KR20150004183A - 바이오센서용 시약조성물 및 이를 포함하는 바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 산화환원효소와 금속함유 착물 및 나프톨 그린 B를 반응시킴으로써 향상된 글루코스 분석 선형성을 얻을 수 있으며, 소량의 글루코스 농도까지 검출할 수 있으므로 혈당 측정에 필요한 혈액을 최소화할 수 있는 등의 효과를 갖는 바이오센서용 시약조성물 및 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다. 이를 위해 본 발명에 따른 바이오센서용 시약조성물 및 이를 포함하는 바이오센서는, 바이오센서용 시약조성물에 있어서 시약조성물은 적어도 2종의 전자전달매개체 및 효소를 포함하는 바이오센서용 시약조성물인 것을 특징으로 한다. 또한, 시료 내에 존재하는 분석물질을 측정하는 바이오센서에 있어서, 일측면에 분석물질과 반응하는 시약조성물이 도포 된 적어도 하나의 전극을 포함하는 하부기판, 하부기판 상에 소정의 높이로 형성되되, 시료가 전극의 위치까지 흡입 및 유도되도록 전극과 대향 하는 일측면에 시료주입부를 구비하는 스페이서 및 스페이서 상에 구비되는 상부기판을 포함하는 바이오센서인 것을 특징으로 한다.

Description

바이오센서용 시약조성물 및 이를 포함하는 바이오센서{REAGENT COMPOSITION FOR BIOSENSOR AND BIOSENSOR COMPRISING THE SAME}
본 발명은 효소와 적어도 2종의 전자전달매개체를 포함하여 향상된 글루코스 분석 선형성을 얻을 수 있으며, 소량의 글루코스 농도까지 검출할 수 있어 혈당 측정에 필요한 혈액을 최소화할 수 있는 등의 효과를 갖는 바이오센서용 시약조성물 및 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명은 바이오센서용 시약조성물 및 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것으로, 특히 생체 시료 중의 특정 성분을 정량하기 위한 시약조성물과 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.
최근 당뇨병 환자가 증가함에 따라, 당뇨병을 진단하고 예방하는데 있어서 혈액내의 포도당(혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 측정해야 할 필요성이 증대되고 있다. 당뇨병은 주요 건강 위험군으로 알려져 있다. 일반적으로, 미국 당뇨병 협회(ADA)는 인슐린 의존형 당뇨병 환자 대부분에게 하루에 3회 이상 혈당을 확인하도록 권고한다. 인슐린은 혈액 중 당의 이용을 제어하고 또 치료되지 않는다면 케톤증을 초래할 수 있는 고혈당증을 방지한다. 그러나 인슐린 요법의 부적절한 관리는 저혈당증을 초래할 수 있다. 저혈당증은 혼수를 유발할 수 있어서 치명적일 수 있다.
또한 오랫동안 당뇨병을 앓게 되면 심장병, 죽상동맥경화증, 실명, 중풍, 고혈압 및 신부전과 같은 합병증을 유발할 수 있다. 인슐린 주사의 양은 혈중 글루코스 양과 관련된다. 따라서, 혈중 글루코스의 정확한 검출은 당뇨병의 적절한 치료에 필수적이다.
이에 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 혈당을 측정할 수 있도록 다양한 혈당 측정기가 제작되고 있다. 일반적으로 혈당 측정기는 사용자 각자가 스트립 형태의 바이오센서를 사용하는데, 이러한 바이오센서의 작동원리는 광학적 방법 또는 전기화학적 방법에 기초하고 있다.
이 중 전기화학적 방법의 가장 큰 특징은 전자전달매개체를 사용하는 것이다. 상기 전자전달매개체로는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체; 퀴논(quinones), 퀴논 유도체; 전이금속함유 유기 및 무기물(헥사아민 루테늄, 오스뮴 함유 고분자, 포타슘 페리시아나이드 등); 및 유기 전도성 염(organic conducting salt), 비오로겐(viologen)과 같은 전자전달 유기물 등을 사용한다.
상기 전기화학적 방법의 혈당 측정 원리를 설명하면, 먼저 혈액내의 포도당은 당산화효소의 촉매작용에 의해 글루콘산으로 산화되게 된다. 이때 당산화효소의 활성 부위인 FAD가 환원되어 FADH2로 된다. 그 후 환원된 FADH2는 전자전달매개체와의 산화환원반응을 통하여 FADH2는 FAD로 산화되고, 전자전달매개체는 환원되게 된다. 이렇게 형성된 환원상태의 전자전달매개체에서 발생 되는 전자는 전극표면까지 확산되는데, 이때 작동 전극표면에서 환원상태 전자전달매개체의 산화전위를 인가하여 생성되는 전류를 측정하여 혈당의 농도를 측정하게 된다.
