CN115094089B - 一种抗hiv病毒药物评价动物模型的建立方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗HIV病毒药物评价动物模型的建立方法，所述方法以NPG小鼠作为构建基础，其包括如下步骤：(1)通过尾静脉注射方法注射人源CBMC细胞；(2)针对人源化小鼠模型构建成功的小鼠，通过腹腔注射HIV‑Nanoluc病毒液进行感染。本发明采用HIV‑Nanoluc病毒感染脐带血CBMC或外周血PBMC人源化小鼠后，在短期内可以进行大量的体内复制提高HIV‑1病毒载量，使评价抗HIV药物的效果表现更加显著。

Description

一种抗HIV病毒药物评价动物模型的建立方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗HIV病毒药物评价动物模型的建立方法及其应用。
背景技术
艾滋病(AIDS)，全称是获得性免疫缺陷综合征，它是由艾滋病病毒(HIV)引起的一种病死率极高的恶性传染病。HIV病毒侵入人体，会感染人的CD4 T细胞，破坏人体的免疫系统，令患者丧失对疾病的抵抗作用，最后导致死亡。目前还没有疫苗可以预防，也没有治愈这种疾病的有效药物或方法。根据世界卫生组织的数据，全世界日常有接近3800万艾滋病患者，2020年约有150万人新感染艾滋病病毒。我国艾滋病毒感染者逐年增加，其总患病人数已突破百万。伴随着高效抗逆转录病毒治疗(HAART)的广泛使用，HAART的副作用和耐药性问题也日益严重，新的抗HIV病毒药物被大量研发出来。针对如此多的新药，建立一种高通量、低成本、高效快速地筛选和评价抗HIV药物有效性的动物模型，至关重要。有效的HIV感染动物模型的建立，可以为HIV/AIDS发病机制、抗HIV病毒药物研发、HIV疫苗制备等研究提供基础平台。
HIV感染动物模型可用于抗HIV药物在人体内的代谢转变及其抗病毒作用，是对药物药效的真实客观评价，对于研究抗艾滋病药物的筛选起到重要作用。HIV-1病毒有高度的宿主专一性，除人类外，只能直接感染黑猩猩、长臂猿等少数非人灵长类(NHP)动物。毫无疑问，非人灵长类动物是研究HIV感染、免疫和病理的良好动物模型。虽然大部分的非人灵长类动物因为多种遗传因子限制不支持HIV-1在动物体内的复制，但是大部分非人灵长类动物对诸如猴免疫缺陷病毒(SIV)和利用基于工程技术构建的猴-人免疫缺陷病毒(SHIV)、猿猴艾滋病毒(stHIV)易感染，并且SIV和HIV在遗传序列、靶细胞以及临床症状上有一定的相似性。北京协和医院艾滋病课题组已经系统建立了规范化中国恒河猴艾滋病动物模型体系，建立超过10种艾滋病动物模型，这些模型使用的病毒涵盖了SIV和不同亚型env来源的SHIV毒株。中国科学院昆明动物研究所用HIV-1病毒标准株HIV-1NL4.3感染北平顶候，首次创建HIV-1感染北平顶猴艾滋病模型。
除了非人灵长类动物模型，非灵长类动物也常用于构建HIV感染动物模型，目前国外广泛运用的非灵长类动物模型主要由小鼠艾滋病动物模型和猫艾滋病(FAIDS)动物模型两大类。猫艾滋病(FAIDS)是由猫免疫缺陷病毒(FIV)引起的一种猫传染病，因与人类艾滋病相似，故叫做猫艾滋病，但人与猫的艾滋病并不会互相感染。猫艾滋病模型主要运用于摸索抗HIV药物的动力学、药物代谢和疫苗的制备方面。非灵长类动物马、牛等也有作为艾滋病动物模型的研究的前例。
小鼠是实验室和临床最常用于建模的实验动物，目前已经有成功构建小鼠艾滋病动物模型，比如小鼠白血病病毒模型、HIV-1感染的嵌合体鼠模型和HIV-1转基因鼠模型。其中小鼠白血病病毒模型的构建方法是在小鼠体内注入白血病病毒(MuLV)，这种模型小鼠会出现脾脏和淋巴结肿大、免疫系统功能下降、易感染病毒等一系列类HIV感染症状，近年来已广泛应用于抗HIV药物的研发、筛选和免疫调节的研究中。HIV-1感染嵌合小鼠模型的构建方法主要有3种：(1)SCID-hu(Thy/Liv)嵌合小鼠模型，(2)Hu-PBMCs-NOD/SCID人鼠嵌合模型，(3)脑炎联合重度免疫缺陷鼠模型。三种建模方式大都采用免疫缺陷小鼠或者通过对宿主小鼠进行亚致死剂量的辐照使小鼠的免疫系统功能缺失，利用人源的免疫细胞进行小鼠体内的定植构建人源化小鼠，再通过HIV病毒感染形成HIV感染的小鼠模。
非人灵长类HIV-1动物模型，被认为是研究艾滋病毒(HIV-1)感染的理想动物模型,至今已有众多的动物如黑猩猩、长臂猿、恒河猴等被用于HIV-1感染的动物模型,但是这些非人灵长类动物中存在多种遗传因子限制了HIV-1的跨物种传播感染.此外猴免疫缺陷病毒(SIV)和利用基于工程技术构建的猴-人免疫缺陷病毒(SHIV)、猿猴艾滋病毒(stHIV)可以感染非人灵长类动物从而构建艾滋病动物模型，但是SIV与HIV-1基因组序列相似性仅45％，遗传差异较大，从而使SIV不能直接代替HIV-1用于HIV/AIDS的研究。SHIV只是嵌入了HIV-12.8％-30％的部分蛋白基因，与HIV-1在基因序列上仍存在很大差异。虽然stHIV-1和SHIV-vif包含了90％以上的HIV-1基因序列，能够在实验猴体内复制，却不出现AIDS症状，也使此类模型在HIV/AIDS的研究中没有得到深入的进展。
