KR20150023175A - 1,4―bdo 생산을 위한 유전자 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
일 구체예는 1,4-BDO 생산을 증가시킬 수 있는 유전자를 proteomics 데이터를 기반으로 발굴하는 스크리닝 방법에 대한 것이다. 또한, 이와 같은 방법으로 선별한 단백질인 Ncgl0630 (citrate synthase)와 Ncgl2145 (hyperthetical protein)을 과발현시 1,4-BDO 생산성이 높아짐을 확인하였다. 이러한 방법으로 보다 많은 1,4-BDO 생산성과 관련된 단백질을 발굴할 수 있어 생산성을 증대시킬 수 있으므로, 산업적으로 이용가능성이 크다고 판단된다.
Description
일 구체예는 1,4-BDO를 효율적으로 생산하는데 관여하는 단백질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 일 구체예는 상기 방법으로 선별된 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 미생물에 관한 것이다. 아울러, 일 구체예는 상기 미생물을 이용하여 높은 효율로 1,4-부탄디올을 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
1,4-부탄디올(이하 1,4-BDO라고 함)은 플라스틱, 섬유 등의 제조에 사용되는 용매로 활용될 뿐 아니라 스판덱스 등의 섬유 생산에 원료로 사용되는 물질이다. 1,4-BDO는 세계적으로 연간 약 130만 톤이 사용되며, 아세틸렌, 부탄, 프로필렌, 부타디엔과 같은 석유 기반 물질들로부터 생산하고 있다. 또한, 매년 6% 수준의 소비량 증가가 예상된다. 1,4-BDO는 고분자, 용매, 정밀화학 중간물질 등으로 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 쓰이고 있다. 현재 대부분의 탄소수 4개 화학물질은 1,4-BDO, 말레익 안하이드라이드 등으로부터 유래되어 합성되고 있지만, 유가가 올라감에 따라 생산비용이 증대되고 있어 화학 생산공정을 보완 및 대체하는 공정의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 미생물을 이용한 생물학적 공정이 제시되고 있다.
화학적인 방법으로 생산하는 기존의 방식과 다르게 2011년 제노메티카(genometica)에서는 대장균 내에서 숙시닐 코에이 신세테아제(succinyl-CoA synthetase, Cat1), 숙시네이트 세미알데히드 디히드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase, SucCD), 4-히드록시부티레이트 디히드로게나제(NAD dependent 4-hydroxybutyrate dehydrogenase, 4hbd), 4-히드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제(4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase, Cat2) 및 알콜 디히드로게나제(alcohol dehydrogenase, AdhE2) 유전자를 이용하여 1,4-BDO 생합성 회로를 구축했다. 그러나 보다 효율적으로 1,4-BDO를 생산하기 위하여, 이미 대장균 내에서 밝혀진 생합성 회로를 변형하여 새로운 생합성 경로를 구축하려는 시도가 있었다. 이러한 시도는 대부분 다양한 유전자 변이를 유발하여 효율성이 높은 효소를 발굴하는데 많은 초점이 맞추어 지고 있었다.
그러나, 이러한 접근 방법만으로는 1,4-BDO를 생산하는데 관여하는 단백질 또는 유전자를 효과적으로 발굴하는데 한계가 있었다. 이러한 문제점을 보완하기 위하여 새로운 접근방법을 시도하였고, 이와 같은 방법에 의해 스크리닝된 유전자가 1,4-BDO의 발현을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
일 측면은 1,4-BDO를 효율적으로 생산하는데 관여하는 단백질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 일 측면은 상기 방법으로 선별된 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 미생물에 관한 것이다. 일 측면은 상기 미생물을 이용하여 높은 효율로 1,4-BDO 를 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
일 측면은 1,4-BDO를 효율적으로 생산하는데 관여하는 단백질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
일 구체예는 1,4-BDO를 포함하지 않거나 1,4-BDO를 포함한 배지 중에서 1,4-BDO를 생산하는 미생물을 배양하는 단계; 배양물로부터 1,4-BDO 농도의 증가에 따라 증가된 발현을 보이는 단백질을 선별하는 단계; 및 선별된 단백질을 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질로 선택하는 단계를 포함하는 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질을 탐색하는 방법을 제공한다.
상기 단백질 스크리닝 방법을 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 1,4-BDO를 포함하지 않거나 1,4-BDO를 포함한 배지 중에서 1,4-BDO를 생산하는 미생물을 배양하는 단계를 포함한다. 상기 미생물은 1,4-BDO를 생산하는 미생물로서 야생형 미생물 및 형질전환된 변이주일 수 있다. 상기 미생물은 1,4-BDO를 생산할 수 있는 미생물일 수 있다. 이때 상기 미생물은 야생형에서 1,4-BDO를 생산하는 미생물일 수 있다. 또한, 1,4-BDO 생합성에 관련된 유전자가 도입되어 1,4-BDO를 생산할 수 있게 된 미생물일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 일 수 있다
또한, 1,4-BDO를 생산할 수 있게 된 미생물은 숙시닐-CoA를 숙시닐 세미알데히드로 전환하는 효소, 숙시닐 세미알데히드를 4-히드록시부틸레이트(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소, 4-히드록시부틸레이트를 4-히드록시부틸레이트-CoA(4-hydroxybutyrate-CoA)로 전환하는 효소, 4-히드록시부틸레이트-CoA를 1,4-BDO로 전환하는 효소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 숙시닐-CoA를 숙시닐 세미알데히드로 전환하는 효소는 상기 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(CoA-dependent succinate semialdehyde dehydrogenase) 일 수 있다. 상기 효소는 EC 1.2.1.b 로 분류되는 효소일 수 있다. 일 구체예로 상기 효소는 SucD일 수 있다. 또한, 숙시닐 세미알데히드를 4-히드록시부틸레이트로 전환하는 효소는 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase) 일 수 있다. 상기 효소는 EC 1.1.1.a로 분류되는 효소 일 수 있다. 또한, 상기 효소는 4Hbd일 수 있다. 또한, 4-히드록시부틸레이트를 4-히드록시부틸레이트-CoA로 전환하는 효소는 4-히드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제(4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase)일 수 있다. 상기 효소는 EC 2.8.3.a로 분류되는 효소 일 수 있다. 일 구체예로 상기 효소는 Cat2일 수 있다. 또한, 상기 4-히드록시부틸레이트-CoA를 1,4-BDO로 전환하는 효소는 알코올 데히드로게나제(alcohol dehydrogenase) 일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제 는 EC.1.1.1.c로 분류되는 효소일 수 있다. 또한, 상기 효소는 AdhE 또는 AdhE2 일 수 있다. 또한, 일 구체예로는 상기 1,4-BDO를 생산하는 미생물은 SucD 단백질, 4Hbd 단백질, Cat2 단백질 및 AdhE 단백질을 발현하는 미생물 일 수 있다.
본 명세서 사용된 용어, "단백질 발현"은 단백질 또는 효소가 미생물내에 존재하고 활성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 상기 단백질 또는 효소는 미생물내에 존재하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되어 존재할 수 있다. 이때, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 미생물내의 크로모좀에 삽입되어 존재할 수 있으며, 플라스미드 벡터내에 존재할 수 있다.
이때, 숙신산-세미알데히드 디히드로게나제는, 대장균, 코리네박테이움 또는 포르피로모나스 유래 단백질 일 수 있다. 이때, sucD 단백질은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 sucD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
이때, 4HB 디히드로게나제는 대장균, 코리네박테이움, 클로스트리움, 또는 포르피로모나스 유래 단백질 일 수 있다. 이 때, 4Hbd 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 4hbD를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
이때, 4-히드록시부티릴 CoA 트랜스퍼라제는 대장균, 코리네박테이움, 클로스트리움, 또는 포르피로모나스 유래 단백질 일 수 있다. 이때, Cat2 단백질은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 Cat2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 알콜 디히드로게나제는 클로스트리움 아세토부티리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래 단백질 일 수 있다. 이 때, AdhE 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 AdhE2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
또한 상기 미생물은, 숙시닐-CoA:조효소 A 트란스퍼라아제(Cat1)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 미생물은 숙시닐-CoA:조효소 A 트란스퍼라아제(succinyl-CoA:coenzyme A transferase, Cat1)는 숙시네이트를 숙시닐-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 Cat1은 EC.2.8.3.a로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 Cat1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 cat1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
C4 화합물을 생산하는 미생물은 피루베이트로부터 락테이트를 합성하는 경로가 불활성화 또는 감소된 것인 미생물 일 수 있다. 상기 미생물은 L-락테이트 데히드로게나아제(L-lactate dehydrogenase, Ldh)의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 Ldh는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 Ldh는 EC.1.1.1.27로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 미생물은 L-락테이트 데히드로게나아제를 코딩하는 유전자가 불활성화 또는 감쇄된 것일 수 있다.
명세서에서 사용된 용어 "불활성화(inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감쇄(attenuation)"는 유전자의 발현이 야생 균주, 조작되지 않은 균주, 또는 모 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 감소되어 있는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 상기 미생물 중 Ldh의 활성의 감소는 야생형 미생물 중의 Ldh의 활성에 비해, 30% 이하, 20% 이하, 또는 10% 이하일 수 있다. 또한, 상기 미생물 중의 Ldh의 활성은 완전히 제거된 것일 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 상동 재조합에 의해 야기될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감쇄는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다. 상기 미생물은 상기 유전자의 불활성화 또는 감쇄로 인해, 상기 유전자가 코딩하고 있는 효소의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "감소"는 조작되지 않은 미생물에 비하여 조작된 상기 미생물에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다.
상기 미생물 중 락테이트 데히드로게나제의 활성의 불활성화 또는 감쇄는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 변이에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 변이는 뉴클레오티드의 치환, 부분 또는 전체 결실, 또는 첨가 일 수 있다. 또한, 상기 미생물 중 락테이트 데히드로게나제의 활성의 감소는 내재적 락테이트 데히드로게나제 유전자를 제거하는 것에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 제거는 상기 유전자가 물리적으로 제거된 것뿐만 아니라 기능적으로 발현되지 않도록 된 것을 포함한다. 상기 제거는 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
명세서에서 사용된 용어, "형질전환"이란 유전자를 미생물 내에 도입하여 미생물 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 유전자는 미생물 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 미생물의 염색체 내에 삽입된 것이든 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 어느 것이든지 포함된다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 미생물 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette) 의 형태로 미생물에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주 세포에 도입되어, 미생물에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성(sequence identity)"은 서열이 비교 범위(window of comparison) 전체에서 염기 대 염기 또는 아미노산 대 아미노산 기준으로 동일하거나 기능적으로 또는 구조적으로 유사한 정도를 의미한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율(percentage of sequence identity)"은 예를 들면, 비교 범위 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 염기 또는 아미노산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된(matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수(즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), MegAlignTM(DNASTAR Inc)등을 들 수 있다. 여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩타이드 또는 유전자를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
상기 1,4-BDO는 증식 곡선에서 어느 단계에서도 첨가될 수 있으나, 미생물이 가장 활발히 증식하는 시기인 대수기(exponential phase)에서 첨가하는 것일 수 있다. 또한, 상기 1,4-BDO를 첨가하는 농도는 0 내지 500g/L, 예를 들면, 0 내지 400g/L, 0 내지 300g/L, 0 내지 200g/L 또는 0 내지 100g/L에서 선택될 수 있다. 2 내지 n의 서로 다른 농도의 1,4-BDO를 처리한다(n은 2 이상의 정수). 1,4-BDO 첨가시 적어도 2개의 예를 들면, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 다른 농도의 1,4-BDO를 배지에 첨가할 수 있다.
미생물 배양 조건은 해당 미생물에 따라 달라질 수 있다. 용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물이 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등이 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 등이 이용될 수 있다. 미생물이 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 무기질소화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다.
또한, 배양물로부터 1,4-BDO 농도의 증가에 따라 증가된 발현을 보이는 단백질을 선별하는 단계를 포함한다. 미생물이 생산하는 단백질은 미생물이 생산하는 모든 단백질이며, 미생물 내에 존재하거나 분비하는 단백질 일 수 있다.
또한, 상기 단백질량을 비교하기 위하여 배양된 미생물을 수거하는 단계 및 미생물에서 단백질을 추출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 단백질량을 비교하기 위하여 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블랏(western blot) 등의 방법이 이용될 수 있다. 또한, 2D 겔 전기영동법(2 dimensional gel electrophoresis) 또는 MALDI-TOF/MS(Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry) 통하여 단백질량을 확인할 수 있다.
상기 단계는 더 높은 1,4-BDO 농도하에서 더 높은 수준으로 발현되는 단백질을 스크리닝하는 것일 수 있다. 두 가지 농도의 1,4-BDO를 처리한 후 상대적으로 더 높은 1,4-BDO 농도하에서 더 높은 수준으로 발현하는 단백질을 선별할 수 있다. 또한, 2 내지 n 의 서로 다른 농도의 1,4-BDO를 처리할 경우, 가장 낮은 농도의 1,4-BDO에 비하여 상대적으로 더 높은 수준으로 발현하는 공통 단백질을 선별할 수 있다(n은 2 이상의 정수). 또한, 농도가 높아짐에 따라 발현량이 함께 증가하는 단백질을 선별할 수 있다.