이러한 전기화학적 바이오센서는 종래의 광학적 방법에 의한 바이오센서와는 달리 산소에 의한 영향을 줄일 수 있고, 시료가 혼탁하더라도 시료를 별도 전처리 없이 사용 가능하다는 장점을 갖는다.
일반적으로 전기화학적 바이오센서는 전기절연성의 기판상에 스크린 인쇄 등의 방법으로 복수의 전극을 포함하는 전극계를 형성하고, 형성된 전극계상에 친수성 고분자와 산화환원효소 및 전자수용체로 이루어지는 효소반응층을 형성한 것이다. 이러한 전기화학적 바이오센서의 효소반응층상에 기질을 포함한 시료액을 떨어뜨리면, 효소반응층이 용해하고 기질과 효소가 반응하여 기질이 산화되고, 이에 따라 전자수용체가 환원된다. 효소반응 종료 후 이 환원된 전자수용체를 전기화학적으로 산화하여 얻어지는 산화 전류로부터 시료액 속의 기질 농도를 구할 수 있다.
이와 같은 바이오센서를 사용함에 있어 소량의 시료로 정확하게 빠른 측정값을 얻는 것은 사용자의 편리를 극대화한다는 점에서 대단히 중요한 문제이다. 대부분의 혈당 측정 제품들은 혈액을 채취하여 바이오센서를 사용하여 혈액 내의 혈당을 정량하는 방법을 이용한다. 그러나, 혈액을 채취하는 일은 환자에게 상당한 고통을 주는 행위이므로, 환자의 고통을 줄이기 위해서는 측정에 필요한 혈액의 양을 최소화하는 것이 요구된다. 특히 1 ㎕ 이하의 소량의 시료, 바람직하게는 0.5 ㎕ 이하의 시료, 더 바람직하게는 0.3 ㎕ 이하의 시료를 사용하면 팔뚝과 같은 대체부위에서 혈액을 채취하여 측정이 가능하기 때문에 환자가 혈당을 측정하는데 따르는 고통을 최소화할 수 있다. 따라서, 바이오센서는 혈당 측정을 위해 필요한 혈액의 양을 최소화할 수 있어야 한다.
한편, 바이오센서에 있어 다른 하나의 문제는 소형화에 따른 측정 감도라 할 수 있다. 전극 표면에 고정화되는 반응 관련 물질의 양은 바이오센서의 감도에 영향을 미치는 중요한 요인들 중 하나이다. 그러나 최근 들어 바이오센서가 점차 소형화되어짐에 따라 특정 물질과 반응할 수 있는 물질들을 고정화할 수 있는 면적도 작아지면서 고감도의 소형화 센서 개발의 심각한 한계가 나타나고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출한 것으로서, 본 발명의 목적은 혈당 측정을 위한 바이오센서용 시약조성물에 있어서 고감도의 향상된 글루코스 분석 선형성을 얻고 글루코스 측정에 필요한 혈액을 최소화할 수 있는 시약조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 시약 조성물을 이용하여 산업적 및 경제적으로 유용한 글루코스 측정용 바이오센서를 제공하는 등의 효과를 갖는 바이오센서용 시약조성물 및 이를 포함하는 바이오센서를 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적은, 바이오센서용 시약조성물에 있어서, 시약조성물은 적어도 2종의 전자전달매개체 및 효소를 포함하는 것을 특징으로 갖는 바이오센서용 시약조성물에 의해 달성된다.
여기서, 전자전달매개체는 금속함유 착물 및 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 금속함유 착물은 루테늄 착물(ruthenium complex) 또는 페리시아나이드 착물(ferricyanide complex)인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 루테늄 착물은 Ru(NH3)6Cl3, [Ru(2,2',2''-terpyridine)(1,10-phenanthroline)(OH2)]2+, trans-[Ru(2,2'-bipyridine)2(OH2)(OH)]2+, [(2,2'-bipyridine)2(OH)RuORu(OH)(2,2'bpy)2]4+ 및 [Ru(4,4'-bipyridine)(NH3)5]2+로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
여기서, 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)는 완충용액 100 중량부에 대하여 0.1 중량부 이상 20 중량부 이하로 사용되는 것을 특징으로 하는 한다.