此外这些非人灵长类动物在我国大都是保护动物，少数可以用于动物实验的非人灵长类动物也因为价格昂贵、培养困难等问题而无法大量用于药物筛选，这些给HIV/AIDS疾病的非人灵长类动物模型研究带来很多困难。综合以上原因，非人灵长类动物用于构建HIV感染动物模型并用于抗HIV药物的大通量筛选不是很好的选择。
非灵长类动物模型中的猫艾滋病动物模型、马艾滋病动物模型和小鼠白血病病毒模型虽然有人类感染HIV-1的部分临床症状，猫免疫缺陷病毒(FIV)虽然和人类免疫缺陷病毒一样对CD4 T细胞、CD8 T细胞或者巨噬细胞有趋向性，但是对Ig+/B细胞有着更广泛的趋向性。因此构建的猫艾滋病动物模型不能很好的反映人体感染HIV的动力学和免疫学特征，同时鉴于猫类动物实验操作难度较高，也不适用于抗HIV药物的大通量筛选。马艾滋病病毒模型同样存在操作困难，饲养困难、价格昂贵以及实验周期长等问题不适用于抗HIV药物的大通量筛选。
小鼠作为动物模型越来越受到各国学者的重视，因为鼠类动物体型小、成本低廉、饲养简单、方便操作、繁殖迅速，是很好的模型生物，目前已广泛应用于实验室和临床研究。但是由于小鼠本身没有人CD4受体，而无法直接用于HIV-1的研究。小鼠白血病病毒模型是艾滋病病毒模型的一种，小鼠白血病病毒和HIV-1的虽然同属于逆转录病毒科，但是基因序列相似性不高，不能很好的反映人感染HIV-1的动力学和免疫学特征，不适用于抗HIV药物的大通量筛选。
HIV-1转基因鼠，可以研究部分HIV-1基因小鼠体内的感染与复制中，但也存在诸多问题，如：小鼠的种属差异性导致的建模不同、目的基因能否准确定位订表达、表达的HIV部分基因产物能否长期表达等问题。具体表现在：(1)HIV-1LTR/Nef/tat等构建的转基因鼠，尽管可以将HIV-1的LTR/Nef/tat等单个或若干个基因序列整合到后代新生鼠种，并且可以在很多组织检车到相关基因的表达，但只表达而不致小鼠产生相应的疾病，没有真正实现HIV-1的感染，也就不能用于抗HIV药物的筛选(2)HIV全序列前病毒DNA转基因小鼠，尽管已证实在部分小鼠中表达完整的全病毒基因拷贝，但是基因的表达和疾病的征象具有很大的个体差异性。小鼠模型中没有观察到AIDS样疾病表型，具备感染人CD4阳性细胞的能力，但不能感染鼠成纤维细胞。同时因为采用的是HIV-1全长序列，有极大的感染人的概率，增加了小鼠的操作和培养难度(3)嵌合表达人CD4及CCR5和CXCR4转基因小鼠，但是该小鼠模型不支持HIV-1病毒的复制，仍需通过嵌合HIV-1易感的人类组织和细胞来制备。
发明内容
基于上述原因，本发明提出一种抗HIV病毒药物评价动物模型的建立方法及其应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：
本发明一方面涉及一种抗HIV病毒药物评价动物模型的建立方法，所述方法以NPG小鼠作为构建基础，其包括如下步骤：
(1)通过尾静脉注射方法注射人源外周血PBMC细胞和/或脐带血CBMC细胞，检测小鼠体内hCD45+细胞比例，当hCD45+细胞比例达到30％以上，判断人源化小鼠模型构建成功；
(2)针对人源化小鼠模型构建成功的小鼠，通过腹腔注射HIV-Nanoluc病毒液进行感染，感染后每周进行成像检测病毒在体内的增殖情况，当荧光信号ROI值达到106～107photons/s为抗HIV病毒药物评价动物模型建模成功。本发明采用HIV-Nanoluc病毒感染外周血PBMC或脐带血CBMC人源化小鼠后，在短期内可以进行大量的体内复制提高HIV-1病毒载量，使评价抗HIV药物的效果表现更加显著。
在本发明的一个优选实施方式中，所述人源外周血PBMC细胞或脐带血CBMC细胞的提取包括如下步骤：
采集健康人外周血于肝素抗凝剂中混匀，离心分离收集上层血浆备用，其余血液成分和预热至室温的PBS进行1:0.5-2的体积比例进行混合，平铺于Ficoll淋巴细胞分离液上形成清晰的分离界面，离心，吸取中间的白膜层于洁净的离心管中，加入PBS清洗，离心弃上清，清洗1-3次。采用本发明的方法，可以将红细胞的数量控制在5％以下；优选在2％以下。
在本发明的一个优选实施方式中，所述尾静脉注射人源CBMC细胞4-6×106cell/只。
在本发明的一个优选实施方式中，所述射HIV-Nanoluc病毒液的注射量为5-10μg/只。通过将病毒液的注射量控制在该优选的范围，一方面可以避免小鼠因病毒液的注射而死亡，另一方面又可以在3周以内就实现造模成功。
