KR20150003156A

KR20150003156A - 라파마이신 유사체 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20150003156A
Application number: KR20147024024A
Authority: KR
Inventors: 빙 왕; 조나손 쫑 짜오
Original assignee: 항조우 질록스 파마 컴퍼니 리니티드
Priority date: 2012-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2015-01-08
Also published as: EP2809675A1; AU2012395673A1; CA2863243A1; SG11201404432QA; AU2012395673A8; JP2016500112A; WO2014082286A1; ZA201405746B; WO2014082286A9; EP2809675A4; CN104854112A

Abstract

트리아졸 부분 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구약물을 갖는 반-합성 라파마이신 유사체는 폭넓은 효능을 지닌 세포정지제(cytostatic agent) 및 mTOR 억제제이며, 신장, 간, 유방, 두경부, 폐, 전립선과 같은 장기에서 다양한 암 또는 종양, 및 관상동맥, 말초동맥, 뇌동맥에서 재발협착증, 면역 및 자가 면역 질환의 치료에 유용하다. 또한, 포유동물에서 진균 성장, 재발협착증, 이식후 조직거부, 및 면역 및 자가면역 질환을 억제하는 조성물 및 암, 진균 성장, 재발협착증, 이식후 조직거부, 및 면역 및 자가면역 질환을 억제하는 방법이 개시된다. 이러한 트리아졸 부분 함유 라파마이신 유사체의 특히 바람직한 응용은 신장 암종, 폐암, 대장암, 및 유방암의 치료이며, 여기서 약물의 효능, 이의 반감기, 조직 분포 특성, 및 경구 및 정맥 경로를 통한 생체이용률을 포함하는 이의 약물동력학적 특성은 임상 결과에 필수적이다.

Description

라파마이신 유사체 및 이의 제조 방법{RAPAMYCIN ANALOGS AND METHODS FOR MAKING THE SAME}

본 발명은 다양한 질환이나 질병의 예방과 치료에 유용한 라파마이신 유사체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

화합물 시클로스포린(cyclosporin A)은 장기 이식 및 면역조절 분야에서의 도입 이후 광범위한 용도를 발견하였으며 이식 절차에 대한 성공률의 상당한 증가를 가져왔다. 최근에, 강력한 면역조절 활성을 갖는 몇 가지 부류의 거대고리 화합물이 발견되었다. Okuhara 등은 1986년 6월 11일 공개된 유럽 특허 출원 제 184,162호에서 S. 츠쿠바엔시스(S. tsukubaensis) 균주로부터 분리된 23-원 거대고리 락톤인 면역억제제 FK-506을 포함하는 스트렙토미세스속(genus Streptomyces)으로부터 분리한 다수의 거대고리 화합물을 개시하고 있다.

C-21 알킬 치환기에서 FK-506과는 다른 FR-900520 및 FR-900523과 같은 그 밖의 관련된 천연 산물이 S. 하이그로스코피쿠스 야쿠심나엔시스(S. hygroscopicus yakushimnaensis)로부터 분리되었다. S. 츠쿠바엔시스(S. tsukubaensis)에 의해 생성된 또 다른 유사체인 FR-900525는 피페콜린산(pipecolic acid)부분의 프롤린(proline)기와의 대체에서 FK-506와 다르다. 신독성(nephrotoxicity)과 같은 시클로스포린 및 FK-506과 관련된 불만족스러운 부작용은, 국소적으로는 효과적이지만 전신적으로는 비효과적인 면역억제제를 포함하는, 개선된 효능과 안전성을 갖는 면역억제제 화합물의 지속적인 탐색으로 이어졌다(US 5,457,111).

아래에서 설명되는 라파마이신은, 특히 체외 및 체내 모두에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해 항진균 활성을 갖는 것으로 밝혀진 스트렙토미세스 하이그로스코피쿠스에 의해 생성되는 거대고리 트리엔(triene) 항생제이다(US 3,929,992 및 US 3,993,749).

라파마이신 단독(US 4,885,171)으로 또는 피시바닐(picibanil)과 함께(US 4,401,653) 라파마이신은 항종양 활성을 갖는 것으로 나타났다. 1977년 라파마이신은 또한 다발성 경화증에 대한 모델인 실험적 알러지성 뇌척수염 모델 및 류마티스성 관절염에 대한 모델인 애주번트 관절염 모델에서 면역억제제로서 효과적인 것으로 나타났으며, IgE-유사 체의 형성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.

라파마이신의 면역억제 효과는 또한 조직부적합성(histoincompatible) 설치류에서 장기 이식의 생존 기간을 연장할 수 있는 능력을 보유하는 것으로 1989년 FASEB에 개시되었다. 라파마이신의 이들 및 다른 생물학적 효과는 Transplantation Reviews, 1992, 6, 39-87에서 검토되고 있다. 라파마이신의 모노에스테르 및 다이에스테르 유도체(31 및 42 위치에서의 에스테르화)는 항진균제로서(US 4,316,885) 그리고 라파마이신의 수용성 전구약물로서(US 4,650,803) 유용한 것으로 나타났다.

라파마이신의 수많은 화학적 변형이 시도되었다. 이들은 라파마이신의 모노 및 다이에스테르 유도체(WO92/05179), 라파마이신의 27-옥심(EPO 467606), 라파마이신의 42-옥소 유사체(US 5,023,262), 바이시클릭 라파마이신(US 5,120,725), 라파마이신 이량체(US 5,120,727), 라파마이신의 실릴 에테르(US 5,120,842), 및 라파마이신 아릴술포네이트 및 라파마이신 술파메이트의 제조를 포함한다. 라파마이신은 이의 자연적으로 발생하는 거울상이성질체 형태로 최근에 합성되었다(K. C. Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 4419-4420; S. L. Schreiber, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 7906-7907; S. J. Danishefsky, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 9345-9346). 라파마이신 유사체의 일례는 라파마이신 유사체를 함유하는 테트라졸이다(US 6,015,815). 테트라졸 헤테로 고리는 하이드록실기를 대체하여 유사체를 형성하는데 사용된다.

이들 변형된 화합물 중 일부가 면역억제 활성, 특히 스텐트 코팅에서 사용될 때 혈관 평활근의 이동과 성장을 억제하는 재협착 방지 활성을 나타내지만, 신세포 암종(renal cell carcinoma), 유방암, 두경부암(head and neck cancer)과 같은 광범위한 암에 대해 잠재적으로 향상된 효능 및 잠재적으로 더 나은 유성(lipophilicity), 혈액 또는 국소 조직에서의 긴 반감기, 또는 산화력에 대한 내성 및 제제에서의 더 나은 안정성을 갖는 라파마이신 유사체에 대한 필요성이 남아있다. 이러한 목표를 달성하는 한 가지 방법은 라파마이신의 측쇄에 트리아졸 부분(triazole moiety)의 도입에 의한 것이며, 이는 알려진 기존의 변형된 라파마이신 유사체 또는 유도체에 비해 더 나은 친유성, 더 나은 안정성, 더 나은 생체이용율(bioavailability), 더 나은 조직 및 세포 흡수, 더 나은 효능을 부여한다. 변형된 라파마이신의 효능은 또한 다양한 암에 대해 더 나은 효능 및 잠재적으로 감소된 독성을 가질 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 라파마이신 분자의 31C- 및 42C- 위치 중 하나 또는 모두에 부착된 원하는 트리아졸 부분을 보유하는 신규한 반합성(semi-synthetic) 라파마이신 유사체를 제공하는 것이다.

일 양태에 따르면, 본 발명은 아래에 제시되는 구조식으로 표시되는 화합물에 관한 것이다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 화합물은 라파마이신의 42C 및 31C 위치 모두에서 두 개의 이러한 치환기를 포함할 수 있다.

본 발명의 트리아졸 부분은 다양한 반응식을 통해 도입될 수 있으며, 일반적인 반응식은 아래에 제시되어 있다:

여기서 A'는 다음의 구조 중 하나이다.

시리즈 B:

본 발명의 또 다른 목적은 발효에 의해 수득되는 출발 물질을 이용한 이러한 화합물의 제조를 위한 합성법 및 이러한 합성법에서 유용한 화학 중간물(chemical intermediate)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 유효 성분으로서 적어도 하나의 상기 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 재발협착증(restenosis), 이식 후 조직 거부, 면역 및 자가면역 기능장애, 진균 성장, 및 암을 포함하는 다양한 질병 상태를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 화합물은 경구용 정제, 경구용 고체 또는 경구용 액체, 경구용 즉시 또는 지효성 방출 제제, 정맥 주사 제제, 비경구 제제, 약학적으로 허용 가능한 비히클로 제조된 크림 또는 용액으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 유효 성분의 즉시 방출 또는 지효성 방출을 위한 약학적 조성물이 또한 본 발명의 범위 내에 있다.

또한, 본 발명의 화합물을 포함하는 의료 기기가 본 발명에 관련된다. 의료 기기의 예는 약물 방출 관상동맥 또는 말초혈관, 식도, 요도, 난소 또는 신경혈관 스텐트를 포함한다.

도 1은 신세포 암종 종양 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 2는 신세포 암종 종양 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 3은 폐암 A549 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 4는 폐암 A549 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 5는 폐암 A549 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 6은 흑색종 SK-MEL-28 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 7은 흑색종 SK-MEL-28 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 8은 흑색종 SK-MEL-28 세포 억제 연구에 대한 그래프이고;
도 9는 표피암 A431 세포 억제 모델에 대한 그래프이고;
도 10은 표피암 A431 세포 억제 모델에 대한 그래프이고;
도 11은 표피암 A431 세포 억제 모델에 대한 그래프이고;
도 12는 교아종 U87 MG 종양 모델 연구에 대한 그래프이고;
도 13은 교아종 U87 MG 종양 모델 연구에 대한 그래프이고;
도 14는 교아종 U87 MG 종양 모델 연구에 대한 그래프이고;
도 15는 인간 결장 종양 HCT 116 모델 연구에 대한 그래프이고;
도 16은 인간 결장 종양 HCT 116 모델 연구에 대한 그래프이고;
도 17은 인간 결장 종양 HCT 116 모델 연구에 대한 그래프이고;
도 18은 유방암 MDA-MB-231 종양 모델에 대한 그래프이고;
도 19는 유방암 MDA-MB-231 종양 모델에 대한 그래프이고;
도 20은 유방암 MDA-MB-231 종양 모델에 대한 그래프이고;
도 21은 유방암 MCF-7 종양 모델에 대한 그래프이고;
도 22는 유방암 MCF-7 종양 모델에 대한 그래프이고;
도 23은 유방암 MCF-7 종양 모델에 대한 그래프이고;
도 24는 전립선암 PC-3 종양 연구에 대한 그래프이고;
도 25는 전립선암 PC-3 종양 연구에 대한 그래프이고;
도 26은 전립선암 PC-3 종양 연구에 대한 그래프이고;
도 27은 HCT 116 치료에서 본 발명의 라파마이신 유사체의 효능을 나타낸다.