여기서, 효소는 산화환원 효소, 탈수소 효소, 전이 효소 또는 가수분해 효소 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase), 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(nicotinamide adenine dinucleotideglucose dehydrogenase), 파이롤로퀴놀린 퀴논-글루코스탈수소효소(pyrroloquinoline quinine glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스산화효소(glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 및 빌리루빈산화 효소(bilirubin oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
여기서, 시약조성물은 글루코스 바이오센서용 시약조성물인 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 목적은, 시료 내에 존재하는 분석물질을 측정하는 바이오센서에 있어서, 일측면에 분석물질과 반응하는 시약조성물이 도포 된 적어도 하나의 전극을 포함하는 하부기판, 하부기판 상에 소정의 높이로 형성되되, 시료가 전극의 위치까지 흡입 및 유도되도록 전극과 대향 하는 일측면에 시료주입부를 구비하는 스페이서 및 스페이서 상에 구비되는 상부기판을 포함하되, 시약조성물은 적어도 2종의 전자전달매개체 및 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서에 의해 달성된다.
바람직하게는, 전자전달매개체는 금속함유 착물 및 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 효소는 산화환원 효소, 탈수소 효소, 전이 효소 또는 가수분해 효소 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 금속함유 착물은 루테늄(ruthenium complex) 또는 페리시아나이드 착물(ferricyanide complex)인 것을 특징으로 한다.
여기서, 루테늄 착물은 Ru(NH3)6Cl3, [Ru(2,2',2''-terpyridine)(1,10-phenanthroline)(OH2)]2+, trans-[Ru(2,2'-bipyridine)2(OH2)(OH)]2+, [(2,2'-bipyridine)2(OH)RuORu(OH)(2,2'bpy)2]4+ 및 [Ru(4,4'-bipyridine)(NH3)5]2+로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 시약조성물은 산화환원효소와 전자전달매개체, 즉 금속함유 착물과 나프톨 그린 B를 반응시킴으로써 향상된 글루코스 분석 선형성을 얻을 수 있으며, 소량의 글루코스 농도까지 검출할 수 있으므로 혈당 측정에 필요한 혈액을 최소화할 수 있는 등의 효과를 가진다.
또한, 본 발명의 바이오센서 시약조성물의 나프톨 그린 B는 용해도가 좋아 산업적으로 사용하기 용이하고, 가격 또한 저렴하여 하루에도 몇 번씩 혈당을 측정해야하는 사람들에게 매우 유용한 글루코스 측정용 바이오센서를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 바이오센서의 분해 사시도이다.
도 2는 본 발명의 비교예 1 내지 3에 따른 글루코스 측정 전류 변화 그래프이다.
도 3은 본 발명의 비교예 4 내지 6에 따른 글루코스 측정 전류 변화 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 내지 4에 따른 글루코스 측정 전류 변화 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예와 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.
본 발명에 따른 바이오센서용 조성물은 적어도 2종의 전자전달매개체와 효소를 포함하는 것을 특징으로 한다.
2종의 전자전달매개체는 금속함유 착물 및 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)일 수 있다.
여기서, 금속함유 착물은 페리시아나이드 착물(ferricyanide complex), 포타슘 페리시안나이드(potassium ferricyanide), 루테늄 착물(ruthenium complex), 헥사아민루테늄클로라이드(hexaamineruthenium chloride), 페로센(ferrocene) 및 그 유도체, 퀴논(quinine) 및 그 유도체, 페나진 메토설페이트 및 그 유도체, p-벤조퀴논 및 그 유도체, 2,6-디클로로페놀인도페놀, 메틸렌 블루, 니트로테트라졸륨 블루, 오스뮴 착체 등 효소와 반응하여 산화 또는 환원할 수 있는 물질들이 사용될 수 있다. 이들 중에서 금속함유 착물은 루테늄 착물 또는 페리시아나이드 착물이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 헥사아민루테늄클로라이드, 포타슘 페리시안나이드가 바람직할 수 있는데, 헥사아민루테늄클로라이드가 보다 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 루테늄 착물은 Ru(NH3)6Cl3, [Ru(2,2',2''-terpyridine)(1,10-phenanthroline)(OH2)]2+, trans-[Ru(2,2'-bipyridine)2(OH2)(OH)]2+, [(2,2'-bipyridine)2(OH)RuORu(OH)(2,2'bpy)2]4+ 및 [Ru(4,4'-bipyridine)(NH3)5]2+로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다. 가장 바람직한 루테늄 착물로는 헥사아민루테늄클로라이드로, 수용액에서 산화-환원 상태가 안정하며 가역적이고, 환원된 전자전달매개체는 산소와 반응하지 않으며, 환원된 전자전달매개체의 산화가 pH에 민감하지 않고, 전기화학적 방해물질인 아세트아미노펜(acetaminophene), 아스코르브산(ascorbic acid), 빌리루빈(Bilirubin), 도파민(Dopamine), 요산(Uric acid), 겐티신산(gentisic acid) 등과 거의 반응하지 않는 특성을 갖는다.
