 다양한 부분으로부터 항체 단편을 구축할 수 있다. 항-dPNAG 항체에 의해 인식되는 에피토프는 고 아세틸화 PNAG 상에도 존재할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
용도
본 발명의 폴리사카라이드, 합성 올리고사카라이드 및 항체는 여러가지 다양한 적용, 예컨대 시험관내, 계내 및 생체내 적용에 유용하다. 폴리사카라이드 및 합성 올리고사카라이드는 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위해 대상체를 생체내 면역화시키는데 사용될 수 있다. 폴리사카라이드 및 합성 올리고사카라이드는 또한 PNAG- 또는 dPNAG-특이적 항체를 발생시키는데 사용될 수 있고, 이는 다시 대상체를 생체내 면역화시켜 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 유도된 PNAG 및/또는 dPNAG는 결합 파트너, 예컨대 항체에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 PNAG-발현 병원체를 검출, 예컨대 대상체에서의 감염을 검출 (즉, 진단)하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 PNAG 및 dPNAG에 결합하는 항체를 생성하는 방법을 제공한다.
비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 유도된 PNAG 및/또는 dPNAG는 ica 유전자좌를 보유하는 것 및 보유하지 않는 것을 포함하는, 임의의 PNAG-발현 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체에서 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. "비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 유도된 PNAG 및/또는 dPNAG"는 본원에 기재된 방법을 사용하여 비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 생산된 폴리사카라이드를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 면역 반응 유도는 감염을 예방할 수 있거나 또는 부분적으로 또는 완전히 치료할 수 있다. 감염의 부분적인 치료는 증상의 중증도 또는 빈도의 감소 및/또는 대상체에서의 병원체 부하의 부분적인 감소를 포함할 수 있다. 부분적인 치료는 대상체가 1종 이상의 다른 치료제를 투여받았거나 또는 투여받을 경우에 유용할 수 있다. 면역 반응 유도는 PNAG 또는 dPNAG (또는 PNAG를 발현하는 병원체)에 대한 면역 반응, 예컨대 항체 반응을 유도하기 위한 유효량의 PNAG 또는 dPNAG 또는 그의 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여함으로써 달성된다.
본원에 사용된 바와 같은 대상체는 온혈 포유동물이고, 예를 들어 인간, 영장류, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 개 및 고양이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-설치류 대상체다. 비-설치류 대상체는, 상기에 정의된 바와 같지만, 구체적으로 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 토끼를 배제한 임의의 대상체이다. 일부 실시양태에서, 바람직한 대상체는 인간이다.
대상체는 PNAG-발현 병원체가 ica-유전자좌를 보유하든지 아니든지에 관계 없이 이러한 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체일 수 있다. PNAG-발현 병원체에 의한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체는 이러한 병원체에 노출될 위험이 있을 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 다수의 비-ica/pga PNAG-양성 병원체는 1종 이상의 항생제 부류에 대해 내성이다. 따라서, 이러한 병원체는 항생제의 사용을 통해 이전 대상체에서 박멸되지 않았을 것이기 때문에 이것에 대한 노출이 발생할 가능성이 있다. 감염이 발생할 위험이 있는 집단은, 예를 들어 신생아 대상체, 면역손상 대상체 (예컨대, 화학요법을 받은 대상체), 면역억제제를 사용하는 대상체 (이식 수용자 포함), 투석 중인 대상체, 고위험의 수술을 받은 대상체, 및 유치 의료 장치, 예컨대 정맥내 관 (예를 들어, 중심 관) 또는 보철물 (예를 들어, 고관절 또는 슬관절 치환술 보철물)을 갖는 대상체를 포함한다.
단백질 담체에 접합된 PNAG 또는 dPNAG 및 합성 올리고사카라이드는 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 유효량은, 예를 들어 PNAG 및/또는 dPNAG에 특이적인 항체의 생산을 유도하는 것, 기억 세포의 생산을 유도하는 것, 및 가능하게는 세포독성 림프구 반응 등에 의해 대상체가 그의 자체의 면역 보호를 생성하는 것을 보조하는데 충분한 양일 수 있다. 면역 반응은 다시 이러한 병원체에 노출된 대상체에서 PNAG-발현 병원체에 의한 감염이 발생하는 것을 예방할 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 방법에 의해서 PNAG 또는 dPNAG 또는 합성 올리고사카라이드 접합 백신의 양이 능동 면역을 유도하기에 충분한지를 평가할 수 있다. 예를 들어, 포유동물에서 PNAG-특이적 항체를 생산하는 PNAG 또는 dPNAG 또는 합성 올리고사카라이드 접합 백신의 능력을 PNAG 항원을 사용하여 마우스 또는 다른 대상체에서 생산된 항체를 스크리닝함으로써 평가할 수 있다. 면역 반응을 유도하기 위한 PNAG 또는 dPNAG의 양은 약 1 내지 100 μg 범위일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
PNAG 및/또는 dPNAG에 특이적인 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어 PNAG-발현 병원체, 예컨대 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 노출될 위험이 있는 대상체에서 전신 감염의 발생을 예방함으로써 대상체에서 수동 면역화를 유도하는데 유용하다. 감염에 대한 수동 면역을 유도하는 방법은 대상체에게 PNAG 또는 PNAG-발현 병원체, 예컨대 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량의 PNAG 및/또는 dPNAG 또는 합성 올리고사카라이드에 특이적인 항체를 투여하는 것을 포함한다.
항체 또는 항체 단편은 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염이 발생할 위험이 있는 임의의 대상체에게 투여될 수 있고, 일부 실시양태에서는 PNAG 및/또는 dPNAG에 대한 능동 면역을 유도할 수 없는 대상체에 특히 적합할 수 있다. PNAG 또는 dPNAG 또는 합성 올리고사카라이드 접합 백신은 특정 대상체에서는 감염을 예방 또는 제거하는데 완전히 효과적이지 않을 수도 있고, 따라서 이러한 대상체는 PNAG 및/또는 dPNAG에 특이적인 항체로의 치료로부터 이익을 얻을 수 있다. 면역 반응을 유도할 수 없는 대상체는 면역손상 대상체 (예를 들어, 화학요법을 받은 대상체, AIDS를 앓고 있는 대상체 등) 또는 아직 면역계가 발달되지 않은 대상체 (예를 들어, 조산 신생아)를 포함한다.
항체 또는 항체 단편은 PNAG 또는 PNAG-발현 병원체, 예컨대 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량으로 대상체에게 투여된다. 본원에 사용된 바와 같은 면역 반응을 유도하기 위한 유효량의 항체 또는 항체 단편은 (i) 병원체에 노출된 대상체에서 그에 의한 감염이 발생하는 것의 예방; (ii) 감염 발달의 억제, 즉 이의 발달의 정지 또는 둔화; 및/또는 (iii) 감염의 경감, 즉 감염된 대상체에서의 미생물의 박멸에 충분한 양의 항체 또는 항체 단편이다. 미생물은 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충 등을 포함한다.
당업자에게 공지된 절차를 사용하여, 항체 또는 항체 단편의 양이 항체의 옵소닌화 정도를 예측하는 시험관내 옵소닌화 검정에서의 유효량인지 결정할 수 있다. 미생물, 예컨대 박테리아를 옵소닌화하는 항체는 미생물의 샘플에 첨가되는 경우에 미생물의 식세포작용을 야기하는 것이다. 옵소닌화 검정은 비색 검정, 화학발광 검정, 형광 또는 방사성표지 흡수 검정, 세포 매개 세포독성 검정, 또는 물질의 옵소닌성 잠재력을 측정하는 다른 검정일 수 있다.
제약 조성물 및 제제
일반적으로, 생체내 투여되는 경우에, 본 발명의 폴리사카라이드, 항체 및 항체 단편은 제약상 허용되는 조성물로 적용된다. 이러한 조성물은 제약상 허용되는 담체, 염, 완충제, 보존제, 아주반트, 및 임의로 다른 예방적 또는 치료적 성분을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 인간 또는 다른 동물에 투여하기에 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 제약상 허용되는 담체의 맥락에서, 용어 "담체"는 폴리사카라이드, 항체 또는 항체 단편과 조합되어 투여를 비롯한 사용을 용이하게 하는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 제약 조성물의 성분은 또한 목적한 제약 효율을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 존재하지 않는 방식으로 폴리사카라이드, 항체 또는 항체 단편, 및 서로와 혼합될 수 있어야 한다.
제약상 허용되는 염은 하기 산: 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산 및 벤젠 술폰산으로부터 제조된 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 제약상 허용되는 염은 카르복실산 기의 알칼리 금속 또는 알칼리 토류 염, 예컨대 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다.
적합한 완충제는 아세트산과 염 (1-2% W/V); 시트르산과 염 (1-3% W/V); 붕산과 염 (0.5-2.5% W/V); 및 인산과 염 (0.8-2% W/V)을 포함한다. 적합한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03% W/V); 클로로부탄올 (0.3-0.9% W/V); 파라벤 (0.01-0.25% W/V) 및 티메로살 (0.004-0.02% W/V)을 포함한다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 전형적으로 폴리사카라이드, 항체 또는 항체 단편의 멸균 수성 제제를 포함하고, 이는 수용자 대상체의 혈액과 등장성일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해, 합성 모노 또는 디-글리세리드를 비롯한 임의의 무자극성 고정 오일이 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산이 주사제의 제조에 사용된다. 피하, 근육내, 복강내, 정맥내 등의 투여에 적합한 담체 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 찾아볼 수 있다.
폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 항체 및 항체 단편은 유효량으로 투여된다. 투여 방식에 따라 1-100 μg 범위의 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드 용량이 유효할 수 있다. 투여 방식에 따라 0.1-100 mg/kg 및 0.1-20 mg/kg 범위의 항체 또는 항체 단편 용량이 유효할 수 있다. 절대량은, 투여가 아직 미생물에 감염되지 않은 고위험 대상체에서 수행되는지 또는 이미 감염을 앓고 있는 대상체에서 수행되는지의 여부, 공동 치료, 투여 횟수, 및 연령, 신체적 상태, 체구 및 체중을 비롯한 개별 환자 파라미터를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 것이다. 이들은 당업자에게 익히 공지된 인자이며, 단지 일상적인 실험으로 다루어질 수 있다. 일반적으로, 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량을 사용하는 것이 바람직하다.
다중 용량의 폴리사카라이드, 항체 및/또는 항체 단편이 고려된다. 일반적으로, 면역화 계획은 높은 용량의 항원 투여에 이어지는, 수 주의 대기 기간 후의 보다 낮은 용량의 후속적인 항원 투여를 포함한다. 추가의 용량을 또한 투여할 수도 있다. 수동 면역화에 대한 투여 일정은 필요한 경우 보다 빈번한 투여에 의해 매우 상이할 것이다. 미생물 감염에 대한 증진된 면역 반응 및/또는 감염으로부터의 후속적인 예방을 유발하는 임의의 요법을 사용할 수 있다. 다중 용량의 특정한 항원의 전달에 바람직한 시간 간격은 단지 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 백신 용량은 임의로는 동등한 시간 간격의 용량으로, 1 내지 6개월의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 항체 및 항체 단편에 대해, 투여 간격은 일반적으로 14-180일 범위이다.
다양한 투여 경로가 이용가능하다. 선택된 특정한 방식은, 예를 들어 치료할 특정한 상태 및 치료 효능에 필요한 투여량에 좌우될 것이다. 일반적으로 말해서, 본 발명의 방법은 임상적으로 허용되지 않는 부작용을 야기하지 않고 유효 수준의 면역 반응을 생성하는 임의의 방식을 의미하는, 의학적으로 허용되는 임의의 투여 방식을 사용하여 실행될 수 있다. 바람직한 투여 방식은 비경구 경로이다. 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 복강내 및 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 다른 경로는 경구, 비내, 피부, 설하 및 국부를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
다른 전달 시스템은 지효성 방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 본 발명의 폴리사카라이드의 반복 투여를 회피하여 대상체 및 의사에 대한 편의성을 증가시킬 수 있다. 다수의 유형의 방출 전달 시스템이 입수가능하며, 당업자에게 공지되어 있다. 이는 중합체 기반 시스템, 예컨대 폴리락트산 및 폴리글리콜산, 폴리무수물 및 폴리카프로락톤; 지질, 예컨대 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리글리세리드인 비중합체 시스템; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅, 통상적인 결합제 및 부형제를 사용한 압축 정제, 부분적으로 융합된 이식물 등을 포함한다. 구체적 예는 (a) 미국 특허 번호 4,452,775 (Kent); 4,667,014 (Nestor et al.); 및 4,748,034 및 5,239,660 (Leonard)에서 밝혀진, 폴리사카라이드가 매트릭스 내의 형태로 함유되는 것인 부식 시스템 및 (b) 미국 특허 번호 3,832,253 (Higuchi et al.) 및 3,854,480 (Zaffaroni)에서 밝혀진, 활성 성분이 중합체를 통해 제어된 속도로 침투되는 것인 확산 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있고, 그 중 일부는 이식에 적합화되어 있다.
이차 작용제
dPNAG 및/또는 PNAG-특이적 항체는 다른 작용제와 함께 전달될 수 있다. 다른 작용제(들)의 특성은 dPNAG-특이적 항체가 투여되는지 또는 PNAG-특이적 항체가 투여되는지에 좌우될 수 있다.
예를 들어, 능동 면역을 유도하고/거나 항체를 생산하기 위해 투여되는 경우에, dPNAG는 아주반트와 함께 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 아주반트는 항원-특이적 면역 반응을 강화시키기 위해 항원 (예컨대, dPNAG)과 함께 (동시에, 동일한 제제로 등 포함) 투여되는 물질을 지칭한다. 아주반트는 알루미늄 화합물, 예를 들어 겔, 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 및 프로인트 완전 또는 불완전 아주반트 (예를 들어, 여기서 dPNAG 항원은 파라핀 오일 에멀젼 중 안정화된 물의 수성 상에 혼입됨)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 파라핀 오일은 상이한 유형의 오일, 예를 들어 스쿠알렌 또는 땅콩 오일로 대체할 수 있다. 아주반트 특성을 갖는 다른 물질은 BCG (약독화 미코박테리움 투베르쿨로시스), 인산칼슘, 레바미솔, 이소프리노신, 다가음이온 (예를 들어, 폴리 A:U), 렌티난, 백일해 독소, 지질 A, 사포닌, QS-21 및 펩티드, 예를 들어 뮤라밀 디펩티드를 포함한다. 희토류 염, 예를 들어 란타넘 및 세륨 또한 아주반트로서 사용될 수 있다. 아주반트의 양은 대상체 및 사용되는 특정한 dPNAG 항원 (예를 들어, 아세테이트 치환의 수준)에 좌우되고, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
작용제는 항미생물제, 예컨대 항박테리아제, 항바이러스제, 항기생충제, 항진균제 등일 수 있다.
작용제는 항박테리아 약물 (예를 들어, 항생제), 또 다른 박테리아 항원, 또는 또 다른 항박테리아 항체, 또는 그의 혼합물 또는 조합물일 수 있다. 박테리아 감염의 치료에서의 항생제의 사용은 일상적이다. 능동 면역화를 유도하기 위한 항원 및 수동 면역화를 유도하기 위한 항체의 사용 또한 일상적이다. 상기 실시양태에서, 통상의 투여 비히클 (예를 들어, 정제, 임플란트, 주사액 등)은 본 발명의 활성제 및 항생제 및/또는 다른 항원 및/또는 다른 항체 둘 다를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항생제 및/또는 다른 항원 및/또는 다른 항체는 개별적으로 투여될 수 있다. 항생제는 dPNAG 또는 항-dPNAG 항체에 접합될 수 있다.
항박테리아 항생제 약물은 익히 공지되어 있고, 제한 없이, 페니실린 G, 페니실린 V, 암피실린, 아목시실린, 바캄피실린, 시클라실린, 에피실린, 헤타실린, 피밤피실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 카르베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 피페라실린, 암디노실린, 세팔렉신, 세프라딘, 세파드록실, 세파클로르, 세파졸린, 세푸록심 악세틸, 세파만돌, 세포니시드, 세폭시틴, 세포탁심, 세프티족심, 세프메녹심, 세프트리악손, 목사락탐, 세포테탄, 세포페라존, 세프타지딤, 이미페넴, 클라불라네이트, 티멘틴, 술박탐, 네오마이신, 에리트로마이신, 메트로니다졸, 클로람페니콜, 클린다마이신, 린코마이신, 반코마이신, 트리메토프림-술파메톡사졸, 아미노글리코시드, 퀴놀론, 테트라시클린 및 리팜핀을 포함한다 (문헌 [Goodman and Gilman's, Pharmacological Basics of Therapeutics, 8th Ed., 1993, McGraw Hill Inc.] 참조).
폴리사카라이드 항원 (PNAG 및 dPNAG 이외의 것) 및 폴리사카라이드-특이적 항체 (PNAG-특이적 항체 이외의 것)는 당업계에 공지되어 있다. 예는 살모넬라 티피 피막 Vi 항원 (Szu, S.C., X. Li, A.L. Stone and J.B. Robbins, Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide, Infection and Immunity. 59:4555-4561 (1991)); 이. 콜라이 K5 피막 (Vann, W., M.A. Schmidt, B. Jann and K. Jann, The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigen) of urinary tract infective Escherichia coli, 010:K5:H4. A polymer similar to desulfo-heparin, European Journal of Biochemistry. 116: 359-364, (1981)); 스타필로코쿠스 아우레우스 유형 5 피막 (Fournier, J.-M., K. Hannon, M. Moreau, W.W. Karakawa and W.F. Vann, Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. (Paris). 138: 561-567, (1987)); 리조비움 멜리로리(Rhizobium melilori) 엑스폴리사카라이드 II (Glazebrook, J. and G.C. Walker, a novel expolysaccharide can function in place of the calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti, Cell. 65:661-672 (1989)); 군 B 스트렙토코쿠스 유형 III (Wessels, M.R., V. Pozsgay, D.L. Kasper and H. J. Jennings, Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III Group B Streptococcus, Journal of Biological Chemistry. 262:8262-8267 (1987)); 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 피셔 7 O-특이적 측쇄 (Knirel, Y.A., N.A. Paramonov, E.V. Vinogradov, A.S. Shashkow, B.A. N.K. Kochetkov, E.S. Stanislavsky and E.V. Kholodkova, Somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa The structure of O-specific polysaccharide chains of lipopolysaccharides of P. aeruginosa O3 (Lanyi), 025 (Wokatsch) and Fisher immunotypes 3 and 7, European Journal of Biochemistry. 167:549, (1987)); 시겔라 손네이(Shigella sonnei) O-특이적 측쇄 (Kenne, L., B. Lindberg and K. Petersson, Structural studies of the O-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide, Carbohydrate Research. 78:119-126, (1980)); 에스. 뉴모니아에 유형 I 피막 (Lindberg, B., Lindqvist, B., Lonngren, J., Powell, D.A., Structural studies of the capsular polysaccharide from S. pneumoniae type 1, Carbohydrate Research. 78:111-117 (1980)); 및 에스. 뉴모니아에 군 항원 (Jennings, H.J., C. Lugowski and N. M. Young, Structure of the complex polysaccharide C-substance from S. pneumoniae type 1, Biochemistry. 19:4712-4719 (1980))을 포함한다. 다른 비-폴리펩티드 항원 및 비-폴리사카라이드 특이적 항체는 당업자에게 공지되어 있고, 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있다.