용어의 정의

본원에서 사용되는 용어 "전구약물(prodrug)"은, 예를 들어, 혈액 내 가수분해에 의해 상기 식의 모 화합물(parent compound)로 생체 내에서 신속하게 변형되는 화합물을 말한다. 철저한 논의가 T. Higuchi 및 V. Stella의 문헌("Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series) 및 Edward B. Roche, ed.의 문헌 ("Bioreversible Carriers in Drug Design", American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987)에 제공되어 있으며, 이 두 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 전구약물"은, 현명한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 및 알레르기 반응 없이 인간 및 하등 포유동물의 조직과 접촉해서 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는, 그리고 이들의 사용 목적에 효과적인 본 발명의 화합물의 전구약물뿐만 아니라, 가능한 경우, 본 발명의 화합물의 양쪽이온성(zwitterionic) 형태를 말한다. 본 발명의 특히 바람직한 약학적으로 허용 가능한 전구약물은 본 발명의 화합물의 C-31 하이드록실기의 전구약물 에스테르이다.

본원에서 사용되는 용어 "전구약물 에스테르"는 생리학적 조건 하에서 가수분해되는 여러 에스테르 형성기 중 임의의 기를 말한다. 전구약물 에스테르기의 예는 아세틸, 에타노일(ethanoyl), 피발로일(pivaloyl), 피발로일옥시메틸(pivaloyloxymethyl), 아세톡시메틸(acetoxymethyl), 프탈리딜(phthalidyl), 메톡시메틸(methoxymethyl), 인단일(indanyl) 등뿐만 아니라 본 발명의 화합물의 C-31 하이드록실기로의 자연적으로 또는 비자연적으로 발생하는 아미노산의 결합에서 유래되는 에스테르기를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "이성질체(isomer)"는 동일한 화학식을 갖지만 구조적으로 또는 광학적으로 다른 구성을 갖는 화합물을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "에피머(epimer)"는 동일한 화학식을 갖지만 특정 위치에서 다른 광학적 구성을 갖는 화합물을 말한다. 라파마이신의 경우, 42-에피 라파마이신은 발효 과정을 통해 수득된 라파마이신과는 반대의 광학 회전을 갖는 화합물을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "15-이성질체"는, 6-원 고리를 포함하는, 발효 과정으로 수득되는 일반적인 라파마이신과는 대조적으로 15 위치에서 7-원 고리를 포함하는 라파마이신의 유사체를 말한다. 이러한 유형의 변환은 "토토머화(tautomerization)"라고도 한다. 본원에서 사용되는 15-이성질체는 또한 라파마이신의 15 토토머(tautomer)라고도 할 수 있다.

화합물의 제조

본 발명의 화합물 및 공정은 본 발명의 화합물을 제조할 수 있는 방법을 제시하는 다음의 합성 방법과 함께 더욱 잘 이해될 것이다.

본 발명의 화합물은 다양한 합성 경로에 의해 제조될 수 있다. 42- 및/또는 31-하이드록실 위치에서 라파마이신의 일반적인 포합 반응(conjugation reaction)의 대부분은 위에서 언급한 라파마이신 특허에서 발견되며, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

실시예

라파마이신 유도체의 합성: 모(parent) 라파마이신 구조는 다음과 같다:

본 발명의 라파마이신 유사체의 시리즈 A의 합성 방법은 다음과 같다:

유사하게 합성된 본 발명의 추가의 라파마이신 유사체는 다음과 같다:

실시예 1: 화합물 A1의 합성

건조 DMF(90 mL) 내의 라파마이신(3 g, 3.2 mmol) 및 Cs₂CO₃(3.2 g, 9.6 mmol)의 교반된 용액에 NaI(1.5 g, 9.6 mmol) 및 3-브로모프로프-1-인(3-bromoprop-1-yne, 1.2 g, 9.6 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 30 시간 동안 교반하였다. 반응이 종료되면, 300 mL의 물을 첨가하고 에틸아세테이트(200 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물(300 mL)로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 50% 내지 100%의 에틸아세테이트)로 정제하여 화합물 A1(2.1 g, 68%)을 연한 녹색 오일로서 수득하였다.

LCMS (m/z) ES- 950 (M-1)^-.

실시예 2: 화합물 A3의 합성

무수 THF(9 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시)( 40-O-(prop-2-ynyloxy)) 라파마이신A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 1-아지도-아다만탄(1-azido-Adamantane)(100 mg, 0.6 mmol)의 용액에 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol) 및 CuI(20mg, 0.1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가하였다. 용액을 상온에서 밤새 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 에틸아세테이트(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 25% 내지 50%의 에틸아세테이트)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A3(26 mg, 10%)을 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.71 (s, 1H), 6.74 (m, 1H), 6.39-6.02 (m, 5H), 5.62-5.36 (m, 5H); LCMS (m/z)ES- 1128(M-1)^-.

실시예 3: 화합물 A4의 합성

무수 THF(9 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 1-아지도벤조산(azidobenzoic acid, 00 mg, 0.6 mmol)의 용액에 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol) 및 CuI(20mg, 0.1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가하였다. 용액을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 에틸아세테이트(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 5% 내지 10%의 메탄올)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A4(29 mg, 12%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.27 (m, 1H), 7.90 (m, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.56 (m, 1H), 6.74 (m, 1H), 6.55-6.00 (m, 5H), 5.60-5.36 (m, 5H); LCMS (m/z) ES- 1114(M-1)^-.

실시예 4: 화합물 A5의 합성

중간물 2의 제조

아세토니트릴(20 mL) 내의 NaN₃(2.0 g, 30.8 mmol)의 교반된 현탁액에 0℃에서 천천히 주사기를 통해 Tf₂O(7.3 g, 25.8 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 또 다른 2 시간 동안 교반하였다. 용해되지 않은 고체를 여과를 통해 제거하였다. 0℃에서, 화합물 1(2.0 g, 13 mmol), CuSO₄(160 mg, 1 mmol), H₂O(6 mL) 및 Et3N(3.6 mL, 25.8 mmol)의 혼합물에 여과액을 적가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 6 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고 소금물로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고 증발시켜 갈색 고체를 수득하고 이를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 30% 내지 50%의 EtOAc)로 정제하여 중간물 2(1.1 g, 48%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.93 (s, 1H), 7.63 (m, 2H), 7.03 (m, 2H), 2.02 (s, 3H); LCMS (m/z) ES+ 177 (M+1)⁺.

무수 THF(9 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 N-(4-아지도-페닐)아세트아미드 중간물 2(100 mg, 0.6 mmol)의 용액에 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol) 및 CuI(20mg, 0.1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가하였다. 용액을 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 혼합물을 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 내의 30% 내지 100%의 EtOAc)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A5(56 mg, 25%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.13 (m, 1H), 7.73 (m, 4H), 6.74 (m, 1H), 6.49-6.00 (m, 5H), 5.65-5.37 (m, 5H); LCMS (m/z) ES- 1127 (M-1)^-.

실시예 5: 화합물 A6의 합성

t-BuOH(6 mL) 및 H₂O(6 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 TMS-N₃(100 mg, 0.9 mmol)의 용액에 Na₂CO₃(100 mg, 1 mmol), CuSO₄(20 mg, 0.13 mmol) 및 아스코르빈산나트륨(40 mg, 0.2 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가하였다. 용액을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 25%의 EtOAc)로 정제하여 흰색 고체로서 화합물 A2(189 mg, 82%)를 수득하고 이를 0℃에서 THF(10 mL) 내의 TBAF에 용해시키고 상온에서7 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 반응 혼합물을 EtOAc와 물 사이에 분배시켰다. 수성상을 EtOAc(25 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 5% 내지 10%의 메탄올)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A6(38 mg, 24%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.75-7.55 (m, 1H), 6.76 (m, 1H), 6.49-6.08 (m, 5H), 5.53-5.35 (m, 3H); LCMS (m/z) ES- 1012 (M-1+18)^-.

실시예 6: 화합물 A7의 합성

중간물 5 및 6의 제조

100 mL의 물 내의 3（5 g, 41 mmol)의 용액에 NaN₃5g, 83 mmol)을 첨가하고 밤새 환류시켰다. 그리고 나서, 100 mL의 DCM을 첨가하고 이후 반응 혼합물을 상온으로 냉각시켰다. 분리된 유기상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고 여과하였다. 0℃에서 용액에 Et₃N(5.05 g, 50 mmol) 및 TsCl(9.55 g, 50 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 100 mL의 물을 첨가하였다. 유기상을 분리하고 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 진공에서 여과 및 진공하여 조생성물을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 10%의 EtOAc)에 의한 정제로 중간물 5(5.7 g, 58%)를 무색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.81 (d, 2H), 7.39 (d, 2H), 4.14 (m,2H), 3.48 (m, 2H),2.43(s, 3H); LCMS (m/z) ES+ 242(M+1)⁺.

30 mL의 무수 DMF 내의 중간물 5(1 g, 4.1 mmol) 및 Cs₂CO₃(2.8 g, 8.2 mmol) 의 용액에 0℃에서 모르폴린(0.71 g, 8.2 mmol)을 첨가하였다. 그리고 나서 이를 상온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 50 mL의 EtOAc와 60 mL의 물 사이에 분배시켰다. 유기상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 진공에서 여과 및 진공하여 조생성물을 수득하였다. 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 50%의 EtOAc)에 의한 정제로 중간물 6(0.4 g, 72%)를 무색 오일로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES+ 157 (M+1)⁺.

무수 THF(9 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 4-(2-아지도-페닐)모르폴린 중간물 6(100 mg, 0.6 mmol)의 용액에 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol) 및 CuI(20mg, 0.1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가하였다. 용액을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 내의 30%의 EtOAc)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A7(45 mg, 20%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.89 (m, 1H), 6.72 (m, 1H), 6.44-6.05 (m, 5H), 5.60-5.37 (m, 5H); LCMS (m/z) ES- 1107 (M-1)^-.

