KR20150046961A

KR20150046961A - O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법

Info

Publication number: KR20150046961A
Application number: KR1020130126606A
Authority: KR
Inventors: 최수진; 김소영; 서창일; 신용욱; 양영렬; 엄혜원; 박혜민; 전성후; 정병훈
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2013-10-23
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2015-05-04
Also published as: WO2015060648A1; RU2744938C1; EP3061813A4; BR112016008947B1; RU2744938C9; BR112016008947A2; CN105705635A; RU2651517C2; JP2016533729A; KR101555749B1; RU2016116162A; US9593353B2; EP3061813A1; MY186224A; CN105705635B; JP6386551B2; US20160304918A1

Abstract

본 발명은 메치오닌에 대한 피드백 내성을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 발현하는 O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용하여 O-숙시닐호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 O-숙시닐호모세린의 생산방법{MICROORGANISMS FOR PRODUCTION OF O-SUCCINYL HOMOSERINE AND METHOD FOR PRODUCTION OF O-SUCCINYL HOMOSERINE USING THE SAME}

본 발명은 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 갖는 신규 분리한 폴리펩티드, 이를 발현하는 O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용하여 O-숙시닐호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

metA 유전자는 호모세린(Homoserine)에 숙시닐코에이(Succinyl-coA)의 숙시닐 부위(Succinyl group)를 결합시켜 O-숙시닐호모세린(O-succinyl homoserine)을 만드는 효소인 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(homoserine O-succinyltransferase, MetA)를 코딩하는 유전자로서, O-숙시닐호모세린 생산 균주의 개발에 있어서 가장 중요한 유전자 중 하나이다.

메치오닌 생합성 경로의 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)가 차단되어 O-숙시닐호모세린이 축적되는 데, 이에, O-숙시닐호모세린 생산 균주는 L-메치오닌 요구성을 나타낸다. 그래서 배지에 메치오닌을 첨가하게 되고, 이렇게 첨가된 메치오닌에 의해서 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제가 피드백 저해(feedback inhibition)를 받아 활성이 억제되고, 최종적으로는 고농도의 O-숙시닐호모세린을 얻을 수 없게 된다.

따라서, 종래의 많은 특허들은 피드백 조절 체계로부터 metA의 피드백 저해를 해제하는 연구에 집중되었다. 하지만, metA에 의해서 코딩되는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 야생형 단백질 자체로도 안정성이 낮고, 피드백 해제를 위해서 변이가 도입되면 불안정성이 더 커지는 문제점을 안고 있다. 높은 생산능을 가지는 O-숙시닐호모세린 생산 균주의 개발을 위해서는 metA 유전자의 피드백 저해가 제거되고 효소 안정성이 확보될 필요가 있다.

자연계에 존재하는 대부분의 미생물은 메치오닌을 생합성하기 위해서 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린을 중간체로 이용하는데, 일반적으로 MetA는 O-숙시닐호모세린을, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제(homoserine O-acetyltransferase, MetX)는 O-아세틸호모세린을 생성시킨다. 그리고, MetX는 MetA와는 달리 피드백저해를 받지 않으며 효소 안정성도 높다.

앞에서 언급된 MetA의 피드백 저해현상과 불안정성 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 메치오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않으며 효소 안정성이 확보된 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제를 찾기 위하여, MetX로 알려진 공지의 단백질들 중에 기질특이성(substrate specificity)이 아세틸코에이(Acetyl-coA)가 아닌 숙시닐코에이(Succinyl-coA)인 특성을 갖는 효소를 탐색하였다. 이렇게 탐색된 후보 metX 유전자를 선별하고, 이를 에스케리키아 속 미생물에 도입하여 플라스크 배양한 결과, O-아세틸호모세린 대신 O-숙시닐호모세린이 생성됨을 확인하였다. 이렇게 선별된 metX 유전자는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지며 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 갖는 신규 분리한 폴리펩티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 신규 분리한 폴리펩티드를 발현하는 O-숙시닐호모세린 생산 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 상기 미생물을 이용하여 O-숙시닐호모세린을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성(feedback resistant)을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine O-succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 2 또는 3의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성(feedback resistant)을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine O-succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물의 배양과정에서 생성된 O-숙시닐호모세린을 수득하는 단계를 포함하는 O-숙시닐 호모세린의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 O-숙시닐호모세린 생산 미생물은 메치오닌에 대한 피드백저해에 내성을 가지며 고수율로 O-숙시닐호모세린을 생산할 수 있으므로, 이를 전구체로 하는 L-메치오닌을 고수율로 생산하는데 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 갖는 신규 분리한 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 "호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성(activity of homoserine O-succinyltransferase)"은 호모세린(Homoserine)을 O-숙시닐호모세린(O-succinyl homoserine)으로 전환하는 활성을 의미한다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 "피드백 저해(feedback inhibition)"는 메치오닌에 의한 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제의 효소 활성의 억제를 나타낸다.

