KR20150004683A

KR20150004683A - 혈액 단백질 바이오마커를 이용한 류마티스 관절염 진단용 키트 및 이를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법

Info

Publication number: KR20150004683A
Application number: KR20130078014A
Authority: KR
Inventors: 서경훈; 윤희관; 박재은; 유석호; 장명희; 김혜난
Original assignee: 배재대학교 산학협력단; 주식회사 에이앤알티
Priority date: 2013-07-03
Filing date: 2013-07-03
Publication date: 2015-01-13

Abstract

본 발명은 바이오마커인 TNF-α, VEGF 및 CEA를 이용한 류마티스 관절염 진단용 키트 및 이를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 류마티스 관절염 진단용 키트는 류마티스 관절염의 중요한 지표 혹은 병인으로 작용하는 바이오마커인 TNF-α, VEGF 및 CEA를 이용함으로써 소량의 혈액만으로도 상대적으로 우수한 민감도와 특이도를 나타내어 류마티스 관절염의 정확한 진단이 가능한바, 간편성, 정확성 및 경제성의 효과가 있다. 따라서 단순한 혈액검사만으로도 간편하게 RA 환자를 선별하거나 치료 효과를 평가하는 방법으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

혈액 단백질 바이오마커를 이용한 류마티스 관절염 진단용 키트 및 이를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법{DIAGNOSTIC KIT OF RHEUMATOID ARTHRITIS USING BLOOD PROTEIN BIOMARKERS AND DIAGNOSTIC METHOD USING THEM}

본 발명은 류마티스 관절염 진단용 키트에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 혈액 단백질 바이오마커를 이용한 류마티스 관절염 진단용 키트 및 이를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법에 관한 것이다.

류마티스 관절염은 관절염을 일으키는 대표적인 자가 면역성 질환으로 우리나라에서는 아직까지 정확한 유병률에 대한 조사가 이루어지지 않았지만 미국의 경우 전 인구의 약 1%가 이 질환을 앓고 있다. 류마티스 관절염은 관절염을 일으키는 수많은 다른 병들과 구분되는 여러 가지 특징적인 소견을 가지고 있다. 우선 이 병은 주로 손과 발 등의 작은 관절을 침범하며 기타 무릎, 어깨, 팔꿈치, 턱관절, 경추 등 모든 관절의 동통, 종창, 열감을 동반할 수 있다. 또한 여러 가지 관절외 증상을 동반할 수 있다. 관절외 증상이라 하면 미열, 전신쇠약감 등의 비교적 가벼운 증상에서부터 폐, 눈, 혈관 등의 중요장기를 침범하는 경우까지 다양하다. 이 병은 류마티스 인자라고 하는 자가항체를 동반하는 경우가 많으며 (약 75~80%), 이 항체의 역가가 높을수록 더 심한 관절염을 동반하며 관절외 증상이나 류마티스 결절 (관절주위의 피부에 혹처럼 튀어나오는 피부 결절)을 동반하는 빈도가 높은 것으로 알려져 있다. 그러나 무엇보다도 중요한 특징은 이 병의 만성적인 경과와 그로 인한 진행성 관절파괴가 온다는 사실이다. 즉 관절의 염증은 활액막 (synovium)에서 시작하지만 만성적인 경과를 거치면서 연골과 뼈를 침범하여 심각한 관절의 손상과 변형을 초래하게 되고 이에 따른 노동력의 상실은 치료에 따른 경비와 함께 환자와 환자의 가족에게 심각한 사회적 경제적 부담이 되고 있다.