실시예 7: 화합물 A9의 합성

무수 THF(9 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 2-아지도에탄올(100 mg, 1.2 mmol) 의 용액에 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol) 및 CuI(20mg, 0.1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가하였다. 용액을 상온에서 밤새 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 5% 내지 5% 내지 10%의 메탄올)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A9(26 mg, 11%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.03-7.78 (m, 1H), 6.70 (m, 1H), 6.46-6.00 (m, 5H), 5.61-5.39 (m, 5H); LCMS (m/z) ES- 1038 (M-1)^-.

실시예 8: 화합물 A10의 합성

중간물 8의 제조

40% HBr(10 mL) 내의 화합물 7(1.3 g, 12.7 mmol)의 용액을 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 50%의 EtOAc)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 중간물 8(0.7 g, 31%)을 흰색 고체로서 수득하였다.

LCMS (m/z) ES+ 183 (M+1)⁺.

중간물 9의 제조

DMSO(16 mL) 내의 중간물 8(0.7 g, 3.9 mmol) 및 NaN₃(1.13 g, 15 mmol)의 용액을 80℃에서 2 일 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 50% 내지 100%의 EtOAc)로 정제하여 중간물 9(0.25 g, 45%)를 흰색 고체로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES+ 146 (M+1)⁺.

화합물 A10의 제조

t-BuOH(6 mL) 및 H₂O(6 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신 A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 2-(아지도메틸) 2-메틸프로판-1,3-디올 중간물 9(100 mg, 0.7 mmol)의 용액에 Na₂CO₃(100 mg, 1 mmol), CuSO₄(20 mg, 0.13 mmol) 및 아스코르빈산나트륨(40 mg, 0.2 mmol)을 N₂ 분위기 하에 첨가하였다. 용액을 상온에서 6 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 5% 내지 10%의 메탄올)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A10(15 mg, 7%)을 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.76 (m, 1H), 6.69 (m, 1H), 6.55-6.00 (m, 5H), 5.63-5.33 (m, 5H), LCMS (m/z) ES- 1096 (M-1)^-.

실시예 9: 화합물 A12의 합성

중간물 11의 제조

MeOH/THF (10 mL/10 mL) 내의 화합물 10(1 g, 7.8 mmol)의 혼합물에 10 mL의 물 내의 LiOH(0.9 g, 39 mmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 2N HCl로 pH=4가 되게 산성화시키고 EtOAc (25 mL.×2 )로 추출하였다. 결합된 유기층을 진공 하에 농축시켜 중간물 11(0.7 g, 91%)을 무색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 2.34 (s,2H); LCMS (m/z) ES+ 102 (M+1)⁺.

화합물 A12의 제조

t-BuOH(6 mL) 및 H₂O(6 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신 A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 2아지도아세트산 중간물 11(100 mg, 1 mmol)의 용액에 Na₂CO₃(100 mg, 1 mmol), CuSO₄(20 mg, 0.13 mmol) 및 아스코르빈산나트륨(40 mg, 0.2 mmol)을 N₂ 분위기 하에 첨가하였다. 용액을 상온에서 2 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 5% 내지 20%의 메탄올)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A12(15 mg, 7%)을 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.89 (m, 1H), 6.72 (m, 1H), 6.49-6.08 (m, 5H), 5.60-5.35 (m, 5H); LCMS (m/z) ES- 1052 (M-1)^-.

실시예 10: 화합물 A13의 합성

중간물 13의 제조

아세토니트릴(20 mL) 내의 NaN₃(2.0 g, 30.8 mmol)의 교반된 현탁액에 0℃에서 천천히 주사기를 통해 Tf₂O(7.3 g, 25.8 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 이 온도에서 또 다른 2 시간 동안 교반하였다. 용해되지 않은 고체를 여과를 통해 제거하였다. 0℃에서, 화합물 12(2.0 g, 10 mmol), CuSO₄(160 mg, 1 mmol), H₂O(6 mL) 및 Et3N(3.6 mL, 25.8 mmol)의 혼합물에 여과액을 적가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 6 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석하고 소금물로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고 증발시켜 갈색 고체를 수득하고 이를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 30% 내지 50%의 EtOAc)로 정제하여 중간물 13(0.4 g, 17%)를 갈색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 6.94 (m, 4H), 3.19 (m, 4H), 2.60 (m, 4H), 2.36 (s, 3H); LCMS (m/z)ES+ 218 (M+1)⁺.

화합물 A13의 제조

t-BuOH(6 mL) 및 H₂O(6 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신 A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 1-(4-아지도-페닐)-4-메틸피페라진 중간물 13(100 mg, 0.5 mmol)의 용액에 Na₂CO₃(100 mg, 1 mmol), CuSO₄(20 mg, 0.13 mmol) 및 아스코르빈산나트륨(40 mg, 0.2 mmol)을 N₂ 분위기 하에 첨가하였다. 용액을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 5% 내지 20%의 메탄올)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A13(33 mg, 14%)을 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.11 (m, 1H), 7.71 (m, 2H), 7.06 (m, 2H), 6.70 (m, 1H), 6.45-6.00 (m, 5H), 5.66-5.36 (m, 5H); LCMS (m/z) ES- 1168 (M-1)^-.

실시예 11: 화합물 A14의 합성

무수 THF(9 mL) 내의 40-오-(프로프-2-이닐옥시) 라파마이신A1(200 mg, 0.2 mmol) 및 1-아지도-메틸)-4-플루오로벤젠(100 mg, 0.6 mmol)의 용액에 DIPEA(100 μL, 0.6 mmol) 및 CuI(20mg, 0.1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가하였다. 용액을 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 에틸아세테이트(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 30% 내지 100%의 에틸아세테이트)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A14(32 mg, 14%)을 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.58 (m, 1H), 7.26 (m, 2H), 7.06 (m, 2H), 6.75 (m, 1H), 6.50-6.00 (m, 5H), 5.60-5.36 (m, 5H); LCMS(m/z)ES-=1102(M-1).

실시예 12: 화합물 A15의 합성

중간물 15의 제조

DCM(100 mL) 내의 화합물 14(3 g, 48 mmol) 및 Et₃N(5 g, 50 mmol)의 용액에 DMAP(0.6 g, 5 mmol)를 첨가하고 0℃에서 TBDPS-Cl(4.4 g, 16 mmol)을 적가한 후 상온에서 밤새 교반하였다. 그리고 나서, 100 mL의 물을 첨가하고 DCM(80 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 30%의 EtOAc)로 정제하여 중간물 15(1.7 g, 12%)를 무색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.63 (m, 4H), 7.36 (m, 6H), 3.74 (m,2H), 3.66 (m, 2H), 1.04 (s,9H); LCMS (m/z) ES+ 301 (M+1)⁺.

중간물 16의 제조

DCM(40 mL) 내의 중간물 15 1.7 g, 5.7 mmol) 및 DIPEA(1.5 g, 11.4 mmol)의 용액에 Tf₂O(1.7 g, 6 mmol)를 0℃에서 첨가하고 상온에서 밤새 교반하였다. 그리고 나서, 50 mL의 물을 첨가하고 DCM(40 mL x 3)으로 추출하였다. 결합된 유기층을 소금물로 세척하고 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 10%의 EtOAc)로 정제하여 중간물 16(1.5 g, 63%)를 무색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.63 (m, 4H), 7.36 (m, 6H), 4.58 (m,2H), 3.95 (m, 2H), 1.04 (s,9H); LCMS (m/z) ES+ 433 (M+1)⁺.

중간물 17의 제조

톨루엔(30 mL) 내의 라파마이신(400 mg, 0.43 mmol) 및 DIPEA(278 mg, 2.15 mmol)의 용액에 중간물 16(0.93 g, 2.15 mmol)을 상온에서 첨가하고 80℃에서 2 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 50 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(30 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 0.5 N HCl로 세척하고, NaHCO₃와 소금물로 포화시킨 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 25% 내지 40%의 EtOAc)로 정제하여 중간물 16(280 mg, 53%)를 흰색 고체로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES- 1194 (M-1)^-.

화합물 A15의 제조

THF(10 mL) 내의 중간물 17(280 mg, 0.23 mmol)의 용액에 피리딘 내의 2 mL HF을 0℃에서 첨가하고 상온에서 4 시간 동안 교반하였다. 그리고 나서, 20 mL의 물을 첨가하고 EtOAc(20 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 0.5 N HCl로 세척하고, NaHCO₃와 소금물로 포화시킨 후, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 농축 후, 잔사를 실리카겔 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 30% 내지 100%의 EtOAc)로 정제하여 흰색 고체를 수득하고 이를 조제용-HPLC로 더 정제하여 화합물 A15(34 mg, 15%)을 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 6.40-6.00 (m, 5H), 5.53-5.25 (m, 4H), 4.83 (s, 1H), 4.13 (m, 1H); LCMS (m/z) ES- 957 (M-1)^-.

본 발명의 라파마이신 유도체의 시리즈 B의 합성

라파마이신 유도체의 B 시리즈를 다음의 반응식에 따라 제조하였다.

상기 반응식에서, R 및 B'는 라파마이신 유도체의 B 시리즈의 일부 실시예에서 다음의 구조를 갖는다:

실시예 13: 화합물 B1의 합성

건조 DCM(150 mL) 내의 라파마이신(5 g, 5.5 mmol) 및 2,6-디-터트-부틸-4-메틸피리딘(3.4 g, 3.4 mmol)의 용액에 트리플루오로메탄술폰산 무수물(1.55 g, 5.5 mmol)을 0℃에서 참가하였다. 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반한 후, NaN₃(3.6 g, 55 mmol)을 첨가하고 DMSO(60 mL)를 40℃에서 첨가한 후, 혼합물을 40℃에서 5 시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하여 혼합물을 급랭시키고, DCM(200 mL.×2)으로 추출한 후, 결합된 추출물을 물로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 후, 진공에서 증발 건조시켰다. 조생성물을 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 25%의 EtOAc)로 정제하여 화합물 B1(1.5 g, 30%)를 흰색 고체로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES- 937 (M-H)^-.

실시예 14: 화합물 B2의 합성

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 SM1(27 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B2(33.2 mg, 21%)를 노란색 고체로서 수득하였다.¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.83 (m, 1H), 6.37-6.01 (m, 4H), 5.40-5.31 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 993 (M-H)^-.