본 발명의 폴리펩티드는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에서 제시한 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지는 한, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드 또한 본 발명에 포함된다. 상기 아미노산 서열에 대한 상동성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST [참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA [참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: www.ncbi.nlm.nih.gov].

상기 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 3의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

본 발명은 또한 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성을 가지는(feedback resistant) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine O-succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는, O-숙시닐호모세린(O-succinyl L-homoserine)을 생산하는 미생물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 "O-숙시닐호모세린(O-succinyl L-homoserine)을 생산하는 미생물"이란 O-숙시닐호모세린을 축적할 수 있는 미생물이다.

상기 O-숙시닐호모세린을 생산하는 미생물은 L-라이신, L-쓰레오닌 또는 L-이소류신 생산 균주를 이용하여 제조할 수도 있다. 바람직하게는, L-쓰레오닌 생산 균주를 이용하여 제조할 수 있다. L-쓰레오닌 생산 균주는 L-쓰레오닌 및 O-숙시닐호모세린의 호모세린까지의 합성이 이미 원활하게 이루어지는 균주로서, 더 많은 양의 메치오닌 전구체, 즉 O-숙시닐호모세린을 합성할 수 있다.

본 발명에서 사용된 상기 용어 “O-숙시닐호모세린(O-succinyl L-homoserine)을 생산하는 미생물”이란 O-숙시닐호모세린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 및 진핵 미생물 균주를 말한다.　 예를 들어, O-숙시닐호모세린을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다.　 바람직하게는, 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물 균주,　보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 가 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서는 L-쓰레오닌을 생산하는 대장균 변이균주로서 쓰레오닌 생산균주 CJM002(KCCM-10568, 대한민국 등록특허번호 제10-0905381호)를 사용하였다.

본 발명에서, 상기 폴리펩티드의 발현은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 작동 가능하게 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 삽입되어 달성될 수 있으나, 이로 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서, 상기 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 암호화하는 단백질을 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현카세트는 통상 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, 이하 "ORF"라 약칭함)에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 본 발명에서 사용되는 프로모터는 숙주세포 내에서 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 높은 빈도로 개시하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 프로모터를 이용할 수 있다. 바람직하게는, T7 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터 등을 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 시스테인 신타아제 유전자로부터 유래된 cysK 프로모터(대한민국 특허등록번호 제10-0966324호)를 사용할 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 첫 번째 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성(feedback resistant)을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine O-succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 미생물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 미생물은 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 코딩하는 metB 유전자가 추가로 결손 또는 약화될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시 양태로서, 본 발명은 L-메치오닌 전구체인 O-숙시닐호모세린을 축적하기 위해서, L-쓰레오닌 생산균주 또는 대장균 야생형 균주에서 L-메치오닌 전구체 분해에 관여하는 유전자를 결손 또는 약화시키고, 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002로부터 유래된 메치오닌에 대한 피드백 저해에 내성(feedback resistant)을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine Succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 도입한 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구현에서, 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002로부터 유래된 metX 유전자는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라아제(O-acetyl-homoserine transferase)(NCBI reference sequence: ZP_03696709.1)를 코딩하는 것으로 알려져 있으나, 이 metX 유전자를 대장균 균주에 도입하여 플라스크 배양한 결과, O-아세틸호모세린 대신 O-숙시닐호모세린을 생산한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 metX 유전자는 metA 유전자가 코딩하는 효소인 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다. 또한, 상기 metX 유전자가 도입된 균주는 변이의 도입 없이도 메치오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않음을 알 수 있었다.