또한, 선별된 단백질을 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질로 선택하는 단계를 포함한다. 상기 단계를 통하여 탐색된 단백질은 1,4-BDO를 생산하는 데 관여하는 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 미생물이 1,4-BDO를 생산하기 위하여 직접적 또는 간접적으로 관여하는 단백질일 수 있다. 상기 발현이 증가되는 단백질은 세포 내에서 발현된 것일 수 있다.
상기 배양하는 단계는 1,4-BDO 생산능이 없는 야생형 미생물 및 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 선별하는 단계는 1,4-BDO 생산능이 없는 야생형 미생물에 비하여 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주에서 발현이 증가된 단백질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
1,4-BDO 생산능이 없는 야생형 미생물 및 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주를 배양하고, 미생물이 생산하는 단백질을 분석하여, 야생형에 비하여 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주에서 더 높은 수준으로 발현되는 단백질을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
사용되는 1,4-BDO 생산능이 없는 야생형 미생물 및 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주는 상기 방법에서 사용된 1,4-BDO를 생산하는 미생물과 동일한 미생물을 사용한다. 또한, 이때, 야생형 미생물은 1,4-BDO를 생산하도록 변이되기 이전의 미생물을 의미한다. 이때, 배양조건은 상기 스크리닝 방법에서 사용된 조건과 동일할 수 있다. 이때, 야생형 미생물 및 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주는 동일한 1,4-BDO의 농도에서 배양될 수 있다. 또한, 1,4-BDO의 부존재 하에서 배양될 수 있다. 상기 발현이 증가되는 단백질은 세포 내에서 발현된 것일 수 있다.
또한, 상기에서 높은 수준으로 발현되는 단백질을 비교하여 스크리닝 단계에서 공통적으로 발현되는 단백질을 선별하는 단계를 포함한다.
서로 다른 1,4-BDO를 첨가시, 상대적으로 높은 1,4-BDO를 첨가한 미생물에서 높은 수준으로 발현을 하는 단백질을 선별할 수 있다. 또한, 1,4-BDO를 첨가하지 않은 경우에 비하여 증가하는 단백질로 선별할 수 있다, 또한, 상대적으로 높은 농도의 1,4-BDO를 첨가시, 상대적으로 높은 수준으로 발현되는 단백질을 선별할 수 있다. 또한, 모든 농도의 1,4-BDO 첨가시 공통적으로 발현되는 단백질일 수 있다. 또한, 농도가 증가할수록 발현 수준이 점차 증가하는 단백질일 수 있다.
이와 같은 스크리닝을 통하여 과발현하는 단백질을 확인할 수 있다. 일례로, 상기 단백질은 시트레이트 신타아제 (Ncgl0630), Ncgl2145 등일 수 있다. Ncgl0630, Ncgl2145 등과 같이 과발현되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 1,4-BDO를 생산하는 미생물에 도입하여 과발현시, 1,4-BDO의 생산을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 일례에서, Ncgl0630이 도입된 균주는 대조군에 비하여 1,4-BDO 생산성이 49% 증가하였다. 또한, Ncgl2145이 도입된 균주는 대조군에 비하여 1,4-BDO 생산성이 18% 증가하였다. 이로써, 상기 스크리닝 방법이 1,4-BDO를 생산하는데 관여하는 단백질을 효과적으로 스크리닝 할 수 있음을 확인하였다.
일 측면은 상기 방법으로 선별된 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 미생물에 관한 것이다. 일 구체예는 시트레이트 신타아제 활성이 증가되어 있는 1,4-BDO를 생산하는 미생물을 제공한다. 상기 시트레이트 신타아제의 활성은 야생형에 비하여 증가된 것일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 1,4-BDO를 높은 수준으로 생산할 수 있다.
상기 미생물은 1,4-BDO를 생산하는 미생물로서 야생형 미생물 또는 형질전환 미생물일 수 있다. 상기 형질전환된 미생물은 야생형 미생물에 1,4-BDO를 생산하기에 적합한 유전자를 삽입, 결실 또는 치환하여 제작할 수 있다. 또한, 형질전환은 하나 이상의 유전자를 변형하여 수행될 수 있다. 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum , 이하 CGL 이라 함)일 수 있다. 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL은, ldhA의 활성이 제거될 수 있다. 또한, 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL에 cat1, sucD, 4hbD, cat2 및 adhE 유전자가 도입될 수 있다.
상기 시트레이트 신타아제는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 유전자 일 수 있다. 또한, 상기 시트레이트 신타아제를 구성하는 단백질 서열은, 상기 서열이 시트레이트 신타아제의 본래 활성을 갖는 한 일부 서열이 치환, 변경, 결실 될 수 있다. 또한, 상기 시트레이트 신타아제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 시트레이트 신타아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 시트레이트 신타아제을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 서열번호 2의 핵산 서열을 가질 수 있다. 상기 핵산이 코딩하는 단백질이 시트레이트 신타아제의 활성을 갖는한, 상기 핵산은 일부 서열이 치환, 변경, 결실 될 수 있다. 또한, 상기 핵산이 코딩하는 단백질이 시트레이트 신타아제의 활성을 갖는한, 상기 핵산과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가진 핵산 서열일 수 있다.
시트레이트 신타아제의 활성의 증가는 시트레이트 신타아제를 코딩하는 핵산을 세포내에서 과발현됨으로서 이루어질 수 있다. 또한, 상기 핵산은 핵산 그 자체 또는 벡터에 삽입되어 미생물내로 도입될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 벡터상에서 발현될 수도 있으나, 미생물내의 크로모좀상에 삽입되어 과발현될 수 있다.
본 명세서내에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터 등이 사용될 수 있다.
발현용 벡터로서 작동을 하려면 복제원점, 프로모터, MCS 및 선택 마커를 함유할 수 있다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해 주고, 프로모터는 삽입되는 외래 유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 다중 클로닝 사이트로서 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 한다. 선택 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 들어갔는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선택 마커는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있고, 비용의 측면을 고려하여 앰피실린 또는 겐타마이신 내성 유전자가 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 강한 프로모터, 예컨대 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 또는 tac 프로모터 등을 포함하며, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 람다 PL 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 또는 tac 프로모터 일 수 있다. 이와 같은 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 연결되어 있다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
또 다른 구체예는 야생형 미생물에 비해서 Ncg12145 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 상기 미생물은 Ncg12145 단백질을 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 미생물을 제공한다. Ncg12145 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, Ncg12145 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 Ncg12145을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 서열번호 4의 핵산 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 서열번호 3을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4의 절편 또는 상기 핵산과 80% 이상, 또는 85% 이상, 또는 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산일 수 있다. 일례로, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 4에 의해 코딩되는 것일 수 있다. 또한, 상기 미생물은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 도입된 1,4-BDO를 생산하는 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 야생형 미생물에 비해서 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 더 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 1,4-BDO를 높은 수준으로 생산할 수 있다.
또한, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 1,4-BDO의 생산을 위하여 야생형 CGL은, ldhA의 활성이 제거될 수 있다. 또한, 1,4-BDO의 생산을 위하여 야생형 CGL에 cat1, sucD, 4hbD, cat2 및 adhE 유전자가 도입될 수 있다.
또 다른 구체예는 야생형 미생물에 비해서 시트레이트 신타아제 및 Ncgl2145 (hyperthetical protein)을 코딩하는 핵산이 더 도입된 미생물을 제공한다. 상기 두 가지 효소가 동시에 과발현되는 미생물은 1,4-BDO를 높은 수준으로 생산할 수 있다.
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 상기 시트레이트 신타아제는 서열번호 1의 단백질 서열을 가질 수 있다. 또한, 서열번호 1의 단백질은 서열번호 2의 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 시트레이트 신타아제는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 유전자 일 수 있다. 상기 Ncgl2145은 서열번호 3의 단백질 서열을 가질 수 있다. 또한, 서열번호 3의 단백질은 서열번호 4의 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL은, ldhA의 활성이 제거될 수 있다. 또한, 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL에 cat1, sucD, 4hbD, cat2 및 adhE를 코딩하는 핵산이 도입될 수 있다.
일 측면은 탐색된 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질을 코딩하는 핵산을 1,4-BDO를 생산하는 미생물에 도입하는 단계;를 포함하는, 1,4-BDO 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질은 시트레이트 신타아제 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 시트레이트 신타아제는 서열번호 1의 아미노산을 갖는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 시트레이트 신타아제는 서열번호 2의 서열을 갖는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 3의 아미노산을 갖는 단백질은 서열번호 4의 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL은, ldhA의 활성이 제거될 수 있다. 또한, 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL에 Cat1, SucD, 4HbD, Cat2 및 AdhE으로 이루어진 군에서 어느 하나의 단백질을 코딩하는 핵산이 도입될 수 있다. 또한, 상기 미생물은 Cat1, SucD, 4HbD, Cat2 및 AdhE을 모두 포함하는 것일 수 있다.
일 측면은 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질을 코딩하는 핵산을 1,4-BDO를 생산하는 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물로부터 1,4-BDO를 수득하는 단계를 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL은, ldhA의 활성이 제거될 수 있다. 또한, 1,4-BDO 생산을 위하여 야생형 CGL에 sucD, 4hbD, cat2 및 adhE 유전자가 도입될 수 있다. 또한, 상기 미생물은 cat1을 코딩하는 핵산 또는 sucCD를 코딩하는 핵산을 더 포함할 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 단밸질을 코딩하는 핵산을 세포내에서 과발현됨으로서 이루어질 수 있다. 또한, 상기 핵산은 핵산 그 자체 또는 벡터에 삽입되어 미생물내로 도입될 수 있다. 또한, 상기 핵산은 벡터상에서 발현될 수도 있으나, 미생물내의 크로모좀상에 삽입되어 과발현될 수 있다. 발현용 벡터로서 작동을 하려면 복제원점, 프로모터, MCS 및 선택 마커를 함유 할 수 있다.
일 구체예는 시트레이트 신타아제가 과발현되거나, Ncgl2145이 도입된 미생물 또는 스크리닝된 단백질을 코딩하는 핵산이 도입된 미생물을 배양하는 단계 및 배양액에서 1,4-BDO를 수득하는 단계를 포함하는 1,4-BDO를 높은 수율로 생산하는 방법을 제공한다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 배양은 혐기성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 용어 "혐기성 조건"은 정상 대기상태보다 산소의 함량이 적은 상태를 의미한다. 혐기성 조건은 예를 들면, 이산화탄소 또는 질소를 약 0.1 내지 0.4 vvm (Volume per Volume per minute), 약 0.2 내지 0.3 vvm, 또는 약 0.25 vvm의 유속으로 공급하여 조성될 수 있다. 또한, 혐기성 조건은 통기 속도가 약 0 내지 0.4 vvm, 약 0.1 내지 0.3 vvm, 약 0.15 내지 0.25 vvm인 것일 수 있다.
이후, 배양물로부터 생산된 C4 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 생산된 C4 유기화합물을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 생산된 C4 화합물은 숙시네이트(succinate), 푸마르산(fumaric acid), 말릭산(malic acid), 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있다. 본 발명에 일례에 따르면, 4-히드록시부티레이트(4-HB), 1,4-부탄디올(1,4-BDO) 또는 이로부터 유래한 C4 화합물 일 수 있다. 일 구현예로, 상기 4-히드록시부티레이트의 회수는 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 또는 이들의 조합에 의하여 이루어질 수 있다.
일 구체예는 고효율의 1,4-BDO 생산을 위한 효과적으로 유전자 발굴할 수 있다. 또한, 이와 같이 발굴된 시트레이트 신타아제를 코딩하는 Ncgl0630 유전자와 Ncgl2145 유전자를 과발현하는 미생물은 효과적으로 1,4-BDO를 생산할 수 있다. 이러한 방법 및 상기 유전자를 통하여 효과적인 1,4-BDO 생산이 가능하다.
도 1은 WT와 1,4-BDO를 생산하는 CGL 균주에, 1,4-BDO 농도를 다르게 하여 처리하였을시 발현되는 성장곡선을 비교한 것을 나타낸 것이다. 이때, WT+BDO 25, 50, 100은 야생형 CGL에 1,4-BDO를 각각 25 g/L, 50 g/L, 100 g/L 추가한 것을 의미한다. 또한, adhE2+BDO 25, 50, 100은 1,4-BOD를 생산할 수 있도록 형질전환된 CGL에 1,4-BDO를 각각 25 g/L, 50 g/L, 100 g/L 추가한 것을 의미한다.
도 2는 CGL 균주에서 생산되는 단백질의 2D-겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다. LB 배지, 온도 30℃에서 배양한 후 균주에서 생산한 단백질을 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 CGL 균주에서 생산되는 단백질의 2D-겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다. LB 배지, 온도 30℃에서 배양한 후 균주에서 생산한 단백질을 나타낸 것이다.
도 4는 CGL의 2D-겔 전기영동 결과, 강도가 증가한 스팟을 나타낸다. 왼쪽 도면은 WT에서 100g/L의 1,4-BDO를 처리했을 때 발현되는 단백질을 관찰한 것이다. 또한, 오른쪽 도면은 adhE가 과발현되는 균주에서 100g/L의 1,4-BDO를 처리했을 때 발현되는 단백질을 관찰한 것이다
도 5는 동정한 유전자 과발현 CGL의 1,4-BDO 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 이때, pEKEx1은 대조군으로 공벡터를 의미하며, pEk0827은 Ncgl0827가 발현되는 벡터를 의미하며, pEk2145 은 Ncgl2145가 발현되는 벡터를 의미하며, pEk0630 은 Ncgl0630가 발현되는 벡터를 의미하며, pEk2826 은 Ncgl2826가 발현되는 벡터를 의미한다.