이러한 류마티스 관절염이 왜 생기는지에 대해서는 아직 확실하지는 않지만 염증성 cytokine들이 병리기전에 중요한 요소로 작용하는 것으로 알려져 있다. Cytokine이라는 것은 여러 종류의 세포로부터 분비되는 hormone-like molecule로서 세포의 수용체에 결합하여 세포의 기능을 조절하는 intercellular communication에 필수적인 물질이다. 류마티스 관절염에서 과잉 생산되는 대표적인 염증성 cytokine이 바로 TNF-α이다. TNF-α는 정상적으로는 면역 방어기전, 즉 감염의 확산을 막는 등의 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 과잉 생산되었을 경우에는 패혈성 쇼크(septic shock)와 같은 심각한 상태에 이르게 하기도 하며 류마티스 관절염에서는 여러 가지 경로를 통하여 염증과 관절파괴를 주도하기도 한다. 이는 주로 macrophage (대식세포)에서 분비되며 이 자체가 다른 염증성 cytokine (IL-1, IL-6, GM-CSF 및 nitric oxide)과 chemokine (면역세포들을 염증성 병변으로 유도하는 물질)의 분비를 촉진시키는 작용도 가지고 있으며 혈관내피세포의 adhesion molecule의 발현을 증가시켜 lymphocyte를 비롯한 inflammatory cell들이 관절 내로 모이게 하는 역할도 가지고 있다. 이 밖에도 synovial fibroblast에서 matrix metalloproteinase라고 하는 효소를 분비하고 osteoclast를 활성화시켜 관절의 연골과 뼈를 손상시키는 물질로도 밝혀져 있다. 이와는 반대로 TNF-α는 염증을 억제하는 cytokine (IL-1receptor antagonist, soluble IL-1 receptor, soluble TNF-αreceptor, IL-4, IL-10, TGF-α)도 분비하는 것으로 알려져 있으나 이 작용보다는 염증성 cytokine의 분비를 더 자극함으로써 결국 "cytokine dysequilibrium"을 초래하게 된다.

류마티스를 진단하기 위한 종래의 방법은 크게 세 가지로 구분할 수 있다. 먼저, 대부분의 류마티스 관절염(RA)의 경우 병력 조사와 촉진 등을 통하여 관절 부위의 붓기, 온도, 움직임의 제한 정도를 확인하고 지속적인 피로감 혹은 피부 밑의 결절이나 럼프를 조사하여 일차적으로 그 진행 정도를 일차 판단한다.

두 번째로 혈액 검사가 있으며, 이는 크게 1) 류마티스 인자 (Rheumatoid factor, RF) 검사와 2) 항 시트룰린화 단백질 항체 검사 (Anti-citrullinated protein antibodies (ACPAs) test)가 있다. RF 검사는 혈액 내의 비특이적 항체인 RF의 존재 여부를 검사하는 방법으로서 negative 결과라 하여서 RA가 아니라 할 수 없고 혈청반응 음성으로 분류하여 정밀 검사를 하여야 하며 RA 환자의 15% 정도가 여기에 속한다. RF는 RA 외에도 쉐그렌 증후군, C형 간염, 만성 감염증에서도 혈청 내에 높은 수준은 보이기도 하는데 건강한 사람의 약 10%에서 자주 발견되는 현상인바, RF 검사는 그 정확도가 높지 않은 문제점이 있다. 또한 ACPAs 검사는 RF 검사의 낮은 정확도를 대체하기 위하여 개발된 검사법으로서 혈액 내의 특정한 단백질 항체를 검사하는 방법이지만, 이 방법 역시 전체 RA 환자 중 67% 정도에서만 양성 반응을 보여서 그 정확도가 그다지 높지 않은 문제점을 안고 있다.

세 번째로, 영상 진단법이 있으며, 보다 구체적으로는 RA 환부 주변의 초음파 검사, MRI 검사 등을 통하여 RA를 진단하는 것으로서, RA 진행 정도 및 환부의 변형 등에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있으나 고비용이며 특정한 장비와 전문가가 있는 특정 병원으로 가야만 되는 불편함이 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 류마티스 관절염의 중요한 지표 혹은 병인으로 작용하는 바이오마커인 TNF-α, VEGF 및 CEA를 이용하여 우수한 민감도와 특이도를 보이는 류마티스 관절염 진단용 키트 및 이를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 TNF-α, VEGF 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 하나 이상의 결합제는 TNF-α, VEGF 및 CEA 마커에 각각 결합되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은

(a) 피검체로부터 분리된 시료를 TNF-α, VEGF 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제로 처리하는 단계; 및