본 발명의 바람직한 구현에서, 본 발명은 대장균(K12) W3110 균주에서 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 코딩하는 metB 유전자를 결손시키고, 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래의 metX 유전자를 도입시킨 균주를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현에서, 본 발명은 L-쓰레오닌 생산균주인 대장균 CJM002에서 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 코딩하는 metB 유전자를 결손시키고, 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래의 metX 유전자를 도입시킨 균주를 제공한다.

보다 바람직하게는, 상기 미생물은 호모세린 키나아제(homoserine kinase)를 코딩하는 thrB 유전자 및 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(homoserine O-succinyltransferase)를 코딩하는 metA 유전자를 추가로 더 결손 또는 약화시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 유전자들의 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI)와 같은 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 용어 "결손(deletion)"은 목적 유전자의 개시코돈에 해당하는 염기서열로부터 종결코돈까지의 염기서열 영역 혹은 그 조절부위 염기서열 중 일부 혹은 전부를 염색체 내부에서 제거한 형태를 의미한다.

본원에서 사용되는 상기 용어 "약화(weakening)"는 미생물 균주에서 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소에 대한 세포 내 활성을 제거하거나 감소시키는 것을 의미하는데, 예를 들어, 유전자의 프로모터(promoter) 부위 및 5'-UTR 부위의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질의 발현을 약화시키거나 해당 유전자의 ORF 부위에 돌연변이를 도입함으로써 단백질의 활성을 약화시킬 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 본 발명에 따른 L-숙시닐호모세린을 생산하는 미생물은 대장균 KCCM 11423P일 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 두 번째 양태로서, 본 발명은 상기 에스케리키아 속 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물의 배양과정에서 생성된 O-숙시닐호모세린을 수득하는 단계를 포함하는 O-숙시닐호모세린의 생산방법을 제공한다.

상기 제조된 O-숙시닐호모세린 생산 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 　이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.　 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.　 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.　 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다.　상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다.　 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.　 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다.　 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.　 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다.　 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.　 이 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다.　이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여 배양물의 pH를 조정할 수 있다.　또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.　또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다.　배양물의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다.　배양 기간은 원하는 O-숙시닐호모세린 의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는10 내지 160 시간이다.

본 발명의 방법으로 생산한 O-숙시닐호모세린은 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase)에 의하여 메치오닌으로 전환될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 생산한O-숙시닐-L-호모세린과 CH₃SH와의 반응을 통하여 L-메치오닌 이외에도 숙신산을 별도의 생산공정 없이 부산물로 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[ 실시예 ]

실시예 1: metX 유전자의 선별

metA 유전자의 피드백 조절의 해제 및 안정성 확보를 위한 방법의 일환으로서, metX 유전자(Homoserine O-acetyltransferase)가 metA 유전자와 비슷한 구조를 가지며 L-메치오닌(L-methionine)에 대한 피드백 저해를 받지 않는 것에 착안하여, 단백질 기본 골격은 metX 유전자의 그것과 같으면서 활성 부위(active site) 및 기질 결합 부위(substrate binding site)가 metA 유전자의 그것과 비슷한 효소를 탐색하였고, 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine O-succinyltransferase) 활성을 갖는 크로모박테리움 비오라시움(Chromobacterium violaceum) 유래의 metX가 개발된바 있다.

이에 신규 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 개발을 위해 기 개발된 크로모박테리움 비오라시움 유래의 metX의 아미노산 서열 상동성 분석을 통해 후보 metX 유전자를 선별하였으며, 선별된 metX 유전자는 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002(Pseudogulbenkiania ferrooxidans 2002)로부터 유래된 것이다.