本发明另一方面涉及上述动物模型的应用，所述动物模型用于抗HIV药物的筛选。
根据上述应用，所述抗HIV药物为VRC01-CAR-CD3+T细胞制剂，所述VRC01-CAR-CD3+T细胞制剂VRC01-CAR慢病毒转导CD3阳性细胞获得，所述VRC01-CAR慢病毒由信号肽SP1、抗HIV gp120抗原特异性单链抗体VRC01、标签信号Strep tag II、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域组成。
本发明至少具有如下有益的效果：
1.本发明采用高度免免疫缺陷NPG小鼠，不会造成移植物抗体宿主病(GvHD)，可以延长HIV感染窗口期；
2.本发明优化了从外周血提取PBMC和脐带血提取CBMC的方法，较现有方法获得的PBMC和CBMC，红细胞含量更低；
3本发明比较了PBMC和CBMC人源化建模，并检测发现与GvHD直接相关的HLA-DR，HLA-DQ两个基因的表达在CBMC细胞低200倍，证实CBMC人源化小鼠的GvHD发生严重程度比PBMC建模小鼠要小，这样为体内抗病毒实验争取更长的窗口期，因此之后人源化小鼠模型均采用CBMC建模。
4.本发明构建的人源化CBMC小鼠可以稳定的建立小鼠体内人的免疫生态环境，并进一步建立一个稳定的鼠类动物的HIV-1感染与病毒复制模型。
5.本发明在NL4-EGFP的基础上进行基因修饰，替换EGFP标签为Nanoluc标签，成功获得新构建HIV-Nanoluc病毒，配合现有的Luciferase催化底物发光系统，可以直观的表现HIV-1感染人源化小鼠的效果。
附图说明
图1：带有萤光素酶NanoLuc的HIV-Nanoluc(NL4-3)的基因组结构设计。
图2：HIV-Nanoluc构建的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3：质粒骨架NL4-EGFP质粒图谱和成功构建的HIV-Nanoluc质粒图谱。
图4：用于药效评价的VRC01-CAR结构和其质粒图谱。
图5：包装的HIV-Nanoluc病毒物理滴度测定和感染力测定。
图6：流式细胞术比较尾静脉注射和腹腔注射以及PBMC和CBMC构建的人源化小鼠体内人T细胞的分化结果。
图7：HLA-DR，HLA-DQ在PBMC和CBMC中的表达分析
图8：Cooke评分系统对PBMC和CBMC人源化建模后50天和150天的GvHD严重程度评估。
图9：尾静脉注射CBMC建模54天后小鼠体内免疫重建评估。
图10：尾静脉注射CBMC建模145天后小鼠体内免疫重建评估。
图11：流式细胞术检测CBMC人源化建模4周小鼠外周血中人T细胞的分化。
图12：HIV-Nanoluc病毒感染人源化小鼠的成像动力学及病毒基因表达分析。
图13：VRC01-CAR-CD3+T CAR-T细胞生长曲线。
图14：流式细胞术检测VRC01-CAR-CD3+T细胞转导效率分析。
图15：利用本发明构建人源化HIV动物模型和小动物成像技术进行CAR-T细胞的药效评估。
图16：QPCR基因表达水平分析CAR-T对感染小鼠的治疗效果。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1：
1构建带有新型的萤光素酶NanoLuc的HIV感染克隆
为了便于评估小鼠体内HIV感染水平，本发明构建并验证了插入新型荧光素酶(NanoLuc)基因的重组HIV病毒HIV-Nanoluc(NL4-3)。NL4-3病毒质粒的构建具体如下：首先合成含有Nanoluc的质粒，通过PCR技术扩增Nanoluc片段(引物见下表1)并添加上BamHⅠ和NotⅠ酶切位点，跑胶回收。使用BamHⅠ和NotⅠ双酶切HIV-EGFP(NL4-EGFP)质粒，得到HIV-NL4质粒载体骨架并进行跑胶回收。再通过T4-DNA连接酶过夜连接Nanoluc片段和HIV-NL4质粒骨架，测序验证正确，表明得到重组HIV病毒HIV-Nanoluc。其结构如图1所示，PCR技术扩增Nanoluc片段琼脂糖凝胶电泳结果和HIV-EGFP质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，质粒骨架NL4-EGFP质粒图谱和成功构建的HIV-Nanoluc质粒图谱如图3所示。
表1：扩增Nanoluc片段的引物序列
为了便于后续HIV感染小鼠模型的药物评价效果，本申请的发明人已构建利用HIV广谱中和抗体scFv作为胞外识别区的CAR结构，该CAR序列由信号肽SP1、抗HIV gp120抗原特异性单链抗体VRC01、标签信号Strep tag II、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域组成(如图4所示)，并验证了该CAR-T治疗HIV的效果。
