KR20150017393A - 인간화된 hiv 감염 동물 모델 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역 결핍 마우스에 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 복강내로 주입하여 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법 및 이로 제조된 인간화된 HIV 감염 동물 모델에 관한 것이다. 이를 통하여, HIV 바이러스의 huCD4+ T 세포 감염과 관련된 여러 연구뿐만 아니라 HIV 치료약물의 직접적인 in vivo 효능 평가를 위한 동물모델로서 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 인간화된 HIV 감염 동물 모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
AIDS(acquired immune deficiency syndrome)는 1980년대 초에 처음으로 발견된 이래, 세계적으로 중요한 질병 중의 하나이다. 현재까지 개발된 AIDS의 치료제는 주로 프로테아제 억제제(protease inhibitor), 역전사효소 (reverse transcriptase) 억제제로서, AZT, ddI, ddC, d4T, 3TC, 네비라핀 등의 역전사 효소억제제 또는 사키나비르, 인디나비르, 리토나비르 등의 프로테아제 억제제가 있다. 이들 치료제는 단독으로 사용할 경우 별 효과가 없으나, AZT, 3TC 등 두 개의 역전사효소 억제제와 하나의 프로테아제 억제제를 복합 처방할 경우 높은 수준의 치료효과를 보이는 것으로 알려졌다. AIDS는 HIV(human immunodeficiency virus)의 감염에 의해서 발병하는데, HIV에 의해 감염되면 3~6주 후 감기 몸살같은 증세를 1~2주 정도 앓다가 회복되며, 그 후 증상없는 잠복기가 10여년 간 지속된다. 긴 잠복기 동안 바이러스는 감염자의 면역 세포를 파괴하면서 지속적으로 증식하기 때문에 환자의 면역 기능이 점차 손상되어 잠복기 말기에는 AIDS 증상이 나타난다.
이러한 AIDS를 치료하기 위하여 여러가지 방법이 시도되고 있으나, 세포 수준이 아니라 동물 모델 수준의 치료제 스크닝을 위해서는 AIDS가 걸린 생리학적 특징을 가지는 동물모델을 개발하는 것이 필수적이다. 이에 따라 본 발명자는 인간화된 HIV 감염된 동물 모델을 발명하였다.
본 발명은 HIV 감염 동물 모델을 개발하기 위하여, 면역 결핍 마우스에 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 복강내로 주입하여 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법 및 이로 제조된 동물 모델을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 인간화된 HIV 감염 동물 모델 마우스에 HIV를 투여하여 HIV를 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 상기 인간화된 HIV 감염 동물 모델 마우스을 이용하여 피검체 HIV 감염 정도 또는 HIV 치료 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 구체예에서, 면역 결핍 마우스에 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 복강내로 주입하여 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 면역 결핍 마우스는 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하고, 마우스 내 혈중 huCD3 T 세포의 양이 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 주입하기 전보다 증가한 것을 특징으로 하는 방법을 제공하며, 마우스 내 huCD4:CD3 T 세포의 비율 또는 huCD8:CD3 T 세포의 비율의 변동성이 0.1 내지 0.35인 방법을 제공하며, 상기 변동성은 4 내지 10주 동안 유지되는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 말초혈액 단핵 세포(PBMC)이 복강내로 주입된 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스를 제공한다. 상기 구체예에서, 면역 결핍 마우스는 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)인 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스를 제공하고, 마우스 내 혈중 huCD3 T 세포의 양이 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 주입하기 전보다 증가한 것을 특징으로 하는 면역 결핍 마우스를 제공하며, 마우스 내 huCD4:CD3 T 세포의 비율 또는 huCD8:CD3 T 세포의 비율의 변동성이 0.1 내지 0.35인 면역 결핍 마우스를 제공하며, 상기 변동성은 4 내지 10주 동안 유지되는 면역 결핍 마우스를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 구체예의 말초혈액 단핵 세포(PBMC)이 복강내로 주입된 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스에 HIV 분리주를 투여하여 HIV를 배양하는 방법을 제공하고, 상기 구체예에서, HIV 투여는 HIV를 포함하는 혈액을 투여하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 구체예의 제 1 마우스에 발병의 기준이 되는 제 1 HIV를 투여하고, 상기 구체예의 제 2 마우스에 피검체의 혈액을 투여하고, 상기 제 1 마우스 및 제 2 마우스상에서 HIV를 배양하고, 상기 배양된 제 1 마우스 및 제 2 마우스상에서 HIV의 양을 비교하여 피검체 HIV 감염 정도를 판별하는 방법을 제공한다
일 구체예에서, 상기 구체예의 마우스에 HIV를 감염시키는 단계; HIV가 감염된 마우스의 HIV 양을 측정하는 단계; HIV가 감염된 마우스에 HIV 치료 약물을 투여하는 단계; 및
상기 약물이 투여된 마우스의 HIV의 양을 측정하여 HIV 치료 약물의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 인간화된 동물 모델은 HIV 바이러스의 huCD4+ T 세포 감염과 관련된 여러 연구뿐만 아니라 HIV 치료약물의 직접적인 생체내 효능 평가를 위한 동물모델로서의 높은 유용성이 있다.