또 하나의 전자전달매개체로 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)를 이용하는 것을 특징으로 한다. 나프톨 그린 B는 나프톨 그린 Y의 나트륨염으로 용해성이 좋으며, 산업적으로 가격이 저렴하고 다양한 분야에서 염료로 사용되고 있다.
한편, 효소로는 글루코스 산화효소, 락테이트 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 알코올 산화효소 등 여러 종류의 산화환원효소와, 글루코스 탈수소효소, GOT(glutamate oxaloacetate transaminase), GPT(glutamate pyruvate transaminase)등 여러 종류의 전이효소와 가수분해효소가 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 헥사아민루테늄클로라이드와 나프톨 그린 B를 함께 사용함으로써 글루코스 검출 성능이 현저히 증가하였다.
본 발명에서 사용되는 전자전달매개체로서는 종래 공지의 것을 사용할 수 있고, 시료나 사용하는 산화 환원 효소에 따라 적절히 결정할 수 있다. 또한, 상기의 나프톨 그린 B를 포함하여 전자전달매개체의 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
전자전달매개체의 함유량에 대해서는 특별히 제한은 없고, 시료의 첨가량 등에 따라 적절히 조절될 수 있다. 전자전달매개체는 글라이신과 같은 완충액으로 조제해 두는 것도 바람직하다.
한편, 산화환원효소(Oxidoreductase)와 전자전달매개물질을 이용한 전기화학적 센서의 측정 원리를 보면 아래의 반응식과 같다.
[반응식]
분석물질 + 효소(산화상태) + 전자전달매개물질(산화상태) ===> 반응결과물질 + 효소(산화상태) + 전자전달매개물질(환원상태)
이 반응식에서 시료 내의 분석물질과 반응하여 생성된 환원상태의 전자전달매개물질은 시료 내에 존재하는 분석물질의 농도에 비례한다. 이를 이용하여 기준전극 또는 보조전극을 기준으로 작동 전극에 일정한 전압을 인가하여 환원상태의 전자전달매개물질을 산화시키며 이때 발생하는 산화 전류의 양을 측정하여 시료 내의 분석물질을 정량할 수 있다.
상기 효소는 상기 [반응식]에 나타낸 바와 같이, 측정하고자 하는 다양한 대사물질과 반응하여 환원된다. 이후 환원된 효소와 전자전달매개체와 반응하여 대사물질을 정량하게 된다.
한편, 시약조성물은 계면활성제, 수용성 고분자, 지방산, 4차 암모늄염 및 효소 안정제 중 적어도 어느 하나를 더 포함할 수 있다.
상기 계면활성제를 함유시킴으로써 산화 환원 효소가 전극에 고착하는 것을 유의하게 억제·방지하고, 그 결과 전극 근방에서의 산화 환원 효소에 의한 산화형 전자 전달체의 환원형 전자 전달체로의 변환 효율을 향상시킬 수 있는, 다시 말하면 보다 시료액 중의 기질 농도와의 상관성을 높게 할 수 있다. 계면활성제의 양 및 형태는 효소 상에서 변성 효과를 피하기 위해 선택적으로 조절할 수 있다.
본 발명에 이용되는 계면활성제는, 본 발명의 효소 활성이 저하되지 않는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 비이온성 계면활성제, 양성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 천연형 계면활성제 등을 적절히 선택하여 사용할 수는 있다. 이들은 단독으로 이용해도 되고 혼합물의 형태로 이용해도 된다. 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 에테르이다. 보다 바람직하게는, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올이며 상표명 Triton X-100으로 구입할 수 있다. 시약 혼합물 중의 Triton X-100의 농도는 바람직하게는 0.01% (W/W) 내지 2%이다.