NanoLuc萤光素酶(Nluc)是一个经过基因工程改造的小分子酶(19.1kDa)，它使用一种新型底物—Furimazine，可产生高强度、辉光型发光信号。生物发光反应不依赖ATP，自发光背景低，光信号更亮，可高达1010，同时抑制背景发光以获得高检测灵敏度，目前已经广泛用于活体动物成像。病毒感染后，可以应用活体动物成像定量和定位病毒在体内的复制，评估药物的抗病毒效果。然而，如何将NanoLuc与HIV构建到同一质粒中，以确保NanoLuc能够产生强的光信号的同时还不影响HIV对模型小鼠的感染，本申请的发明人对此进行了探索，由此得到了本发明特定序列的HIV-Nanoluc质粒。其中，5'LTR的核苷酸序列为SEQ IDNO.1；HIV-1ψ的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；Gag-Pol的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；Vif+Vpr的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；Tat+Vpu的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；Env的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；Nano-Luc的核苷酸序列为SEQ ID NO.7；IRES的核苷酸序列为SEQ ID NO.8；3'LTR的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。
2HIV-Nanoluc慢病毒包装浓缩后的物理滴度测定和感染PBMC的能力验证
HIV-Nanoluc质粒和PEI共转染293T，3天后收集培养基上清经离心、纯化和浓缩后获得HIV-Nanoluc病毒，使用P24 Elisa试剂盒检测HIV-Nanoluc病毒物理滴度，实验结果如图5-B至图5-D，根据5-A P24标准曲线计算出HIV-Nanoluc病毒的物理滴度。对浓缩后的NL4-Nanoluc病毒进行感染实验，验证病毒感染能力。根据P24物理滴度计算出NL4-Nanoluc病毒添加量，感染的靶细胞为PHA激活的PBMC，通过成像仪检测Nanoluciferase报告基因的表达量，从而反映病毒的感染能力。实验结果如图5-C和5-D，结果显示NL4-Nanoluc病毒在感染PBMC后报告基因发出荧光信号，表明NL4-Nanoluc病毒具有感染PBMC的能力；同时NL4-Nanoluc病毒在添加100pg的条件下区域荧光强度(用“ROI”指代)比添加10pg和添加1pg的ROI高，且在添加100pg时ROI约为添加10pg时的10倍，表明本实验包装的NL4-Nanoluc病毒感染有较好的剂量依赖性。
3健康人外周血PBMC和健康人脐带血CBMC的分离以及技术优化
采集健康人外周血于肝素抗凝剂中轻柔混匀，分装于离心管中进行重量配平，使用水平转子离心机调整参数为升降速加速度均为1档，室温700×g离心10分钟，弃掉上层血浆。其余血液成分和预热至室温的PBS进行1:1的混合，平铺于Ficoll淋巴细胞分离液上形成清晰的分离界面，使用水平转子离心机调整参数为升降速加速度均为1档，室温700×g离心25分钟。吸取中间的白膜层于洁净的离心管中，加入PBS清洗、450g离心弃上清，清洗两次。如果提取的PBMC含有较大量的红细胞，可以加入红细胞裂解液进行裂解。采用本方法得到的PBMC基本不含有红细胞并且用时相对较少。脐带血中CBMC的提取方法相同，仅将离心力大小700×g改为650g。所提取的细胞经显微镜观察，未见红细胞。
4采用腹腔注射和尾静脉注射两种方式分别注射PBMC和CBMC于NPG小鼠体内，对构建的小鼠人源化建模进行比较
在4周龄NPG小鼠经过适应性培养3天后，体内注射由上一步分离的PBMC和CBMC，进人源化小鼠建模。目前常用于小鼠人源化建模的两种注射方式为尾静脉注射和腹腔注射，其中腹腔注射难度较低，为大多数人所采用。本实验同时采用这尾静脉注射和腹腔注射对NPG小鼠体内注射PBMC和CBMC进行人源化建模，探究这两种注射方式以及两种人源细胞对建模的影响。
具体实验方式为，选取合适的5周龄NPG小鼠，分为4组每组各4只，保持四组在体重、状态等相对一致。一组采用尾静脉注射PBMC 5×106cell/只，二组采用腹腔注射PBMC 5×106cell/只，三组采用尾静脉注射CBMC 5×106cell/只，四组采用腹腔注射CBMC 5×106cell/只。动物房观察培养3周后，采用颌下静脉采血的方法取四组全部小鼠外周血，每只约150ul，利用小鼠专用的红细胞裂解液进行小鼠外周血的裂解，得到小鼠外周血淋巴细胞，计数并取1×106cell进行流式染色HuCD3/CD4/CD8流式抗体，经清洗后进行流式上机，根据建模小鼠外周血中人T细胞的分型结果判断两种注射方式和两种人源细胞对人源化小鼠建模的影响。