실시예 2: 플라스미드의 제작

2-1. 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자의 합성

선별한 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자는 NCBI 데이터베이스의 참조 서열(reference sequence) ZP_03696709.1의 metX 유전자 서열(서열번호 2)을 기반으로 대장균(Escherichia coli)에서 발현되도록 코돈 최적화(codon optimization) 과정을 거쳐 합성하였다(서열번호 3).

2-2. 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자를 발현하는 플라스미드의 제작

합성한 서열번호 3의 염기서열을 근간으로 서열번호 4, 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 metX 유전자를 증폭하였다. 서열번호 5의 프라이머는 제한효소 HindIII 부위를 가지고 있다.

PCR 조건은 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물은 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후, 1.14kb 크기의 밴드를 용리하여 정제한 뒤, HindIII 제한효소를 처리하고, cysK 프로모터가 포함된 pCL1920 벡터를 EcoRV 및 HindIII 제한효소 처리 후, 두 단편을 클로닝 하였다. 클로닝 결과로 얻은 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자 발현 플라스미드를 pCL-PcysK-metX(pfe)라 명명하였다.

실시예 3: 실험균주의 제작

3-1. metB 유전자 결손

야생형 E. coli(K12) W3110 균주에서 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 결손시켰다. metB 유전자 결손을 위해 FRT-one-step-PCR deletion 방법을 수행하였다(PNAS (2000) vol97 P6640-6645). metB 유전자 결손을 위해서 서열번호 6, 7의 프라이머를 이용하여 pKD3 벡터(PNAS (2000) vol97 P6640-6645)를 주형으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트(deletion cassette)를 제작하였다.

PCR 조건은 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물은 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1.1kb 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터(PNAS (2000) vol97 P6640-6645)를 미리 형질 전환 시킨 E. coli(K12) W3110 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션(electroporation)을 위하여 pKD46으로 형질전환된 W3110 균주는 200 μg/L 암피실린(ampicillin)과 5 mM 아라비노스 (L-arabinose)가 포함된 LB배지를 이용하여 30℃ OD600=0.5까지 배양시킨 후, 10% 글리세롤로 3회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 30 μg/L 클로람페니콜(chloramphenicol)을 포함한 LB 평판배지에 도말하여 37℃에서 1~2일 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 서열번호 8, 9의 프라이머를 이용하여 위 조건으로 PCR 한 후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.5kb로 관찰되는 것을 확인함으로써 metB 유전자의 결손을 확인하였다.

확인된 균주는 pCP20 벡터(PNAS (2000) vol97 P6640-6645)로 형질전환시켜 100 μg/L 암피실린을 포함한 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통해 1.0% 아가로스 겔 상에서 작아진 최종 metB 유전자 결손 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 메치오닌 요구성 균주를 CC03-0131 로 명명하였다.

3-2. thrB 유전자 결손

호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자인 thrB 유전자를 결손시킴으로써 호모세린으로부터 O-숙시닐 호모세린의 합성량을 증가시키고자 하였다. 특히, 쓰레오닌 생산균주를 이용할 경우 호모세린의 이용 활성이 매우 크기 때문에 이 유전자의 결손이 꼭 필요하다. 상기 제작된 CC03-0131 균주에서 thrB 유전자 결손을 위해 FRT-one-step-PCR deletion 방법을 수행하였다. thrB 유전자 결손을 위해서는 서열번호 10, 11의 프라이머를 이용하여 pKD3 벡터를 주형으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트를 제작하였다.

PCR 조건은 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물은 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1.1 kb 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터를 미리 형질 전환 시킨 CC03-0131 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 CC03-0131 균주는 200 μg/L 암피실린과 5 mM 아라비노스가 포함된 LB배지를 이용하여 30℃ OD600=0.5까지 배양시킨 후, 10% 글리세롤로 3회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 30 μg/L 클로람페니콜을 포함한 LB 평판배지에 도말하여 37℃에서 1~2일 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 서열번호 12, 13의 프라이머를 이용하여 위 조건으로 PCR 한 후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.5kb로 관찰되는 것을 확인함으로써 thrB 유전자의 결손을 확인하였다.