(b) 상기 시료에 존재하는 마커의 수준 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법이 효소면역측정법(ELISA)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 류마티스 관절염 진단용 키트는 류마티스 관절염의 중요한 지표 혹은 병인으로 작용하는 바이오마커인 TNF-α, VEGF 및 CEA를 이용함으로써 소량의 혈액만으로도 상대적으로 우수한 민감도와 특이도를 나타내어 류마티스 관절염의 정확한 진단이 가능한바, 간편성, 정확성 및 경제성의 효과가 있다. 따라서 단순한 혈액검사만으로도 간편하게 RA 환자를 선별하거나 치료 효과를 평가하는 방법으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 ELISA 분석을 통한 혈액(혈청) 샘플 내 CEA 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 ELISA 분석을 통한 혈액(혈청) 샘플 내 TNF-α 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ELISA 분석을 통한 혈액(혈청) 샘플 내 VEGF 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 정상 56명, 관절염 환자 20명의 혈청을 이용하여 ROC 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명자들은 검사 대상자의 혈액에서 분리한 소량의 혈청을 이용하여 상대적으로 우수한 민감도와 특이도를 보이는 진단법을 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 류마티스 관절염의 중요한 지표 혹은 병인으로 작용하는 복수의 바이오마커인 TNF-α, VEGF 및 CEA를 이용한 진단법을 개발하였고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 TNF-α, VEGF 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물을 제공하며, 이때, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 결합제는, 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이며, 결합제는 TNF-α, VEGF 및 CEA에 각각 결합하는 결합제를 모두 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어 "TNF-α"는 종양괴사인자-알파(Tumor Necrosis Factor-alpha)로서, Cachexin 혹은 Cachectin으로도 알려져 있고, 면역계에서 염증반응을 증가시키기 위해서 만들어내는 신호전달 물질이며, 급성 면역반응을 매개하는 주요한 성장인자이다. 주로 활성화된 마크로파지에의해 생성되며, 다양한 면역 신호전달 물질로 작용하게 된다. 상처의 재생과 피부 면역에서도 주요한 역할이 밝혀지고 있다.

TNF-α는 암세포의 사멸도 유도시키지만 과도한 염증을 유발시켜서 류마티스에도 영향을 끼친다. TNF-α 저해제는 TNF-α가 세포의 특정 수용체에 결합하지 못하도록 만들어서 염증반응 발생을 막는다. 많은 관절염 환자들이 TNF-α가 과다 생성되고 있다.

TNF-α는 다양한 질환에서 개체의 염증, 면역, 또는 자가면역 질환뿐만 아니라, 종양 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 염증성 TNF-α와 관련 질환의 예는 류마티스 관절염, 건선 관절염, 강직 척추염, 염증 장질환(궤양성 대장염 및 크론병 포함), 건선, 또는 염증성 근육염을 포함한다. 진단될 수 있는 염증 질환의 다른 예는 랑게르한스 세포 조직구증, 성인성 호흡곤란 증후군/폐쇄성 세기관지염, 베게너 육아종증, 혈관염, 악액질, 구내염, 특발성폐섬유증, 피부근육염 또는 다발근육염, 비감염성 공막염, 폐와 관련이 있는 만성 사르코이드증, 과량의 모세포를 갖는 골수형성이상 증후군/불응성 빈혈, 궤양성 대장염, 중간 내지 심각한 만성 폐쇄성 폐질환, 및 거세포 동맥염을 포함한다.

본 발명에서 용어 "VEGF"는 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor)로, 혈관신생 (angiogenesis) 유도와 혈관의 투과도 (permeability)를 증가시키는 역할을 한다. VEGF는 성체에서의 혈관 생성(angiogenesis) 뿐만 아니라, 배아 발생에서의 혈관발달(vasculogenesis)을 조절하는 기능을 하며, 포유동물에서는 현재 다섯 종류의 VEGF들(VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PLGF)이 밝혀져 있다. 이들은 VEGF 수용체(VEGFR) -1, -2, -3 라고 알려진 세 개의 수용체 타이로신 인산화 효소(RTK)와 헤파린 설페이트 프로테오클리칸(HSPGs: heparin sulphate proteoglycans), 뉴로필린(NRPs) 등의 보조 수용체들에 중복적으로 결합한다. VEGF 수용체는 많은 성장인자 수용체가 그러하듯이 세포이동, 생존, 증식 등을 유발하는데, 다른 RTK 등에는 없는 삼차원의 혈관을 형성할 수 있는 신호를 전달하거나 혈관투과성을 조절하는 기능을 가진다. 암세포가 증식 및 성장하기 위해서는 산소와 영양을 공급하는 새로운 혈관이 필요하게 된다. 새로운 혈관 형성에는 여러 인자들이 관여하지만 그 중에서 가장 중추적인 조절인자로서 역할을 하는 것이 혈관내피세포 성장인자(VEGF; vascular endothelial growth factor)로 알려져 있다.