검출 및 진단 검정
dPNAG 및 합성 올리고사카라이드 항원 및 이에 대한 항체는 또한 대상체 또는 샘플의 면역학적 상태를 결정하기 위한 진단 검정에 유용하거나, 또는 면역검정에서 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 샘플에서 표면 상에 PNAG를 갖는 미생물, 예컨대 박테리아의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 미생물이 샘플에 존재하는 경우에, 항체는 감염된 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 항체는 또한 PNAG 항원의 존재에 대해 미생물을 스크리닝하고, 복합 혼합물로부터 dPNAG 또는 PNAG 항원 및 dPNAG 또는 PNAG 항원을 함유하는 미생물을 단리시키는데 사용될 수 있다.
상기 기재된 검정 및 당업계에 공지된 임의의 다른 검정은 dPNAG 또는 항체를 표지하고/거나 불용성 매트릭스 상에 dPNAG 또는 항체를 고정화함으로써 달성될 수 있다. dPNAG 및/또는 그의 항체를 사용하기 위한 분석 및 진단 방법은 하기 시약: 표지된 분석물 유사체, 고정화된 분석물 유사체, 표지된 결합 파트너, 고정화된 결합 파트너 및 입체 접합체 중 적어도 하나를 사용한다. 사용된 표지는 분석물 및 그의 결합 파트너의 결합을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기일 수 있다. 다수의 표지가 면역검정에서의 이러한 사용에 대해 공지되어 있다. 예를 들어, 직접적으로 검출될 수 있는 화합물, 예컨대 형광색소, 화학발광 및 방사성 표지, 뿐만 아니라 반응 또는 유도체화를 통해 검출될 수 있는 화합물, 예컨대 효소가 있다. 표지의 이들 유형의 예는 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I 방사성동위원소, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예컨대 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라빈디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예컨대 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 포함한다. 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제를 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴 아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지 및 안정한 자유 라디칼과 커플링시켰다.
표지는 당업자에게 공지된 방법에 의해 dPNAG 또는 항-dPNAG 항체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,940,475 및 3,645,090은 항체에 대한 형광단 및 효소의 접합을 설명한다. 통상적으로 항원 및 항체와 함께 사용되는 것으로 보고되어 있고, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 검정은 경쟁 및 샌드위치 검정을 포함한다.
하기 실시예는 예시의 목적으로 포함되며, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1: 다양한 미생물 종에 의한 박테리아 표면 폴리사카라이드 폴리-N-아세틸 글루코사민 (PNAG)의 발현.
항체의 직접 결합: 20℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 24-72시간 동안 대기중 산소 조건 (21% O2), 5% CO2 또는 혐기성 조건 하에 PNAG 생산을 촉진하기 위한 다양한 배지 중에서 유기체를 성장시켰다. 플레이트로부터의 세포는 PBS (포스페이트-완충 염수)에 직접 현탁시킨 반면, 브로쓰 중의 것은 세척하여 PBS 중에 재현탁시켰다.
샘플을 슬라이드 상에 두고, 이어서 1분 동안 메탄올 고정을 수행하였다. 샘플을 4℃에서 밤새 4uM 사이토(Syto) 83과 함께 0.5% BSA를 함유하는 PBS 중 알렉사플루오르(Alexafluor) 488 (AF488)에 직접 접합된 MAb F429 (음성 대조군, 슈도모나스 아에루기노사 알기네이트 항원에 특이적인 인간 IgG1) (1.63 mg/ml 원액의 1:313 희석물, 최종 농도 5.2 ug/ml)와 또는 AF488에 직접 접합된 MAb F598 (PNAG에 특이적인 인간 IgG1) (4.35 mg/ml 원액의 1:833 희석물, 최종 농도 5.2 ug/ml)과 함께 추가로 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS로 세척하고, 공초점 분석을 위해 1.5 커버-글래스를 올렸다.
PNAG에 대한 MAb F598 결합의 특이성: 20℃ 내지 37℃ 범위의 온도에서 24-72시간 동안 대기중 산소 조건 (21% O2), 5% CO2 또는 혐기성 조건 하에 PNAG 생산을 촉진하기 위한 다양한 배지 중에서 유기체를 성장시켰다. 플레이트로부터의 박테리아 세포는 TBS (트리스(tris)-완충 염수, pH 6.5) 중에 직접 현탁시킨 반면, 브로쓰 중의 것은 세척하여 TBS 중에 재현탁시켰다.
일반적으로는, 샘플을 키티나제, 디스퍼신(Dispersin) B 또는 퍼아이오데이트로 처리한 다음, MAb F598에 노출시켰다. TBS pH 6.5 중의 샘플을 37℃에서 24시간 동안 (a) 50 μg/ml 키티나제 (음성 대조군), (b) 디스퍼신 B (PNAG를 소화시킴)와 함께 인큐베이션하거나, 또는 37℃에서 2시간 동안 (c) 0.4 M 퍼아이오데이트와 함께 인큐베이션하였다. PNAG는 퍼아이오데이트에 의해 절단되었고, 디스퍼신 B에 의해 소화되었으며, 키티나제에 의해서는 영향을 받지 않았다. 이어서, 세포를 PNAG에 대한 인간 IgG 모노클로날 항체 (MAb) 또는 무관한 항원-슈도모나스 아에루기노사 알기네이트에 대한 IgG1 MAb (MAb F429) (음성 대조군, 슈도모나스 아에루기노사 알기네이트 항원에 특이적인 인간 IgG1)와 반응시켰다. 무관한 항원에 대한 항체는 PNAG에 결합해서는 안 된다.
구체적으로는, 샘플을 세척하고, 10 μl의 분취액을 유리 슬라이드 상에서 공기-건조시키고, 이어서 1분 동안 메탄올 고정을 수행하였다. 4℃에서 밤새 4 μM 사이토 83 (DNA를 적색으로 염색시킴)과 함께 0.5% BSA를 함유하는 PBS 중에서, MAb F429 (음성 대조군)를 AF488에 직접 접합시키고 (1.63 mg/ml 원액의 1:313 희석물, 최종 농도 5.2 μg/ml), MAb F598 (항-PNAG, 로트 2)을 AF488에 직접 접합시켰다 (4.35 mg/ml 원액의 1:833 희석물, 최종 농도 5.2 ug/ml). 샘플을 PBS로 세척하고, 공초점 분석을 위해 유리 슬라이드 상에 1.5 커버글래스를 올렸다.
<표 1>
Figure pct00009
Figure pct00010
ND = 수행하지 않음.
또한, 키티나제-저항성이며 디스퍼신 B-감수성인 PNAG는 에스. 뉴모니아에 중이염을 앓는 소아로부터의 중이 삼출액 (MEF)의 샘플 및 비피막형 에이치. 인플루엔자에 중이염을 앓는 소아로부터의 2개의 MEF 샘플 내 감염 박테리아 상에서 검출되었다. 또한, 동일한 감염 박테리아는 에스. 뉴모니아에 또는 에이치. 인플루엔자에-특이적 항체로 염색되었다. PNAG는 또한 엠. 투베르쿨로시스-감염된 환자로부터의 폐 조직에서 검출되었다. 실험적으로 에스. 뉴모니아에 혈청군 19A로 감염시킨 친칠라로부터의 비인두 유체에서, 혈청군 19A 피막과 키티나제-저항성이며 디스퍼신 B-감수성인 PNAG 항원의 공동-국재화가 용이하게 관찰될 수 있었다. 실험적으로 씨. 로덴티움으로 감염시킨 마우스의 위장관에서는, 상피 세포와 연관된 미생물 주위에서 PNAG가 검출되었다. 씨. 알비칸스 각막염을 앓는 마우스로부터의 안구 조직에서는, 진균 세포의 DNA-양성 부분 상에서 PNAG가 검출되었다.