실시예 15: 화합물 B3의 합성

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 SM1(40 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축하고 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B3(20.7 mg, 13%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.55 (s, 1H), 7.89 (m, 1H), 6.39-6.02 (m, 4H), 5.46-4.83 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1020 (M-H)^-.

실시예 16: 화합물 B4의 합성

DCM(100 mL) 내의 1(2 g, 32.8 mmol)의 용액에 SM1(2 g, 16.4 mmol)를 0℃에서 1 시간에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 농축하고 잔사를 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 2%의 메탄올)로 정제하여 중간물 2(0.9 g, 54%)를 노란색 오일로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES+ 100 (M+H)⁺.

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 중간물 2(48 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B4(17.1 mg, 11%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.40 (s, 1H), 6.39-6.02 (m, 4H), 5.37-4.94 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1036 (M-H)^-.

실시예 17: 화합물 B5의 합성

THF(40 mL) 내의 1(2 g, 19.0 mmol)의 용액에 K₂CO₃(5.2 g, 38 mmol) 및 SM1(2.2 g, 19 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 상온에서 4 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 3%의 메탄올)로 정제하여 중간물 2(1.2 g, 44%)를 노란색 오일로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 3.65 (m, 4H), 3.49 (m, 2H), 2.75 (m, 4H), 2.22 (m, 1H).

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 중간물 2(69 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B5(26.7 mg, 11%)를 흰색 고체로서 수득하였다.¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.92 (s, 1H), 6.39-5.99 (m, 4H), 5.45-4.84 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1080 (M-H)^-.

실시예 18: 화합물 B6의 합성

THF(40 mL) 내의 1(0.5 g, 5.8 mmol)의 용액에 K₂CO₃(1.6 g, 11.6 mmol) 및 SM1(0.69 g, 5.8 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 상온에서 4 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 3%의 메탄올)로 정제하여 2(0.3 g, 42%)를 노란색 오일로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES+ 125 (M+H)⁺.

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 2(60 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B6(25.8 mg, 15%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.81 (s, 1H), 6.40-6.02 (m, 4H), 5.45-4.81 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1062 (M-H)^-.

실시예 19: 화합물 B17의 합성

THF(40 mL) 내의 1(0.5 g, 5 mmol)의 용액에 K₂CO₃(1.4 g, 10 mmol) 및 SM1(0.6 g, 5 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 상온에서 4 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 3%의 메탄올)로 정제하여 중간물 2(0.5 g, 72%)를 노란색 오일로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES+ 139 (M+H)⁺.

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 2(60 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B7(12 mg, 7%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.39 (s, 1H), 7.76 (s, 1H), 6.37-6.01 (m, 4H), 5.41-4.78 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1075 (M-H)^-.

실시예 20: 화합물 B9의 합성

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 SM1(50 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B9(37.1 mg, 22%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.37-7.89 (m, 5H), 6.39-6.01 (m, 4H), 5.42-4.99 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1040 (M-H)^-.

실시예 21: 화합물 B11의 합성

디옥산(20 mL) 내의 SM1(2.1 g, 10 mmol)의 용액에 에티닐트리메틸실란(2 g, 20 mmol), CuI(191 mg, 1 mmol) 및 Pd(PPh₃)₂Cl₂(730 mg, 1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가한 후, Et₃N(10 g, 100 mmol)을 적가하였다. 100℃에서 밤새 교반한 후, 혼합물을 물로 급랭시키고, EtOAc(50 mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 후, 농축하여 조중간물(crude intermediate) 1을 수득하였다.

조중간물 1을 상온에서 2 시간 동안 THF(20 mL, 20 mmol) 내의 TBAF에 용해시키고 처리한 후 물로 급랭시키고 EtOAc(50 mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 후, 농축하여 조중간물 2를 수득하고 이를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 2(0.9 g, 58%)를 노란색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.96 (d, 2H), 7.62 (d, 2H), 4.48 (s, 1H), 3.87 (s, 3H).

MeOH(10 mL) 내의 2(0.5 g, 3.13 mmol)의 용액에 물(10 mL) 내의 LiOH(0.312 g, 12.52 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2 시간 동안 교반한 후, HCl 용액(2N)으로 급랭시키고, EtOAc (30 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 후, 농축하여 원하는 중간물 3(0.35 g, 77%)을 노란색 고체로서 수득하였다.

MeOH/H₂O(6 mL/3 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 중간물 3(70 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 대략 pH 3 내지 4로 조절하고, 여과한 후, 여과액을 농축하고, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 1.5%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B11(15.5 mg, 9%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.19 (m, 3H), 7.98 (d, 2H), 6.77-6.11 (m, 4H), 5.49-4.51 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1083 (M-H)^-.

실시예 22: 화합물 B12의 합성

프로판-2-올(20 mL) 내의 SM1(4 g, 23 mmol)의 용액에 물 내의 NaOH(2.8 g, 69 mmol)와 3-브로모프로프-1-인(2.4 g, 20 mmol)을 첨가하였다. 70℃에서 4 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 농축하고, 여과한 후, 필터 케이크를 물로 세척한 후, 건조시켜 중간물 1(2 g, 37%)을 노란색 고체로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES+ 234 (M+Na)⁺.

DMF(8 mL) 내의 중간물 1(1 g, 4.3 mmol)의 용액에 DCM(4 mL) 내의 옥살릴 클로라이드(1.1 g, 8.6 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 상온에서 밤새 교반한 후, 혼합물을 물로 급랭시키고, DCM(30 mL x 3)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 0 내지 10%의 EtOAc)로 정제하여 원하는 중간물 2(0.35 g, 77%)를 노란색 고체로서 수득하였다.

중간물 2(0.35 g, 1.5 mmol)를 암모니아수에 첨가하고, 혼합물을 상온에서 1 시간 동안 교반하고, 물을 첨가하여 급랭시킨 후, EtOAc(20 mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 석유 에테르 내의 0 내지 50%의 EtOAc)로 정제하여 중간물 3(0.2 g, 두 단계 동안 20%)를 노란색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.77 (d, 2H), 7.24 (s, 2H), 7.14 (d, 2H), 4.90 (d, 2H), 3.63 (m, 1H).

MeOH/H₂O(6 mL/3 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 중간물 3(101 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과한 후, 여과액을 농축하고, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 2.5%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B12(13.4 mg, 7.3%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.88 (m, 3H), 7.12 (m, 2H), 6.39-6.01 (m, 4H), 5.42-4.63 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1148 (M-H)^-.

실시예 23: 화합물 B13의 합성

디옥산(20 mL) 내의 SM1(2.3 g, 10 mmol)의 용액에 에티닐트리메틸실란(2 g, 20 mmol), CuI(191 mg, 1 mmol) 및 Pd(PPh₃)₂Cl₂(730 mg, 1 mmol)을 N₂ 분위기 하에서 첨가한 후, Et₃N(10 g, 100 mmol)을 적가하였다. 100℃에서 밤새 교반한 후, 물을 첨가하여 혼합물을 급랭시키고, 혼합물을 EtOAc(50 mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 후, 농축하여 조중간물 1을 수득하였다.

조중간물 1을 상온에서 2 시간 동안 THF(20 mL, 20 mmol) 내의 TBAF로 처리한 후 물로 급랭시키고 EtOAc(50 mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시킨 후, 농축하여 조중간물 2를 수득하고 이를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 중간물 2(1.5 g, 84%)를 노란색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (d, 2H), 7.68 (d, 2H), 7.46 (s, 2H), 4.45 (s, 1H).

MeOH/H₂O(6 mL/3 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 중간물 3(87 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하였다. 여과액을 농축하고, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 1.5%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B13(48.7 mg, 27%)을 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.21 (m, 1H), 7.93 (m, 4H), 6.37-6.00 (m, 4H), 5.44-5.30 (m, 5H), LCMS (m/z) ES- 1118 (M-H)^-.

실시예 24: 화합물 B14의 합성

EtOH(20 mL) 내의 SM1(2.3 g, 20 mmol)의 용액에 물 내의 NaOH(1.6 g, 40 mmol)를 첨가한 후, 3-브로모프로프-1-인(2.4 g, 20 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 상온에서 4 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 HCl 용액(2N)으로 급랭시키고, pH를 3 내지 4로 조절한 후, EtOAc (50 mL x 5)로 추출하였다. 결합된 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 0 내지 3%의 메탄올)로 정제하여 중간물 1(1.2 mg, 40%)을 무색 결정으로서 수득하였다. LCMS (m/z) ES- 154 (M+H)⁺.

MeOH/H₂O(4 mL/2 mL) 내의 화합물 B1(150 mg, 0.16 mmol) 및 중간물 1(73 mg, 0.48 mmol)의 용액에 비타민C 나트륨염(63 mg, 0.32 mmol)을 첨가한 후, CuSO₄(51 mg, 0.32 mmol) 및 Na₂CO₃(51 mg, 0.48 mmol)을 첨가하였다. 밤새 교반한 후, 혼합물을 여과하고, 여과액을 농축한 후, 칼럼 크로마토그래피(용리액으로서 디클로로메탄 내의 2%의 메탄올)로 정제하여 화합물 B14(12.6 mg, 7.2%)를 흰색 고체로서 수득하였다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.17 (m, 1H), 6.39-5.99 (m, 4H), 5.56-4.87 (m, 4H); LCMS (m/z) ES- 1090 (M-H)^-.

본 발명의 라파마이신 유사체의 효소 활성

mTOR은 세포 성장, 증식, 운동성, 생존 및 단백질 합성을 포함하는 다수의 세포 반응을 조절하는 것으로 나타난 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. mTOR 키나아제 활성은 여러 가지 상류 신호전달 경로에 의해 조절되며 이의 조절장애(dysregulation)는 암의 여러 가지 형태에 연루된다. 이제 우리는 mTOR에 의해 GFP-표지된 기질의 인산화를 검출하기 위해 테르븀 표지된 항-인산화 4E-BP1 항체를 이용한다. 이 TR-FRET 기반 분석법은 체외에서 mTOR의 억제제를 선별하는데 사용할 수 있다.

물질: 분석 버퍼 성분: 1M HEPES pH7.5, GIBCO, Cat#15630; 1M MgCl₂, Sigma, Cat# M1028; 0.5M EDTA, GIBCO, Cat# 15575; DTT, Sigma Cat# 43819; EGTA, Sigma Cat# E3889; Triton X100, Sigma, Cat# T8787; BSA CALBIOCHEM Cat# 126575.