VEGF에 의한 내피세포 투과성 조절 메커니즘은 VEGF는 VEGFR-2를 경유하여, p120과 p100의 serine/threonine dephosphorylation을 유도함으로써 cadherin의 접착성을 변화시키고, 이를 통하여 혈관 투여도 및 세포의 이동성을 야기한다는 것이다. 하지만 이러한 실험 결과는 이전에 보고된 beta-catenin의 tyrosine phosphorylation에 의한 혈관 내피세포의 접착성 변형 유도 기작과는 실험 조건이 다르게 보고가 되었기 때문에 실제로 어떤 기작이 더욱 신빙성을 가지는 지는 좀 더 많은 실험을 필요로 하는 부분이다. 이러한 일련의 과정들은 adheren junction의 조밀함을 완화시켜 혈관의 투여도를 높이고, 또한 세포들의 이동을 야기하게 된다.

VEGF의 처음 알려질 당시에 angiogenesis factor로써 알려지기 보다는 혈관의 permeability 조절인자 (VPF)로 알려졌었다. 이후에 암세포에서 VEGF를 경유한 암세포의 조절기작들은 많은 연구가 이루어졌으나 permeability와 연관하여 이루어진 연구들은 암과 직접적으로 관련한 실험에 비해 극히 미비한 실정이다. 하지만 VEGF가 permeability를 조절함으로써, 암세포의 angiogenesis 유도와 전이과정, 그리고 암세포의 이동을 좀 더 용이하도록 유도할 것이라고 주장되어져 오고 있다.

본 발명에 용어 "CEA"는 암태아항원(Carcinoembryonic antigen)으로서, embryonic entodermal ephithelium에서 정상적으로 발견되는 당단백이다. CEA는 정상적으로 태생기의 장, 췌장, 간에서 생성되는 항원성 당단백으로 출생 후 소실되어 버리는 태아성 항원이다. 태아의 내배엽 조직이나 대장의 상피조직에 주로 존재한다. 대장암을 비롯하여 위암, 췌장암, 폐암, 유방암 등 여러 장기의 종양에서 폭 넓게 출현하는 범종양 표지자다. 종양세포뿐만 아니라 점액질을 생산하는 정상 상피에서도 생산된다. 면역 글로불린과 유사하며 생물학적으로는 암세포의 유착 및 이탈에 모두 관여하는 양극성을 보인다. 정상조직에서 나오는 CEA는 혈류나 림프조직에 접근하지 못하여 대개 분변으로 배출되게 되므로 혈중농도로는 잘 확인되지 않는다. 반면에 암세포의 경우는 혈류나 림프 침투를 하므로 CEA가 혈중에서 확인될 여지가 높다. 체내에서의 반감기는 간기능에 좌우되며 대개 2-10 일이다.

CEA의 직장벽 내에 국한된 결직장암에 대한 민감도가 20-40% 정도에 불과한 것으로 되어 있다. 뚜렷한 진행암이라면 90% 이상에서 상승하는 것으로 되어는 있지만 조기암에서는 상승정도가 낮은 것을 감안해서 전체적으로 결직장암의 60-70% 정도에서 상승한다고 보면 된다. 뿐만 아니라 결직장암이 아니라도 췌장암, 유방암, 위암, 폐암에서도 그 혈중치가 올라가며 양성질환 중에서도 궤양성 대장염이나 췌장염, 간염, 위염에서도 올라갈 수 있고 담배를 많이 피워 생기는 만성 기관지염 환자의 경우에도 올라갈 수도 있는 것으로 보고되고 있다.

본 발명에서 용어 "진단"은 질병 발생 가능성을 예측하거나 질병 발생 위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

상기 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메라 항체(chimeric antibody)로 수득되거나, 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화 항체(humanized antibody)로 수득될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다.

이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, ELISA 방법에 의해 정상인과 환자의 혈액 샘플로부터 CEA, TNF-α 및 VEGF 수준을 측정한 결과, 정상인 혈청보다 류마티스 관절염 환자군 혈청에서 CEA, TNF-α 및 VEGF 수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 류마티스 관절염 환자의 ROC(receiver operating characteristic)를 분석한 결과, TNF-α, VEGF 및 CEA 단독으로 진단을 하는 것 보다 TNF-α, VEGF 및 CEA를 같이 분석하면 민감도와 특이도가 증가하는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

따라서, 관절염에서 중요한 병인으로 작용하는 TNF-α, VEGF 및 CEA를 이용한 관절염의 대표적인 인자들을 효과적으로 진단할 수 있었으며, 앞으로 관절염의 이상적인 진단 및 환자 치료의 경과 지표 테스트로 적용될 수 있을 것이다.