实验结果如图6所示，可知在两种人源细胞PBMC和CBMC构建的人源化小鼠外周血中，尾静脉注射组Hu-CD4 T细胞的含量均高于腹腔注射组，而腹腔注射组Hu-CD8 T细胞的含量较高。同时比较通过尾静脉注射PBMC小鼠和CBMC小鼠，可知注射CBMC小鼠体内的Hu-CD4 T细胞的含量更高。因为HIV主要感染Hu-CD4 T细胞，由实验结果可知通过尾静脉注射CBMC方法构建的人源化小鼠更符合我们构建感染模型小鼠的要求。
5尾静脉注射人PBMC和人CBMC对NPG小鼠人源化建模后生理状态分析以及GVHD严重程度评估
为了进一步检测尾静脉注射人PBMC和CBMC对人源化小鼠生存状态的影响，在NPG小鼠人源化建模成功后第4周，采集小鼠外周血，通过流式细胞术检测与GvHD直接相关的HLA-DR，HLA-DQ两个基因的表达。人源PBMC中的T细胞受到小鼠异种抗原刺激而增殖，其他类型细胞则维持较低含量或过早消亡。PBMC人源化小鼠体内的人源细胞以T细胞为主，适合需要T细胞免疫反应的各类研究。但T细胞也会对受体小鼠进行过度免疫攻击，进而引发移植物抗宿主病(GvHD)。实验结果如图7所示，PBMC人源化小鼠高表达HLA-DQ和HLA-DR，相比CBMC人源化小鼠高200倍，因此可以推测CBMC人源化小鼠的GvHD发生比PBMC建模小鼠要延迟，这样可以为体内抗病毒实验争取更长的窗口期。
同时于人源化建模50天和150天对PBMC人源化小鼠CBMC人源化小鼠的体重、形态、行为等进行观察并拍照。同时根据通用的GVHD评分标准-Cooke评分系统(见表2)对小鼠进行GVHD情况进行评价。实验结果如图8所示，在人源化建模150天时，PBMC人源化小鼠开始出现弓背、耸毛等表现，并有倦怠、纳差、毛发无光泽、脱毛、步态不稳、腹泻等GVHD的症状；与此相对应,CBMC人源化小鼠状态良好，基本没有出现弓背、耸毛、和脱毛情况，并且行动度高。在人源化建模50天，PBMC人源化小鼠和CBMC人源化小鼠的GVHD评分差距不大，表明高度免疫缺陷的NPG小鼠在进行人源化建模后50天小鼠仍然保持较好的生存状态；在人源化建模150天时，PBMC人源化小鼠的GVHD评分接近CBMC人源化小鼠评分的5倍，存在显著差异，表明PBMC人源化小鼠发生高度的GVHD。
基于实验结果6，实验结果7和实验结果8，通过尾静脉注射CBMC构建的人源化小鼠，在小鼠外周血中高表达人CD3+CD4+T细胞，且可以维持150天不发生高度GVHD，大大延长了实验的窗口期，因此后续的实验中采用的人源化小鼠建模方式均为通过尾静脉注射CBMC。
表2 Cooke评分系统
6尾静脉注射人CBMC后T细胞在小鼠体内的分型检测及评价
为了进一步检测尾静脉注射人CBMC后T细胞在小鼠体内不同组织的分型情况，分别在注射后第54天和145天取建模小鼠进行解剖，取小鼠的外周血组织、脾脏组织和骨髓进行处理，得到血液淋巴细胞、脾脏细胞和骨髓细胞，计数并取1×106cell进行流式染色hCD3/CD4/CD8流式抗体，经清洗后进行流式上机，根据建模小鼠相应组织部位细胞的T细胞分型结果检测人CBMC在NPG小鼠体内的分型情况。
实验结果如图9所示，可知通过尾静脉注射人CBMC构建的NPG人源化小鼠在第54天时，骨髓细胞中有部分hu-CD4 T细胞和hu-CD8 T细胞，而在脾脏细胞中hu-CD4 T细胞和hu-CD8 T细胞的分化均在30％左右，人源化效果良好。可以得出在人CBMC注射54天时，人CBMC在小鼠骨髓和脾脏中出现分化，尤其是脾脏组织中分型明显。
实验结果如图10示，在通过尾静脉注射人CBMC构建的NPG人源化小鼠在第154天时，hCD3/CD4/CD8 T细胞在骨髓、脾脏和外周血中仍然存在。由该结果可以得知，通过该实验方法构建的NPG人源化小鼠有很长的人源化效果，延长了HIV感染的时间，可供较长实验周期。
7尾静脉注射人CBMC后T细胞在小鼠外周血的分型检测及评价
购买4周龄NPG小鼠，适应性培养一周，取健康NPG小鼠，尾静脉注射人CBMC 5×106cell/只，观察2周后，颌下静脉采血检测小鼠体内hCD45/CD3/CD4/CD8 T细胞比例，每周检测一次。
具体而言，采用颌下静脉采血的方法取全部建模小鼠外周血约150ul，利用小鼠专用的红细胞裂解液进行小鼠外周血的裂解，得到小鼠外周血淋巴细胞，计数并取1*10^6cell进行流式染色hCD45/CD3/CD4/CD8流式抗体，经清洗后进行流式上机，根据建模小鼠外周血中人T细胞的分化情况判断NPG小鼠人源化建模的构建情况.