도 1은 인간 PBMC를 투여하여 인간화된 마우스의 혈액내 인간 T(huCD4+ T)세포 분포 변화이다.
도 2는 인간 PBMC를 투여하여 인간화된 마우스의 혈액내 인간 T(huCD4+ T)의 세포 비율 및 변동성이다.
도 3은 인간 PBMC를 투여하여 인간화된 마우스의 조직내 인간 T(huCD4+ T) 세포의 분포 확인이다.
도 4는 인간 PBMC를 투여하여 인간화된 마우스의 혈액 및 골수에서의 인간 조혈줄기세포(huCD34+ ) 세포의 분포이다.
도 5는 HIV 감염 및 항바이러스제인 HAART의 투여에 따른 인간화된 NOG 마우스에서 인간 T(huCD4+ T) 세포의 변화와 HIV-1 p24 항원의 변화이다.
도 2는 인간 PBMC를 투여하여 인간화된 마우스의 혈액내 인간 T(huCD4+ T)의 세포 비율 및 변동성이다.
도 3은 인간 PBMC를 투여하여 인간화된 마우스의 조직내 인간 T(huCD4+ T) 세포의 분포 확인이다.
도 4는 인간 PBMC를 투여하여 인간화된 마우스의 혈액 및 골수에서의 인간 조혈줄기세포(huCD34+ ) 세포의 분포이다.
도 5는 HIV 감염 및 항바이러스제인 HAART의 투여에 따른 인간화된 NOG 마우스에서 인간 T(huCD4+ T) 세포의 변화와 HIV-1 p24 항원의 변화이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 면역결핍 마우스의 제조
SCID 마우스와 NOD/Shi 마우스를 교배하고, 이 교배된 NOD/Shi-scid 마우스와 IL-2γnull 마우스를 다시 교배시켜서 NOG 마우스를 제조하였다(Humanized 마우스 in translational biomedical research, Leonard D. Shultz, Fumihiko Ishikawaand Dale L. Greiner, 2007, nature 참조)
실시예
2.
PBMC
를 복강 투여한 인간화된 면역 결핍 마우스의 투여경로에 따른 효과 확인
T 세포 비율 및 변동성
정상인으로부터 PBMC을 수득하고, 이를 실시예 1의 마우스에 투여하였다. 투여 방법에 따른 인간화된 면역 결핍 마우스의 특징을 하기 표 1과 같이 비교하였다.