도 2는 CGL 균주에서 생산되는 단백질의 2D-겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다. LB 배지, 온도 30℃에서 배양한 후 균주에서 생산한 단백질을 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 CGL 균주에서 생산되는 단백질의 2D-겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다. LB 배지, 온도 30℃에서 배양한 후 균주에서 생산한 단백질을 나타낸 것이다.
도 4는 CGL의 2D-겔 전기영동 결과, 강도가 증가한 스팟을 나타낸다. 왼쪽 도면은 WT에서 100g/L의 1,4-BDO를 처리했을 때 발현되는 단백질을 관찰한 것이다. 또한, 오른쪽 도면은 adhE가 과발현되는 균주에서 100g/L의 1,4-BDO를 처리했을 때 발현되는 단백질을 관찰한 것이다
도 5는 동정한 유전자 과발현 CGL의 1,4-BDO 생산성을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 이때, pEKEx1은 대조군으로 공벡터를 의미하며, pEk0827은 Ncgl0827가 발현되는 벡터를 의미하며, pEk2145 은 Ncgl2145가 발현되는 벡터를 의미하며, pEk0630 은 Ncgl0630가 발현되는 벡터를 의미하며, pEk2826 은 Ncgl2826가 발현되는 벡터를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실시예
1. 내재적
락테이트
데히드로게나제
유전자가 결실된
코리네박테리아
속 미생물의 준비
혐기 조건 하에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)을 배양하는 경우 세포내 아세틸-CoA의 농도가 낮아지는 점을 발견하였다. 따라서 TCA 사이클 활성 저하가 아세틸-CoA의 농도 저하에 의하여 야기되는 것으로 가정하였다. 또한, 이러한 문제점을 해소하기 위한 방법을 찾기 위한 실험을 설계하였다. 이를 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 자연형 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰에서 Pdh 효소 활성을 측정하기 용이하도록 내재적 락테이트 데히드로게나제 유전자를 결실시켜, 내재적 락테이트 데히드로게나제 유전자가 결실된 △ldh 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 (이하 기본 균주라 함)을 제작하였다.
1.1.
치환 벡터(
replacement
vector
)의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum, CGL) ATCC 13032의 L-락테이트 데히드로게나제(ldh) 유전자를 pK19 mobsacB(ATCC 87098) 벡터를 사용하여 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다. ldh 유전자를 제거하기 위한 두 상동 부위는 주형으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 통한 증폭에 의하여 얻었다. 상기 상동 부위는 ldh 유전자의 상류(upstream) 및 하류(downstream) 부위로서, 각각 ldhA_5'_HindIII(서열번호 17) 및 ldhA_up_3'_XhoI(서열번호 18)의 프라이머 세트와, ldhA_dn_5'_XhoI(서열번호 19) 및 ldhA_3'_EcoRI(서열번호 20)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. PCR 증폭은 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링, 및 72℃에서 30초간 신장단계를 30회 반복함으로써 수행하였다. 이하 모든 PCR 증폭은 이와 동일한 조건으로 수행하였다. 얻어진 증폭 산물을 pK19 mobsacB 벡터의 HindIII 및 EcoRI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_△ldh 벡터를 제작하였다.
1.2.
CGL
(△ldh) 균주 제조
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 전기천공법(electroporation)을 통해 상기 pK19_△ldh 벡터를 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. LBHIS 배지는 18.5 g/L 뇌-심장 침출배지(brain-heart infusion broth), 0.5 M 솔비톨(sorbitol), 5 g/L 박토-트립톤(bacto-tryptone), 2.5 g/L 박토-효모 추출물(bacto-yeast extract), 5 g/L NaCl 및 18 g/L 박토-아가(bacto-agar)를 포함한다. 이하 LBHIS 배지의 조성은 이와 동일하다. 형성된 콜로니를 LB-수크로스 배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였고, ldhA up(서열번호 21) 및 ldhA down(서열번호 22)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 ldh 유전자 결실 여부를 확인하였다. 그 결과, CGL (△ldh) 균주 (B005)를 얻었다.
실시예
2. 1,4-
BDO
를 생산하기 위한 유전자 도입
2.1.
pK19
gapA
::4G 벡터를 제작
상기에서 준비한 균주를 기반으로 하여 1,4-BDO를 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 제작하였다. cat1, sucD 4hbD cat2의 4종의 유전자를 염색체 내에 삽입하기 위하여, pK19 mobsacB에 기반하여 cat1, sucD, 4hbD 및 cat2 유전자 삽입용 벡터 pK19 gapA::4G를 제작하였다. 서열번호 23의 핵산 서열을 갖는 4G 유전자 전체를 합성하여 pK19 mobsacB벡터의 NheI 및 XbaI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19 gapA::4G 벡터를 제작하였다.
2.2.
CGL
(△
ldh
4G) 균주 제조
CGL (△ldh) 에 전기천공법(electroporation)을 통해 상기 pK19 gapA::4G 벡터를 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 형성된 콜로니를 LB-수크로스 배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였고, 0049-1 for (서열번호 24) 및 0049-2 rev (서열번호 25)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 4G 유전자 도입 여부를 확인하였다. 그 결과, CGL (△ldh 4G) 균주를 얻었다.
실시예
3.
adhE2
유전자를 도입한 균주의 제조
3.1.
pK19
gapA
::
adhE2
벡터의 제작
또한, adhE2 유전자를 염색체 내에 삽입하기 위하여, pK19 mobsacB에 기반하여 adhE2 유전자 삽입용 벡터 pK19 gapA::adhE2를 제작하였다. 서열번호 26의 핵산 서열을 갖는 adhE2 유전자 전체를 합성하여 pK19 mobsacB벡터의 SmaI 제한효소 위치에 클로닝하여 pK19_adhE2 벡터를 제작하였다.
3.2.
CGL
(△
ldh
4G
adhE2
) 균주 제조
CGL (△ldh 4G) 에 전기천공법(electroporation)을 통해 상기 pK19 gapA::adhE2 벡터를 도입하였다. 도입된 균주를 25 ㎍/ml의 카나마이신을 함유한 LBHIS 배지에 도말하여 30℃에서 배양하였다. 형성된 콜로니를 LB-수크로스 배지에 도말하여 30℃에서 배양하여 이중 교차가 일어난 것만을 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 게놈 DNA를 분리하였고, AdhE2_1_F (서열번호 27) 및 AdhE2_2260_R (서열번호 28)의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 통해 adhE2 유전자 도입 여부를 확인하였다. 그 결과 1,4-BDO를 생산할 수 있는 CGL (△ldh 4G adhE2)를 얻었다.
실시예
4: 1,4-
BDO
생산 효과 유전자 탐색
CGL의 WT과 1,4-BDO를 생산하는 변이주(△ldhA, cat1, sucD 4hbD cat2 adhE)를 LB 배지, 온도 30℃에서 배양하였다, CGL의 WT과 1,4-BDO를 생산하는 변이주(△ldhA, cat1, sucD 4hbD cat2 adhE)의 대수기(exponential phase)에서 OD600이 1.5 ~ 2.5 이었을 시, 0, 25, 50, 100g/L 1,4-BDO를 투여하였다. 0, 1, 3, 5h 시간별로 샘플링을 하여 2DE 겔 전기영동을 통하여 전체 단백질 발현 변화를 비교하였다(도면 3 참조). 그 중 중복적으로 증가하는 스팟 7개를 선정하였으며(도면 4), MALDI/MS를 통하여 Ncgl0827, Ncgl2145, Ncgl0630 및 Ncgl2826 를 동정하였다.
실시예
5:
동정된
단백질을 과발현하는 1,4-
BDO
생산 변이주 제작
탐색된 단백질이 실제로 1,4-BDO의 생산에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 탐색된 단백질이 도입된 미생물을 제작하였다. 이를 위하여 탐색된 단백질을 코딩하는 서열을 벡터에 도입하고, 도입된 벡터를 CGL에 도입하였다. 상기 CGL은 1,4-BDO를 생산할 수 있는 변이주를 사용하였다.
Ncgl0630 유전자(서열번호 2), Ncgl2145 유전자(서열번호 4), Ncgl0827 유전자(서열번호 5) 및 Ncgl2826 유전자(서열번호 6)는 pEKEx1 벡터(A family of Corynebacterium glutamicum / Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression and promoter probing. Gene, 102 (1991) 93-98) 내 MCS에 삽입되어 tac 프로모터에 의해 발현되었다. Ncgl0630 유전자는 제한효소 EcoRI, SalI 인지서열을 이용하여 삽입하였고, Ncgl2145, Ncgl0827, Ncgl2826 유전자는 각각 제한효소 BamHI, PstI 인지서열을, EcoRI (single) 인지서열을, EcoRI, BamHI 인지서열을 이용하여 삽입하였다. 각 유전자가 삽입된 발현벡터(pEK0630, pEK2145, pEK0827, pEK2826)와 대조군으로 pEKEx1 공벡터(Ref)를 각각 1,4-BDO를 생산할 수 있는 변이주 C024(△ldhA, cat1 sucD 4hbD cat2 adhE2)에 도입하여 총 5개의 균주를 제작하였다.
실시예
6: 동정한 유전자 과발현
CGL
의 1,4-
BDO
생산성 비교
대조군 포함 상기에서 제작한 CGL 변이주, 총 5개를 발효를 통하여 1,4-BDO 생산성을 비교하였다. 우선 일정하게 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양 후 일정 시간이 흐른뒤 배지중의 산소량을 줄여 혐기성 조건으로 변화하여 발효가 일어나게 하였다.
5개의 변이주 콜로니를 항생제 카나마이신 25 ㎍/mL을 포함하는 LB 배지 3mL에 각각 접종하여 30℃, 220rpm에서 12시간 배양하였다. 이를 항생제 카나마이신 25 ㎍/mL과 tac 프로모터 발현을 유도하기 위한 물질인 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 0.5 mM을 포함하는 LB배지 50mL에 다시 접종하여 250mL 플라스크에서 30℃ 220rpm으로 24시간 배양하였다. 그 후 혐기성 조건으로 변화시키기 위해 배양액을 125mL 플라스크로 옮기고 공기가 공급되지 않도록 필름으로 밀봉하여 30℃ 90rpm으로 72시간 배양하였다. 최종 시점의 배양액에서 원심분리를 통해 균주 세포를 분리한 후 상등액을 HPLC로 분석하여 1,4-BDO 를 정량하였다. Ncgl0630의 경우 대조군에 비해 1,4-BDO 생산성이 49% 증가하였으며 Ncgl2145은 대조군에 비해 18% 증가하였다.