또한, 공초점 현미경 분석에서 MAb F598과는 반응하지만 MAb F429와는 반응하지 않는 박테리아 균주는 비브리오 콜레라에 2R1 및 비브리오 콜레라에 0395를 포함한다.
PNAG에 대한 폴리클로날 토끼 항체와는 반응하지만 정상 토끼 혈청과는 반응하지 않는 박테리아 균주는 박테로이데스 세타이오타미크론 및 박테로이데스 불가티스를 포함한다.
실시예 2: GI관 내 씨. 로덴티움.
샘플을 4℃에서 밤새 4 μM 사이토 83 (핵 염색용)과 함께 0.5% BSA를 함유하는 PBS 중 AF488에 직접 접합된 MAb F429 (음성 대조군, 피. 아에루기노사 알기네이트 항원에 특이적인 인간 IgG1) (1.63 mg/ml 원액의 1:313 희석물, 최종 농도 5.2 ug/ml)와 또는 AF488에 직접 접합된 MAb F598 (PNAG에 특이적인 인간 IgG1) (4.35 mg/ml 원액의 1:833 희석물, 최종 농도 5.2 ug/ml)과 반응시켰다. 샘플을 PBS로 세척하고, 공초점 분석을 위해 1.5 커버-글래스를 올렸다.
결과는 감염된 마우스의 GI관 내 씨. 로덴티움 콜로니에서의 PNAG의 존재를 F598 항체의 사용에 의해 나타내었다. MAb F429는 상기 콜로니를 염색시키지 않았으며, 이는 F598 MAb에 의한 염색의 특이성을 확인시켜 준다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 3: 귀 및 비강 세척액 내 에스. 뉴모니아에.
본 실시예는 중이염을 앓는 친칠라의 귀 및 비강 세척액 내 피막 유형 19A의 에스. 뉴모니아에 상에서의 PNAG 항원의 공발현을 입증한다.
샘플을 밤새 TBS 중 50 μg/ml 디스퍼신 B 또는 키티나제와 함께 인큐베이션한 다음, 4℃에서 밤새 BSA/PBS 중 1:50의 F598 (1 mg/ml) 또는 F429 (1 mg/ml) 및 토끼 항-에스. 뉴모니아에 19A 피막 폴리사카라이드 (1:100)로 표지하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 AF 488에 접합된 염소 항-인간 IgG 및 염소 항-토끼 AF 568 (1:200)로 표지하였다.
결과는 중이염을 앓는 친칠라의 비인두 세척액 내 에스. 뉴모니아에 박테리아 세포 주위의 PNAG의 존재를 나타내었다. 키티나제 및 디스퍼신 B로 처리한 다음, 대조 MAb F429에 노출시킨 샘플은 음성이었다. 디스퍼신 B로 처리한 다음, MAb F598에 노출시킨 샘플은 음성인 반면, 키티나제로 처리한 다음, MAb F598에 노출시킨 샘플은 양성이었으며, 이는 중이염을 앓는 친칠라의 비인두 세척액에서의 PNAG의 존재를 입증한다. 염색 패턴은 토끼 항-SPn 19A 염색과 중복되었다 (데이터는 제시되지 않음).
유사하게, 키티나제 처리 후에 PNAG-특이적 MAb F598로는 염색되지만 대조 MAb F429로는 염색되지 않음으로써 결정된 바와 같이, 중이염을 앓는 에스. 뉴모니아 19A로 감염시킨 친칠라의 귀 유체 (세척액) 및 비도에서 PNAG가 검출되었다. 염색 패턴은 토끼 항-SPn 19A 염색과 중복되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 4: 중이염을 앓는 소아로부터의 인간 귀 유체 내 에스. 뉴모니아 또는 비피막형 에이치. 인플루엔자.
귀 유체 샘플을 37℃에서 밤새 100 μg/ml DNaseI과 함께 인큐베이션한 다음, 37℃에서 24시간 동안 TBS 중 50 μg/ml 키티나제 또는 디스퍼신 B로 처리하였다. 샘플을 세척하고, 10 μl의 분취액을 유리 슬라이드 상에 공기-건조시키고, 열 고정시키고, 4℃에서 밤새 0.5% BSA를 함유하는 PBS (PBS/BSA) 중 F598 (AP01) 50 μg/ml 또는 F429 (1 mg/ml), 및 마우스 항-에스. 뉴모니아에 포스파티딜콜린 (1:100) 또는 기니 피그 항-에이치. 인플루엔자 (열 사멸된 전세포; 1:100)로 표지하였다. 샘플을 PBS로 세척하고, 실온에서 1시간 동안 PBS/BSA 중 1:250의 AF488에 접합된 항-인간 IgG, 및 1:200의 AF568에 접합된 염소 항-마우스 IgG 또는 염소-항 기니 피그 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세척하고, 장착하였다.
결과는 에스. 뉴모니아에 귀 감염 (중이염)을 앓는 인간 대상체의 귀 유체에서의 PNAG의 존재를 입증한다. 키티나제에 이어서 MAb F429에 노출시키거나 또는 디스퍼신 B에 이어서 MAb F598에 노출시킨 샘플은 음성인 반면, 키티나제에 이어서 MAb F598에 노출시킨 샘플은 양성이었다. 염색 패턴은 에스. 뉴모니아에 포스파티딜콜린 염색에 대해 마우스 항체로 관찰된 것과 중복되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 5: 혈액 중 피. 베르게이 및 피. 팔시파룸.
말라리아 감염된 마우스 (피. 베르게이 NK-65로 감염시킨 BALB/CJ, 감염 후 제18일)로부터의 염색되지 않은 신선 혈액 도말표본의 공초점 현미경분석을 수행하였다. 도말표본을 키티나제, 디스퍼신 B 및 퍼아이오데이트 처리를 위한 3개의 웰에 팝-펜(pap-pen)으로 분배하였다. 슬라이드를 열 고정시키고, 37℃에서 24시간 동안 TBS 중 50 μg/ml 키티나제 또는 디스퍼신 B로 처리하거나 또는 37℃에서 2시간 동안 0.4 M 퍼아이오데이트로 처리하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, AF488 (녹색)에 직접 접합된 MAb F598 (1.3 mg/ml 원액; 600 μl 중 2.4 μl와 동등한 1:250 희석물 사용; 최종 농도 5.2 μg/ml 또는 600 μl 중 3.12 μg; 웰당 200 μl 첨가)과 함께 인큐베이션하였다. 또한, 0.5% BSA를 함유하는 PBS (BSA/PBS) 중 사이토 83 (DNA 염료-적색) 4 μM을 첨가하고; 둘 모두를 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 세척하고, 공초점 현미경에 의해 관찰하기 위해 1.5 μm 커버글래스로 덮었다.
결과는 뇌 말라리아로 사망한 마우스의 혈액에서의 PNAG의 존재를 나타내었다. 디스퍼신 B 또는 퍼아이오데이트로 처리하고, 이어서 MAb F598로 염색한 샘플은 음성인 반면, 키티나제로 처리하고, 이어서 MAb F598로 염색한 샘플은 양성이었다 (데이터는 제시되지 않음).
유사한 접근법을 사용하여, 피. 팔시파룸으로 감염시킨 인간으로부터의 혈액에서의 PNAG 발현을 분석하였다. 대조 MAb F429로 염색한 샘플, 및 디스퍼신 B 또는 퍼아이오데이트로 처리하고, 이어서 MAb F598로 염색한 샘플은 음성이었다 (데이터는 제시되지 않음). 키티나제로 처리하거나 또는 처리하지 않고, 이어서 F598로 염색한 샘플은 양성이었다 (데이터는 제시되지 않음). F598의 염색 패턴은 적혈구 내부의 DNA의 확인과 중복되었으며, 인간 적혈구는 핵 또는 DNA를 함유하지 않기 때문에 이는 말라리아 기생충의 존재를 가리킨다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 6: 폐 내 비. 돌로사.
이전 실시예에 기재된 것과 유사한 접근법을 사용하여, 비. 돌로사 폐렴 및 패혈증으로 사망한 낭성 섬유증 환자로부터 폐 조직을 절개하고, PNAG 발현에 대해 분석하였다. TO-PRO-3을 사용하여 폐 세포 핵을 염색하였다. 항-비. 돌로사 마우스 혈청에 이어서 AF568 당나귀 항-마우스 IgG를 사용하여 비. 돌로사 세포를 시각화하였다. 9GlcNH2-TT PNAG 당형태에 대한 토끼 항혈청에 이어서 AF488 염소 항-토끼 IgG를 사용하여 PNAG를 시각화하였다. 음성 대조군은 TO-PRO-3 핵 염색을 갖는 정상 토끼 혈청이었다. PNAG 발현은 비. 돌로사 세포 염색과 중복되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 7: 눈 내 씨. 알비칸스.