| 투여경로 | CD4:CD3 T 세포 비율 | CD8:CD3 T 세포 비율 | 혈액상 hCD3 T 세포의 %비율 |
| I.P. | 0.76±0.14 | 0.22±0.12 | 65.80±24.07 |
| I.V. | 0.35±0.40 | 0.53±0.45 | 51.10±32.00 |
복강내 주사(I.P.)와 정맥내 주사(I.V.)를 각각 수행하여 4주 후에 각 20마리의 NOG 마우스 혈액내 huCD3+ T, huCD4+ T 및 huCD8+ T 세포들을 flow cytometry를 사용하여 확인하고 huCD4:CD3 T 세포와 huCD8:CD3 T 세포의 비율을 통하여 인간화 되었는지를 확인하였다(도 1 참조). 그 결과 복강내 주사(intraperitoneal injection: i.p. injection)로 이식한 NOG 마우스의 경우 huCD4:CD3 T 세포 의 비율은 0.76 ± 0.14 %을 보였고, huCD8:CD3 T 세포의 비율은 0.22 ± 0.12%를 보였다. 하지만, 정맥내 주사로 이식한 NOG 마우스의 경우 huCD4:CD3 T 세포의 비율은 0.35 ± 0.40%로 복강내 주사에 비하여 절반으로 감소하였으며, huCD8:CD3 T 세포의 비율은 0.53 ± 0.45%를 보였다. 또한, 혈액세포 중 huCD3+ T 세포는 복강내 주사로 이식한 NOG 마우스의 경우 65.80 ± 24.07%였고, 정맥내 주사로 이식한 NOG마우스의 경우 51.10 ± 32.00%로 존재하였다(표 1 참조).
또한, 혈액내 존재하는 인간 T 세포의 변화를 시간 별로 huCD4:CD3 T 세포와 huCD8:CD3 T 세포 비율의 변화를 확인한 결과, 이식 4주 후 부터 10주 동안 복강내 주사방법으로 이식한 마우스의 경우 huCD4:CD3 T 세포 의 비율이 0.69 ~ 0.86의 범위에서 유지되었다. 하지만, 정맥내 주사방법으로 이식한 마우스에서는 0.35 ~ 0.95의 범위로 시간에 따라 매우 불안정하게 큰 변화를 보여 HIV 감염 동물 모델로 사용하는 것이 불가능하다는 것을 알 수 있었다. 나아가, huCD8:CD3 T 세포의 비율은 복강내 주사의 경우 0.13 ~ 0.29의 범위에서 유지된 반면에, 정맥내 주사 방법으로 이식한 마우스는 0.03 ~ 0.53의 범위로 huCD4:CD3 T 세포 의 비율에서와 같이 시간에 따라 매우 큰 변화를 보였다(도 2 참조).
이러한 결과는 인간화된 마우스를 제작하는 경우 사람의 PBMC를 이식하는 방법 중 복강내 주사 방법이 정맥내 주사 방법 보다 혈액세포 중 huCD3+ T 세포가 더 많이 존재하였으며, huCD4:CD3 T 세포와 huCD8:CD3 T 세포의 비율에서도 각 개체간의 차이가 적게 나타남으로써 HIV 감염 마우스 모델 제작하는 방법에서 기존 방법보다 더 효과적이라는 것을 보여주었다.
T 세포 분포의 지속성
정상인의 PBMC을 이식하여 13일 경과된 NOG 마우스의 혈액에서 huCD3+ T 세포는 혈액 내 전체 PBMC 중 약 16.41% 이하 정도로 미미하게 존재하였으나 21일 경과된 NOG 마우스에서 혈액 내 전체 PBMC 중 약 34.88.% 정도로 증가였으며, 28일(4주) 후에는 약 79.14% 정도까지 급격하게 증가하였다. 28일째에는 증가된 huCD3+ T 세포는 최소한 70일(10주) 후까지 유지되는 양상을 보였다. 그러므로 NOG 마우스에 이식된 사람의 PBMC가 이식 초기에는 대부분의 huCD3+ T 세포가 감소하였지만 21일 이후에는 점차 증가하여 적어도 70일 이상까지 혈액에 잘 보존되어있는 것을 확인하였다. 이는 사람의 PBMC를 이식한 초기에는 NOG 마우스의 혈액에 존재하는 huCD3+ T 세포들이 감소되었다가 점차 증가되어 유지되는 결과는 이들 huCD3+ T 세포들이 이식된 사람의 PBMC에서 직접 유래된 것이 아니라 NOG 마우스의 체내에서 재군락화(repopulation)되었기 때문으로 생각되었다(도 1 참조).