1,4-BDO 생산을 증가시킬 수 있는 유전자를 proteomics 데이터를 기반으로 발굴하는 스크리닝 방법을 이용하면 효과적으로 1,4-BDO 생산 관련 유전자를 발굴할 수 있다. 이러한, 방법으로 보다 많은 1,4-BDO 생산성과 관련된 단백질을 발굴할 수 있어 생산성을 증대시킬 수 있으므로, 산업적으로 이용가능성이 크다고 판단된다. 또한, 이와 같은 방법으로 선별한 단백질인 Ncgl0630 (citrate synthase)와 Ncgl2145 (hyperthetical protein)을 과발현하는 미생물은 산업적으로 효과적으로 이용될 수 있다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd
<120> A screening method of identification of gene for 1,4-BDO
production of producing C4-chemicals using the same
<130> PN098079
<160> 28
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 383
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
Met Ser Ser Ala Thr Thr Thr Asp Val Arg Lys Gly Leu Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ile Ala Asp Tyr Thr Ala Val Ser Lys Val Met Pro Glu Thr Asn Ser
20 25 30
Leu Thr Tyr Arg Gly Tyr Ala Val Glu Asp Leu Val Glu Asn Cys Ser
35 40 45
Phe Glu Glu Val Phe Tyr Leu Leu Trp His Gly Glu Leu Pro Thr Ala
50 55 60
Gln Gln Leu Ala Glu Phe Asn Glu Arg Gly Arg Ser Tyr Arg Ser Leu
65 70 75 80
Asp Ala Gly Leu Ile Ser Leu Ile His Ser Leu Pro Lys Glu Ala His
85 90 95
Pro Met Asp Val Met Arg Thr Ala Val Ser Tyr Met Gly Thr Lys Asp
100 105 110
Ser Glu Tyr Phe Thr Thr Asp Ser Glu His Ile Arg Lys Val Gly His
115 120 125
Thr Leu Leu Ala Gln Leu Pro Met Val Leu Ala Met Asp Ile Arg Arg
130 135 140
Arg Lys Gly Leu Asp Ile Ile Ala Pro Asp Ser Ser Lys Ser Val Ala
145 150 155 160
Glu Asn Leu Leu Ser Met Val Phe Gly Thr Gly Pro Glu Ser Pro Ala
165 170 175
Ser Asn Pro Ala Asp Val Arg Asp Phe Glu Lys Ser Leu Ile Leu Tyr
180 185 190
Ala Glu His Ser Phe Asn Ala Ser Thr Phe Thr Ala Arg Val Ile Thr
195 200 205
Ser Thr Lys Ser Asp Val Tyr Ser Ala Ile Thr Gly Ala Ile Gly Ala
210 215 220
Leu Lys Gly Pro Leu His Gly Gly Ala Asn Glu Phe Val Met His Thr
225 230 235 240
Met Leu Ala Ile Asp Asp Pro Asn Lys Ala Ala Ala Trp Ile Asn Asn
245 250 255
Ala Leu Asp Asn Lys Asn Val Val Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr
260 265 270
Lys Arg Gly Asp Ser Arg Val Pro Ser Met Glu Lys Ser Phe Arg Glu
275 280 285
Leu Ala Ala Arg His Asp Gly Glu Lys Trp Val Ala Met Tyr Glu Asn
290 295 300
Met Arg Asp Ala Met Asp Ala Arg Thr Gly Ile Lys Pro Asn Leu Asp
305 310 315 320
Phe Pro Ala Gly Pro Ala Tyr His Leu Leu Gly Phe Pro Val Asp Phe
325 330 335
Phe Thr Pro Leu Phe Val Ile Ala Arg Val Ala Gly Trp Thr Ala His
340 345 350
Ile Val Glu Gln Tyr Glu Asn Asn Ser Leu Ile Arg Pro Leu Ser Glu
355 360 365
Tyr Asn Gly Glu Glu Gln Arg Glu Val Ala Pro Ile Glu Lys Arg
370 375 380
<210> 2
<211> 1152
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
atgtccagcg ccacaaccac tgatgttcgc aaagggctct acggagtcat cgccgattac 60
acggccgttt ccaaagtcat gccagagacc aattcactga cctaccgtgg ctacgcggtg 120
gaagatttgg tggaaaactg cagcttcgag gaggtgtttt acctcctgtg gcacggcgag 180
ctgcccactg cgcaacaact tgcggagttc aatgagcgtg gccgttccta ccgctccctg 240
gatgccggtt tgatctccct gatccactct ttgcccaaag aagcccaccc gatggatgtt 300
atgcgcaccg cggtgtccta catgggcacc aaggattccg agtatttcac caccgattct 360
gagcacatcc gcaaagttgg ccacaccttg ttggcgcagc ttccgatggt gctagccatg 420
gatattcgtc gccgcaaggg cctcgatatc atcgcccctg actccagcaa gtcagtcgcc 480
gaaaacctgc tgtctatggt gtttggtact ggcccggaat cacctgcatc caacccagct 540
gacgtccgcg attttgagaa atcactgatc ctctacgccg agcactcctt caacgcctcc 600
accttcaccg cccgcgtgat cacctccacc aaatcggatg tgtactccgc aatcaccggc 660
gcgatcggtg ctctcaaggg cccattgcac ggtggcgcca acgagtttgt catgcacacc 720
atgttggcga tcgacgatcc caacaaggcc gccgcctgga tcaacaacgc tttggacaac 780
aagaatgtgg tcatgggctt tggccaccgc gtgtacaagc gcggcgattc ccgcgtgcca 840
tcaatggaga agtccttccg ggaattagct gcccgccacg acggcgaaaa gtgggttgcc 900
atgtatgaaa acatgcgcga cgccatggac gcccgcaccg gcatcaagcc gaatctcgat 960
ttccctgctg gccctgccta ccacctgctc ggtttcccgg tcgatttctt caccccgctg 1020
ttcgtcatcg cccgcgtcgc cggctggacg gcccacatcg tggagcagta cgaaaacaac 1080
tcgctcatcc gcccactgtc cgagtacaac ggcgaggagc agcgcgaggt cgcgcccatt 1140
gaaaagcgct aa 1152
<210> 3
<211> 160
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
Met Ala Ile Lys Leu Ser Ile Asp Leu Ser Asp Ala Thr Phe Ala Glu
1 5 10 15
Leu Ser Ala Val Ile Gly Tyr Ala His Gln Leu Gly Val Asp Ala Asp
20 25 30
Glu Lys Leu Thr Phe Glu Gly Thr Val Leu Asn Ile Glu Phe Asp Gly
35 40 45
Asp Leu Gln Phe Asp Asp Val Phe Asp Ala Phe Asp Glu Ala Glu Ile
50 55 60
Glu Leu Asp Asn Pro Arg Glu Asp Gly Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Leu
65 70 75 80
Ile Asp Glu Asp Glu Asp Tyr Arg Ala Gln Thr Lys Ser Gln Ile Asn
85 90 95
Asp Glu Val Ile Asn Glu Ile Arg Asp Gly Ile Ser Ser Phe Val Asp
100 105 110
Gly Ile Val Asn Gly Leu Gly Gln Gly Arg Arg Gly Gly Arg Tyr Gly
115 120 125
Asp Phe Gly Gly Pro Arg Gly Pro Arg Gly Pro Arg Asn Asp Gly Pro
130 135 140
Phe Gly Pro Phe Gly Pro Phe Gly Pro Gly Tyr Arg Gly Pro Arg Phe
145 150 155 160
<210> 4
<211> 483
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
atggcaatca agctgtccat tgacctatca gatgcaacat tcgcagaact ttcggcagtc 60
atcggttacg cacatcagtt gggtgttgat gcggatgaga agctcacctt tgaaggtaca 120
gtccttaaca ttgaattcga cggcgacctt cagtttgatg atgtttttga tgcctttgat 180
gaggcggaaa ttgagctcga caaccctcgc gaagacggcc ccatctacgc agatgatctg 240
atcgatgagg atgaggacta ccgcgcacag accaagagcc agatcaacga cgaggttatc 300
aacgagatcc gcgatggtat ttcaagcttc gttgatggca tcgtaaatgg ccttggccag 360
ggtcgccgcg gtggacgtta cggtgatttc ggtgggccac gcggccctcg cggtccacgc 420
aatgacggtc cattcggccc atttggacca ttcggtccgg gataccgcgg tccgcgtttc 480
tag 483
<210> 5
<211> 1563
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 5
atgagcgatg atcgtaaggc aattaaacgc gcactaatta gcgtgtatga caagactggc 60
ctggaggatc tagcccaggc acttcaccgc gagaacgtgg aaattgtttc caccggatcc 120
actgcggcga agattgctga gcttggtatt cctgttaccc cggttgagga gctcaccggt 180
ttccctgagt gccttgaggg ccgtgtgaag acactgcacc ctaaggttca cgctggcatc 240
ttggcggaca cccgcaagga agaccacctg cgtcagctca aggaacttga ggtcgcccca 300
ttccagcttg tcgtggtgaa cctgtaccca tttgctgaga ccgttgcgtc cggcgccgat 360
ttcgatgctt gcgttgagca gatcgacatc ggaggcccat ccatggttcg tgctgcggca 420
aagaaccacc catctgtcgc tgtggttgtt tcaccgaacc gctacgagga tgtccaggaa 480
gctttgaaga ccggtggatt ctcccgcgcg gagcgcacca agttggctgc tgaggctttc 540
cgccacaccg caacctacga tgtcaccgtt gcaacctgga tgagcgagca gctggctgcc 600
gaagattctg agactgagtt cccaggttgg atcggcacca ccaacacctt gtcccgcagc 660
ttgcgttacg gtgagaaccc tcaccagtct gcagctttgt acgtgggcaa cacccgcgga 720
cttgcacagg ctaagcagtt ccacggcaag gaaatgagct acaacaacta caccgattct 780
gatgctgcat ggcgtgcagc gtgggatcac gagcgtcctt gtgtagctat catcaagcat 840
gcaaaccctt gtggcattgc tgtttctgat gagtccatcg cagcggcaca ccgcgaggca 900
cacgcatgtg actctgtgtc cgcattcggt ggcgtcatcg cgtccaaccg tgaagtcagc 960
gttgagatgg ctaaccaggt tgcagagatc ttcactgagg tcatcatcgc tccttcctat 1020
gaagagggcg ctgtggagat cctgagccag aagaagaaca tccgtattct tcaggctgaa 1080
gcacctgtgc gtaagggctt tgagtcccgt gagatctccg gcggtctgct tgttcaggaa 1140
cgcgacttga tccacgctga gggcgacaac tccgcaaact ggactcttgc tgccggctct 1200
gctgtttctc ctgaggttct gaaggacctg gagttcgcgt ggactgcagt tcgttccgtg 1260
aagtccaacg caattctgtt ggctaagaac ggcgctaccg ttggcgttgg catgggacag 1320
gtcaaccgcg ttgactctgc tcgcttggct gtcgaccgtg caggtgcaga gcgcgctacc 1380
ggttccgttg ctgcttccga tgcgttcttc ccattcgctg acggctttga ggttctcgct 1440
gaggctggca tcactgctgt tgtgcagcct ggtggatcca ttcgcgacaa cgaggtcatt 1500
gaggcagcca acaaggctgg cgtgaccatg tacctgactg gtgcgcgaca cttcgctcac 1560
taa 1563
<210> 6
<211> 603
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 6
atggctgtat acgaactccc agaactcgac tacgcatacg acgctctcga gccacacatc 60
gccgctgaaa tcatggagct tcaccactcc aagcaccacg caacctacgt tgcaggcgca 120
aatgcagcac tcgaggcact agagaaggca cgcgaagagg gcaccaaccc tgaccagatc 180
cgcgcactgt ccaagaacct tgcattcaac ctcggtggac acaccaacca ctccgttttc 240
tggaagaacc tctcccctaa cggtggtggc gagcctaccg gcgaactggc tgaggctatc 300
aaccgcgact tcggttcttt cgctaagttc caggatcact tcaactccgc agcactcggc 360
ctgcagggct ccggctgggc agttctcggc tacgaccaca tctccggtcg cctggttatc 420
gagcagctca ccgaccagca gggcaacatc tccgtcgaca tcaccccagt tctgatgctc 480
gatatgtggg agcacgcttt ctacctgcag tacaagaacg ttaaggcaga ttacgtcaag 540
gctgtttgga acgtcttcaa ctgggacgac gcagcagcac gcttcgcagc agcttccaag 600
taa 603
<210> 7
<211> 371
<212> PRT
<213> Clostridium kluyveri
<400> 7
Met Gln Leu Phe Lys Leu Lys Ser Val Thr His His Phe Asp Thr Phe
1 5 10 15
Ala Glu Phe Ala Lys Glu Phe Cys Leu Gly Glu Arg Asp Leu Val Ile
20 25 30
Thr Asn Glu Phe Ile Tyr Glu Pro Tyr Met Lys Ala Cys Gln Leu Pro
35 40 45
Cys His Phe Val Met Gln Glu Lys Tyr Gly Gln Gly Glu Pro Ser Asp
50 55 60
Glu Met Met Asn Asn Ile Leu Ala Asp Ile Arg Asn Ile Gln Phe Asp
65 70 75 80
Arg Val Ile Gly Ile Gly Gly Gly Thr Val Ile Asp Ile Ser Lys Leu
85 90 95
Phe Val Leu Lys Gly Leu Asn Asp Val Leu Asp Ala Phe Asp Arg Lys
100 105 110
Ile Pro Leu Ile Lys Glu Lys Glu Leu Ile Ile Val Pro Thr Thr Cys
115 120 125
Gly Thr Gly Ser Glu Val Thr Asn Ile Ser Ile Ala Glu Ile Lys Ser
130 135 140
Arg His Thr Lys Met Gly Leu Ala Asp Asp Ala Ile Val Ala Asp His
145 150 155 160
Ala Ile Ile Ile Pro Glu Leu Leu Lys Ser Leu Pro Phe His Phe Tyr
165 170 175
Ala Cys Ser Ala Ile Asp Ala Leu Ile His Ala Ile Glu Ser Tyr Val
180 185 190
Ser Pro Lys Ala Ser Pro Tyr Ser Arg Leu Phe Ser Glu Ala Ala Trp
195 200 205
Asp Ile Ile Leu Glu Val Phe Lys Lys Ile Ala Glu His Gly Pro Glu
210 215 220
Tyr Arg Phe Glu Lys Leu Gly Glu Met Ile Met Ala Ser Asn Tyr Ala
225 230 235 240
Gly Ile Ala Phe Gly Asn Ala Gly Val Gly Ala Val His Ala Leu Ser