상기 첨가제에 있어서, 수용성 고분자는 시약조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행한다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트(perfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate), 폴리아미드(polyamide) 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 혈당 측정 바이오센서를 실시예로 설명하지만, 혈당 검사의 적용과 동일하게 특정효소에 알맞은 전자전달 매개체를 도입함으로써 다양한 대사물질, 예를 들면 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 단백질, 과산화수소, 알코올, 아미노산, GPT(glutamate pyruvate transaminase), GOT(glutamate oxaloacetate transaminase)와 같은 효소 등의 생체 시료, 환경시료, 농업·공업 시료 또는 식품 시료 중의 다양한 유기물 또는 무기물 농도도 동일한 방법으로 정량할 수 있다.
따라서, 본 발명은 시약조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 다양한 대사물질의 정량에 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 혈당 산화효소, 락테이트 산화효소, 콜레스테롤 산화효소, 글루타메이트 산화효소, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제, 알코올 산화효소 등을 사용해서 콜레스테롤, 락테이트, 글루타메이트, 과산화수소 및 알코올의 정량을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 당산화효소(glucose oxidase; GOx), 당탈수소화 효소(glucose dehydrogenase; GDH), 콜레스테롤 산화효소, 콜레스테롤 에스테르화 효소, 락테이트 산화효소, 아스코빅산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올 산화효소, 알코올 탈수소화효소, 빌리루빈 산화효소(bilirubin oxidase) 및 당탈수소화효소로 이루어진 군에서 선택된 산화효소를 사용한다.
또한 본 발명의 바이오센서는 중성지방 센서, 콜레스테롤 센서 등의 종래 공지의 센서에 적용하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오센서의 분해 사시도이다.
상기 도 1을 예시로 본 발명의 바이오센서를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 의한 시약조성물을 포함하는 바이오센서는 크게 하부기판(100)과 스페이서(200) 및 상부기판(300)으로 구비될 수 있다.
상기 하부기판(100)은 적어도 하나 이상의 전극(21~23)을 일측면에 구비하고 시료 내에 존재하는 분석물질과 반응하는 시약조성물을 전극 위에 도포하여 형성되는 절연성 하부기판(100)이다.
상기 스페이서(200)는 상기 하부기판(100) 상에 소정의 높이로 형성되어 상기 하부기판(100)과 상기 상부기판(300)을 접착시킬 수 있으며, 분석물질 시료가 상기 하부기판(100)의 상기 전극(21~23)까지 흡입 및 유도되도록 상기 전극과 대향 되는 일측면에 시료주입부(30)를 더 구비할 수 있다.
상기 상부기판(300)은 상기 하부기판(100)과 마주보며 상기 스페이서(200) 상에 구비되고, 시료주입부(30)를 통해 분석물질 시료와 함께 흡입되는 공기를 배출하는 공기배출부(40)를 더 포함하는 절연성 상부기판(300)일 수 있다.
이때, 공기배출부(40)는 시료의 흡입속도를 높이기 위하여 시료주입부(30)와 별개의 다른 층에 터널 형태로 형성될 수 있으며, 특히 공기배출부(40)는 시료의 흡입방향과 수직한 방향으로 형성된 반원통형의 형상인 것이 바람직할 수 있다.
보다 구체적으로 설명하면, 하부기판(100)은 절연성 물질로 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리이미드, 아크릴수지, 폴리에스터, PVC 또는 폴리카본에이트로 구성된 얇은 판이 사용될 수 있다. 하부기판(100)은 50~400㎛의 두께를 가지는 절연성 물질이 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 100~300㎛ 두께를 가지는 절연성 물질을 사용하는 것이 적절하다.
상기 하부기판(100)의 상부에는 측정장치(도면 도시 생략)에 접촉되는 리드선(24~26)과, 리드선에 연결되어 흡입된 시료에 흐르는 전기신호를 검출하는 전극(21~23)이 인쇄된 전극계(20)가 형성된다. 여기서 전극은 작동전극(23), 기준전극(22) 및 확인전극(21)으로 구성될 수 있다. 상기 리드선(24~26)은 일반적인 스크린 프린트와 같은 방법으로 형성할 수 있다. 또한 상기 전극(21~23)은 전도성 카본 잉크(탄소반죽)를 사용하여 스크린 프린트 방법으로 형성할 수 있다.
한편 상기 전극(21~23) 상호간의 절연을 위해 전극(21~23) 각각의 상부면 일부를 제외한 나머지 부분에는 절연체(절연반죽)를 부분적으로 도포함으로써 절연층이 형성된다. 이러한 절연체로는 비전도성 스크린 프린팅 잉크 또는 절연용 잉크를 사용할 수 있다.