조직내
T세포의 존재 확인
정상인의 PBMC를 이식하지 않은 NOG 마우스의 간, 림프절 및 비장 조직 내에서는 huCD3+ T, huCD4+ T와 huCD8+ T 세포가 전혀 존재하지 않았으나, 정상인의 PBMC를 이식한 NOG 마우스의 각 조직 내에서는 huCD3+ T, huCD4+ T와 huCD8+ T 세포가 존재하고 있는 것을 확인하였다(도 3 참조).
액 및 골수에서의 인간
조혈줄기세포
(
huCD34
+) 세포의 분포
HuCD34+ T 세포들은 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell, HSC)로서 일반적으로 제대혈 세포(cord blood cell)와 골수(bone marrow)에서 대부분 발견된다. 조혈줄기세포는 골수에서 자가 복제 및 분화를 통해 백혈구, 적혈구 및 혈소판 등의 혈액세포를 만들어 내는 세포로서 실시예 1의 인간화된 마우스의 혈액에서 huCD3+ T, huCD4+ T 와 huCD8+ T 세포들이 급격하게 증가하거나 장기간 유지되는 결과를 통하여 사람의 PBMC에 존재하는 조혈줄기세포에서 유래되었을 가능성이 높은 것으로 생각되었다. 이에 따라 정상인의 PBMC를 이식하여 4 주 경과된 NOG 마우스의 대퇴골(femur)에서 채취한 골수와 혈액에서의 huCD34+ T 세포의 분포양상을 분석하였다(도 4 참조).
HuCD34+ T 세포의 경우, 혈액에서는 전체 PBMC의 0.37 %로 매우 낮은 수준으로 존재하지 않았으나 인간화된 NOG 마우스 골수에서는 전체 골수 세포의 2.30 %로 상대적으로 높은 수준으로 존재하였다. 반면에 골수 및 혈액에서 모두 huCD3+ T, huCD4+ T 및 huCD8+ T 세포들은 혈액에서 뿐만 아니라 골수에서도 분화되어 존재하였다. 이러한 결과는 사람의 PBMC를 NOG 마우스에 이식하면 매우 적은 양으로 존재하는 조혈줄기세포들이 골수를 찾아서 되돌아가는 고유한 특성에 의해 NOG 마우스의 골수에 정착하고, 이들에 의해 다양한 인간 T 세포들로 분화되어 혈액으로 재군락화되는 것으로 생각되었다.
인간화된
NOG
마우스에 대한
HIV
감염력 및 항 레트로바이러스
치료능
분석
HIV 감염 및 항바이러스제인 HAART의 투여에 따른 인간화된 NOG 마우스에서 huCD4+ T 세포의 변화와 HIV-1 p24 항원의 변화를 비교 분석하였다. 그 결과, HIV 감염 후 혈액 내 HIV-1 p24 항원의 양이 14일째에는 3.09 ng/ml로 급격하게 증가하였으며 21일째에는 6.58 ng/ml까지 도달하였으며, huCD4+ T 세포들도 14일째에 급격하게 감소되는 양상을 보였다. 반면에 HIV 비감염 인간화된 NOG 마우스에서는 전혀 HIV-1 p24 항원이 검출되지 않았으며, huCD4+ T 세포들이 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 또한, HIV 감염 인간화된 NOG 마우스에서의 항바이러스제인 HAART를 투여에 따른 혈액 내 huCD4+ T 세포과 HIV-1 p24 항원의 양의 변화를 확인한 결과, HARRT 투여한 HIV 감염 인간화된 NOG 마우스에서 거의 HIV-1 p24 항원이 검출되지 않은 반면에, HARRT 투여 중지 후 7일째에 1.84 ng/ml로 증가하였으며, 14일째에는 3.45 ng/ml로 급격하게 증가하였다. HIV-1 p24 항원의 증가함에 따라 HARRT 투여를 중지한 HIV 감염 인간화된 NOG 마우스의 huCD4+ T 세포의 양도 동시에 감소된 것을 확인하였다.