245 250 255
Tyr Pro Leu Gly Gly Asn Tyr His Val Pro His Gly Glu Ala Asn Tyr
260 265 270
Gln Phe Phe Thr Glu Val Phe Lys Val Tyr Gln Lys Lys Asn Pro Phe
275 280 285
Gly Tyr Ile Val Glu Leu Asn Trp Lys Leu Ser Lys Ile Leu Asn Cys
290 295 300
Gln Pro Glu Tyr Val Tyr Pro Lys Leu Asp Glu Leu Leu Gly Cys Leu
305 310 315 320
Leu Thr Lys Lys Pro Leu His Glu Tyr Gly Met Lys Asp Glu Glu Val
325 330 335
Arg Gly Phe Ala Glu Ser Val Leu Lys Thr Gln Gln Arg Leu Leu Ala
340 345 350
Asn Asn Tyr Val Glu Leu Thr Val Asp Glu Ile Glu Gly Ile Tyr Arg
355 360 365
Arg Leu Tyr
370
<210> 8
<211> 431
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 8
Met Lys Asp Val Leu Ala Glu Tyr Ala Ser Arg Ile Val Ser Ala Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Lys His Ile Lys Asn Gly Glu Arg Val Ala Leu Ser His
20 25 30
Ala Ala Gly Val Pro Gln Ser Cys Val Asp Ala Leu Val Gln Gln Ala
35 40 45
Asp Leu Phe Gln Asn Val Glu Ile Tyr His Met Leu Cys Leu Gly Glu
50 55 60
Gly Lys Tyr Met Ala Pro Glu Met Ala Pro His Phe Arg His Ile Thr
65 70 75 80
Asn Phe Val Gly Gly Asn Ser Arg Lys Ala Val Glu Glu Asn Arg Ala
85 90 95
Asp Phe Ile Pro Val Phe Phe Tyr Glu Val Pro Ser Met Ile Arg Lys
100 105 110
Asp Ile Leu His Ile Asp Val Ala Ile Val Gln Leu Ser Met Pro Asp
115 120 125
Glu Asn Gly Tyr Cys Ser Phe Gly Val Ser Cys Asp Tyr Ser Lys Pro
130 135 140
Ala Ala Glu Ser Ala His Leu Val Ile Gly Glu Ile Asn Arg Gln Met
145 150 155 160
Pro Tyr Val His Gly Asp Asn Leu Ile His Ile Ser Lys Leu Asp Tyr
165 170 175
Ile Val Met Ala Asp Tyr Pro Ile Tyr Ser Leu Ala Lys Pro Lys Ile
180 185 190
Gly Glu Val Glu Glu Ala Ile Gly Arg Asn Cys Ala Glu Leu Ile Glu
195 200 205
Asp Gly Ala Thr Leu Gln Leu Gly Ile Gly Ala Ile Pro Asp Ala Ala
210 215 220
Leu Leu Phe Leu Lys Asp Lys Lys Asp Leu Gly Ile His Thr Glu Met
225 230 235 240
Phe Ser Asp Gly Val Val Glu Leu Val Arg Ser Gly Val Ile Thr Gly
245 250 255
Lys Lys Lys Thr Leu His Pro Gly Lys Met Val Ala Thr Phe Leu Met
260 265 270
Gly Ser Glu Asp Val Tyr His Phe Ile Asp Lys Asn Pro Asp Val Glu
275 280 285
Leu Tyr Pro Val Asp Tyr Val Asn Asp Pro Arg Val Ile Ala Gln Asn
290 295 300
Asp Asn Met Val Ser Ile Asn Ser Cys Ile Glu Ile Asp Leu Met Gly
305 310 315 320
Gln Val Val Ser Glu Cys Ile Gly Ser Lys Gln Phe Ser Gly Thr Gly
325 330 335
Gly Gln Val Asp Tyr Val Arg Gly Ala Ala Trp Ser Lys Asn Gly Lys
340 345 350
Ser Ile Met Ala Ile Pro Ser Thr Ala Lys Asn Gly Thr Ala Ser Arg
355 360 365
Ile Val Pro Ile Ile Ala Glu Gly Ala Ala Val Thr Thr Leu Arg Asn
370 375 380
Glu Val Asp Tyr Val Val Thr Glu Tyr Gly Ile Ala Gln Leu Lys Gly
385 390 395 400
Lys Ser Leu Arg Gln Arg Ala Glu Ala Leu Ile Ala Ile Ala His Pro
405 410 415
Asp Phe Arg Glu Glu Leu Thr Lys His Leu Arg Lys Arg Phe Gly
420 425 430
<210> 9
<211> 858
<212> PRT
<213> Clostridium acetobutyricum
<400> 9
Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu
1 5 10 15
Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp
20 25 30
Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn
35 40 45
Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp
50 55 60
Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr
65 70 75 80
Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly
85 90 95
Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro
100 105 110
Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu
115 120 125
Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys
130 135 140
Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala
145 150 155 160
Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu
165 170 175
Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly
180 185 190
Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile
195 200 205
Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp
210 215 220
Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn
225 230 235 240
Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile
245 250 255
Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu
260 265 270
Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly
275 280 285
Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys
290 295 300
Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu
305 310 315 320
Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser
325 330 335
Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys
340 345 350
Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser
355 360 365
Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly
370 375 380
Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln
385 390 395 400
Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr
405 410 415
Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu
420 425 430
Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn
435 440 445
Met Leu Trp Phe Lys Val Pro Gln Lys Ile Tyr Phe Lys Tyr Gly Cys
450 455 460
Leu Arg Phe Ala Leu Lys Glu Leu Lys Asp Met Asn Lys Lys Arg Ala
465 470 475 480
Phe Ile Val Thr Asp Lys Asp Leu Phe Lys Leu Gly Tyr Val Asn Lys
485 490 495
Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr
500 505 510
Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys
515 520 525
Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly
530 535 540
Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro
545 550 555 560
Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Ala Ile Asn Phe Met Asp Ile Arg Lys
565 570 575
Arg Ile Cys Asn Phe Pro Lys Leu Gly Thr Lys Ala Ile Ser Val Ala
580 585 590
Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val
595 600 605
Ile Thr Asn Asp Glu Thr Gly Met Lys Tyr Pro Leu Thr Ser Tyr Glu
610 615 620
Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met
625 630 635 640
Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala
645 650 655
Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu
660 665 670
Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr
675 680 685
Lys Asn Gly Thr Asn Asp Ile Glu Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala
690 695 700
Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys
705 710 715 720
His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ala Met His His Val Pro His Gly
725 730 735
Ile Ala Cys Ala Val Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Tyr Asn Ala Thr
740 745 750
Asp Cys Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Pro Gln Tyr Lys Ser Pro Asn
755 760 765
Ala Lys Arg Lys Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu Asn Leu Lys Gly
770 775 780
Thr Ser Asp Thr Glu Lys Val Thr Ala Leu Ile Glu Ala Ile Ser Lys
785 790 795 800
Leu Lys Ile Asp Leu Ser Ile Pro Gln Asn Ile Ser Ala Ala Gly Ile
805 810 815
Asn Lys Lys Asp Phe Tyr Asn Thr Leu Asp Lys Met Ser Glu Leu Ala
820 825 830
Phe Asp Asp Gln Cys Thr Thr Ala Asn Pro Arg Tyr Pro Leu Ile Ser
835 840 845
Glu Leu Lys Asp Ile Tyr Ile Lys Ser Phe
850 855
<210> 10
<211> 451
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 10
Met Glu Ile Lys Glu Met Val Ser Leu Ala Arg Lys Ala Gln Lys Glu
1 5 10 15
Tyr Gln Ala Thr His Asn Gln Glu Ala Val Asp Asn Ile Cys Arg Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Val Ile Tyr Glu Asn Ala Ala Ile Leu Ala Arg Glu Ala
35 40 45
Val Asp Glu Thr Gly Met Gly Val Tyr Glu His Lys Val Ala Lys Asn
50 55 60
Gln Gly Lys Ser Lys Gly Val Trp Tyr Asn Leu His Asn Lys Lys Ser
65 70 75 80
Ile Gly Ile Leu Asn Ile Asp Glu Arg Thr Gly Met Ile Glu Ile Ala
85 90 95
Lys Pro Ile Gly Val Val Gly Ala Val Thr Pro Thr Thr Asn Pro Ile
100 105 110
Val Thr Pro Met Ser Asn Ile Ile Phe Ala Leu Lys Thr Cys Asn Ala
115 120 125
Ile Ile Ile Ala Pro His Pro Arg Ser Lys Lys Cys Ser Ala His Ala
130 135 140
Val Arg Leu Ile Lys Glu Ala Ile Ala Pro Phe Asn Val Pro Glu Gly
145 150 155 160
Met Val Gln Ile Ile Glu Glu Pro Ser Ile Glu Lys Thr Gln Glu Leu
165 170 175
Met Gly Ala Val Asp Val Val Val Ala Thr Gly Gly Met Gly Met Val
180 185 190
Lys Ser Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ser Phe Gly Val Gly Ala Gly
195 200 205
Asn Val Gln Val Ile Val Asp Ser Asn Ile Asp Phe Glu Ala Ala Ala
210 215 220
Glu Lys Ile Ile Thr Gly Arg Ala Phe Asp Asn Gly Ile Ile Cys Ser
225 230 235 240
Gly Glu Gln Ser Ile Ile Tyr Asn Glu Ala Asp Lys Glu Ala Val Phe
245 250 255
Thr Ala Phe Arg Asn His Gly Ala Tyr Phe Cys Asp Glu Ala Glu Gly
260 265 270
Asp Arg Ala Arg Ala Ala Ile Phe Glu Asn Gly Ala Ile Ala Lys Asp
275 280 285
Val Val Gly Gln Ser Val Ala Phe Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ile Asn
290 295 300
Ile Pro Glu Gly Thr Arg Ile Leu Val Val Glu Ala Arg Gly Val Gly
305 310 315 320
Ala Glu Asp Val Ile Cys Lys Glu Lys Met Cys Pro Val Met Cys Ala
325 330 335
Leu Ser Tyr Lys His Phe Glu Glu Gly Val Glu Ile Ala Arg Thr Asn
340 345 350
Leu Ala Asn Glu Gly Asn Gly His Thr Cys Ala Ile His Ser Asn Asn
355 360 365
Gln Ala His Ile Ile Leu Ala Gly Ser Glu Leu Thr Val Ser Arg Ile
370 375 380
Val Val Asn Ala Pro Ser Ala Thr Thr Ala Gly Gly His Ile Gln Asn
385 390 395 400
Gly Leu Ala Val Thr Asn Thr Leu Gly Cys Gly Ser Trp Gly Asn Asn
405 410 415
Ser Ile Ser Glu Asn Phe Thr Tyr Lys His Leu Leu Asn Ile Ser Arg
420 425 430
Ile Ala Pro Leu Asn Ser Ser Ile His Ile Pro Asp Asp Lys Glu Ile
435 440 445
Trp Glu Leu
450
<210> 11
<211> 538
<212> PRT
<213> Clostridium kluyveri
<400> 11
Met Ser Lys Gly Ile Lys Asn Ser Gln Leu Lys Lys Lys Asn Val Lys
1 5 10 15
Ala Ser Asn Val Ala Glu Lys Ile Glu Glu Lys Val Glu Lys Thr Asp
20 25 30
Lys Val Val Glu Lys Ala Ala Glu Val Thr Glu Lys Arg Ile Arg Asn
35 40 45