实验结果如图11所示,经过人CBMC注射4周的NPG小鼠在小鼠的外周血淋巴细胞中含有40％以上的hCD45+T细胞,并且有较高的CD3+CD4+T细胞,符合我们的感染实验需求,说明人源化建模成功。
每周称重1次动物体重，人源化建模小鼠和未建模的对照小鼠体重维持稳定状态。临床观察：观察内容包括但不限于行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足、呼吸。观察结果表明，人源化建模小鼠和未建模的对照小鼠情况大致相同。
8构建HIV感染小鼠模型和检测标准
将上一步中检测到外周血中hCD45+T细胞超过40％的小鼠,通过腹腔注射HIV-Nanoluc病毒液(6μg/只)进行HIV感染小鼠模型的构建，感染后每周进行成像检测病毒在体内的增殖情况，当荧光信号ROI值达到106～107photons/s为感染模型建成功。
小鼠成像实验利用Nano-Glo Luciferase实验系统,按照说明书要求配置成像底物,每只小鼠通过腹腔注射成像底物150μl,再通过动物麻醉系统利用异氟烷进行小鼠麻醉,之后使用小动物成像系统进行成像操作,除曝光时间调整为曝光60s,其余参数按照默认.
实验结果如图12-A所示,在HIV-Nanoluc病毒感染人源化小鼠3周成像小鼠腹腔部分有高度的荧光信号，可知有高滴度的HIV病毒复制。图12-B为对图12-A荧光强度分析的定量结果。
为了呈现小鼠感染HIV动力学，分别于HIV-Nanoluc病毒感染后7天和感染14天取小鼠进行解剖，经研磨得到小鼠脾脏细胞，计数脾脏细胞1×106cell，用RNA提取试剂盒进行RNA的提取,RNA提取完成后测浓度,取相同μg的脾脏细胞RNA利用赛默飞的逆转录DNA试剂盒形成cDNA.另取脾脏细胞1×106cell利用采用DNAzol提取DNA，提取完成后测浓度。取相同μg的脾脏细胞cDNA和DNA进行QPCR实验，检测感染小鼠模型的脾脏细胞中随着NL4-1RNA和DNA拷贝数感染动力学曲线。用于定量的引物和探针为gag引物和探针，如表3。
表3.1荧光定量PCR引物和探针
表3.2荧光定量PCR反应体系
表3.3荧光定量PCR反应条件
实验结果如图12-C、12-D和12-E所示，随著感染时间的增加，在HIV-Nanoluc病毒感染14天时，HIV-1RNA、DNA拷贝数和整合DNA拷贝数在小鼠体内不断升高，对比感染后7日HIV-1RNA拷贝数增加约7倍，HIV-1DNA拷贝数增加约6.5倍，HIV-1DNA整合拷贝数增加约15倍。和成像结果有较高的一致性，使评价抗HIV药物的效果更佳。
9VRC01-CAR-CD3+T细胞制剂制备及转效测定
9.1CAR-CD3+T细胞制备
采集健康供者脐带血60mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，具体方法同上分离外周血PBMC。计数后，使用适量CD3+T细胞阳性选择磁珠试剂盒分选CD3阳性细胞，并以1.0～2.0×106个/mL密度在T细胞完全培养液中培养，同时按每106个细胞加入25μl人CD3/CD28活化磁珠活化T细胞。
24小时后，按MOI＝3加入VRC01-CAR慢病毒进行转导，同时放入适量的polybrene混匀后置于CO2培养箱孵育，4小时后补加适量的T细胞完全培养基进行换液培养。
VRC01-CAR慢病毒转导24小时,将VRC01-CAR-CD3+T细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×106/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×106/mL。每天计数，得到VRC01-CAR-CD3+T的生长曲线如图13所示。
根据预计细胞用量收集VRC01-CAR-CD3+T细胞，重悬于含2％人血白蛋白的100mL生理盐水中，转入细胞回输袋中，热封后制成VRC01-CAR-CD3+T细胞制剂成品。或者冻存于含有10％FBS的DMSO中，使用程序降温仪进行细胞冻存。
9.2CAR-CD3+T细胞转导效率检测
取1.0×106个CAR-CD3+T细胞，与FITC-Strep II室温孵育30分钟，用含有2％FBS的PBS清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR阳性细胞在总细胞中的比率。VRC01-CAR-CD3+T细胞转导效率，检测结果如图14所示。图14表明成功制备了VRC01-CAR-CD3+T细胞，anti-gp120的CAR分子的表达率达到39.6％，可以充分满足本项目动物实验设计要求。
10利用HIV感染小鼠模型进行CAR-T细胞在体内的药效实验
CAR-T治疗HIV感染模型药效实验：将感染HIV一周左右荧光信号ROI值达到106～107photons/s的感染小鼠模型，注射上述培养冻存的VRC01-CAR-CD3+T细胞1～5×107cells/只。每周成像观察小鼠病毒荷载情况。并在实验终点进行小鼠解剖，取小鼠的脾脏组织和大脑组织提取DNA、RNA逆转录成cDNA进行QPCR实验，确定小鼠组织病毒的载量，实验结果如图11所示。
由图15可知，安慰剂治疗组小鼠随着时间的增加，小鼠体内荧光信号强度在持续上升,VRC01-CAR-CD3+T治疗组小鼠随着治疗时间的增加，小鼠体内荧光信号强度在持续减少，并维持两周在仪器内检测不出，表明CAR-T在体内逐渐杀死HIV-Nanoluc感染的细胞。由此可知该感染模型可以作为小鼠药效的评价模型。
在进行CAR-T治疗22天后，对安慰剂治疗组和CAR-T治疗组进行解剖，取小鼠的脾脏细胞5×106细胞提取RNA，RNA提取完成后测浓度,取相同量的脾脏细胞RNA利用逆转录DNA试剂盒形成cDNA进行QPCR实验，确定小鼠组织HIV-1RNA拷贝数。另取小鼠的脾脏细胞5×106细胞提取DNA，利用DNAzol提取DNA，利用QPCR实验确定HIV-1DNA在脾脏组织的拷贝数和整合拷贝数结果。另取相同重量的大脑组织进行DNA和RNA的提取，其中RNA利用试剂盒逆转录成cDNA，取相同μg的DNA和cDNA进行QPCR实验，确定HIV-1DNA在大脑组织的拷贝数和整合拷贝数结果
实验结果如图16所示，CAR-T细胞治疗组小鼠和对照组小鼠脾脏组织和大脑组织的HIV-1RNA,DNA和整合DNA拷贝数有显著性差异。在脾脏组织中，CAR-T细胞治疗组小鼠相较于对照组小鼠HIV-1RNA拷贝数降低约3.7倍，HIV-1DNA拷贝数降低约3.2倍，整合HIV-1DNA拷贝数降低约3.7倍。在大脑组织中，CAR-T细胞治疗组小鼠相较于对照组小鼠HIV-1RNA拷贝数降低约5.6倍，HIV-1总DNA拷贝数降低约4.8倍，整合HIV-1DNA拷贝数降低约2.2倍。同时结果表明，小鼠脾脏组织HIV-1拷贝数远大于大脑组织中的拷贝数。结合图12可知，随着HIV病毒感染人源化小鼠，小鼠脾脏中HIV病毒的载量越来越高。
根据小动物成像的实验结果和QPCR实验结果可知，该感染动物模型可以用于HIV药物的药效评估。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 武汉科技大学