이에, 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 진단용 키트를 제공하다. 본 발명의 류마티스 관절염 진단용 키트는 상기 조성물 외에 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수도 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

상기 진단용 키트가 ELISA 키트인 경우, 바람직하게 마커 단백질에 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수도 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은

본 발명에서 용어 "시료'란 개체의 조직에서 TNF-α, VEGF 및 CEA의 발현수준이 차이가 나는 전혈, 혈장, 혈액 등을 의미한다.

본 발명의 류마티스 관절염의 진단을 위한 정보제공 방법은 상기 시료에 TNF-α, VEGF 및 CEA에 특이적인 항체를 처리한 후, 상기 시료 내에서 항체-항원 복합체를 형성하도록 하여 이들의 반응 수준을 비교할 수 있는데, 본 발명에서 항원-항체 반응 수준이란 시료 중의 상기 단백질 항원과 이를 인지하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부위와 결합된 양을 의미하며, 항원-항체 복합체의 양이다. 이러한 항원-항체의 반응수준은 당업계에서 통상적으로 사용되는 측정방법을 제한 없이 사용하여 비교할 수 있다.

이러한 항원-항체 반응수준 측정방법의 예로는 웨스턴 블럿(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 응집법 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 ELISA 방법을 이용할 수 있다.

ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 류마티스 관절염의 발병 유무를 진단할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 혈액 샘플 수집

충남대학교병원 IRB 심사를 통과한 인체자원은행에서 공급받은 정상인과 류마티스 관절염혈청 및 Bio Serve 사에서 인증된 혈청을 구입하여 하기의 실험을 진행하였고, 보다 구체적으로는 정상 20명, 유방암 20명, 위암 20명, 대장암 20명, 갑상선암 20명, 관절염 20명, 난소암 10명, 건선 10명의 시료를 수집하였다.

실시예 2. ELISA 분석을 통한 CEA , TNF -α 및 VEGF 수준 측정

실시예 1을 통해 수집된 혈액 샘플을 하기와 같은 ELISA 분석을 통해 CEA, TNF-α 및 VEGF 수준을 측정하였다.

2-1. 항체 코팅

코팅버퍼(coating buffer 1L : Na₂CO₃[Sigma, S7795]) 1.59g, NaHCO₃(Sigma, S8875) 2.93g, NaN₃(Sigma, S2002) 0.2g dH₂O(pH9.6보정 후)를 filter[0.2m])에 100ng/well 희석하여 96well 플레이트(NUNC, 439454)에 각 well에 100μl첨가하여 4℃에서 12시간 반응시켰다(ex buffer 9.99ml+Ab(1mg/ml) 10μl). 반응이 끝나면 각 well의 내용물을 흡입해 내고 표준액(Sigma, P2688) 200μl 첨가하여 실온(15~25℃)에서 2시간 반응시킨 후, 플레이트를 흡습지(핸드타올)에 뒤집어 강하게 쳐서 남아있는 습기를 완전히 제거하였다.

2-2. 혈청 반응 및 2차 항체 반응

표준액 30μl와 혈청(혹은 혈장) 20μl 및 2차 항체(표준액을 사용하여 1/500로 희석) 50μl 첨가 후 30초 동안 프레임을 가볍게 흔들어 완전히 혼합한 후 37℃에서 60분간 반응시켰다 (표준액과 2차 항체 및 검체의 반응시간의 편차를 최소화하기 위하여 검사 시 표준액 및 검체를 10분 이내에 넣는다).

2-3. 혈청 및 2차 항체 제거 및 세척

각 well의 내용물을 흡입해 내고 세척액(Sigma, P3563)을 플레이트의 각 well에 300μl씩 분주하여 세척하며, 이를 3회 반복하여 세척하였다. 세척된 플레이트를 흡습지(핸드타올)에 뒤집어 강하게 쳐서 남아있는 습기를 완전히 제거하였다.

2-4. Streptavidin HRP 반응

표준액으로 희석하여 조제한 Streptavidin HRP용액(R&D, DY998)을 플레이트의 각 well에 100μl씩 분주하였다. 30초 동안 프레임을 가볍게 흔들어 완전히 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다.