Leu Lys Leu Gln Glu Lys Val Val Thr Ala Asp Val Ala Ala Asp Met
50 55 60
Ile Glu Asn Gly Met Ile Val Ala Ile Ser Gly Phe Thr Pro Ser Gly
65 70 75 80
Tyr Pro Lys Glu Val Pro Lys Ala Leu Thr Lys Lys Val Asn Ala Leu
85 90 95
Glu Glu Glu Phe Lys Val Thr Leu Tyr Thr Gly Ser Ser Thr Gly Ala
100 105 110
Asp Ile Asp Gly Glu Trp Ala Lys Ala Gly Ile Ile Glu Arg Arg Ile
115 120 125
Pro Tyr Gln Thr Asn Ser Asp Met Arg Lys Lys Ile Asn Asp Gly Ser
130 135 140
Ile Lys Tyr Ala Asp Met His Leu Ser His Met Ala Gln Tyr Ile Asn
145 150 155 160
Tyr Ser Val Ile Pro Lys Val Asp Ile Ala Ile Ile Glu Ala Val Ala
165 170 175
Ile Thr Glu Glu Gly Asp Ile Ile Pro Ser Thr Gly Ile Gly Asn Thr
180 185 190
Ala Thr Phe Val Glu Asn Ala Asp Lys Val Ile Val Glu Ile Asn Glu
195 200 205
Ala Gln Pro Leu Glu Leu Glu Gly Met Ala Asp Ile Tyr Thr Leu Lys
210 215 220
Asn Pro Pro Arg Arg Glu Pro Ile Pro Ile Val Asn Ala Gly Asn Arg
225 230 235 240
Ile Gly Thr Thr Tyr Val Thr Cys Gly Ser Glu Lys Ile Cys Ala Ile
245 250 255
Val Met Thr Asn Thr Gln Asp Lys Thr Arg Pro Leu Thr Glu Val Ser
260 265 270
Pro Val Ser Gln Ala Ile Ser Asp Asn Leu Ile Gly Phe Leu Asn Lys
275 280 285
Glu Val Glu Glu Gly Lys Leu Pro Lys Asn Leu Leu Pro Ile Gln Ser
290 295 300
Gly Val Gly Ser Val Ala Asn Ala Val Leu Ala Gly Leu Cys Glu Ser
305 310 315 320
Asn Phe Lys Asn Leu Ser Cys Tyr Thr Glu Val Ile Gln Asp Ser Met
325 330 335
Leu Lys Leu Ile Lys Cys Gly Lys Ala Asp Val Val Ser Gly Thr Ser
340 345 350
Ile Ser Pro Ser Pro Glu Met Leu Pro Glu Phe Ile Lys Asp Ile Asn
355 360 365
Phe Phe Arg Glu Lys Ile Val Leu Arg Pro Gln Glu Ile Ser Asn Asn
370 375 380
Pro Glu Ile Ala Arg Arg Ile Gly Val Ile Ser Ile Asn Thr Ala Leu
385 390 395 400
Glu Val Asp Ile Tyr Gly Asn Val Asn Ser Thr His Val Met Gly Ser
405 410 415
Lys Met Met Asn Gly Ile Gly Gly Ser Gly Asp Phe Ala Arg Asn Ala
420 425 430
Tyr Leu Thr Ile Phe Thr Thr Glu Ser Ile Ala Lys Lys Gly Asp Ile
435 440 445
Ser Ser Ile Val Pro Met Val Ser His Val Asp His Thr Glu His Asp
450 455 460
Val Met Val Ile Val Thr Glu Gln Gly Val Ala Asp Leu Arg Gly Leu
465 470 475 480
Ser Pro Arg Glu Lys Ala Val Ala Ile Ile Glu Asn Cys Val His Pro
485 490 495
Asp Tyr Lys Asp Met Leu Met Glu Tyr Phe Glu Glu Ala Cys Lys Ser
500 505 510
Ser Gly Gly Asn Thr Pro His Asn Leu Glu Lys Ala Leu Ser Trp His
515 520 525
Thr Lys Phe Ile Lys Thr Gly Ser Met Lys
530 535
<210> 12
<211> 1116
<212> DNA
<213> Clostridium kluyveri
<400> 12
atgcagcttt tcaagctcaa gagcgtcaca catcactttg atacttttgc agagtttgcc 60
aaggagttct gtctcggtga acgcgacttg gtaattacca acgagttcat ctacgaaccg 120
tatatgaagg catgccagct gccttgtcat tttgtgatgc aggagaaata cggccaaggc 180
gagccttctg acgagatgat gaacaacatc ctagcagata tccgtaatat ccagttcgac 240
cgcgtgatcg ggatcggagg tggtacggtt attgacatct caaaactctt tgttctgaag 300
ggattaaatg atgttctcga cgcgttcgat cgcaagattc cccttatcaa agagaaagaa 360
ctgatcattg tgcccaccac ctgcggaacc ggctcggagg tgacgaacat ttccatcgcc 420
gagatcaagt cccggcacac caagatgggt ttggctgacg atgcaattgt tgctgaccac 480
gccataatca tccctgaact tctgaagagc ttgcccttcc acttctatgc atgctccgca 540
atcgacgctc ttattcatgc catcgagtca tacgtttctc caaaagcgtc tccatactcc 600
cgtctgttca gtgaggcggc gtgggacatt atcctggaag ttttcaagaa aatcgccgaa 660
cacggcccag agtaccgctt cgagaagctg ggggaaatga tcatggccag caactatgcc 720
ggtatcgctt tcggcaacgc aggcgttggc gccgtccacg ctctatccta cccgttgggc 780
ggcaactatc acgtgccgca tggagaagca aactatcagt tcttcaccga ggtctttaaa 840
gtataccaaa agaagaatcc gttcggctat attgtcgaac tcaactggaa gctctccaag 900
attctgaact gccagccaga gtacgtgtac ccgaagctgg atgaactgct cggttgcctt 960
cttaccaaga aacctttgca cgaatacggc atgaaggacg aagaggttcg tggcttcgcg 1020
gaatcggtcc tgaagaccca gcaacgcttg ctcgccaaca actacgtcga acttactgtc 1080
gatgagatcg aaggtatcta ccgacgtctc tactag 1116
<210> 13
<211> 1296
<212> DNA
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 13
atgaaggatg tactggcgga atacgcctcc cgcattgttt cggcggagga ggccgttaag 60
cacatcaaaa acggtgaacg ggtagctttg tcacacgctg ccggcgtgcc tcagagttgc 120
gttgacgcac tggtgcagca ggccgacctt ttccagaatg tggaaatcta tcacatgctg 180
tgcctcggtg agggtaagta tatggcgcct gagatggccc ctcacttccg ccacatcacc 240
aactttgtcg gtggtaactc ccgtaaggcg gtcgaagaaa accgggccga tttcattccg 300
gtattctttt acgaggtgcc aagcatgatt cgcaaagaca tcctccacat tgatgtcgcc 360
atcgttcagc tttcaatgcc tgacgaaaat ggttactgtt cctttggagt atcttgcgat 420
tactccaagc cggcagcaga gagcgctcac ctggttatcg gagaaatcaa ccgtcaaatg 480
ccatacgtac acggcgacaa cttgattcat atctccaagt tggattacat cgtgatggca 540
gactacccca tctactctct tgcaaagccc aagatcgggg aagtcgagga agctatcggg 600
aggaattgtg ccgagcttat tgaagatggt gccactctcc agctgggaat cggcgcgatt 660
cctgatgcgg ccctgttatt tctcaaggac aaaaaggatc tgggcatcca taccgaaatg 720
ttctccgatg gtgttgtcga attggttcgc tccggcgtta tcacaggcaa gaaaaagact 780
cttcaccccg gaaagatggt cgcaaccttc ctgatgggaa gcgaggacgt gtatcatttc 840
atcgataaaa accccgatgt agaactgtat ccagtagatt acgtgaatga cccgcgtgtg 900
atcgcccaaa acgacaatat ggtctcgatt aacagctgca tcgaaatcga ccttatggga 960
caggtcgtgt ccgagtgcat cggctcaaag caattcagcg gcaccggcgg ccaagttgac 1020
tacgtgcgtg gcgcagcatg gtctaaaaac ggcaaatcga tcatggcaat cccgtccact 1080
gcaaaaaacg gtacggcatc tcgaattgta cctatcatcg cggagggcgc tgctgtcacc 1140
accctgcgca acgaggtcga ttacgttgta accgagtacg gtatcgctca gctcaagggc 1200
aagagcctgc gccagcgcgc agaggctttg atcgcgatag cccaccccga cttccgtgag 1260
gaactaacga aacatctccg caagcgattc ggataa 1296
<210> 14
<211> 2577
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutyricum
<400> 14
atgaaagtaa ccaatcagaa agagttgaag cagaagttga acgagctgcg agaggctcag 60
aagaagttcg caacctacac ccaggaacag gtggacaaga tctttaagca gtgtgccatt 120
gcagccgcga aagaacgtat taatctcgcg aaacttgcgg tcgaggaaac cggtattggg 180
ctggtagaag acaagatcat caagaaccac ttcgccgctg aatacatcta caacaagtac 240
aaaaacgaaa agacatgtgg tatcatcgac cacgacgaca gcttgggcat caccaaggta 300
gcggagccaa tcggtatcgt cgcagctatc gtgcccacta ctaaccctac ctccactgct 360
attttcaagt cactcatctc cctgaaaacc cgcaatgcta tcttcttctc acctcaccca 420
cgcgctaaga aatcaactat cgctgcagct aaacttatcc tggatgcagc cgtgaaagcc 480
ggggctccga aaaacatcat cggttggatc gacgaacctt ccattgaact ctctcaagac 540
ctcatgtccg aggcagacat tatcctggca accggaggcc catccatggt taaagcagct 600
tacagctcag gcaagccggc tatcggcgtt ggagctggta acactccagc aatcatcgac 660
gagtcggccg atatcgacat ggcagtgtcc tctattatcc tgtccaaaac ttatgacaac 720
ggcgttattt gcgcgtccga gcagtctatt ctcgtcatga actctattta cgagaaggta 780
aaggaggagt ttgtgaagcg ggggtcgtac attctgaacc agaacgagat cgctaagatc 840
aaagagacta tgtttaaaaa cggagccatc aacgcagata tcgtagggaa gtccgcgtac 900
atcattgcta agatggctgg aatcgaagtc cctcaaacca cgaaaattct gatcggcgag 960
gtgcaatcgg tcgaaaagtc cgagctgttc tcgcatgaaa agttgtcccc ggtcctcgcg 1020
atgtataaag ttaaggattt tgatgaagca ctcaagaaag ctcagcgcct gatcgaattg 1080
ggtggctcgg gtcacacctc ttccctctac attgactccc agaacaataa agataaggtg 1140
aaagagttcg gcctggctat gaagacgtct cgtaccttca tcaatatgcc ctcttcacag 1200
ggcgccagcg gtgaccttta caatttcgct atcgctccta gctttaccct cggctgcggc 1260
acctggggcg gtaattctgt gtcccaaaac gtcgaaccaa agcatctgct caacattaaa 1320
agcgtcgccg aacgtcgcga gaacatgttg tggttcaagg tcccgcaaaa aatctacttc 1380
aagtatggtt gcttgcgctt tgcacttaaa gagcttaagg acatgaataa aaagcgggcg 1440
ttcatcgtca ctgataagga tctgttcaaa ctgggctatg ttaacaagat taccaaggtc 1500
ctggatgaga tcgatatcaa gtattccatc ttcaccgata ttaagtccga tccgaccatt 1560
gattccgtga agaagggcgc gaaggagatg ctcaactttg aacccgacac gattatttct 1620
attggcggag gcagcccaat ggacgcagct aaggttatgc acctgctgta tgagtaccca 1680
gaagcagaga tcgagaacct tgcaatcaat ttcatggata ttcgcaaacg catttgcaac 1740
tttcctaagc ttggtacaaa agctatctct gttgcgatcc ctaccaccgc aggaaccggc 1800
agcgaagcga caccattcgc cgttattacc aacgatgaaa caggtatgaa gtacccactt 1860
acctcttatg aacttacccc gaacatggct atcattgata cggaattgat gctgaacatg 1920
ccgcggaagt tgaccgcagc tacgggaatc gatgcattgg ttcatgcaat cgaggcatac 1980
gtttccgtca tggcaaccga ttacaccgac gagctcgcgt tgcgtgcgat taaaatgatc 2040
ttcaagtacc ttccacgcgc atacaagaat ggcacaaacg atattgaagc ccgagaaaag 2100
atggcacacg cttcgaacat cgctggtatg gccttcgcga atgcgtttct cggagtgtgt 2160
cactccatgg cgcacaaact gggagccatg catcacgtgc cccacggtat cgcatgcgcc 2220
gttcttattg aagaggtgat caagtataat gccaccgatt gccccactaa gcagacggcc 2280
ttccctcagt acaaatcgcc caatgccaag cgtaaatacg cggaaattgc cgagtacttg 2340
aaccttaagg ggaccagcga cacggaaaag gtgaccgcac tgattgaagc catctccaag 2400
cttaagatcg acctgagcat cccacaaaac atctcagcag ccggcattaa caagaaggac 2460
ttctacaaca ctctcgacaa gatgtcagag ctcgccttcg atgatcagtg cactaccgca 2520
aacccacgtt atccgctcat ctctgaactg aaggatatct acatcaagtc gttttaa 2577
<210> 15
<211> 1356
<212> DNA
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 15
atggagatta aagagatggt cagtcttgcg cgcaaagctc agaaggagta tcaggccacc 60
cataaccaag aagctgtgga caacatctgc cgagcagcag cgaaggttat ttacgaaaat 120
gcagcaattc tggcacgcga ggcagtggac gaaaccggca tgggtgttta cgagcacaag 180
gtggccaaga atcaaggcaa gtccaaaggt gtttggtaca acctgcataa caagaagtcg 240
attggcatcc tcaatatcga cgagcgtacc ggcatgatcg agatcgcaaa acctatcggg 300
gttgtaggcg ccgttacgcc aaccaccaac cctatcgtta ctccgatgag caacatcatc 360
tttgctctta agacctgcaa cgccatcatt atcgccccac acccgcgctc caaaaagtgc 420
tctgcccacg cagttcggct gatcaaagag gctatcgctc cgttcaacgt gcccgaaggt 480
atggttcaga tcatcgagga gcctagcatc gagaagacgc aggaattgat gggcgccgta 540
gacgtggtcg ttgctaccgg gggcatgggc atggtcaagt ctgcctactc ctcagggaag 600
ccttctttcg gtgtcggagc cggcaatgtt caggtgatag tggacagcaa catcgacttc 660