효소, 기질 및 검출 시약: mTOR: Invitrogen, Cat# PV4753; GFP-4E-BP1: Invitrogen, Cat# PV4759; FKBP12: SinoBiological, Cat# 10268-H08E; ATP: Sigma Cat# A26209; Tb-anti-p4E-BP1: Invitrogen, Cat# PV4755; TR-FRET Dilution buffer Invitrogen, Cat# PV3574.

플레이트: 화합물 제조 플레이트: 384-웰, Corning cat# 3657; 분석 플레이트: 블랙 저부피 384-웰 마이크로티터 플레이트(Greiner Bio-One, Cat# 784076).

절차: 화합물 투여량 구배 용액 제조:

화합물을 100uM 내지 1.7nM 범위의 11 가지의 서로 다른 농도로(100 μL, 33 μM, 11 μM, 3.7 μM, 1.2 μM, 411 nM, 137 nM, 46 nM, 15 nM, 5 nM, 1.7 nM) 마이크로티터 플레이트 내에서 100% DMSO로 3배 연속 희석하였다. 그리고 나서, 100% DMSO 내의 희석된 화합물을 ddH2O로 10 배 희석하여, 화합물이 10% DMSO 내에 있게 하였다.

본 발명의 라파마이신 유도체의 mTOR 억제 능력을 측정하는 일반적인 분석 프로토콜은 다음과 같다:

분석 프로토콜:

10% DMSO 내의 0.5 μl의 희석된 화합물을 블랙 저부피 384-웰 마이크로티터 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany，cat# 784076)로 피펫팅하였다.

수성 분석 버퍼(50 mM HEPES/NaOH pH 7.5, 5 mM MgCl₂, 1.0 mM 디티오트레이톨, 1 mM EGTA, 0.01%(v/v) Triton-X100(Sigma), 0.01 %(w/v) 소혈청 알부민)(mTOR, 0.3125 ng/μl=> 5 μl 분석 부피 내의 최종 농도는 0.125 ng/μl) 내의 2μl의 mTOR 용액을 분석 플레이트에 첨가하고 화합물-효소 혼합물을 22℃에서 15 분 동안 배양하여 키나아제 반응이 시작되기 전에 시험 화합물이 효소에 미리 결합되도록 하였다.

키나아제 반응은 분석 버퍼 내의 2.5 μl의 ATP(ATP, 200 μM => 5 μl 분석 부피 내의 최종 농도는 10 μM)의 용액과 분석 버퍼 내의 기질(0.8 μM => 5 μl 분석 부피 내의 최종 농도는 0.4 μM)의 첨가에 의해 시작되었으며, 생성된 혼합물을 22℃에서 18 분 동안 배양하였다.

5ul의 30mM EDTA(EDTA, 30 mM => 10 μl 분석 부피 내의 최종 농도는 15mM) 및 TR-FRET 희석 버퍼 내의 4nM Tb-킬레이트 표지된 항-4E-BP1 [pT46] 인산 특히 항체(Invitrogen Cat# PV4755, Tb-표지된 항체, 4 nM => 10 μl 분석 부피 내의 최종 농도는 2 nM)의 첨가에 의해 반응을 중지시켰고, 생성된 혼합물을 22℃에서 1 시간 동안 배양하여 인산화 기질과 Tb-킬레이트 표지된 항체의 복합체를 형성하였다.

Tb-킬레이트에서 GFT로의 공명 에너지 전이의 측정에 의해 인산화 기질의 양을 평가하였다. 따라서, 340 nm에서의 여기 이후 495 nm 및 520 nm에서의 형광 방출을 다표지 측정정치인 Envision 2104 multilabel reader(Perkin-Elmer)로 측정하였다. 520 nm 및 495 nm에서의 방출의 비율을 인산화 기질의 양에 대한 척도로 하였다. 데이터를 정규화(억제제 없는 효소 반응 = 0% 억제, 효소는 없지만 모든 다른 분석 성분 = 100% 억제)하였고 IDBS XLfit 소프트웨어(ID Business Solutions Ltd., UK)를 사용하여 4-파라미터 최적화(방정식 (1))에 의해 IC50 값을 계산하였다:

Y=Bottom + (TOP-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*hillslope)) 방정식 (1)

이 방정식에서, Y는 정규화된 %억제값이다. X는 시험 화합물 농도의 로그값이다. IC50은 최대 억제의 절반이 달성된 화합물의 농도이다.

본 발명의 라파마이신 유사체/유도체의 mTOR 억제 효과의 시험 결과는 다음과 같다:

화합물 ID	IC50(nM)	화합물 ID	IC50(nM)
라파마이신	5.09
화합물 A15	6.43	B2	18.43
화합물 A4	6604.427021	B3	15.40
화합물 A7	>10000	B4	28.52
화합물 A10	>10000	B5	19.38
화합물 A5	>10000	B6	12.96
화합물 A6	9143.20	B7	23.77
화합물 A3	>10000	B9	27.16
화합물 A13	>10000	B11	446.00
화합물 A12	>10000	B12	35.19
화합물 A14	>10000	B13	29.03
화합물 A9	>10000	B14	6.80

종양 세포 억제 연구:

세포 증식 분석

ATP용 화학발광 검출 키트인 CellTiter-Glo®에 의한 세포 생존율의 정량적 측정을 위한 균질 검출 방법에 의해 배양액 내의 살아있는 세포의 수를 측정함으로써 세포 활성에 대한 다양한 화합물의 효과를 정량화하였다. ATP는 살아있는 세포의 대사의 지표이다. 세포를 세척하거나 배지를 제거하지 않고, 혈청 함유 배양 세포 내의 단일 시약(CellTiter-Glo® 시약]을 균질 검출 단계에 직접 추가하였다. 시약을 첨가하고 96-웰 또는 384-웰 플레이트에서 혼합한 후, 10 분 이내에 시스템에 의해 정량화될 수 있는 세포의 수는 각각의 웰에서 15 마리의 세포와 같이 작았다.

시약의 제조

10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 이중 항생제를 포함하는 배지 및 다음의 적절한 첨가제를 사용하여 다양한 세포 유형을 배양하였다: 직장결장암 세포 HCT116, 유방암 세포 MCF-7 및 MDA-MB-231, 흑색종 세포 SK-MEL-28, A549 및 편평상피 세포 암종 세포 A431 배양용 DMEM 배지(Gibco사, Item No. 11995073); U87/MG 및 신장암 세포 786-O 배양용 RPMI-1640 배지(2 mM L-글루타민, 1.5 g / L 중탄산나트륨, 4.5 g / L 글루코오스, 10 mM HEPES, 1.0 mM 피루빈산나트륨(Item # 72400-120, Gibco사); 전립선암 세포주 PC-3 배양용 F-12K 혼합 배지(Item #21127, Gibco사).

계측

다표지 마이크로플레이트 리더(Perkin Elmer사의 Envison 214)

세포 배양 조건

9 개의 세포주 모두를 9 계대 이후 3000 세포/웰의 세포 밀도로 플레이트 내의 웰에 배양하였다.

배양 배지의 제조 및 세포 배양 조건:

화합물을 제조하고 다음 날 세포를 처리한다: 분석될 각각의 화학 화합물을 100% DMSO를 이용하여 10 mM 모액으로 희석시키고, 100% DMSO를 이용한 추가의 희석에 의해 2 mM로 희석시킨 후, 무혈청 세포 배양 배지와 최대 제어로서 0.5% DMSO(화합물 없음) 및 최소 제어로서 10 μM의 라파마이신을 사용하여 연속 5X 희석을 수행하여 최종 10 가지의 희석 농도(2000, 400, 80, 16, 3.2, 0.64, 0.128, 0.0256, 0.00512, 0.00102 μM)가 되게 하였다. 각각의 희석된 화합물의 0.5 μl의 용액을 100 μl의 세포 배양 플레이트에 첨가하였고, 화합물의 최종 농도는 10 개의 포인트(10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032, 0.00064, 0.000128, 0.0000256, .00000512 μM)이다. 그리고 나서, 세포를 37℃ 배양기에서 72 시간 동안 배양하였다. 각각의 화합물의 억제를 결정하는 실험의 신뢰성을 보장하기 위해, 각각의 화합물에 대해 중복으로 사용하였고, 농도 구배를 두 번 반복하였으며(표 1), 각각의 화합물의 결정을 두 번 반복하였다.

플레이트 측정

세포 배양 72 시간 이후, 플레이트 상의 각각의 웰에 50 ul의 CellTiter Glo를 첨가하고 진탕기에서 5 분 동안 진탕한 후, 상온에서 10 분 동안 진탕하였다. 마이크로플레이트 리더로 세포수를 분석하였다.

데이터 분석

다표지 마이크로플레이트 리더를 이용한 측정을 통해 세포 생존율을 얻었다. %세포 생존율에 대한 각각의 희석값의 효과를 다음의 식을 사용하여 계산하였다: %세포 억제=100-100x(Signal-low control)/(High control-low control), 여기서 signal, low control, 및 high control은 각각 시험 화합물, 최소값 및 최대값이다.

세포를 억제하는 각각의 시험 화합물의 IC50는 아래의 식 2에 의해 얻었다:

Y=Bottom + (TOP-Bottom)/(1+((IC50/X)^hillslope)), 여기서 X와 Y는 알려진 값이고, IC50, Hillslope, Top 및 Bottom의 4 개의 파라미터는 분석 소프트웨어에 의해 생성된다. Y는 %억제, X는 시험 화합물의 농도, 그리고 IC50는 세포의 50%를 억제하는데 필요한 화합물의 농도이다. Hillslope는 일반적으로 대략 1인 곡선 맞춤의 기울기이다.

모든 실험 데이터는 IDBS XLfit5(ID Business Solutions Ltd., UK)에 의해 분석하였다.

실험 결과 및 결론

시험된 암세포 모델 각각에 대한 다음의 그래프에 각각의 시험 화합물의 모든 효능이 나타나 있다. 그래프에서 곡선이 낮을수록 각각의 화합물의 효능이 더 좋다. 각각의 그래프에 도시된 데이터로부터, 시리즈 B의 모든 화합물이 시험된 암세포에 대한 다양한 수준의 높은 효능을 보인다는 것을 알 수 있다. B 시리즈 화합물의 일부는 효능이 매우 강력하여, nM 농도 범위의 효능 수준에 도달한다.