이지데왁스(EzDewax)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여, 씨. 알비칸스 감염된 마우스 눈의 파라핀-포매 조직학 절편을 탈파라핀화하였다. 슬라이드를 실온에서 2시간 동안 물 중에서 재수화시키고, 이어서 실온에서 2시간 동안 0.5% BSA/PBS 중에서 차단하였다. 샘플을 4℃에서 밤새 4uM 사이토 83과 함께 0.5% BSA를 함유하는 PBS 중 AF488에 직접 접합된 MAb F429 (음성 대조군) (1.63 mg/ml 원액의 1:313 희석물, 최종 농도 5.2 ug/ml) 또는 AF488에 직접 접합된 PNAG에 대한 MAb F598 (4.35 mg/ml 원액의 1:833 희석물, 최종 농도 5.2 ug/ml)과 함께 추가로 인큐베이션하였다. 샘플을 PBS로 세척하고, 공초점 분석을 위해 1.5 커버글래스를 올렸다.
결과는 핵이 MAb F598로는 공초점 염색되었지만 MAb F429로는 공초점 염색되지 않았음을 나타내었으며, 이는 씨. 알비칸스에 의한 PNAG의 생체내 발현을 입증한다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 8: 씨. 알비칸스 각막염의 뮤린 모델에서의 미생물 PNAG에 대한 MAb F598의 효능.
마취시킨 수컷 C57Bl/6 마우스의 각막을 스크래칭하고 (3X 1 mm), 이어서 5 μl 부피의 칸디다 알비칸스 SC5314를 ~105-107 CFU/눈으로 접종함으로써 각막염을 유발하였다. 감염 후 4시간째에 IP 주사 및/또는 국소 적용에 의해 PNAG-특이적 MAb (F598) 또는 대조 인간 IgG1 MAb (F429)를 전달하고, 감염 후 24 및 32시간째에 추가의 항체를 국소적으로 적용하였다. 감염 후 24 및 32시간째에 마우스를 검사하고, 대조군이 이 시점에 회복불가능한 각막 손상을 나타낸 경우에는 동물을 안락사시키고, CFU/눈을 결정하였다. 36시간째에 대조군이 손상된 눈에 대한 3+ 이하의 손상을 갖는 경우에는, 감염이 48시간까지 진행되도록 하고, 그 후에 마우스를 안락사시키고, CFU/눈 및 마우스 처리에 대한 지식이 없는 관찰자에 의해 0 내지 4의 각막 병리상태 점수를 결정하였다. 각막 병리상태 점수는 다음과 같다:
점수 4: 각막의 천공
점수 3: 전안부를 짙은 혼탁
점수 2: 동공을 덮는 짙은 혼탁
점수 1: 동공을 부분적으로 덮는 희미한 혼탁
점수 0: 비감염된 반대측 눈과 동일함.
MAb F598의 IP 주사 및/또는 국소 적용에 의해 치료적으로 처리된 씨. 알비칸스 감염된 마우스는 대조 MAb F429로 처리된 마우스와 비교하여 눈에서의 현저하게 감소된 박테리아 수준 및 감소된 각막 병리상태를 가졌다. 이러한 데이터는 도 1-4에 나타내었다.
PNAG에 대한 항체는 씨. 알비칸스 각막염의 모델에서 치료 효능을 입증하였고, 이는 PNAG의 생체내 발현, 및 PNAG에 대한 백신 및 면역요법제에 의한 진균 감염의 예방 또는 치료 잠재력을 가리킨다.
실시예 9: 에스. 뉴모니아로 인한 치사성 폐렴에 대한, 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대한 폴리클로날 항체의 보호 효능.
에스. 뉴모니아에 균주 D39를 37℃에서 5% CO2 하에 트립티카제 대두 브로쓰 (TSB) 중에서 밤새 성장시켰다. 배양액을 토드-휴이트(Todd-Hewitt) 브로쓰 + 1% 글루코스에 650 nm에서의 OD=0.1로 희석하고, OD=0.45일 때까지 (대략 2.5시간) 37℃에서 성장시켰다. CBA/N 마우스에, 열-불활성화된 정상 염소 혈청 37.5 μl 또는 PBS 중에 50 μL로 희석한 항-9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 발생된 염소 항혈청을 이소플루란 마취 하에 후안와 (RO) 주사하였다. 마우스에 주사하였다. 24시간 후에, 박테리아 제제를 650 nm에서의 OD = 0.45로 희석하였다 (즉, 이 실험의 경우, 83 μL를 PBS 중에 917 μL로 희석하여 3 x 107 CFU/mL를 제공함). 마우스를 케타민/크실라진 (마우스당 250μL)으로 마취시키고, 2 x 10 μL 용량의 박테리아를 비강내로 점적주입하였다. 마우스를 7일 동안 생존에 대해 모니터링하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.
또한, FVB 마우스에서 혈청형 9V DSM 11865 균주로의 비강내 감염 4시간 전에 주어진 mAb F598은 마우스 폐에서의 박테리아 부담 감소에 있어서 항생제 세포탁심 (감염 후 1 및 4시간째에 투여됨)만큼 강력한 것으로 밝혀졌다.
실시예 10: 에스. 피오게네스 (군 A 스트렙토코쿠스)로 인한 치사성 피부 감염에 대한, 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대한 폴리클로날 항체의 보호 효능.
마우스는 CD1(ICR) 6주령의 암컷 마우스였다. 군 1 (8마리의 마우스)은 정상 토끼 혈청 (NRS)을 주사한 마우스에 해당하였다. 군 2 (8마리의 마우스)는 9GlcNH2-TT를 주사한 마우스에 해당하였다. 박테리아는 대수기에서 107 CFU/ml로 사용된 군 A 스트렙토코쿠스 (GAS) 균주 950771이었다. 항체는 200 μl/마우스/용량으로 사용된 폴리클로날 토끼 항-9GlcNH2-TT 및 200 μl/마우스/용량으로 사용된 NRS였다.
제0일에, GAS 박테리아 세포의 원액을 혈액 한천 플레이트 (BAP) 상에 스트리킹하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 37℃에서 정치 배양을 위한 1% 글루코스를 함유하는 토드-휴이트 효모 추출물 브로쓰 (THY+G)의 튜브에 접종하는데 사용하였다. 감염 24시간 전에 마우스에 IP 주사하였다. 제1일에, 감염 4시간 전에 마우스를 제2회 IP 면역화시켰다. 감염을 위한 접종물을 제조하기 위해, THY+G 10 ml를 사용하고, OD600nm=0.05의 박테리아 현탁액을 제조하였으며, OD600nm = 0.15가 달성될 때까지 이를 37℃에 두었다. 이를 희석하고, CFU 결정을 위해 다음과 같이 BAP 상에 플레이팅하였다: 10-5 및 10-6 희석물 10 μl를 BAP (각 희석물에 대해 2개의 플레이트) 상에 플레이팅하였다. 감염 접종물을 제조하기 위해, THY+G 배양액 10 ml를 15 ml 원추형 튜브로 옮기고, 2000 rpm에서 20분 동안 튜브를 원심분리시켜 박테리아 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 1 ml THY+G 브로쓰 중에 현탁시키고, 이를 미세원심분리기 튜브로 옮기고, 8000 rpm에서 2분 동안 회전시켰다. 상청액을 폐기하고, 박테리아 세포의 펠릿을 500 μl 주사용수 중에 현탁시킨 다음, 1 ml 27 게이지(Gauge) 시린지로 옮기고, 빙상에서 유지시켰다. 주사용수로 50 mg/ml 넴부탈(Nembutal)의 1:4 희석물 [최종 농도 10 μg/ml]을 제조하고, IP 주사하였다 (마우스당 0.3 ml 마취제 용액). 우측 측복부를 면도하고, 에탄올을 함유하는 면봉으로 닦아낸 다음, 마우스당 박테리아 현탁액 0.1 ml를 피하 주사하였다 (즉, 5x105 CFU/마우스). 실제 접종물을 확인하기 위해, 박테리아 현탁액을 희석하고, 계수를 위해 플레이팅하였다. 주사된 박테리아 현탁액은 1.7x106 CFU/ml의 농도를 가졌으며, 이는 각 마우스에 1.7x105 CFU가 주사되었음을 의미한다. 마우스를 관찰하고, 빈사 마우스를 안락사시켰다. 결과는 도 6에 나타내었다.
실시예 11: 군 B 엔. 메닌기티데스로 공격한 2-3일령 마우스 새끼의 수막염 (뇌 내의 박테리아)에 대한 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 토끼에서 발생된 항체의 보호 효능.
마우스는 2 내지 3일령의 CD-1 신생아 마우스였다. 엔. 메닌기티데스를 혈액 한천 플레이트 상에서 밤새 성장시키고, 박테리아 세포를 긁어내어 PBS에 넣고, 지정된 바와 같은 다양한 공격 용량을 제공하도록 600 nm에서의 OD를 조정하였다. 감염 24시간 전에 마우스에 NRS (50 μl IP (어큐레이트(Accurate)로부터의 NRS)) 또는 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 발생된 토끼 혈청 (50 μl IP (토끼 4.2, 채혈 4-3/4-4))을 1회 주사하였다. IP 24시간 후에 마우스를 하기 희석도: 5x105, 5x106 또는 5x108의 혈청군 B 엔. 메닌기티디스 균주 B16B6 50 μl로 공격하였다. 마우스를 24시간 후에 희생시키고, 뇌를 제거하고, 균질화하고, 박테리아 계수를 위해 초콜릿 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 결과는 도 7에 나타내었다.
실시예 12: 감염성 결장염에 걸리기 쉬운 마우스에 투여한 경우의 완전 인간 IgG1 MAb F598의 보호 효능.