확인된 균주는 pCP20 벡터로 형질전환시켜 100 μg/L 암피실린을 포함한 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통해 1.0% 아가로스 겔 상에서 작아진 최종 thrB 유전자 결손 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 CC03-0131-2로 명명하였다.

3-3. metA 유전자 결손

E. coli 균주에서 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자의 기질 특이성 및 활성 확인을 위해 E. coli(K12) W3110 균주에 metB 및 thrB 유전자를 결손시킨 CC03-0131-2 균주를 기반으로 염색체상의 본래 metA 유전자를 결손시켰다. metA 유전자 결손을 위해 FRT-one-step-PCR deletion 방법을 수행하였다. metA 유전자 결손을 위해서는 서열번호 14, 15의 프라이머를 이용하여 pKD3 벡터를 주형으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트를 제작하였다.

PCR 조건은 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 30회 반복 수행하였다. 이 PCR 결과물은 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1.1kb 크기의 밴드를 용리하여 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터를 미리 형질 전환 시킨 CC03-0131-2 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션(electroporation)을 위하여 pKD46으로 형질전환된 CC03-0131-2 균주는 200 μg/L 암피실린과 5 mM 아라비노스가 포함된 LB배지를 이용하여 30℃ OD600=0.5까지 배양시킨 후, 10% 글리세롤로 3회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 30 μg/L 클로람페니콜을 포함한 LB 평판배지에 도말하여 37℃에서 1~2일 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 서열번호 16, 17의 프라이머를 이용하여 위 조건으로 PCR 한 후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.5kb로 관찰되는 것을 확인함으로써 metA 유전자의 결손을 확인하였다.

확인된 균주는 pCP20 벡터로 형질전환시켜 100 μg/L 암피실린을 포함한 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통해 1.0% 아가로스 겔 상에서 작아진 최종 metA 유전자 결손 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 CC03-0132로 명명하였다.

3-4. 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 유래 metX 유전자 발현 플라스미드가 도입된 균주의 제작

슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자의 기질 특이성 및 활성 확인을 위해, 야생형 균주 E. coli(K12) W3110 기반으로 metB, thrB 및 metA 유전자를 결손시킨 균주 CC03-0132 균주에 플라스미드 상기 실시예 2에서 제작한 pCL-PcysK-metX(pfe)를 도입하였다.

플라스미드 pCL-PcysK-metX(pfe)를 도입한 CC03-0132 균주를 CC03-0135로 명명하고, 2013년 O6월 10일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터에 수탁번호 KCCM 11423P로 기탁하였다.

대조군으로 CC03-0132 균주에 플라스미드 pCL-PcysK-metA를 도입하여 제작된 균주를 CC03-0132/pCL-PcysK- metA로 명명하였다.

뿐만 아니라, 대한민국 특허등록번호 제10-0905381호에 개시된 균주로서, 메치오닌 요구성 균주인 L-쓰레오닌(L-threonine) 생산 균주 TF4076(수탁번호: KFCC-10718)를 기반으로 NTG를 이용한 인공적인 돌연변이법을 사용하여 메치오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산균주 CJM002(수탁번호: KCCM-10568)를 이용하여, 상기 3-1 내지 3-3과 동일한 방법으로 균주를 제작하였고, 제작된 균주를 CJM-BTA로 명명하였다.

CJM-BTA 균주를 기반으로 상기와 동일한 플라스미드 pCL-PcysK-metX(pfe), pCL-PcysK-metA를 도입하였으며, 제작된 균주를 각각 CJM-BTA/pCL-PcysK- metX(pfe) 및 CJM-BTA/pCL-PcysK- metA로 명명하였다.

실시예 4: 균주를 이용한 O- 숙시닐호모세린의 생산

4-1. 플라스크 배양 실험

상기 실시예 3에서 제작된 균주에 도입된 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자의 기질 특이성 및 활성을 확인하기 위해 삼각플라스크 배양을 실시하였다. 플라스크 배지 조성을 하기 표 1에 나타내었다.