<120> 一种抗HIV病毒药物评价动物模型的建立方法及其应用
<130> CP201221
<141> 2022-05-17
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 634
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
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<400> 6
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ctccttggga tattgatgat ctgtagtgct acagaaaaat tgtgggtcac agtctattat 120
ggggtacctg tgtggaagga agcaaccacc actctatttt gtgcatcaga tgctaaagca 180
tatgatacag aggtacataa tgtttgggcc acacatgcct gtgtacccac agaccccaac 240
ccacaagaag tagtattggt aaatgtgaca gaaaatttta acatgtggaa aaatgacatg 300
gtagaacaga tgcatgagga tataatcagt ttatgggatc aaagcctaaa gccatgtgta 360
aaattaaccc cactctgtgt tagtttaaag tgcactgatt tgaagaatga tactaatacc 420
aatagtagta gcgggagaat gataatggag aaaggagaga taaaaaactg ctctttcaat 480
atcagcacaa gcataagaga taaggtgcag aaagaatatg cattctttta taaacttgat 540
atagtaccaa tagataatac cagctatagg ttgataagtt gtaacacctc agtcattaca 600
caggcctgtc caaaggtatc ctttgagcca attcccatac attattgtgc cccggctggt 660
tttgcgattc taaaatgtaa taataagacg ttcaatggaa caggaccatg tacaaatgtc 720
agcacagtac aatgtacaca tggaatcagg ccagtagtat caactcaact gctgttaaat 780
ggcagtctag cagaagaaga tgtagtaatt agatctgcca atttcacaga caatgctaaa 840
accataatag tacagctgaa cacatctgta gaaattaatt gtacaagacc caacaacaat 900
acaagaaaaa gtatccgtat ccagagggga ccagggagag catttgttac aataggaaaa 960
ataggaaata tgagacaagc acattgtaac attagtagag caaaatggaa tgccacttta 1020
aaacagatag ctagcaaatt aagagaacaa tttggaaata ataaaacaat aatctttaag 1080
caatcctcag gaggggaccc agaaattgta acgcacagtt ttaattgtgg aggggaattt 1140
ttctactgta attcaacaca actgtttaat agtacttggt ttaatagtac ttggagtact 1200
gaagggtcaa ataacactga aggaagtgac acaatcacac tcccatgcag aataaaacaa 1260
tttataaaca tgtggcagga agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat cagtggacaa 1320
attagatgtt catcaaatat tactgggctg ctattaacaa gagatggtgg taataacaac 1380
aatgggtccg agatcttcag acctggagga ggcgatatga gggacaattg gagaagtgaa 1440
ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag 1500
agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc 1560
ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga 1620
caattattgt ctgatatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa 1680
cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaaacagc tccaggcaag aatcctggct 1740
gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc 1800
atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt 1860
tggaataaca tgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata 1920
cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa 1980
ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata 2040
aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt 2100
tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca 2160
atcccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga 2220
gacagatcca ttcgattagt gaacggatcc ttagcactta tctgggacga tctgcggagc 2280
ctgtgcctct tcagctacca ccgcttgaga gacttactct tgattgtaac gaggattgtg 2340
gaacttctgg gacgcagggg gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct cctacagtat 2400