gaagcggcag cagaaaagat catcaccgga cgtgccttcg acaacggtat catctgctca 720
ggcgaacagt ccatcatcta caacgaggct gacaaggaag cagttttcac agcattccgc 780
aaccacggtg cgtacttttg cgacgaggcc gagggagatc gggctcgtgc agcgatcttc 840
gaaaatggag ccatcgcgaa agatgttgtg ggccagtccg ttgcctttat tgcaaagaag 900
gcgaacatta atatccccga gggtactcgt attctcgtgg tcgaagctcg cggagtaggc 960
gccgaagatg tcatctgtaa agaaaagatg tgtccagtca tgtgcgccct ctcctacaag 1020
cacttcgaag agggggtaga gatcgcaagg acgaacctcg caaacgaagg caatggccat 1080
acctgtgcta tccactccaa caaccaagca cacatcatct tggcaggctc ggagctgacc 1140
gtgtctcgca tcgtggtcaa cgcgccaagt gctaccacag caggcggtca catccagaac 1200
ggtcttgccg tcaccaatac tctaggctgc ggctcttggg gtaacaactc gatctccgaa 1260
aacttcactt ataaacacct gctcaacatt tcacgcatcg ccccgttgaa ctccagcatt 1320
catatcccag atgataagga aatctgggaa ctctaa 1356
<210> 16
<211> 1617
<212> DNA
<213> Clostridium kluyveri
<400> 16
atgtctaaag gaatcaagaa tagccaattg aaaaaaaaga acgtcaaggc cagtaacgtt 60
gctgagaaga tcgaagagaa ggtggaaaag accgacaagg tcgttgagaa ggctgctgag 120
gtgaccgaaa agcgcattcg aaacttaaag ctccaggaaa aagttgtgac cgcagatgtc 180
gcagctgaca tgatcgagaa tggcatgatc gtcgcaatta gcggcttcac gccatccggg 240
tatccaaagg aggttccaaa agcccttact aagaaggtta atgcgctgga ggaggagttc 300
aaggtgacgc tgtataccgg ttctagcaca ggcgctgata ttgacggaga atgggcgaag 360
gcaggaataa tcgaacggcg tatcccatac cagaccaact ctgacatgag gaaaaaaata 420
aacgatggtt caatcaagta cgcagatatg cacctgagcc acatggctca atacattaac 480
tattctgtga ttcctaaggt tgacattgcc atcatcgagg cggtggccat taccgaggaa 540
ggggatatta ttcctagtac tggaatcggc aacacagcta cgtttgtcga gaatgcggat 600
aaggtaattg tggaaataaa cgaggctcag ccgcttgagt tggaaggcat ggcagatatc 660
tataccctga agaaccctcc acgtcgcgag cccatcccga tagtcaacgc aggcaaccgc 720
atagggacca cttacgtcac ctgtggctct gaaaaaatct gcgcgatcgt catgaccaac 780
acccaagaca aaacccgccc actcaccgaa gtttctcctg tcagtcaggc aatctccgat 840
aacctgattg gcttcctgaa caaagaagta gaggagggta aactcccaaa aaacctgctc 900
cccatacagt caggtgtcgg ttcggttgct aacgccgttc tagccggact ctgcgaatca 960
aacttcaaaa atttgagctg ctacacagaa gtgatccagg attcgatgtt gaagctcatc 1020
aaatgtggaa aggcagatgt ggtgtccggc acctcgatct cgccatcacc ggaaatgctg 1080
cccgagttca taaaggacat aaattttttt cgcgagaaga tagtactgcg cccccaggaa 1140
atatctaata atccggaaat agctcgtcgt ataggagtga tctccataaa cactgctttg 1200
gaagtagaca tctacggtaa tgtgaactcc acgcatgtca tgggctccaa gatgatgaac 1260
ggcatcggcg gcagcggcga ctttgcccgc aacgcatacc tcaccatatt cactacggag 1320
tccatcgcga agaagggcga catttcctct atcgttccta tggtttccca cgtggaccac 1380
accgagcatg acgtaatggt catcgttacc gaacaggggg ttgcggatct gcgcggtctt 1440
tcccctcggg aaaaggccgt ggcgataatt gagaattgcg tccacccgga ttacaaggat 1500
atgctcatgg agtacttcga ggaggcttgt aagtcctcag gtggcaacac cccacacaac 1560
cttgaaaaag ccctatcctg gcacactaag ttcataaaaa ctggctcgat gaagtaa 1617
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA_5'_HindIII
<400> 17
catgattacg ccaagcttga gagcccacca cattgcgatt tcc 43
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA_up_3'_XhoI
<400> 18
tcgaaactcg agtttcgatc ccacttcctg atttccctaa cc 42
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA_dn_5'_XhoI
<400> 19
tcgaaactcg agtaaatctt tggcgcctag ttggcgacg 39
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA_3'_EcoRI
<400> 20
acgacggcca gtgaattcga cgacatctga gggtggataa agtggg 46
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA up
<400> 21
atcgggcata attaaaggtg 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA down
<400> 22
gtcacctcat caagttctag aa 22
<210> 23
<211> 6702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4gene_cat1_sucD_4hbd_cat2
<400> 23
tctagaatga ctattaatgt ctccgaacta cttgccaaag tccccacggg tctactgatt 60
ggtgattcct gggtggaagc atccgacggc ggtactttcg atgtggaaaa cccagcgacg 120
ggtgaaacaa tcgcaacgct cgcgtctgct acttccgagg atgcactggc tgctcttgat 180
gctgcatgcg ctgttcaggc cgagtgggct aggatgccag cgcgcgagcg ttctaatatt 240
ttacgccgcg gttttgagct cgtagcagaa cgtgcagaag agttcgccac cctcatgacc 300
ttggaaatgg gcaagccttt ggctgaagct cgcggcgaag tcacctacgg caacgaattc 360
ctgcgctggt tctctgagga agcagttcgt ctgtatggcc gttacggaac cacaccagaa 420
ggcaacttgc ggatgctgac cgccctcaag ccagttggcc cgtgcctcct gatcacccca 480
tggaacttcc cactagcaat ggctactaga tgattttgca tctgctgcga aatctttgtt 540
tccccgctaa agttgaggac aggttgacac ggagttgact cgacgaatta tccaatgtga 600
gtaggtttgg tgcgtgagtt ggaaaaattc gccatactcg cccttgggtt ctgtcagctc 660
aagaattctt gagtgaccga tgctctgatt gacctaactg cttgacacat tgcatttcct 720
acaatcttta gaggagacac aacatgtcta aaggaatcaa gaatagccaa ttgaaaaaaa 780
agaacgtcaa ggccagtaac gttgctgaga agatcgaaga gaaggtggaa aagaccgaca 840
aggtcgttga gaaggctgct gaggtgaccg aaaagcgaat tcgaaactta aagctccagg 900
aaaaagttgt gaccgcagat gtcgcagctg acatgatcga gaatggcatg atcgtcgcaa 960
ttagcggctt cacgccatcc gggtatccaa aggaggttcc aaaagccctt actaagaagg 1020
ttaatgcgct ggaggaggag ttcaaggtga cgctgtatac cggttctagc acaggcgctg 1080
atattgacgg agaatgggcg aaggcaggaa taatcgaacg gcgtatccca taccagacca 1140
actctgacat gaggaaaaaa ataaacgatg gttcaatcaa gtacgcagat atgcacctga 1200
gccacatggc tcaatacatt aactattctg tgattcctaa ggttgacatt gccatcatcg 1260
aggcggtggc cattaccgag gaaggggata ttattcctag tactggaatc ggcaacacag 1320
ctacgtttgt cgagaatgcg gataaggtaa ttgtggaaat aaacgaggct cagccgcttg 1380
agttggaagg catggcagat atctataccc tgaagaaccc tccacgtcgc gagcccatcc 1440
cgatagtcaa cgcaggcaac cgcataggga ccacttacgt cacctgtggc tctgaaaaaa 1500
tctgcgcgat cgtcatgacc aacacccaag acaaaacccg cccactcacc gaagtttctc 1560
ctgtcagtca ggcaatctcc gataacctga ttggcttcct gaacaaagaa gtagaggagg 1620
gtaaactccc aaaaaacctg ctccccatac agtcaggtgt cggttcggtt gctaacgccg 1680
tgcatcccgg actctgcgaa tcaaacttca aaaatttgag ctgctacaca gaagtgatcc 1740
aggattcgat gttgaagctg atcaaatgtg gaaaggcaga tgtggtgtcc ggcacctcga 1800
tctcgccatc accggaaatg ctgcccgagt tcataaagga cataaatttt tttcgcgaga 1860
agatagtact gcgcccccag gaaatatcta ataatccgga aatagctcgt cgtataggag 1920
tgatctccat aaacactgct ttggaagtag acatctacgg taatgtgaac tccacgcatg 1980
tcatgggctc caagatgatg aacggcatcg gcggcagcgg cgactttgcc cgcaacgcat 2040
acctcaccat attcactacg gagtccatcg cgaagaaggg cgacatttcc tctatcgttc 2100
ctatggtttc ccacgtggac cacaccgagc atgacgtaat ggtcatcgtt accgaacagg 2160
gggttgcgga tctccgcggt ctttcccctc gggaaaaggc cgtggcgata attgagaatt 2220
gcgtccaccc ggattacaag gatatgctca tggagtactt cgaggaggct tgtaagtcct 2280
caggtggcaa caccccacac aaccttgaaa aagccctatc ctggcacact aagttcataa 2340
aaactggctc gatgaagtaa ttagaggaga cacaacatgg agattaaaga gatggtcagt 2400
cttgcgcgca aagctcagaa ggagtatcag gccacccata accaagaagc tgtggacaac 2460
atctgccgag ctgcagcgaa ggttatttac gaaaatgcag caattctggc ccgcgaggca 2520
gtggacgaaa ccggcatggg tgtttacgag cacaaggtgg ccaagaatca aggcaagtcc 2580
aaaggtgttt ggtacaacct gcataacaag aagtcgattg gcatcctcaa tatcgatgag 2640
cgtaccggca tgatcgagat cgcaaaacct atcggggttg taggcgccgt tacgccaacc 2700
accaacccta tcgttactcc gatgagcaac atcatctttg ctcttaagac ctgcaacgcc 2760
atcattatcg ccccacaccc gcgctccaaa aagtgctctg cccacgcagt tcggctgatc 2820
aaagaggcta tcgctccgtt caacgtgccc gaaggtatgg ttcagatcat cgaggagcct 2880
agcatcgaga agacgcagga attgatgggc gccgtagacg tggtcgttgc taccgggggc 2940
atgggcatgg tcaagtctgc ctactcctca gggaagcctt ctttcggtgt cggagccggc 3000
aatgttcagg tgatagtgga cagcaacatc gatttcgaag cggctgcaga aaagatcatc 3060
accggacgtg ccttcgacaa cggtatcatc tgctcaggcg aacagtccat catctacaac 3120
gaggctgaca aggaagcagt tttcacagca ttccgcaacc acggtgcgta cttttgcgac 3180
gaggccgagg gagatcgggc tcgtgcagcg atcttcgaaa atggagccat cgcgaaagat 3240
gttgtgggcc agtccgttgc ctttattgcc aagaaggcga acattaatat ccccgagggt 3300
actcgtattc tcgtggtcga agctcgcgga gtaggcgccg aagatgtcat ctgtaaagaa 3360
aagatgtgtc cagtcatgtg cgccctctcc tacaagcact tcgaagaggg ggtagagatc 3420
gcaaggacga acctcgcaaa cgaaggcaat ggccatacct gtgctatcca ctccaacaac 3480
caagcacaca tcatcttggc aggctcggag ctgaccgtgt ctcgcatcgt ggtcaacgcg 3540
ccaagtgcta ccacagcagg cggtcacatc cagaacggtc ttgccgtcac caatactcta 3600
ggctgcggct cttggggtaa caactcgatc tccgaaaact tcacttataa acacctgctc 3660
aacatttcac gcatcgcccc gttgaactcc agcattcata tcccagatga taaggaaatc 3720
tgggaactct aattagagga gacacaacat gcagcttttc aagctcaaga gcgtcacaca 3780
tcactttgat acttttgcag agtttgccaa ggaattctgt ctcggtgaac gcgacttggt 3840
aattaccaac gagttcatct acgaaccgta tatgaaggca tgccagctgc cttgtcattt 3900
tgtgatgcag gagaaatacg gccaaggcga gccttctgac gagatgatga acaacatcct 3960
agcagatatc cgtaatatcc agttcgaccg cgtgatcggg atcggaggtg gtacggttat 4020
tgacatctca aaactctttg ttctgaaggg attaaatgat gttctcgacg cgttcgatcg 4080
caagattccc cttatcaaag agaaagaact gatcattgtg cccaccacct gcggaaccgg 4140
ctcggaggtg acgaacattt ccatcgccga gatcaagtcc cggcacacca agatgggttt 4200
ggctgacgat gcaattgttg ctgaccacgc cataatcatc cctgaacttc tgaagagctt 4260
gcccttccac ttctatgcat gctccgcaat cgatgctctt attcatgcca tcgagtcata 4320
cgtttctcca aaagcgtctc catactcccg tctgttcagt gaggcggcgt gggacattat 4380
cctggaagtt ttcaagaaaa tcgccgaaca cggcccagag taccgcttcg agaagctggg 4440
ggaaatgatc atggccagca actatgccgg tatcgctttc ggcaacgcag gcgttggcgc 4500
cgtccacgct ctatcctacc cgttgggcgg caactatcac gtgccgcatg gagaagcaaa 4560
ctatcagttc ttcaccgagg tctttaaagt ataccaaaag aagaatccgt tcggctatat 4620
tgtcgaactc aactggaagc tctccaagat tctgaactgc cagccagagt acgtgtaccc 4680
gaagctggat gaactgctcg gttgccttct taccaagaaa cctttgcacg aatacggcat 4740
gaaggacgaa gaggttcgtg gcttcgcgga atcggtcctg aagacccagc aacgcttgct 4800
cgccaacaac tacgtcgaac ttactgtcga tgagatcgaa ggtatctacc gacgtctcta 4860
ctaattagag gagacacaac atgaaggatg tactggcgga atacgcctcc cgcattgttt 4920