플라스크 배지 조성

조성	Stock	농도(리터당)	Vol( ml )
포도당		40 g	200
KH₂PO₄		2 g	100
암모늄 설페이트		17 g	500
MgSO₄·7H₂O		1 g
효모엑기스		4 g
메치오닌		0.4 g
MnSO₄·7H₂O	10 mg/ml	0.01 g (stock 1 ml)
ZnSO₄·7H₂O	1 mg/ml	0.01 g (stock 10 ml)
FeSO₄·7H₂O	10 mg/ml	10 mg (stock 1 ml)
탄산칼슘		30 g	200

평판 LB배지에 CC03-0132 균주를 접종하고, 항생제 스펙티노마이신이 함유된 평판 LB배지에 metX 발현 벡터를 형질 전환 시킨 CC03-0135 균주 및 동일 벡터를 이용하여 제작된 metA 발현 벡터를 형질전환시킨 균주뿐만 아니라, CJM-BTA 균주 기반으로 metX 또는 metA 발현 벡터를 각각 형질전환시킨 두 균주를 접종하여 33℃에서 하루 밤 배양한 후, 단일 콜로니를 스펙티노마이신이 포함된 2ml LB 배지에 접종한 후 33℃에서 2시간 배양하고, 다시 25ml 플라스크 배지를 포함한 250ml 삼각플라스크에 OD600=0.07 로 접종하여 33℃ 200rpm 에서 48시간 배양하여 HPLC 분석을 통해 O-숙시닐 호모세린 생산량을 비교하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

플라스크 배양을 통한 O-숙시닐 호모세린의 생산

균주	OD	소모당 (g/L)	O- 숙시닐 호모세린 생산량 (g/L)
CC03-0132	16	40	0.0
CC03-0132 /pCL-PcysK- metA	20	40	0.5
CC03-0132 /pCL-PcysK- metX(pfe) : CC03-135	21	40	1.5
CJM-BTA	5	40	0.0
CJM-BTA /pCL-PcysK- metA	6	40	1.0
CJM-BTA /pCL-PcysK- metX(pfe)	7	40	4.0

그 결과, 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자는 E. coli의 metA 유전자와 마찬가지로, 숙시닐 CoA(succinyl-CoA)를 기질로 이용하여 O-숙시닐 호모세린을 생산하며, O-아세틸 호모세린은 생산하지 않았다. 슈도굴벤키아니아 퍼록시단스 2002 유래 metX 유전자가 도입된 경우는 변이의 도입 없이 야생형 그 자체로도 배지에 첨가된 메치오닌에 의한 피드백 저해 현상이 나타나지 않음을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11423P