신세포 암종 종양 세포 억제 연구:

신세포 암종 종양 세포 억제 연구: 도 1 및 도 2.

폐암 A549 세포 억제 연구: 도 3, 도 4 및 도 5.

흑색종 SK - MEL -28 세포 억제 연구: 도 6, 도 7 및 도 8.

표피암 A431 세포 억제 모델: 도 9, 도 10 및 도 11.

교아종 U87 MG 종양 모델 연구: 도 12, 도 12 및 도 14.

인간 결장 종양 HCT 116 모델 연구: 도 15, 도 16 및 도 17.

유방암 MDA - MB -231 종양 모델: 도 18, 도 19 및 도 20.

유방암 MCF -7 종양 모델: 도 21, 도 22 및 도 23.

전립선암 PC -3 종양 연구: 도 24, 도 25 및 도 26.

인간 대장 종양 ( HCT116 ) 모델에서 라파마이신 유도체의 효능 연구

목적: 본 연구의 목적은 피하 HCT-116 인간 대장암 모델에서 종양 발생을 둔화시키거나 제거하는데 있어서 경구 투여된 A15(양성 제어군) 및 B 시리즈에서 주도적인 화합물의 체내 치료 효능을 전임상적으로 평가하기 위한 것이다.

동물: Balb/c 누드 마우스, 암컷, 6-8 주령, 대략 18-20 g의 체중. 총 70 마리가 연구를 위해 필요하며, 이들은 Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.에서 구입한다.

종양 접종: 종양 발생을 위해 0.1 ml의 PBS 내의 HCT-116 종양 세포(3x106)를 각각의 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종한다. 종양 크기가 대략 ~150 mm³에 달했을 때 치료를 시작한다. 시험 물질 투여 및 각 그룹의 동물 수는 다음의 실험 설계표에 나타나 있다.

그룹 및 치료

그룹	n	치료	투여량(mg/kg)	투여 경로	투여량	스케쥴
1	10	비히클	-	p.o	10 μl/g	QD x 21
2	10	A15	9	p.o	10 μl/g	QD x 21
3	10	B	3	p.o	10 μl/g	QD x 21
4	10	B	9	p.o	10 μl/g	QD x 21
5	10	B	18	p.o	10 μl/g	QD x 21

주: n: 동물 수; 투여량: 체중을 기준으로 조절(10 μl/g). 치료 방식은 체중이 15% 이상 감소하였을 때 조절됨.

그룹 배정: 치료를 개시하기 전에, 모든 동물을 칭량하고 종양 부피를 측정한다. 종양 부피는 주어진 치료 효과에 영향을 줄 수 있기 때문에, 종양 부피를 근거로 한 난괴법(randomized block design)을 이용하여 마우스를 그룹으로 배정한다. 이는 모든 그룹이 기준선에서 비교될 수 있음을 보장한다.

종료점: 주요 종료점은 종양 성장이 지연되거나 마우스가 치료될 수 있는지를 확인하기 위한 것이다. 종양 크기는 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 매주 2 회씩 측정하며, 부피는 다음의 식을 사용하여 mm³으로 나타낸다: V = 0.5 a x b2, 여기서 a와 b는 각각 종양의 긴 직경과 짧은 직경이다. 종양 크기는 이후 T-C 및 T/C 값의 계산을 위해 사용된다. T-C는 치료군의 종양이 소정의 크기(예컨대, 500 mm³)에 도달하는데 필요한 평균 시간(일)으로서 T로 계산되고, C는 제어군의 종양이 동일한 크기에 도달하는데 필요한 평균 시간(일)이다. T/C 값(%)은 항종양 효과의 지표이고, T와 C는 정해진 날에 각각 치료군 및 제어군의 평균 부피이다. 종양 조직은 연구의 마지막 날에 종양 칭량 및 사진을 위해 수집된다.

종료: 본 연구는 제어군의 평균 종양 크기가 500-1000 mm³에 도달할 때 종료된다. 계속 악화되는 상태에 있는 것으로 관찰되는 동물은 사망 이전에 또는 혼수 상태에 도달하기 전에 안락사시킨다. 심한 고통 및/또는 통증의 명백한 징후를 보이는 동물은 인도적으로 희생시킨다. 다음과 같은 상황인 경우, 동물을 안락사시킨다:

동물의 체중이 상당히 감소한(수척해진) 경우. 명백한 체중 감량: 20% 이상;

동물이 충분한 음식이나 물을 섭취하지 못하는 경우.

연구는 모든 비히클 처리된 제어군의 평균 종양 크기가 2000 mm³의 값에 도달할 때 모든 그룹의 모든 동물을 희생시키고 종료한다.

통계 분석: 두 개의 그룹 간의 비교를 위해, 독립 표본 t-test가 사용된다. 세 개 이상의 그룹 간의 비교를 위해, 일원 분산분석(one-way ANOVA)이 수행된다. 상당한 F-통계(오차 분산에 대한 치료 변화의 비율)가 얻어지면, ANOVA 이후 다중 비교 방법이 적용된다. 치료 사이의 잠재적인 시너지 효과는 LSD 또는 Dunnett's T3에 의해 분석된다. 모든 데이터는 SPSS 17.0 소프트웨어를 사용하여 분석된다. p < 0.05는 통계적으로 유의성 있는 것으로 간주된다.

요약: 다음의 도면에 도시된 바와 같이, 치료 22 일 이후, 9 mg/kg/일의 A15 양성 대조군 화합물은 SubQ HCT116 내성 대장암 이종이식 모델(* P<0.05)에서 종양 성장을 63%만큼 상당히 억제하였으며, 이는 문헌의 보고와 일치한다. 치료 22 일 이후, B 화합물은 비히클 처리군에 비해 각각 3, 9 및 18 mg/kg/일에서 종양 성장을 42%, 57% 및 64% (**, P<0.01) 억제하였다. 명백한 독성을 관찰되지 않았다. 이러한 데이터는 B 화합물이 체내에서 매우 효능이 있고 대장암 저장을 극복할 수 있는 것을 나타낸다.

도 27. 본 도면에서, 맨 위의 선(다이아몬드)은 비히클에 대한 것이고, 두 번째 선(삼각형)은 3 mg/Kg의 투여량에서 B7에 대한 것이고, 세 번째 선(보라색 크로스)은 9gm/Kg 투여량에서 B7를 나타내고, 네 번째 선(파란색 크로스)은 18 mg/Kg 투여량에서 B7을 나타낸다.