여기서, 상기와 같이 부분적으로 절연체를 인쇄하고 남은 부분 중 노출된 전극(21~23)의 상부면에는 시약조성물이 도포된다. 상기 시약조성물에는 주입된 시료와 반응하는 효소와 전자전달매개체(전자수용체)가 포함된다. 상기 시약조성물은 상기 전극(21~23)을 충분히 덮도록 전극 위에 도포되어 고정된다. 또한, 상기 시약조성물은 상기 전극(21~23) 모두에 도포되거나, 적어도 하나에 도포 될 수 있으며, 작동전극(23)에만 도포되어 사용될 수도 있다.
상기 시약조성물에 분석물질을 포함한 시료를 시료주입부(30)를 통해 주입하면, 시료 내에 포함된 분석물질과 효소(Enzyme)가 반응하여 분석물질이 산화되고, 이에 따라 전자수용체가 환원된다. 효소반응 종료 후 이 환원된 전자수용체를 전기화학적으로 산화하여 얻어지는 산화 전류를 상기 전극(21~23)과 연결된 리드선(24~26)에 접촉되는 측정 장치(도면 도시 생략)를 통해 측정함으로써 시료 중에 포함된 분석물질의 농도를 구할 수 있다.
스페이서(200)는 상부기판(300)과 하부기판(100)을 접착하여 형성되는 시료주입부(30)를 통해 모세관을 형성한다. 이를 통해 분석물질 시료가 빠르게 흡수될 수 있다.
스페이서(200)는 양면테이프로 구성될 수 있다. 시료주입부(30)를 통해 측정하고자하는 시료가 모세관 현상으로 자동 주입되며, 시료도입공간(30)에 존재하던 공기는 시료의 유입으로 인해 상부기판(300)에 형성된 공기배출부(40)를 통해 외부로 배출된다.
한편, 본 발명에 따른 전극(21~23)은 전도성 고분자, 탄소, ITO입자, 금속입자, 흑연, 백금 처리된 탄소, 은, 금, 팔라듐 또는 백금 성분 등을 이용하여 제작된다. 예를 들면, 탄소나 백금 처리된 탄소로 구성된 잉크, 또는 팔라듐을 포함하는 잉크를 사용하여 하부기판(100)에 전극(21~23)을 인쇄할 수 있다. 또는, 금을 이용한 진공증착에 의해 하부기판(100)에 전극(21~23)을 형성할 수도 있다.
이하, 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1]
시약조성물 제조
pH 6.5, 50mM ACES 완충용액(ACES: N-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid)을 제조하였다. 제조한 완충용액 100 중량부에 0.6 중량부의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 넣고 녹인 다음 0.1 중량부의 TritonX-100 및 1.4 중량부의 효소 안정제를 차례로 더 넣고 녹였다.
상기 용액에 2.3 중량부의 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3), 0.9 중량부의 Naphthol Green B 및 0.15 중량부의 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH)를 차례로 넣고 녹여 시약조성물을 제조하였다.
바이오센서 제조
폴리에스터 하부기판 위에 전도성 탄소반죽(conducting carbon paste)을 사용하여 스크린 인쇄(screen printing) 방법으로 작동전극, 기준전극, 확인전극을 형성하였다. 상기 전극을 드라이 오븐을 사용하여 120℃에서 20분간 건조 후 다시 스크린 인쇄 방법으로 절연반죽(insulating paste)을 도포하였다.
상기 작동전극에 상기 시약조성물을 1㎎ 도포한 후 40℃ 드라이 오븐에서 20분간 건조시키고, 건조된 하판에 스페이서를 붙인 뒤 상부기판을 덮어 압착하였다.