20130610

<110> CJ Cheiljedang Corporation <120> Microorganisms for production of O-succinyl homoserine and method for production of O-succinyl homoserine using the same <130> PA12-0493 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 380 <212> PRT <213> Pseudogulbenkiania ferrooxidans <400> 1 Met Ser Thr Thr Glu Ser Ser Val Gly Ile Val Ser Ala Gln Gln Ala 1 5 10 15 Leu Phe Asp Val Pro Leu Asp Leu Ala Cys Gly Lys Thr Leu Thr Ser 20 25 30 Tyr Gln Leu Ile Phe Glu Thr Tyr Gly Glu Leu Asn Ala Ala Lys Ser 35 40 45 Asn Ala Ile Leu Ile Cys His Ala Leu Ser Gly His His His Ala Ala 50 55 60 Gly Arg Tyr Gln Pro Asp Asp Lys Ser Ala Gly Trp Trp Asp Ser Met 65 70 75 80 Ile Gly Pro Gly Lys Pro Ile Asp Thr Arg Arg Phe Phe Val Val Ala 85 90 95 Leu Asn Asn Leu Gly Gly Cys His Gly Ser Thr Gly Pro Ser Ser Ile 100 105 110 Asn Pro Ala Thr Arg Gln Pro Trp Gly Ser Ala Phe Pro Val Val Thr 115 120 125 Val Pro Asp Trp Val Thr Ala Gln Ala Arg Leu Ala Asp Arg Leu Gly 130 135 140 Ile Asp Arg Trp Ala Ala Ile Ile Gly Gly Ser Leu Gly Gly Met Gln 145 150 155 160 Ala Leu Gln Trp Ser Ile Asp Tyr Pro Asp Arg Val Ala Asn Ala Ile 165 170 175 Val Ile Ala Ser Ala Pro Lys Leu Ser Ala Gln Asn Ile Ala Phe Asn 180 185 190 Asp Val Ala Arg Gln Ala Ile Leu Thr Asp Pro Asp Phe His Gly Gly 195 200 205 Asp Phe Tyr Gln Gln Asp Ala Ile Pro Arg Arg Gly Leu Arg Leu Ala 210 215 220 Arg Met Leu Gly His Ile Thr Tyr Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly Glu 225 230 235 240 Lys Phe Gly Arg Met Leu Arg Ser Gly Glu Tyr Lys Phe Gly Tyr Asp 245 250 255 Val Glu Phe Glu Ile Glu Ser Tyr Leu Arg Tyr Gln Gly Asp Lys Phe 260 265 270 Ser Asp Tyr Phe Asp Ala Asn Thr Tyr Leu Leu Met Thr Lys Ala Leu 275 280 285 Asp Tyr Phe Asp Pro Ala Lys Asp His Gly Gly Asp Leu Val Ala Ala 290 295 300 Leu Lys Lys Ala Thr Ala Asn Phe Leu Val Ala Ser Phe Thr Ser Asp 305 310 315 320 Trp Arg Phe Ser Pro Leu Arg Ser Arg Glu Leu Val Gln Gly Leu Ile 325 330 335 Ala Ala Asp Lys Arg Val Ala Tyr Gly Glu Ile Glu Ser Ala His Gly 340 345 350 His Asp Ala Phe Leu Met Thr Asp Gln Pro Tyr Val Asp Leu Met Arg 355 360 365 Ala Tyr Leu Asp Arg Val Ala Lys Glu Val Ala Ala 370 375 380 <210> 2 <211> 1143 <212> DNA <213> Pseudogulbenkiania ferrooxidans <400> 2 atgtccacaa ccgaatcgtc ggtcggtatc gtcagcgccc agcaggcgct gttcgacgtg 60 ccgctcgatc tggcctgcgg caagacgctg acgtcgtacc agctgatttt tgagacctac 120 ggcgagctga acgccgccaa gagcaacgcc atcctgatct gccacgcgtt gtccggccac 180 caccacgccg ccggccgcta ccagccggac gacaagagcg ccggctggtg ggacagcatg 240 atcgggccgg gcaagccgat cgacacgcgc cgcttcttcg tggtggcgct caacaacctg 300 ggcggctgcc acggttctac tggcccctcc agcatcaacc cggccacgcg ccagccgtgg 360 ggctcggcct tcccggtggt gacggtgccg gactgggtga cggcgcaggc gcggttggcc 420 gaccggctcg gcatcgaccg ctgggcggcg atcatcggcg gctcgctcgg cggcatgcag 480 gcgctgcagt ggagcatcga ctaccccgac cgcgtcgcca acgccatcgt catcgcctcg 540 gcgcccaagt tgtcggcgca gaacatcgcc ttcaacgacg tggcgcgcca ggccatcctc 600 accgacccgg acttccacgg cggcgacttc taccagcagg atgccatccc gcgtcgcggc 660 ctgcgcctgg cgcgcatgct gggccacatc acctatctgt cggacgacgg catgggcgag 720 aaattcggcc gcatgctgcg ctccggcgag tacaagttcg gctacgacgt ggagttcgag 780 atcgagtcct acctgcgcta ccagggcgac aagttctccg actacttcga cgccaacacc 840 tacctcttga tgaccaaggc gctggactac ttcgatccgg ccaaggacca cggcggcgac 900 ctggtggcgg cgctgaagaa ggcgaccgcc aacttcctgg tggcgagctt cacttccgac 960 tggcgcttct cgcccttgcg ctcgcgcgag ctggtgcagg gcctgatcgc cgccgacaag 1020 cgcgtggcct acggcgagat cgaatccgcc cacggccacg acgccttcct