2-5. Streptavidin HRP 반응액 제거 및 세척

각 well의 내용물을 흡입해 내고 세척액을 플레이트의 각 well에 300μl씩 분주하여 세척하며, 이를 3회 반복하여 세척하였다. 세척된 플레이트를 흡습지에 뒤집어 강하게 쳐서 남아있는 습기를 완전히 제거 하였다.

2-6. 기질액 반응 및 반응 정지

기질액(TMB, KPL 52-00-03)을 각 well에 100μl씩 넣고 프레임을 가볍게 처서 잘 혼합한 후, 실온(15~25℃)에서 30분 동안 반응시켰다. 이때, 상기 반응은 직사광선을 피하여 실시하였다. 반응정지액(Hydrogen peroxide solution, Sigma, 320501) 100μl 씩 각 well에 넣고 부드럽게 혼합하여 반응을 정지시켰다(이때 푸른색은 노란색으로 완전히 바뀌어야 한다).

2-7. 흡광도 측정

검체의 흡광도를 450nm에서 측정 하였다. 이중파장을 사용할 경우 참조 파장은 620nm로 측정하였고, 흡광도는 반응정지액을 넣은 후 10분 이내에 측정한다.

2-8. 결과 분석

혈청 분석할 때 농도를 알고 있는 표준 단백질(Ag protein)을 standard로 사용하였으며, ELISA 측정값을 이용 Microsoft Office Excel 프로그램을 사용하여 혈청의 상대적인 농도를 계산하였다. 한편, 통계 분석은 MedCalc for windows version 10 분석 프로그램을 이용하여 분석 하였다.

① 혈청 내 CEA 수준

ELISA 분석을 통한 혈액(혈청) 샘플 내 CEA 수준을 측정한 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 대장암, 위암 및 관절염의 경우에, 정상인 혈청보다 환자군 혈청에서 CEA 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

② 혈청 내 TNF-α 수준

ELISA 분석을 통한 혈액(혈청) 샘플 내 TNF-α 수준을 측정한 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 관절염의 경우에, 정상인 혈청뿐만 아니라 다른 질환의 환자군 혈청보다 TNF-α 수준이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

③ 혈청 내 VEGF 수준

ELISA 분석을 통한 혈액(혈청) 샘플 내 VEGF 수준을 측정한 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 대장암, 위암, 갑상선암 및 관절염의 경우에, 정상인 혈청보다 환자군 혈청에서 VEGF 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 관절염 환자의 ROC(receiver operating characteristic) 분석

정상 56명, 관절염 환자 20명의 혈청을 이용하여 ROC 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

추가적으로, 통계 분석을 통해 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 산출하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

	sensitivity	specificity	AUC
TNF-α	52.4%	96.4%	0.735
VEGF	52.4%	74.5%	0.570
CEA	85.7%	43.6%	0.682
Logistic	81.0%	76.4%	0.814

표 1에 나타낸 바와 같이, TNF-α의 경우에는 민감도와 특이도가 각각 52.4% 및 96.4%였고, AUC는 0.735였고, VEGF의 경우에는 민감도와 특이도가 각각 52.4% 및 74.5%였고, AUC는 0.570임을 확인할 수 있었다. 또한, CEA의 경우에는 민감도와 특이도가 각각 85.7% 및 43.6%였고, AUC는 0.682였고, Logistic의 경우에는 민감도와 특이도가 각각 81.0% 및 76.4%였고, AUC는 0.814임을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 관절염 환자를 진단하고자 하는 경우, TNF-α, VEGF 및 CEA 단독으로 진단을 하는 것보다 TNF-α, VEGF 및 CEA를 같이 분석하면 민감도와 특이도가 증가하는 것을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

TNF-α, VEGF 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제를 포함하는 류마티스 관절염 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제는 TNF-α, VEGF 및 CEA 마커에 각각 결합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 진단용 키트.
류마티스 관절염 진단을 위한 정보 제공 방법으로서,
(a) 피검체로부터 분리된 시료를 TNF-α, VEGF 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합제로 처리하는 단계; 및
(b) 상기 시료에 존재하는 마커의 수준 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제는 TNF-α, VEGF 및 CEA 마커에 각각 결합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 부분인 것을 특징으로 하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 방법이 효소면역측정법(ELISA)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는, 방법.