치료 방법

본 발명의 화합물은, 이에 제한되지 않으나 실시예에 명시된 것들을 포함하여, 포유동물(특히 인간)에서 면역억제 및 항종양 활성을 보유한다. 면역억제제로서, 본 발명의 화합물은 심장, 신장, 간, 골수, 피부, 각막, 폐, 췌장, 소장(intestinum tenue), 사지, 근육, 신경, 십이지장, 소장(small-bowel), 또는 이자섬 세포(pancreatic-islet-cell) 등의 이식에 의한 저항과 같은 면역 매개 질환; 골수 이식으로 인한 이식편 대 숙주 질환(graft-versus-host disease); 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 제1형 당뇨병, 포도막염(uveitis), 알러지성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 사구체신염(glomerulonephritis) 등과 같은 자가면역 질환의 치료 및 예방에 유용하다. 추가의 용도는 건선(psoriasis), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis) 및 습진성 피부염(eczematous dermatitis), 지루성 피부염(seborrhoeic dermatitis), 편평 태선(lichen planus), 수포창(pemphigus), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 수포성 표피박리증(epidermolysis bullosa), 두드러기(urticaria), 혈관부종(angioedemas), 혈관염(vasculitis), 홍진(erythemas), 피부 호산구증가증(cutaneous eosinophijias), 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 여드름 및 원형 탈모증(alopecia areata)과 같은 염증성 및 과증식성 피부 질환 및 면역학적으로 매개되는 질환의 피부 발현; 각결막염(keratoconjunctivitis), 춘계 결막염(vernal conjunctivitis), 베체트병과 관련된 포도막염(uveitis associated with Behcet's disease), 각막염(keratitis), 포진성 각막염(herpetic keratitis), 원추 각막(conical cornea), 각막 상피 변성(dystrophia epithelialis corneae), 각막 맥반(corneal leukoma), 및 눈 천포창(ocular pemphigus)과 같은 다양한 안구 질환(자가면역 등)의 치료와 예방을 포함한다. 또한, 천식(예컨대, 기관지 천식, 알러지성 천식, 내인성 천식, 외인성 천식 및 먼지 천식), 특히 만성 또는 고질적 천식(예컨대, 후기 천식 및 기도 과민반응성), 기관지염, 알러지성 비염 등과 같은 질환을 포함하는 가역성 기도수축에 따른 질환이 본 발명의 화합물의 표적이 된다. 위장 궤양, 허혈성 질환 및 혈전증으로 인한 혈관 손상과 같은 점막과 혈관의 염증. 또한, 내막 평활근 세포의 과형성, 특히 생리학적 또는 기계적으로 매개되는 혈관 손상 이후의 재발협착증 및 혈관 폐색과 같은 과증식성 혈관 질환이 본 발명의 화합물에 의해 치료되거나 예방될 수 있다. 그 밖의 치료 가능한 질병은 다음과 같다: 허혈성 장 질환, 염증성 장 질환, 괴사성 장염, 및 복강 질환(coeliac disease), 직장염(proctitis), 호산구성 위장관염(eosinophilic gastroenteritis), 비만세포증(mastocytosis), 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 장 염증/알러지; 다발성 근염(multiple myositis), 길랭-바래 증후군(Guillain-Barre syndrome), 메니에르병(Meniere's disease), 다신경염(polyneuritis), 다발성 신경염(multiple neuritis), 단신경염(mononeuritis) 및 신경근증(radiculopathy)과 같은 신경 질환; 갑상선 기능 항진증(hyperthyroidism) 및 바제도병(Basedow's disease)과 같은 내분비성 질환; 순수 적혈구 무형성증(pure red cell aplasia), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 저형성성 빈혈(hypoplastic anemia), 특발성 혈소판감소 자반병(idiopathic thrombocytopenic purpura), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 과립구감소증(agranulocytosis), 악성 빈혈(pernicious anemia), 거대적혈구성 빈혈(megaloblastic anemia) 및 홍색 비후증(erythroplasia)와 같은 혈액 질환; 골다공증(osteoporosis)과 같은 골 질환; 유육종증(sarcoidosis), 폐섬유증(fibroid lung) 및 특발성 간질성 폐렴(idiopathic interstitial pneumonia)과 같은 호흡기 질환; 피부근염(dermatomyositis), 심상성 백반(leukoderma vulgaris), 심상성 어린선(ichthyosis vulgaris), 광알러지성 민감증(photoallergic sensitivity) 및 피부 T세포 림프종(cutaneous T cell lymphoma)과 같은 피부 질환; 동맥경화증(arteriosclerosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 대동맥염증 증후군(aortitis syndrome), 결절성 다발성동맥염(polyarteritis nodosa) 및 심근증(myocardosis)과 같은 순환계 질환; 경피증(scleroderma), 베게너 육아종(Wegener's granuloma] 및 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome]과 같은 교원병(collagen disease); 지방증(adiposis); 호산성 근막염(eosinophilic fasciitis); 치은, 치주, 치조골 및 치근을 덮는 골물질(substantia ossea dentis)의 병소와 같은 치주 질환; 사구체신염(glomerulonephritis)과 같은 신장 증후군; 탈모를 방지하거나 모발 발아를 제공하고 및/또는 모발 생성 및 모발 성장을 촉진함으로써 발생하는 남성형 탈모증 또는 노인성 탈모증; 근이영양증(muscular dystrophy); 농피증(pyoderma)및 세자리 증후군(Sezary's syndrome]; 예를 들어 보존, 이식 또는 허혈성 질환(예컨대, 혈전증 및 심근경색) 시 발생하는 장기(예컨대, 심장, 간, 신장 및 소화관)의 허혈재관류 손상(ischemia-reperfusion injury)과 같은 장기 손상과 같은 활성 산소매개 질환; 내독소 쇼크증(endotoxin-shock), 가막성 대장염(pseudomembranous colitis) 및 약물 또는 방사선에 의한 대장염과 같은 장 질환; 급성 허혈성 신기능 부전 및 만성 신기능 부전과 같은 신장 질환; 폐-산소 또는 약물(예컨대, 파라코트(paracort) 및 블레오마이신(bleomycin))로 인한 중독증(toxinosis), 폐암 및 폐 기종(pulmonary emphysema)과 같은 폐질환; 백내장, 철침착증(siderosis), 망막염, 색소성 망막염, 노인성 황반 변성(senile macular degeneration), 유리체 상처(vitreal scarring) 및 각막의 알칼리 화상(corneal alkali burn)과 같은 안 질환; 다형 홍반(erythema multiforme), 선상 IgA 수포성 피부종(linear IgA bullous dermatosis) 및 시멘트 피부염과 같은 피부염; 및 치은염, 치주염, 패혈증, 췌장염, 환경 오염(예컨대, 공기 오염)으로 인한 질환, 노화, 발암, 암종의 전이 및 고산병과 같은 그 밖의 질환; 히스타민 또는 류코트리엔-C₄ 방출로 인한 질환; 장-, 혈관-, 또는 신경-베체트병과 같은 베체트병, 및 구강, 피부, 눈, 음문, 조음, 부고환, 폐, 신장 등에 영향을 주는 베체트병. 또한, 본 발명의 화합물은 면역성 질환(예컨대, 자가면역 간염, 원발 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis) 및 경화성 담관염(sclerosing cholangitis)과 같은 만성 자가면역 간 질환), 부분 간 절제, 급성 간 괴사(예컨대, 독소, 바이러스성 간염, 쇼크 또는 산소결핍에 의한 괴사), B형 바이러스 간염, 비-A형/비-B형 간염, 간경변(알코올성 간경변) 및 전격성 간부전, 후발성 간부전 및 만성 간부전의 급성 악화(만성 간 질환에 대한 급성 간부전)와 같은 간부전과 같은 간 질환의 치료 및 예방에 유용할 수 있으며, 또한 사이토메갈로바이러스 감염증(cytomegalovirus infection), 특히 HCMV 감염에 대한 화학요법 효과의 증가, 신장증(nephrosis), 경피증, 폐 섬유증, 동맥경화증, 울혈성 심부전(congestive heart failure), 심실 비대(ventricular hypertrophy), 수술후 유착 및 상처, 뇌졸중, 심근 경색 및 허혈 및 재관류와 관련된 손상 등에 대한 항염증 활성과 같은 이들의 유용한 활성으로 인해 다양한 질환에 유용하다.

또한, 본 발명의 화합물은 FK-506 길항 특성을 보유한다. 본 발명의 화합물은 따라서 면역감소(immunodepression) 또는 면역감소와 관련된 질병의 치료에서 사용될 수 있다. 면역감소와 관련된 질병의 예는 AIDS, 암, 진균 감염, 노인성 치매, 정신적 외상(상처 치유, 수술 및 쇼크를 포함함), 만성 세균 감염, 및 특정 중추 신경계 장애를 포함한다. 치료될 면역감소는, 예를 들어, FK-506 또는 라파마이신과 같은 12-(2-시클로헥실-1-메틸비닐)-13,19,21,27-테트라메틸-11,28-디옥사-아자트리시클로[22.3.1.04.9]옥타코스-18-엔의 유도체와 같은, 면역억제 거대고리 화합물의 과다복용에 의해 유발될 수 있다. 환자에 의한 이러한 약제의 과다복용은 정해진 시간에 약물을 복용하는 것을 잊어버린 것을 자각할 때 매우 일반적이며 심각한 부작용으로 이어질 수 있다.

본 발명의 화합물은, 이에 제한되지 않으나 실시예에 명시된 것들을 포함하여, 포유동물(특히 인간)에서 항종양 활성을 보유한다. 항암제로서, 본 발명의 화합물은 뇌 및 신경혈관 종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 중피종(mesothelioma), 림프암, 위암, 신장암, 신장암종, 간암 및 간경화증, 난소암, 난소 자궁내막증, 고환암, 피부암, 흑색종, 신경 및 모든 내분비암, 비장암, 췌장암, 호지킨암(Hodgkin's cancer), 림프종, 백혈병과 같은 혈액 증식 질환, 및 제어되지 않는 세포 증식으로 인한 모든 암 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물은 효과적인 약학적 제제를 생성하기 위해 유드라짓(Eudragit), 카복시메틸셀룰로오스나트륨(NaCM), 카복시프로필셀룰로오스나트륨, 임의의 다른 자연적으로 유래하는 또는 합성 부형제와 같은 일반적으로 공지된 약학적 부형제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 제제는 의료적 필요에 따라 즉시 방출 제제, 또는 지효성 방출 제제, 또는 부위 주사 제제와 같이 형성될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 스텐트, 풍선, 풍선 카테터, 정형외과용 기기와 같은 의료 기기와 결합되어 의료 기기의 효능을 더 향상시킬 수 있다. 본 발명의 화합물은 국소 주사제와 같은 의료 치료 요법의 주요 기능의 성분일 수 있고, 또는 의료 기기 상의 코팅과 같은 보조적인 기능 또는 저분자 또는 고분자 부형제와 함께 보조적인 기능일 수 있고 의료 기기의 코팅 또는 충전제로서 사용될 수 있다.

풍선 혈관확장술(angioplasty) 또는 스텐트 대체 이후 재발협착증을 치료하기 위해 사용될 때, 본 발명의 화합물 및 천연 라파마이신은 라파마이신 또는 mTOR의 포유동물 표적의 억제를 통해 이의 치료 기능을 보이는 것으로 생각된다.

상기 또는 다른 치료에서 사용될 때, 본 발명의 화합물 중 하나의 치료적 유효량이 순수한 형태로 사용될 수 있고, 이러한 형태가 존재하는 경우, 약학적으로 허용 가능한 염, 에스테르 또는 전구약물의 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 관심 있는 화합물을 포함하는 약학적 조성물로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 "치료적 유효량"이란 용어는 임의의 의료적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험 비율에서 질병을 치료하기 위한 화합물의 충분한 양을 의미한다. 그러나, 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 일일 사용량은 현명한 의학적 판단의 범위 내에서 담당 의사에 의해 결정된다는 것을 이해할 것이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량 수준은 치료되는 질병 및 질병의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성 및 식습관; 사용되는 특정 화합물의 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율; 사용되는 특정 화합물과 병용해서 또는 우연히 함께 사용되는 약물; 의료 분야에서 공지된 유사한 요인을 포함하는 다양한 요인에 의해 결정된다. 예를 들어, 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 것보다 낮은 수준에서 화합물의 투여량을 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 늘리는 것이 본 기술분야에서 통상적이다.

인간 또는 하등 포유동물에 투여되는 본 발명의 화합물의 총 일일 투여량은 대략 0.01 내지 대략 20 mg/kg/일의 범위일 수 있다. 경구 투여를 위해, 더욱 바람직한 투여량은 대략 0.001 내지 대략 3 mg/kg/일의 범위일 수 있다. 원하는 경우, 효과적인 일일 투여량은 투여의 목적으로 다수의 투여량으로 분할될 수 있고; 그 결과, 단일 투여량의 조성물은 일일 투여량을 형성하기 위해 그러한 양 또는 이의 약수를 포함할 수 있다. 국소 투여는 적용 부위에 따라 0.001 내지 10% mg/kg/일의 범위인 투여량을 포함할 수 있다. 재발협착증 및 취약한 플라크를 치료하기 위해 국소 투여될 때, 투여량은 대략 1 μg/mm의 스텐트 길이 내지 대략 100 μg/mm의 스텐트 길이의 범위일 수 있다.

약학적 조성물

본 발명의 약학적 조성물은 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하며, 경구적으로, 직장으로, 비경구적으로, 낭내(intracisternally), 질내(intravaginally), 복강내, 국소적으로(분말, 연고, 점적약(drop) 또는 경피 패치와 같이), 구강으로, 또는 구강 또는 비강 스프레이로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 비독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 밀봉재 또는 임의의 유형의 보조 제제를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방법을 말한다.

비경구 주사용 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 멸균 수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 유제뿐만 아니라 사용 직전에 멸균 주사 용액 또는 분산액으로 재구성되기 위한 멸균 분말을 포함한다. 적절한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카복시메틸셀룰로오스 및 이의 적절한 혼합물, 식물성 오일(예컨대, 올리브유), 및 에틸 올레산염과 같은 주사 가능한 유기 에테르를 포함한다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅재의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제의 포함에 의해 미생물의 활동을 방지할 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제(isotonic agent)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 모노스테아린산 알루미늄 및 젤라탄과 같이 흡수를 지연하는 물질의 포함에 의해 주사형 제형의 흡수를 연장시킬 수 있다.