TRUC 마우스는 후천성 및 선천성 면역계가 결핍되어 있다 (Garrett et al. Cell 2007 131(1):33-45; Garrett et al. Cell Host Microbe, 2010 8(3):292-300). 이들 마우스에서는 8주령까지 감염성 결장염이 자발적으로 발생한다. 일생의 제1주에 시작하여 신생아 TRUC 마우스에 MAb F598 또는 PBS, 또는 MAb F598 또는 대조 인간 IgG1 MAb 50 μg을 8주째에 희생시킬 때까지 1주에 3회 ip 주사하였다. 마우스의 장관을 제거하고, 기재된 바와 같이 결장염의 평가를 위해 처리하였다 (Garrett et al. Cell 2007 131(1):33-45; Garrett et al. Cell Host Microbe, 2010 8(3):292-300). 전체 결장염 병리상태 점수를 MAb F598 또는 대조 IgG1 MAb가 주어진 마우스 군들 간에 비교하였다. 결과는 도 8 및 9에 나타내었다.
다른 실험에서, 일생의 제7일에 시작하여 mAb F598을 매주 투여하는 것은 (병리학자에 의해 맹검 방식으로) 8주령에 결정된 전체 조직병리학적 손상을 유의하게 감소시켰다.
WT 신생아가 TRUC 암컷에 의해 교차-양육되는 경우에는, 제8주에 이것에서 자발성 결장염이 발생하지만, TRUC 자손에서보다는 덜 중증이다. 교란되지 않은 면역계 기능의 설정에서 결장염에 대한 mAb F598의 치료 잠재력을 평가하기 위해, TRUC 암컷에 의해 양육된 WT 마우스의 처리를 mAb F598 또는 대조 인간 IgG1 mAb F105를 격주로 주사하여 4주령에 개시하고, 8주령에서의 결장염 병리상태의 수준을 결정하였다. mAb F598은 대조군과 비교하여 수용자 마우스에서의 전체 병리상태 점수를 유의하게 감소시켰는데, 단핵구 침윤 및 반응성 증식증에서는 유의한 감소가 있었지만, 손상에서는 없었으며, 이는 대조군의 대부분이 0의 손상 점수를 가졌기 때문이다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 13: 엘. 모노시토게네스 균주 10403S에 대한 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 토끼에서 발생된 항체의 보호 효능.
2 또는 3일령의 영아 CD1 마우스를 공격 24시간 전에 NRS (n=15) 또는 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 발생된 토끼 면역 혈청 (n=15) 50 μl로 IP 면역화시켰다. 마우스를 엘. 모노시토게네스 (50 ul 중 % X 10^8 CFU)로 IP 공격하였다. 24시간에 걸쳐 생존을 모니터링하였다. 예이츠(Yates) 보정을 이용한 카이-제곱에 의해 전체 생존을 분석하였다 (P.001). 결과는 도 10에 나타내었다.
말라리아에 대한 효과적인 백신은 다중 기생충 항원을 필요로 할 가능성이 있지만, PNAG가 다가 백신을 위한 후보 백신 항원 성분일 수 있는지를 결정하는 것에서의 초기 단계로서, PNAG-양성 피. 베르게이 ANKA로 감염시킨 C57BL/6 마우스를 감염 전날에 시작하여 감염 후 20일에 걸쳐 3일마다 ip 주사한 200 μL의 PNAG에 대한 폴리클로날 항체 또는 대조 정상 혈청으로 처리하였다. PNAG에 대한 항체는 처리된 마우스의 생존을 유의하게 연장시켰고, 뇌 말라리아의 발생을 방지하였다. 정상 혈청으로 처리한 8마리의 마우스 중 5마리는 제9일까지 낮은 수준의 기생충혈증으로 사망하였고, 나머지 3마리는 제30일까지 높은 수준의 기생충혈증으로 사망하였다. 3주 동안 PNAG에 대한 항체로 처리한 마우스에 대해서는, 제7일까지 오직 1마리만 뇌 말라리아로 사망하였고, 4마리는 제33일 (이는 항체의 최종 주사 후 13일째임)까지 증가하는 수준의 기생충혈증이 발생하여 사망하였고, 1마리는 제22일까지 검출가능한 기생충혈증을 앓지 않다가 제40일 (항체의 최종 투여 후 20일째)에 사망하였고, 2마리의 마우스는 45일 실험 기간 동안 검출가능한 기생충혈증을 거의 내지 전혀 앓지 않고 생존하였다. 항체 처리는 초기 프로토콜 약관에 따라 제20일에 중단하였다. 항체 처리의 지속기간을 증가시킴으로써 연장된 생존이 관찰될 수 있는 가능성이 있다.
실시예 14: PNAG에 대한 항체는 다양한 PNAG-발현 병원체의 옵소닌성 또는 살박테리아 사멸을 매개한다.
에스. 뉴모니아에 및 이. 파에칼리스 옵소닌성 사멸 프로토콜은 HL60 세포를 신선 인간 PMN 대신에 식세포의 공급원으로서 사용한 것을 제외하고는, 스쿠르니크(Skurnik) 등 (J Clin Invest. 2010, 120(9):3220-33)에 의해서 에스. 아우레우스에 대해 공개된 것과 유사하다. HL60 세포를 6일 동안 0.8% DMF를 사용하여 분화시키고, 1.3x106/ml로 조정하였다. 박테리아를 37℃에서 밤새 성장시켰다 (진탕시키지 않음). 에스. 뉴모니아는 5% CO2 하에 THY +1% 글루코스 (THY+G) 중에 두었다. 이. 파에칼리스는 대기 상태에서 성장시켰다. 검정 말미에 박테리아 균주를 TSB + 혈액 한천 상에 플레이팅하였다. 진탕시키면서 CSB 중에서 밤새 성장시킨 표적 에스. 아우레우스 MN8 박테리아로 보체를 흡착시켰다. C': 에스. 아우레우스 MN8 세포로 흡착시킨 인비트로젠(Invitrogen)으로부터의 보체 혈청 Cat # 31203/S 로트 # 510908698270. 하기 2개의 항원 중 1개에 대해 토끼 항체를 발생시켰다:
1. 파상풍 톡소이드에 접합된 탈아세틸화 PNAG (dPNAG) (dPNAG-TT): 문헌 [Maira-Litran et al. Infect Immun. 2005, 73(10):6752-62. Erratum in: Infect Immun. 2005, 73(11):7789]; 및
2. TT에 접합된 합성 9GlcNH2 올리고사카라이드: 문헌 [Gening et al. Infect Immun. 2010, 78(2):764-72].
PNAG에 대한 인간 MAb인 MAb F598을 또한 시험하였다 (Kelly-Quintos et al. Infect Immun. 2006, 74(5):2742-50).
결과는 도 11-13에 나타내었다.
군 A 스트렙토코쿠스 옵소닌성 사멸 프로토콜은 다음과 같다: 군 A 스트렙토코쿠스 (GAS) 균주 771, 188을 사용하였다. 사용된 MAb 로트: 새로이 x1 해동된 F598 AP1-01 [19 mg/ml]. MAb F598에 대한 대조군: 피. 아에루기노사 알기네이트에 대한 MAb F429 [1.0 mg/ml]. 느슨한 덮개를 덮어 진탕시키면서 37℃에서 50ml 원추 내 10 ml THB+G에 접종한 동결 원액으로부터 에스. 아우레우스 MN8 균주를 성장시켰다. GAS 771 및 188을 밤새 플레이트로부터 THY+G 중에서 성장시키고, 37℃ 정치 배양액에 OD650=0.05로 접종하였다. 느슨한 덮개를 덮어 진탕시키면서 37℃에서 50ml 원추 내 10ml CSB 중 THB+G에 접종한 동결 원액으로부터 에스. 아우레우스 MN8 Dica를 성장시켰다. 검정 말미에 GAS 균주를 혈액을 함유하는 TSA 상에 플레이팅하였다. 각각 진탕시키면서 THB+G 중에서 또는 정치상태로 THY+G 중에서 밤새 성장시킨 표적 에스. 아우레우스 MN8△ica 또는 GAS 771 박테리아로 보체를 흡착시켰다. 완충제: HBSS + 0.1% 젤라틴. C': 에스. 아우레우스 MN8 Dica, 또는 GAS 771 또는 188의 세포로 흡착시킨 인비트로젠으로부터의 보체 혈청 Cat # 31203/S 로트 # 510908698270.
결과는 도 14에 나타내었다.
씨. 알비칸스 옵소닌성 사멸 프로토콜은 다음과 같다: 씨. 알비칸스를 YPD (효모 추출물/펩톤/덱스트로스) 브로쓰 중에서 OD 1.0으로 성장시킨 다음, 회전시키고, MEM+1% BSA 중에 재현탁시키고, 650 nm에서의 OD를 0.4로 조정한 다음, 현탁액을 1:10 희석하였다. MAb F429를 단백질 A에 의해 하이브리도마 상청액으로부터 정제하고, pH 6.5 PBS에 투석하고, -20℃에서 저장하였다. 완충제: MEM + 1% BSA. C': 토끼로부터의 보체 혈청, 시그마(Sigma) 로트 106K6029, 카탈로그 번호 S7764. 보체를 씨. 알비칸스 세포로 흡착시켰다. 식세포는 트리마 칼라(TRIMA collar) 공여자로부터 획득하였다.