tggagtcagg aactaaagaa tagtgctgtt aacttgctca atgccacagc catagcagta 2460
gctgagggga cagatagggt tatagaagta ttacaagcag cttatagagc tattcgccac 2520
atacctagaa gaataagaca gggcttggaa aggattttgc tataa 2565
<210> 7
<211> 516
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 480
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtaa 516
<210> 8
<211> 581
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
aattccgccc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag 60
gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga 120
gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg 180
ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt 240
gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca 300
ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc 360
agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat 420
tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc 480
ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga 540
accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata a 581
<210> 9
<211> 634
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 180
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgaccctg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 300
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420
gctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 634
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
tggaaaggat tttgctggat cctggtcttc acactcgaag at 42
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
cggaattatc actagtggcg gccgcttacg ccagaatgcg ttc 43
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 12
ggaccaggag cgacactaga a 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 13
cagccaaaac tcttgcttta tgg 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 14
gtgctaagca gttggtggt 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 15
acagcctcaa gatcatcagc a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 16
atgagtcctt ccacgatacc a 21
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 17
gtgctaagca gttggtggtg cagga 25

Claims (5)

1.一种抗HIV病毒药物评价动物模型的建立方法，所述方法以NPG小鼠作为构建基础，其包括如下步骤：
(1)通过尾静脉注射方法注射人源脐带血CBMC细胞，检测小鼠体内hCD45+细胞比例，当hCD45+细胞比例达到30％以上，判断人源化小鼠模型构建成功；
(2)针对人源化小鼠模型构建成功的小鼠，通过腹腔注射HIV-Nanoluc病毒液进行感染，感染后每周进行成像检测病毒在体内的增殖情况，当荧光信号ROI值达到106～107photons/s为抗HIV病毒药物评价动物模型建模成功；
所述HIV-Nanoluc病毒液具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
所述尾静脉注射人源CBMC细胞4-6×106cell/只。
2.根据权利要求1所述的方法，所述人源脐带血CBMC细胞的提取包括如下步骤：
采集健康人脐带血于肝素抗凝剂中混匀，离心分离收集上层血浆备用，其余血液成分和预热至室温的PBS进行1:0.5-2的体积比例进行混合，平铺于Ficoll淋巴细胞分离液上形成清晰的分离界面，离心，吸取中间的白膜层于洁净的离心管中，加入PBS清洗，离心弃上清，清洗1-3次。
3.根据权利要求1所述的方法，所述HIV-Nanoluc病毒液的注射量为5-10μg/只。
4.权利要求1-3任意一项所述方法建立的动物模型的应用，所述动物模型用于抗HIV药物的筛选。
5.根据权利要求4所述的应用，所述抗HIV药物为VRC01-CAR-CD3+T细胞制剂，所述VRC01-CAR-CD3+T细胞制剂由VRC01-CAR慢病毒转导CD3阳性细胞获得，所述VRC01-CAR慢病毒由信号肽SP1、抗HIV gp120抗原特异性单链抗体VRC01、标签信号Strep tag II、连接肽、CD8铰链区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域组成。
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提高人外周血单核细胞分离率的方法探讨;吴鹏;刘映峰;梁东辉;陈允钦;;实用医学杂志(第05期);第707-708页 *

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