gatgaccgac 1080 caaccctacg tggacctgat gcgtgcctac ctcgaccgtg tagccaagga ggtggcggca 1140 tga 1143 <210> 3 <211> 1143 <212> DNA <213> Pseudogulbenkiania ferrooxidans <400> 3 atgtccacta cagaatcctc ggtcggtata gtcagcgccc agcaggcgct gtttgacgtg 60 cctctcgatc tggcttgcgg gaagacgctg acatcttatc agttaatttt cgaaacctac 120 ggcgagctga atgcagccaa aagcaatgcc atcctgattt gtcatgcctt gtccggacac 180 caccatgccg ccggccggta tcagcccgat gacaaatcag cgggatggtg ggactcaatg 240 atcgggccgg gcaaaccgat agacactaga cgctttttcg tggtcgcact caataacctg 300 ggcgggtgtc acggttctac gggcccttcg agcataaatc cggctacgcg ccagccgtgg 360 gggtctgcat ttccagtggt aacggttcct gattgggtta ctgcgcaggc acggcttgct 420 gatcggctcg gtatagatcg ctgggcagcg attatcggag gttcactagg cggtatgcaa 480 gcactgcagt ggagcattga ttaccccgat cgcgtagcaa atgccattgt catcgccagt 540 gcacccaaat tgtcggcaca aaacattgcc tttaacgacg tggcgcgaca agcaatttta 600 accgatcctg actttcatgg cggcgatttt taccaacaag atgccattcc gcgtcgcggc 660 ctgagactgg ctcgtatgct gggccacatt acctatctgt ctgatgacgg catgggagaa 720 aaatttggtc gcatgctgag aagtggggaa tataaattcg gctatgacgt ggaatttgaa 780 attgagagtt atctacgcta tcagggtgat aaattctccg attattttga tgccaacaca 840 tacttattga tgacaaaagc ccttgactat ttcgatcctg ccaaggatca tggtggcgat 900 ttagtggctg ctctgaaaaa agcgaccgca aattttttag ttgcgtcatt tactagcgat 960 tggcgcttta gtccattgcg tagtagggag ctggtgcaag gtcttatcgc cgccgacaag 1020 cgagtagcct atggagaaat cgagtcagcc catggccatg atgcgtttct gatgaccgac 1080 cagccatatg tcgacctgat gcgtgcctat cttgaccgtg tagccaaaga agtggcggca 1140 taa 1143 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atcatgtcca ctacagaatc ctcg 24 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cccaagcttt tatgccgcca cttctttggc 30 <210> 6 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgctgcgcca gctccatacg cggcaccagc gttcgcaacc cacgtagcag catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tattcgccgc tccattcagc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 taccccttgt ttgcagcccg 20 <210> 10 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 catggttaaa gtttatgccc cggcttccag tgccaatatg agcgtcgggt gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 11 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggagataccg ctcgctaccg cgccgatttc cgcgaccgcc tgccgcgcct catatgaata 60 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Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 메치오닌에 의한 피드백 내성(feedback resistant)을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine O-Succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드.
제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 서열번호 2 또는 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지고 메치오닌에 의한 피드백 내성(feedback resistant)을 가지며 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(Homoserine Succinyltransferase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 미생물.
제3항에 있어서,
상기 미생물은 에스케리키아 속 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물.
제3항에 있어서,
상기 미생물은 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 미생물.
제3항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 미생물.
제3항에 있어서,
시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase)를 코딩하는 metB 유전자가 추가로 결손 또는 약화된 것을 특징으로 하는 미생물.
제7항에 있어서,
호모세린 키나아제(homoserine kinase)를 코딩하는 thrB 유전자 또는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(homoserine O-succinyltransferase)를 코딩하는 metA 유전자가 추가로 결손 또는 약화된 것을 특징으로 하는 미생물.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물의 배양과정에서 생성된 O-숙시닐호모세린을 수득하는 단계를 포함하는 O-숙시닐 호모세린의 생산방법.