[ 실시예 2]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, 1.8 중량부의 Naphthol Green B를 제외한 나머지 조성물의 농도는 동일하게 실시하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 실시예 3]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, 3.5 중량부의 Naphthol Green B를 제외한 나머지 조성물의 농도는 동일하게 실시하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 실시예 4]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, 6.6 중량부의 Naphthol Green B를 제외한 나머지 조성물의 농도는 동일하게 실시하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 비교예 1]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, 헥사아민루테늄클로라이드의 농도는 1.5 중량부, FAD-GDH는 0.15 중량부로 제조하고 Naphthol Green B는 포함하지 않은 시약조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 비교예 2]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, 헥사아민루테늄클로라이드의 농도는 3.1 중량부, FAD-GDH는 0.15 중량부로 제조하고 Naphthol Green B는 포함하지 않은 시약조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 비교예 3]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, 헥사아민루테늄클로라이드의 농도는 4.6 중량부, FAD-GDH는 0.15 중량부로 제조하고 Naphthol Green B는 포함하지 않은 시약조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 비교예 4]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, Naphthol Green B의 농도는 4.4 중량부, FAD-GDH는 0.15 중량부로 제조하고, 헥사아민루테늄클로라이드는 포함하지 않은 시약조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 비교예 5]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, Naphthol Green B의 농도는 8.8 중량부, FAD-GDH는 0.15 중량부로 제조하고, 헥사아민루테늄클로라이드는 포함하지 않은 시약조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 비교예 6]
상기 실시예 1과 같이 시약조성물을 제조하되, Naphthol Green B의 농도는 13.2 중량부, FAD-GDH는 0.15 중량부로 제조하고, 헥사아민루테늄클로라이드는 포함하지 않은 시약조성물을 제조하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 바이오센서를 제조하였다.
[ 실험예 ]
상기 실시예와 비교예를 통해 제조된 바이오센서를 이용하여 글루코스 표준용액에 대한 전류측정을 수행하였다. 여기서, 상기 글루코스 표준용액은 정맥에서 추출한 혈액을 헤마토크릿(hematocrit) 42%에 맞추고 글루코스 분석기(제조사:YSI, 모델명: 2300 Stat Plus)를 사용하여 여러 가지의 글루코스 농도를 가지도록 제조한 혈액을 말한다.
도 2은 본 발명의 비교예 1 내지 3에 따른 글루코스 측정 전류 변화 그래프이다. 상기 도 2의 T1은 1.5 중량부 헥사아민루테늄클로라이드 + 0.15 중량부 FAD-GDH의 비교예 1에 의한 실험결과이다. T2는 3.1 중량부 헥사아민루테늄클로라이드 + 0.15 중량부 FAD-GDH의 비교예 2에 의한 실험결과이며, T3은 4.6 중량부 헥사아민루테늄클로라이드 + 0.15 중량부 FAD-GDH의 비교예 3에 의한 실험결과이다.
상기 비교예 1 내지 3에 의한 바이오센서를 이용하여 실험예와 같이 실험 한 결과, 시약조성물 중 Naphthol Green B를 포함하지 않는 바이오센서는 글루코스 농도에 따라서 측정되는 전류가 점진적으로 증가하지 않아 선형성이 확보되지 않는 것으로 확인되었다.
도 3는 본 발명의 비교예 4 내지 6에 따른 글루코스 측정 전류 변화 그래프이다. 상기 도 3의 T1은 4.4 중량부 Naphthol Green B + 0.15 중량부 FAD-GDH의 비교예 4에 의한 실험결과이다. T2는 8.8 중량부 Naphthol Green B + 0.15 중량부 FAD-GDH의 비교예 5에 의한 실험결과이며, T3은 13.2 중량부 Naphthol Green B + 0.15 중량부 FAD-GDH의 비교예 6에 의한 실험결과이다.
상기 비교예 4 내지 6에 의한 바이오센서를 이용하여 실험예와 같이 실험 한 결과, 시약조성물 중 헥사아민루테늄클로라이드를 포함하지 않는 바이오센서는 글루코스 농도에 따라서 측정되는 전류가 점진적으로 증가하지 않아 선형성이 확보되지 않는 것으로 확인되었다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 내지 4에 따른 글루코스 측정 전류 변화 그래프이다. 상기 도 4의 T1은 0.9 중량부 Naphthol Green B + 2.3 중량부 헥사아민루테늄클로라이드 + 0.15 중량부 FAD-GDH의 실시예 1에 의한 실험결과이다. T2는 1.8 중량부 Naphthol Green B + 2.3 중량부 헥사아민루테늄클로라이드 + 0.15 중량부 FAD-GDH의 실시예 2에 의한 실험결과이며, T3은 3.5 중량부 Naphthol Green B + 2.3 중량부 헥사아민루테늄클로라이드 + 0.15 중량부 FAD-GDH의 실시예 3에 의한 실험결과이다. 마지막으로 T4는 6.6 중량부 Naphthol Green B + 2.3 중량부 헥사아민루테늄클로라이드 + 0.15 중량부 FAD-GDH의 실시예 4에 의한 실험결과이다.