결과는 도 15에 나타내었다.
엔. 메닌기티디스 및 엔. 고노레아에 살박테리아 사멸 프로토콜은 다음과 같다: 정상 토끼 혈청 (-20℃ 원액으로부터의 NRS, 어큐레이트 케미칼(Accurate Chemical), 로트 2008) 및 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 발생된 토끼 항체 (-20℃에서 저장됨, 토끼 4.3 및 4.4로부터의 혈청)를 사용하였다. 혈청을 4℃에서 평형화하고, 검정 때까지 4℃에서 유지하였다. 엔. 메닌기티디스 또는 엔. 고노레아에 박테리아를 5% CO2 하에 초콜릿 한천 상에서 24-48시간 동안 성장시켰다. 박테리아를 0.5% 글루코스, 9 mM CaCl2, 및 4.9 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 1% (wt/vol) 소 혈청 알부민 (라이프블러드 메디칼(Lifeblood Medical), 뉴저지주 프리홀드)을 함유하는 PBS = PBS++, pH 7.4 중에 현탁시켰다. 박테리아 현탁액을 초콜릿 한천 현탁액으로부터 제조된 OD650 nm 현탁액으로부터 PBS++ 중에 ~ 1.5-2 X 104 CFU/ml로 희석하였다. 검정은 혈청 희석물 80 μl 및 네이세리아 세포 20 μl를 함께 혼합한 다음, 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하는 것을 포함하였다. 튜브를 (가능한 경우에 궤도식으로) 약하게 진탕시키면서 37℃에 두었다. 10 μl의 1:2 및 10-1 희석물 둘 모두를 뮐러-힌톤(Muller-Hinton) 브로쓰 중에서 제조한 다음, 초콜릿 한천 상에 플레이팅하였다. 배양액을 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 콜로니를 계수하였다. 결과는 도 16 및 17에 나타내었다.
특이적 항원 억제와 함께 또는 이것 없이, 9GlcNH2-TT에 대한 토끼 혈청 존재 하의 엔. 메닌기티디스 및 엔. 고노레아에 균주의 살박테리아 사멸을 다음과 같이 수행하였다:
완충제: 0.5% 글루코스, 9 mM CaCl2, 및 4.9 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 1% (wt/vol) 소 혈청 알부민 (라이프블러드 메디칼, 뉴저지주 프리홀드)을 함유하는 완충제-PBS = PBS++, pH 7.4.
사용된 박테리아 균주 및 제조: 박테리아를 0.5% 글루코스, 9 mM CaCl2, 및 4.9 mM MgCl2ㆍ6H2O 및 1% (wt/vol) 소 혈청 알부민 (라이프블러드 메디칼, 뉴저지주 프리홀드)을 함유하는 PBS = PBS++, pH 7.4 중에 재현탁시켰다. OD의 초콜릿 한천 현탁액으로부터의 OD650nm 현탁액으로부터 박테리아 현탁액을 PBS++ 중에 ~ 1.5-2 X 104 CFU/ml로 현탁시켰다.
억제 항원: PBS++ 중에 200 ug/ml 최종 농도로 용해시켰다.
사용된 PNAG 항원: 로트 27. 균주 2192로부터 사용된 알기네이트 항원, Pk 3 (실행 1)
사용된 항혈청: 정상 토끼 혈청 (-20℃ 원액으로부터의 NRS, 어큐레이트 케미칼). 9GlcNH2-TT 접합 백신에 대해 발생된 토끼 항체 (-20℃에서 저장됨, 토끼 4.3 및 4.4로부터의 혈청)를 사용함.
검정: 혈청 공급원 (>80-90% 사멸률을 달성하기 위해 필요한 직접 살박테리아 검정에서의 가장 높은 희석도에 기초한 희석물, 1:2 혈청 희석도에서의 최대 사멸률이 보다 낮지 않는 한, 이 경우에 1:2 최종 희석도의 혈청을 사용함) 40 μl, 항원 40 μl 및 네이세리아 세포 20 μl (적당하게 희석된 항혈청 80 μl가 첨가된 항원이 없는 튜브)를 함께 혼합하였다. 튜브를 (가능한 경우 궤도식으로) 약하게 진탕시키면서 37℃에 두었다. 초콜릿 한천 상에 플레이팅하고, 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 다음날 콜로니를 계수하였다.
결과는 도 18 및 19에 나타내었다.
등가물
상기 기재된 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하는데 충분하다고 여겨진다. 본 발명은 제공된 실시예의 범위로 제한되지 않는데, 이는 실시예가 본 발명의 한 측면의 한 예시이며, 다른 기능적으로 동등한 실시양태가 본 발명의 범위에 속하기 때문이다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 명백할 것이고, 이는 첨부된 청구범위에 속할 것이다. 본 발명의 이점 및 목적이 본 발명의 각 실시양태에 반드시 포함되지는 않는다.
본원에 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 공개공보는 달리 나타내지 않는 한 본원에 참조로 포함된다.

Claims (122)

  1. 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체에게, 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량의 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
    Figure pct00011

    상기 식에서, n은 적어도 5이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
  2. 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체에게, 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 유효량의, 담체에 접합된 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
    Figure pct00012

    상기 식에서, n은 5 이상이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
  3. 제2항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드가 링커를 통해 담체에 접합된 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 담체가 펩티드 담체인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R 기의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만이 -NH-CO-CH3인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R 기가 -NH-CO-CH3이 아닌 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, n이 적어도 15, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500인 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드가 100-500 kDa의 분자량을 갖는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스가 에스. 뉴모니아(S. pneumonia), 군 A 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 군 B 스트렙토코쿠스 또는 엔테로코쿠스(Enterococcus)인 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균이 리스테리아(Listeria), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) 또는 엠. 스메그마티스(M. smegmatis)인 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스가 네이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 네이세리아 고노레아에(Neisseria gonorrhoeae), 비피막형 에이치. 인플루엔자에(H. influenzae), 헬리코박터(Helicobacter) 또는 캄필로박터(Campylobacter)인 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균이 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 비. 세타이오타미크론(B. thetaiotamicron), 비. 불가티스(B. vulgatis), 시트로박터 로덴티움(Citrobacter rodentium), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 티피 또는 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움인 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 진균인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 진균이 칸디다 알비칸스(Candida albicans) (효모), 칸디다 알비칸스 (균사), 아스페르길루스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium) 또는 크립토코쿠스(Cryptococcus)인 방법.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 기생충인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 기생충이 피. 베르게이(P. bergei) 또는 피. 팔시파룸(P. falciparum)인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 영장류, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 개 또는 고양이인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염이 발생할 위험이 있는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드를 아주반트와 함께 투여하는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드를 전신으로 투여하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드를 국부적으로 투여하는 것인 방법.
  28. 대상체에서 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 포함하는 제약 조성물.
    Figure pct00013

    상기 식에서, n은 적어도 5이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
  29. 대상체에서 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, 담체에 접합된 하기 화학식을 갖는 단리된 폴리사카라이드를 포함하는 제약 조성물.
    Figure pct00014

    상기 식에서, n은 5 이상이고, R은 -NH-CO-CH3 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 단 R 기의 50% 미만은 -NH-CO-CH3이다.
  30. 제29항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드가 링커를 통해 담체에 접합된 것인 제약 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 담체가 펩티드 담체인 제약 조성물.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, R 기의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만이 -NH-CO-CH3인 제약 조성물.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, R 기가 -NH-CO-CH3이 아닌 것인 제약 조성물.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, n이 적어도 15, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500인 제약 조성물.
  35. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드가 100-500 kDa의 분자량을 갖는 것인 제약 조성물.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스인 제약 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스가 에스. 뉴모니아, 군 A 스트렙토코쿠스, 군 B 스트렙토코쿠스 또는 엔테로코쿠스인 제약 조성물.
  38. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균인 제약 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균이 리스테리아, 클로스트리디움 디피실레, 비. 서브틸리스, 엠. 투베르쿨로시스 또는 엠. 스메그마티스인 제약 조성물.
  40. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스인 제약 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스가 네이세리아 메닌기티데스, 네이세리아 고노레아에, 비피막형 에이치. 인플루엔자에, 헬리코박터 또는 캄필로박터인 제약 조성물.
  42. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균인 제약 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균이 박테로이데스 프라길리스, 비. 세타이오타미크론, 비. 불가티스, 시트로박터 로덴티움, 비브리오 콜레라, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 또는 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움인 제약 조성물.
  44. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 진균인 제약 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 진균이 칸디다 알비칸스 (효모), 칸디다 알비칸스 (균사), 아스페르길루스, 푸사리움 또는 크립토코쿠스인 제약 조성물.
  46. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 기생충인 제약 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 기생충이 피. 베르게이 또는 피. 팔시파룸인 제약 조성물.
  48. 제28항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 제약 조성물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 영장류, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 개 또는 고양이인 제약 조성물.
  50. 제28항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있는 것인 제약 조성물.