이러한 HIV-1 p24 항원의 증가와 huCD4+ T 세포가 급격한 감소되는 시기와 거의 일치한 결과는 HIV 감염 후 HIV가 인간화된 NOG 마우스에 존재하는 huCD4+ T 세포를 없애면서 증식하여 HIV의 바이러스 양이 급격하게 증가된 것을 보여주었다(도 5 참조)
지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (19)
- 면역 결핍 마우스에 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 복강내로 주입하여 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서,
면역 결핍 마우스는 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)인 것을 특징으로 하는 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법. - 제 1항에 있어서,
마우스 내 혈중 hCD3+ T 세포의 양이 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 주입하기 전보다 증가한 것을 특징으로 하는 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법. - 제 1항에 있어서,
마우스 내 huCD4:CD3 T 세포의 비율 또는 huCD8:CD3 T 세포의 비율의 변동성이 0.1 내지 0.35인 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법. - 제 4항에 있어서,
huCD4:CD3 T 세포의 비율은 0.12 내지 0.16인 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법. - 제 4항에 있어서,
huCD8:CD3 T 세포의 비율은 0.10 내지 0.14인 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법. - 제 4항에 있어서,
상기 변동성은 4 내지 10주 동안 유지되는 인간화된 HIV 감염 동물 모델을 제조하는 방법. - 말초혈액 단핵 세포(PBMC)이 복강내로 주입된 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스.
- 제 8항에 있어서,
면역 결핍 마우스는 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull)인 것을 특징으로 하는 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스. - 제 8항에 있어서,
마우스 내 혈중 hCD3+ T 세포의 양이 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 주입하기 전보다 증가한 것을 특징으로 하는 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스. - 제 8항에 있어서,
마우스 내 huCD4:CD3 T 세포의 비율 또는 huCD8:CD3 T 세포의 비율의 변동성이 0.1 내지 0.35인 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스. - 제 8항에 있어서,
huCD4:CD3 T 세포의 비율은 0.12 내지 0.16인 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스. - 제 8항에 있어서,
huCD8:CD3 T 세포의 비율은 0.10 내지 0.14인 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스. - 제 11항에 있어서,
상기 변동성은 4 내지 10주 동안 유지되는 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스. - 제 8항 내지 제 13 중 어느 한 인간화된 HIV 감염 동물 모델용 면역 결핍 마우스에 HIV를 투여하여 HIV를 배양하는 방법.
- 제 15항에 있어서,
마우스에 투여된 HIV는 AIDS 환자에서 분리된 HIV를 배양하는 방법. - 제 15항에 있어서,
HIV의 투여는 HIV를 포함하는 혈액을 투여하는 HIV를 배양하는 방법. - 제 8항 내지 제 13항 중 어느 하나의 제 1 마우스에 발병의 기준이 되는 제 1 HIV 바이러스의 양을 투여하고,
제 8항 내지 제 13항 중 어느 하나의 제 2 마우스에 피검체의 혈액을 투여하고,
상기 제 1 마우스 및 제 2 마우스상에서 HIV를 배양하고,
상기 배양된 제 1 마우스 및 제 2 마우스상에서 HIV 바이러스양을 비교하여 피검체 HIV 감염 정도를 판별하는 방법. - 제 8항 내지 제 13항 중 어느 하나의 마우스에 HIV를 감염시키는 단계;
HIV가 감염된 마우스의 HIV 바이러스양을 측정하는 단계;
HIV가 감염된 마우스에 HIV 치료 약물을 투여하는 단계; 및
상기 약물이 투여된 마우스의 HIV 바이러스양을 측정하여 HIV 치료 약물의 효능을 평가하는 방법.
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| KR1020130045403A KR101525232B1 (ko) | 2013-04-24 | 2013-04-24 | 인간화된 hiv 감염 동물 모델 및 이의 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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| KR20150017393A true KR20150017393A (ko) | 2015-02-17 |
| KR101525232B1 KR101525232B1 (ko) | 2015-06-01 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
2013
- 2013-04-24 KR KR1020130045403A patent/KR101525232B1/ko active IP Right Grant
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