cggcggagga ggccgttaag cacatcaaaa acggtgaacg ggtagctttg tcacacgctg 4980
ccggcgtgcc tcagagttgc gttgacgcac tggtgcagca ggccgacctt ttccagaatg 5040
tggaaatcta tcacatgctg tgcctcggtg agggtaagta tatggcgcct gagatggccc 5100
ctcacttccg ccacatcacc aactttgtcg gtggtaactc ccgtaaggcg gtcgaagaaa 5160
accgggccga tttcattccg gtattctttt acgaggtgcc aagcatgatt cgcaaagaca 5220
tcctccacat tgatgtcgcc atcgttcagc tttcaatgcc tgacgaaaat ggttactgtt 5280
cctttggagt atcttgcgat tactccaagc cggcagcaga gagcgctcac ctggttatcg 5340
gagaaatcaa ccgtcaaatg ccatacgtac acggcgacaa cttgattcat atctccaagt 5400
tggattacat cgtgatggca gactacccca tctactctct tgcaaagccc aagatcgggg 5460
aagtcgagga agctatcggg aggaattgtg ccgagcttat tgaagatggt gccactctcc 5520
agctgggaat cggcgcgatt cctgatgcgg ccctgttatt tctcaaggac aaaaaggatc 5580
tgggcatcca taccgaaatg ttctccgatg gtgttgtcga attggttcgc tccggcgtta 5640
tcacaggcaa gaaaaagact cttcaccccg gaaagatggt cgcaaccttc ctgatgggaa 5700
gcgaggacgt gtatcatttc atcgataaaa accccgatgt agaactgtat ccagtagatt 5760
acgtgaatga cccgcgtgtg atcgcccaaa acgacaatat ggtctcgatt aacagctgca 5820
tcgaaatcga ccttatggga caggtcgtgt ccgagtgcat cggctcaaag caattcagcg 5880
gcaccggcgg ccaagttgac tacgtgcgtg gcgcagcatg gtctaaaaac ggcaaatcga 5940
tcatggcaat cccgtccact gcaaaaaacg gtacggcatc tcgaattgta cctatcatcg 6000
cggagggcgc tgctgtcacc accctgcgca acgaggtcga ttacgttgta accgagtacg 6060
gtatcgctca gctcaagggc aagagcctgc gccagcgcgc agaggctttg atcgcgatag 6120
cccaccccga cttccgtgag gaactaacga aacatctccg caagcgattc ggataacata 6180
tggcggccgc aagcttgcct cgacgaaggc gtcaccgtgg gccccctggt tgaggaaaaa 6240
gcacgagaca gcgttgcatc gcttgtcgac gccgccgtcg ccgaaggtgc caccgtcctc 6300
accggcggca aggccggcac aggtgcaggc tacttctacg aaccaacggt gctcacggga 6360
gtttcaacag atgcggctat cctgaacgaa gagatcttcg gtcccgtcgc accgatcgtc 6420
accttccaaa ccgaggaaga agccctgcgt ctagccaact ccaccgaata cggactggcc 6480
tcctatgtgt tcacccagga cacctcacgt attttccgcg tctccgatgg tctcgagttc 6540
ggcctagtgg gcgtcaattc cggtgtcatc tctaacgctg ctgcaccttt tggtggcgta 6600
aaacaatccg gaatgggccg cgaaggtggt ctcgaaggaa tcgaggagta cacctccgtg 6660
cagtacatcg gtatccggga tccttacgcc ggctaggcta gc 6702
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0049-1 for
<400> 24
gcaggcatgc aagcttaaag tccccacggg tctact 36
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 0049-2 rev
<400> 25
ggccagtgcc aagctttacc gatgtactgc acggag 36
<210> 26
<211> 3608
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adhE2_nt
<400> 26
aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg gaggcacctc acaggtgcaa 60
ttattacaca accccacagc gatgtccgca tcctttgatg accccaacct catctcgctt 120
gctggactgg ttccaaccat gcacttagcc gatgctgcca gcctgtccac cttggcccag 180
gaccggttga gcatcaccgg tgataaaggt gccaatgctg gtgcgaagat cgcctcccta 240
gtcgcgggca tggtcgccgg tgctgattcc atcgatgaca tggatgtact ccgccacgga 300
ggtatgcgcc gacttttcga ccggatctac gccccatcca cattggggtc ttttctgcgg 360
gccttcactt tcggccacgt acgccaactc gatgattttg catctgctgc gaaatctttg 420
tttccccgct aaagttgagg acaggttgac acggagttga ctcgacgaat tatccaatgt 480
gagtaggttt ggtgcgtgag ttggaaaaat tcgccatact cgcccttggg ttctgtcagc 540
tcaagaattc ttgagtgacc gatgctctga ttgacctaac tgcttgacac attgcatttc 600
ctacaatctt tagaggagac acaacatgaa agtaaccaat cagaaagagt tgaagcagaa 660
gttgaacgag ctgcgagagg ctcagaagaa gttcgcaacc tacacccagg aacaggtgga 720
caagatcttt aagcagtgtg ccattgcagc cgcgaaagaa cgtattaatc tcgcgaaact 780
tgcggtcgag gaaaccggta ttgggctggt agaagacaag atcatcaaga accacttcgc 840
cgctgaatac atctacaaca agtacaaaaa cgaaaagaca tgtggtatca tcgaccacga 900
cgacagcttg ggcatcacca aggtagcgga gccaatcggt atcgtcgcag ctatcgtgcc 960
cactactaac cctacctcca ctgctatttt caagtcactc atctccctga aaacccgcaa 1020
tgctatcttc ttctcacctc acccacgcgc taagaaatca actatcgctg cagctaaact 1080
tatcctggat gcagccgtga aagccggggc tccgaaaaac atcatcggtt ggatcgacga 1140
accttccatt gaactctctc aagacctcat gtccgaggca gacattatcc tggcaaccgg 1200
aggcccatcc atggttaaag cagcttacag ctcaggcaag ccggctatcg gcgttggagc 1260
tggtaacact ccagcaatca tcgacgagtc ggccgatatc gacatggcag tgtcctctat 1320
tatcctgtcc aaaacttatg acaacggcgt tatttgcgcg tccgagcagt ctattctcgt 1380
catgaactct atttacgaga aggtaaagga ggagtttgtg aagcgggggt cgtacattct 1440
gaaccagaac gagatcgcta agatcaaaga gactatgttt aaaaacggag ccatcaacgc 1500
agatatcgta gggaagtccg cgtacatcat tgctaagatg gctggaatcg aagtccctca 1560
aaccacgaaa attctgatcg gcgaggtgca atcggtcgaa aagtccgagc tgttctcgca 1620
tgaaaagttg tccccggtcc tcgcgatgta taaagttaag gattttgatg aagcactcaa 1680
gaaagctcag cgcctgatcg aattgggtgg ctcgggtcac acctcttccc tctacattga 1740
ctcccagaac aataaagata aggtgaaaga gttcggcctg gctatgaaga cgtctcgtac 1800
cttcatcaat atgccctctt cacagggcgc cagcggtgac ctttacaatt tcgctatcgc 1860
tcctagcttt accctcggct gcggcacctg gggcggtaat tctgtgtccc aaaacgtcga 1920
accaaagcat ctgctcaaca ttaaaagcgt cgccgaacgt cgcgagaaca tgttgtggtt 1980
caaggtcccg caaaaaatct acttcaagta tggttgcttg cgctttgcac ttaaagagct 2040
taaggacatg aataaaaagc gggcgttcat cgtcactgat aaggatctgt tcaaactggg 2100
ctatgttaac aagattacca aggtcctgga tgagatcgat atcaagtatt ccatcttcac 2160
cgatattaag tccgatccga ccattgattc cgtgaagaag ggcgcgaagg agatgctcaa 2220
ctttgaaccc gacacgatta tttctattgg cggaggcagc ccaatggacg cagctaaggt 2280
tatgcacctg ctgtatgagt acccagaagc agagatcgag aaccttgcaa tcaatttcat 2340
ggatattcgc aaacgcattt gcaactttcc taagcttggt acaaaagcta tctctgttgc 2400
gatccctacc accgcaggaa ccggcagcga agcgacacca ttcgccgtta ttaccaacga 2460
tgaaacaggt atgaagtacc cacttacctc ttatgaactt accccgaaca tggctatcat 2520
tgatacggaa ttgatgctga acatgccgcg gaagttgacc gcagctacgg gaatcgatgc 2580
attggttcat gcaatcgagg catacgtttc cgtcatggca accgattaca ccgacgagct 2640
cgcgttgcgt gcgattaaaa tgatcttcaa gtaccttcca cgcgcataca agaatggcac 2700
aaacgatatt gaagcccgag aaaagatggc acacgcttcg aacatcgctg gtatggcctt 2760
cgcgaatgcg tttctcggag tgtgtcactc catggcgcac aaactgggag ccatgcatca 2820
cgtgccccac ggtatcgcat gcgccgttct tattgaagag gtgatcaagt ataatgccac 2880
cgattgcccc actaagcaga cggccttccc tcagtacaaa tcgcccaatg ccaagcgtaa 2940
atacgcggaa attgccgagt acttgaacct taaggggacc agcgacacgg aaaaggtgac 3000
cgcactgatt gaagccatct ccaagcttaa gatcgacctg agcatcccac aaaacatctc 3060
agcagccggc attaacaaga aggacttcta caacactctc gacaagatgt cagagctcgc 3120
cttcgatgat cagtgcacta ccgcaaaccc acgttatccg ctcatctctg aactgaagga 3180
tatctacatc aagtcgtttt aatttgatca cggccattca ccaccgtaac cggtagctcc 3240
ctgaccaccc agccgagctt tcggcgtgag atgacaacaa ttcgtggaac aaccagaaca 3300
agacgtgatc tggcgatcac ccctacccga aaattccgga cccgcccgga accgggatca 3360
ggacatcacc gagggcacat cggtggatcg aggcttaatg gaacgcccca ctcatccaat 3420
ccggcaattt tgatgctgta cccatcgacg catggtgctc caaatacgtg gaagccatca 3480
cggtcacgga tgaagcatgg caggttttcc ggttggaagt ccactggatt gttgggcagg 3540
aaccaggtga gcgcctgaat ggcgaatggc gataagctag aggatccccg ggtaccgagc 3600
tcgaattc 3608
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AdhE2_1_F
<400> 27
atgaaagtaa ccaatcagaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AdhE2_2260_R
<400> 28
aatcggtggc attatacttg 20
Claims (18)
1,4-BDO를 포함하지 않거나 1,4-BDO를 포함한 배지 중에서 1,4-BDO를 생산하는 미생물을 배양하는 단계;
배양물로부터 1,4-BDO 농도의 증가에 따라 증가된 발현을 보이는 단백질을 선별하는 단계; 및
선별된 단백질을 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질로 선택하는 단계를 포함하는 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질을 탐색하는 방법.
배양물로부터 1,4-BDO 농도의 증가에 따라 증가된 발현을 보이는 단백질을 선별하는 단계; 및
선별된 단백질을 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질로 선택하는 단계를 포함하는 1,4-BDO 생산에 양성적으로 관여하는 단백질을 탐색하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 배양하는 단계는 1,4-BDO 생산능이 없는 야생형 미생물 및 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 선별하는 단계는 야생형 미생물에 비하여 1,4-BDO를 생산하는 그의 변이주에서 발현이 증가된 단백질을 선별하는 단계를 더 포함하는, 1,4-BDO 생산성에 양성적으로 관영하는 단백질을 탐색하는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 LdhA의 활성이 제거된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 조효소 A 의존성 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제, 4-히드록시부틸레이트 데히드로게나제, 4-히드록시부티릴 CoA:아세틸-CoA 트랜스퍼라제 및 알콜 디히드로게나제 유전자가 더 도입된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 1,4-BDO는 대수기에 배지 중에 첨가된 것인 방법.
야생형 미생물에 비해서 시트레이트 신타아제 활성이 증가되어 있는 1,4-BDO를 생산하는 미생물.
청구항 7에 있어서, 상기 시트레이트 신타아제는 서열번호 1과 적어도 95%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 미생물
청구항 8에 있어서, 서열번호 1과 적어도 95%이상의 서열 동일성을 갖는의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 도입된 것인 미생물.
청구항 8에 있어서, 상기 시트레이트 신타아제를코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2인 것인 미생물.
청구항 7에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 미생물.
야생형 미생물에 비해서 서열번호 3과 적어도 95%이상의 서열 동일성을 갖는의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 도입된 1,4-BDO를 생산하는 미생물.
청구항 12에 있어서, 상기 서열번호 3 의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 4인 것인 미생물.
청구항 12에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인 1,4-BDO를 생산하는 미생물.
야생형 미생물에 비해서 시트레이트 신타아제를 코딩하는 핵산 서열 및 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 도입된 1,4-BDO를 생산하는 미생물.
청구항 1에 의해 탐색된 단백질을 코딩하는 핵산을 1,4-BDO를 생산하는 미생물에 도입하는 단계;를 포함하는, 1,4-BDO 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법.
청구항 7에 의해 제조된 미생물을 배양하는 단계; 및
배양물로부터 1,4-BDO를 수득하는 단계를 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 방법.
배양물로부터 1,4-BDO를 수득하는 단계를 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 방법.
청구항 12에 의해 제조된 미생물을 배양하는 단계; 및
배양물로부터 1,4-BDO를 수득하는 단계를 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 방법.
배양물로부터 1,4-BDO를 수득하는 단계를 포함하는 1,4-BDO를 생산하는 방법.
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