  51. 제28항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염이 발생할 위험이 있는 것인 제약 조성물.
  52. 제28항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드가 아주반트와 함께 사용되는 것인 제약 조성물.
  53. 제28항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드가 전신 투여를 위해 제제화되는 것인 제약 조성물.
  54. 제28항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드가 국부 투여를 위해 제제화되는 것인 제약 조성물.
  55. 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있거나 또는 이러한 감염이 발생할 위험이 있는 대상체에게 유효량의 PNAG-특이적 항체 또는 PNAG-특이적 항체 단편을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스가 에스. 뉴모니아, 군 A 스트렙토코쿠스, 군 B 스트렙토코쿠스 또는 엔테로코쿠스인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균이 리스테리아, 클로스트리디움 디피실레, 비. 서브틸리스, 엠. 투베르쿨로시스 또는 엠. 스메그마티스인 방법.
  60. 제55항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스가 네이세리아 메닌기티데스, 네이세리아 고노레아에, 비피막형 에이치. 인플루엔자에, 헬리코박터 또는 캄필로박터인 방법.
  62. 제55항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균이 박테로이데스 프라길리스, 비. 세타이오타미크론, 비. 불가티스, 시트로박터 로덴티움, 비브리오 콜레라, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 또는 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움인 방법.
  64. 제55항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 진균인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 진균이 칸디다 알비칸스 (효모), 칸디다 알비칸스 (균사), 아스페르길루스, 푸사리움 또는 크립토코쿠스인 방법.
  66. 제55항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 기생충인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 기생충이 피. 베르게이 또는 피. 팔시파룸인 방법.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  69. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 영장류, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 개 또는 고양이인 방법.
  70. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있는 것인 방법.
  71. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염이 발생할 위험이 있는 것인 방법.
  72. 제55항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편을 전신으로 투여하는 것인 방법.
  73. 제55항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편을 국부적으로 투여하는 것인 방법.
  74. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 F598 (ATCC PTA-5931) 항체 또는 그의 단편인 방법.
  75. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 F628 (ATCC PTA-5932) 항체 또는 그의 단편인 방법.
  76. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 F630 (ATCC PTA-5933) 항체 또는 그의 단편인 방법.
  77. 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 작용제에 접합된 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 작용제가 세포독성제인 방법.
  79. 대상체에서 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 사용하기 위한, PNAG-특이적 항체 또는 PNAG-특이적 항체 단편을 포함하는 제약 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스인 제약 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 코쿠스가 에스. 뉴모니아, 군 A 스트렙토코쿠스, 군 B 스트렙토코쿠스 또는 엔테로코쿠스인 제약 조성물.
  82. 제79항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균인 제약 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-양성 간균이 리스테리아, 클로스트리디움 디피실레, 비. 서브틸리스, 엠. 투베르쿨로시스 또는 엠. 스메그마티스인 제약 조성물.
  84. 제79항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스인 제약 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 코쿠스 또는 코코바실루스가 네이세리아 메닌기티데스, 네이세리아 고노레아에, 비피막형 에이치. 인플루엔자에, 헬리코박터 또는 캄필로박터인 제약 조성물.
  86. 제79항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균인 제약 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 그람-음성 간균이 박테로이데스 프라길리스, 비. 세타이오타미크론, 비. 불가티스, 시트로박터 로덴티움, 비브리오 콜레라에, 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피 또는 살모넬라 엔테리카 혈청형 티피뮤리움인 제약 조성물.
  88. 제79항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 진균인 제약 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 진균이 칸디다 알비칸스 (효모), 칸디다 알비칸스 (균사), 아스페르길루스, 푸사리움 또는 크립토코쿠스인 제약 조성물.
  90. 제79항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 비-ica/pga PNAG-양성 기생충인 제약 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 비-ica/pga PNAG-양성 기생충이 피. 베르게이 또는 피. 팔시파룸인 제약 조성물.
  92. 제79항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 제약 조성물.
  93. 제79항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 영장류, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 개 또는 고양이인 제약 조성물.
  94. 제79항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염을 앓고 있는 것인 제약 조성물.
  95. 제79항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 비-ica/pga PNAG-양성 병원체에 의한 감염이 발생할 위험이 있는 것인 제약 조성물.
  96. 제79항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 전신 투여를 위해 제제화되는 것인 제약 조성물.
  97. 제79항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 국부 투여를 위해 제제화되는 것인 제약 조성물.
  98. 제79항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 F598 (ATCC PTA-5931) 항체 또는 그의 단편인 제약 조성물.
  99. 제79항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 F628 (ATCC PTA-5932) 항체 또는 그의 단편인 제약 조성물.
  100. 제79항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 F630 (ATCC PTA-5933) 항체 또는 그의 단편인 제약 조성물.
  101. 제79항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 작용제에 접합된 것인 제약 조성물.
  102. 제101항에 있어서, 작용제가 세포독성제인 제약 조성물.
  103. 농축된 미생물 세포체 제제로부터 조 폴리사카라이드 제제를 에탄올 침전시키고;
    조 폴리사카라이드를 리소자임 및 리소스타핀으로 공동으로 소화시킨 후 뉴클레아제 및 프로테이나제 K로 순차적으로 소화시켜 소화된 폴리사카라이드 제제를 형성하고;
    소화된 폴리사카라이드 제제를 크기별로 분획화하고;
    아세틸화 폴리사카라이드 분획을 단리시키고;
    아세틸화 폴리사카라이드 분획을 탈아세틸화하여 50% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 생성하는 것
    을 포함하며, 여기서 미생물 세포체 제제는 비-ica/pga PNAG-양성 미생물로부터 유도된 것인 방법.
  104. 미생물 배양액으로부터 불순한 폴리사카라이드를 제조하고;
    불순한 폴리사카라이드를 산 또는 염기와 함께 인큐베이션하여 반-순수한 폴리사카라이드 제제를 생성하고;
    제제를 중화시키고;
    중화된 제제를 플루오린화수소산 중에서 인큐베이션하고;
    제제로부터 아세틸화 폴리사카라이드를 단리시키고;
    아세틸화 폴리사카라이드를 탈아세틸화하여 50% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 생성하는 것
    을 포함하며, 여기서 미생물 배양액은 비-ica/pga PNAG-양성 미생물 배양액인 방법.
  105. 미생물 배양액으로부터 불순한 폴리사카라이드를 제조하고;
    불순한 폴리사카라이드를 산 또는 염기와 함께 인큐베이션하여 반-순수한 폴리사카라이드 제제를 생성하고;
    제제를 중화시키고;
    중화된 제제를 플루오린화수소산 중에서 인큐베이션하고;
    제제로부터 50% 미만의 아세테이트 치환을 갖는 PNAG 폴리사카라이드를 단리시키는 것
    을 포함하며, 여기서 미생물 배양액은 비-ica/pga PNAG-양성 미생물 배양액인 방법.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 폴리사카라이드에 담체를 접합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 담체가 펩티드 담체인 방법.
  108. 제103항 또는 제104항에 있어서, 아세틸화 폴리사카라이드를 화학적으로 탈아세틸화하는 것인 방법.
  109. 제108항에 있어서, 아세틸화 폴리사카라이드를 염기성 용액과 함께 인큐베이션함으로써 탈아세틸화하는 것인 방법.
  110. 제103항 또는 제104항에 있어서, 아세틸화 폴리사카라이드를 효소적으로 탈아세틸화하는 것인 방법.
  111. 대상체에게 항체를 생산하기 위한 유효량의 비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 단리된 PNAG 폴리사카라이드 및 아주반트를 투여하고,
    대상체로부터 항체를 단리시키는 것
    을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체인 방법.
  113. 대상체에게 항체를 생산하기 위한 유효량의 비-ica/pga PNAG-양성 병원체로부터 단리된 PNAG 폴리사카라이드 및 아주반트를 투여하고,
    대상체로부터 비장 세포를 수확하고,
    대상체로부터의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키고,
    융합 서브클론으로부터 생산된 항체를 수확하는 것
    을 포함하는, 모노클로날 항체를 생산하는 방법.
  114. 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, PNAG 폴리사카라이드가 50% 미만으로 아세틸화된 것인 방법.
  115. 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 단리시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  116. 제111항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 토끼인 방법.
  117. 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  118. 비-ica/pga PNAG-양성 병원체를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 PNAG-특이적 항체 또는 항체 단편과 접촉시키고,
    샘플에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합을 검출하는 것
    을 포함하며, 여기서 항체 또는 항체 단편의 결합은 비-ica/pga PNAG-양성 병원체가 샘플에 존재함을 가리키는 것인, 비-ica/pga PNAG-양성 병원체를 검출하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 샘플이 스타필로코쿠스 음성인 방법.
  120. 제118항 또는 제119항에 있어서, 샘플이 대상체로부터의 생물학적 샘플인 방법.
  121. 제120항에 있어서, 생물학적 샘플이 요, 혈액, 고름, 피부, 객담, 관절액, 림프 또는 젖인 방법.
  122. 제118항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 검출가능한 표지에 접합된 것인 방법.
KR1020147036646A 2012-05-30 2013-05-30 폴리사카라이드 조성물 및 사용 방법 KR102282726B1 (ko)

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