상기 실시예 1 내지 4에 따른 바이오센서를 이용하여 실험예와 같이 실험 한 결과, Naphthol Green B의 농도가 증가할수록 글루코스 농도에 따라서 측정되는 전류가 점진적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한 Naphthol Green B의 농도가 증가할수록 선형성이 좋아지는 것을 확인하였다. 여기서, Naphthol Green B의 농도가 3.5 중량부일때 가장 좋은 선형성을 확인할 수 있었다.
본 발명의 시약조성물은 적절한 반응을 유도하기 위하여 Naphthol Green B를 0.1 중량부 이상 20 중량부 이하의 농도로 사용하는 것이 바람직할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1 중량부 이상 5 중량부 이하의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase), 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(nicotinamide adenine dinucleotideglucose dehydrogenase), 파이롤로퀴놀린 퀴논-글루코스탈수소효소(pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스산화효소(glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 및 빌리루빈산화 효소(bilirubin oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 한다. 이에, 상기 산화화원효소 중 선택되는 1종과 이에 반응하는 시료 분석물질을 선택하여 제조됨으로써 글루코스, 콜레스테롤, 락테이트, 글루탐산 및 알코올 중 어느 하나를 검출하는 바이오센서를 제공할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시예에 따른 전기화학적 바이오센서는 작동전극, 기준전극 및 확인전극이 하부기판의 한 평면상에 구비되는 것으로 제공되지만, 작동전극, 기준전극 및 확인전극이 서로 다른 평면상(예를 들어, 상부기판)에서 대면하도록 구비되어 제공될 수도 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
21~23. 전극들 24~26. 리드선
30. 시료주입부 40. 공기배출부
100. 하부기판 200. 스페이서
300. 상부기판

Claims (13)

  1. 바이오센서용 시약조성물에 있어서,
    상기 시약조성물은 적어도 2종의 전자전달매개체 및 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전자전달매개체는 금속함유 착물 및 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 금속함유 착물은 루테늄 착물(ruthenium complex) 또는 페리시아나이드 착물(ferricyanide complex)인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 루테늄 착물은 Ru(NH3)6Cl3, [Ru(2,2',2''-terpyridine)(1,10-phenanthroline)(OH2)]2+, trans-[Ru(2,2'-bipyridine)2(OH2)(OH)]2+, [(2,2'-bipyridine)2(OH)RuORu(OH)(2,2'bpy)2]4+ 및 [Ru(4,4'-bipyridine)(NH3)5]2+로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)는 완충용액 100 중량부에 대하여 0.1 중량부 이상 20 중량부 이하로 사용되는 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 효소는 산화환원 효소, 탈수소 효소, 전이 효소 또는 가수분해 효소 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase), 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코스탈수소효소(nicotinamide adenine dinucleotideglucose dehydrogenase), 파이롤로퀴놀린 퀴논-글루코스탈수소효소(pyrroloquinoline quinine glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase), 글루코스산화효소(glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤 에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 및 빌리루빈산화 효소(bilirubin oxidase)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약조성물은 글루코스 바이오센서용 시약조성물인 것을 특징으로 하는 바이오센서용 시약조성물.
  9. 시료 내에 존재하는 분석물질을 측정하는 바이오센서에 있어서,
    일측면에 분석물질과 반응하는 시약조성물이 도포 된 적어도 하나의 전극을 포함하는 하부기판;
    상기 하부기판 상에 소정의 높이로 형성되되, 시료가 상기 전극의 위치까지 흡입 및 유도되도록 상기 전극과 대향하는 일측면에 시료주입부를 구비하는 스페이서 및
    상기 스페이서 상에 구비되는 상부기판을 포함하되,
    상기 시약조성물은 적어도 2종의 전자전달매개체 및 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 전자전달매개체는 금속함유 착물 및 나프톨 그린 B(Naphthol Green B)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 효소는 산화환원 효소, 탈수소 효소, 전이 효소 또는 가수분해 효소 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 금속함유 착물은 루테늄(ruthenium complex) 또는 페리시아나이드 착물(ferricyanide complex)인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 루테늄 착물은 Ru(NH3)6Cl3, [Ru(2,2',2''-terpyridine)(1,10-phenanthroline)(OH2)]2+, trans-[Ru(2,2'-bipyridine)2(OH2)(OH)]2+, [(2,2'-bipyridine)2(OH)RuORu(OH)(2,2'bpy)2]4+ 및 [Ru(4,4'-bipyridine)(NH3)5]2+로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 바이오센서.

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