일부 경우, 약물의 효과를 연장시키기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직하다. 이는 낮은 물 용해도를 갖는 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다. 약물의 흡수율은 이후 용해율에 의해 결정되고, 이는 다시 결정 크기와 결정 형태에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로 비경구 투여된 약제의 지연된 흡수는 오일 비히클 내에 약물을 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다.

폴리락타이드-폴리글리콜라이드(polylactide-polyglycolide)와 같은 생분해성 고분자 내에 약물의 마이크로인캡슐 매트릭스(microencapsule matrix)를 형성하여 주사용 제제를 제조할 수 있다. 약물/고분자의 비율 및 사용된 특정 고분자의 특성에 따라, 약물 방출 비율이 조절될 수 있다. 그 밖의 생분해성 고분자의 예는 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 또한 리포좀 또는 신체 조직에 적합한 마이크로에멀젼(microemulsion) 내에 약물을 포획함으로써 주사용 제제를 제조할 수 있다.

주사용 제제는, 예를 들어, 세균-고정 필터(bacterial-retaining filter)를 통한 여과에 의해, 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매체 내에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 살균제를 도입함으로써 살균될 수 있다.

경구 투여를 위한 고체 제형은 캡슐, 정제, 환제, 분말, 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 제형에서, 활성 화합물은 구연산나트륨 또는 인산이칼슘과 같은 적어도 하나의 불활성의, 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체 및/또는 a) 전분, 락토오스, 수크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 규산과 같은 충전제 또는 증량제, b) 카복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스, 및 아카시아와 같은 결합제, c) 글리세롤과 같은 보습제, d) 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 탄산나트륨 등의 붕해제, e) 파라핀과 같은 용해 지연제, f) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제, e) 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제, h) 고령토 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제, 및 i) 탈크, 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 라우릴황산나트륨, 및 이들의 혼합물과 같은 윤활제와 혼합된다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여량은 또한 완충제를 포함할 수 있다.

유사한 유형의 고체 조성물이 또한, 부드러운, 반고체 및 경질 충전 젤라틴 캡슐 또는 락토오스 또는 유당뿐만 아니라 고분자 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 액체 충전 캡슐 내에서 충전제로 사용될 수 있다.

정제, 당제, 캡슐, 환제 및 과립의 고체 제형이 장용성 코팅(enteric coating) 및 제약 제형 분야에서 공지된 다른 코팅과 같은 코팅 및 쉘과 함께 제조될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있고 또한, 바람직하게, 장관(intestinal tract)의 특정 부위에서, 선택적으로, 지연된 방식으로 유효 성분(들)만을 방출할 수 있는 조성물일 수 있다.

활성 화합물은 또한, 적절한 경우, 하나 이상의 상기한 부형제를 포함하는 마이크로-캡슐화된 형태일 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 제형은 약학적으로 허용 가능한 유화제, 용액, 현탁액, 시럽 등을 포함한다. 활성 화합물에 더하여, 액체 제형은, 예를 들어 물 또는 기타 용매, 가용화제 및, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸 포름아미드, 오일(특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물과 같은 유화제를 포함한다.

불활성 희석제 외에도, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 착향제, 및 방향제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

활성 화합물에 더하여, 현탁액은, 예를 들어 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로오스, 알루미늄 금속 수산화물, 벤토나이트, 한천, 트라가칸트, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

국소 투여는 폐 및 누의 표면을 포함하여, 스킨 또는 점막으로의 투여를 포함한다. 국소 투여를 위한 조성물은, 흡입용을 포함하여, 압축 또는 비압축될 수 있는 건조 분말로 제조될 수 있다. 비압축 분말 조성물에서, 미세하게 분할된 형태의 유효 성분은, 예를 들어, 최대 100 마이크로미터 직경의 크기를 갖는 입자를 포함하는 대형의, 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 혼합하여 사용할 수 있다. 적절한 불활성 담체는 락토오스와 같은 당을 포함한다. 바람직하게, 유효 성분의 입자의 적어도 95 wt%는 0.01 내지 10 마이크로미터 범위의 유효 입경을 갖는다. 피부에서 국소용으로 사용하기 위한 조성물은 또한 연고, 크림, 로션, 및 젤을 포함한다.

대안적으로, 상기 조성물은 압축될 수 있고 질소와 같은 압축 가스 또는 액화 가스 추진제를 포함할 수 있다. 액화 추진제 및 전체 조성물은 바람직하게 유효 성분이 실질적인 정도로 내부에서 용해되지 않게 하기 위한 것이다. 압축 조성물은 또한 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 액체 또는 고체 비이온성 계면활성제일 수 있고, 또는 고체 음이온성 계면활성제일 수 있다. 나트륨염의 형태인 고체 음이온성 계면활성제를 사용하는 것이 바람직하다.

국소 투여의 추가의 형태는 자가면역 질환, 알러지성 또는 염증성 질병과 같은 눈의 면역 매개 질병의 치료 및 각막 이식을 위해 눈에 투여되기 위한 것이다. 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 안과 비히클의 형태로 전달되어, 화합물이 충분한 시간 동안 안구 표면에서 접촉한 상태로 유지됨으로써 화합물이, 예를 들어, 눈의 전방(anterior chamber), 후방(posterior chamber), 유리체(vitreous body), 수양액(aqueous humor), 유리액(vitreous humor), 각막, 홍채/섬모체(iris/ciliary), 수정체, 맥락막(choroid)/망막 및 공막(sclera)과 같은 눈의 각막 및 내부 영역에 침투할 수 있게 한다. 약학적으로 허용 가능한 안과 비히클은, 예를 들어, 연고, 식물성 오일 또는 캡슐화재일 수 있다.

직장 또는 질 투여를 위한 조성물은 바람직하게 좌약 또는 관장(retention enema)이고, 이는 상온에서는 고체지만 체온에서 액체이고 따라서 직장 또는 질강 내에서 녹고 활성 화합물을 방출하는 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 좌약 왁스와 같은 적절한 비자극성 부형제를 본 발명의 화합물과 혼합함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 리포좀의 형태로 투여될 수 있다. 본 기술분야에 공지된 바와 같이, 리포좀은 일반적으로 인지질 또는 다른 지질 물질에서 유래된다. 리포좀은 수성 매체에서 분산되는 단일- 또는 다중-층 수화 액체 결정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 임의의 비독성의, 생리학적으로 허용 가능하고 대사 가능한 액체가 사용될 수 있다. 리포좀 형태의 본 조성물은, 본 발명의 화합물 외에도, 안정화제, 방부제, 부형제 등을 포함할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴)이며, 천연 및 합성 모두일 수 있다. 리포좀을 형성하는 방법들은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq)을 참고하라.

본 발명의 화합물은 또한 하나 이상의 면역억제제와 공동 투여될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 면역억제제는 IMURAN.RTM, 아자티오프린 나트륨 azathioprine sodium, 브레퀴나르 나트륨 brequinar sodium, SPANIDIN.RTM. 구스페리무스 트리하이드로클로라이드(gusperimus trihydrochloride, 데옥시스퍼구알린(deoxyspergualin)으로도 알려짐), 미조리빈(mizoribine, 브레디닌(bredinin)으로도 알려짐), CELLCEPT.RTM. 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), NEORAL.RTM. 시클로스포린 A(cylosporin A, SANDIMMUNE.RTM.라는 상표 하에 시클로스포린 A의 다른 제제로도 판매됨), PROGRAF.RTM. 타크로리무스(tacrolimus, FK-506으로도 알려짐), 시롤리무스(sirolimus) 및 RAPAMUNE.RTM., 레플루노마이드(leflunomide, HWA-486로도 알려짐), 프레드니솔론(prednisolone) 및 이의 유도체와 같은 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 올소크론(orthoclone)(OKT3) 및 Zenapax.RTM과 같은 항체 요법, 및 티모글로불린(thymoglobulin)과 같은 항흉선세포 글로불린(antithymocyte globulin)을 포함한다.

스텐트 또는 다른 이식 가능한 장치로부터의 약물/약물 조합물의 국소 전달은 다음과 같은 장점을 갖는다: 즉, 스텐트의 지지 작용을 통한 혈관 반동 및 리모델링의 방지 및 신생혈관 내막증식(neointimal hyperplasia) 또는 재발협착증의 여러 성분의 방지뿐만 아니라 염증 및 혈전증의 감소. 스텐트가 시술된 관상동맥으로의 약물, 물질 또는 화합물의 이러한 국소 투여는 또한 추가의 치료 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 전신 투여보다는 국소 전달을 이용하여 약물, 물질 또는 화합물의 높은 조직 농도가 달성될 수 있다. 또한, 높은 조직 농도를 유지하면서 전신 투여보다는 국소 전달을 이용하여 전신 독성의 감소를 달성할 수 있다. 또한 전신 투여보다는 스텐트로부터의 국소 전달을 이용하는데 있어서, 단일 시술이 더 나은 환자 수용에 충분할 수 있다. 약물, 물질, 및/또는 화합물의 복합 치료의 또 다른 이점은 각각의 치료 약물, 물질, 및/또는 화합물의 투여량을 줄이는 것일 수 있고, 이에 따라 재발협착증, 염증 및 혈전증의 감소를 달성하면서 이들의 독성을 제한할 수 있다. 국소 스텐트 기반 치료는 따라서 재발협착증 방지의, 항염증성, 항혈전성 약물, 물질 또는 화합물의 치료 비율(효능/독성)을 향상시키는 수단이다.

전술한 상세한 설명 및 수반하는 실시예는 단지 예시이며, 첨부한 청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위에 대한 제한으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 개시된 실시형태에 대한 다양한 변경 및 변형은 본 기술분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 화학 구조, 치환기, 유도체, 중간물, 합성, 제제 및/또는 본 발명의 사용 방법에 관한 것들을 제한 없이 포함하는 이러한 변경 및 변형은 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

Claims

화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구 약물에 있어서,

여기서 A는
a) 수소, 알킬 및 치환된 알킬, 알케닐 및 치환된 알케닐, 알키닐 및 치환된 알키닐, 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬, 헤터로시클로알킬 및 치환된 헤터로시클로알킬; 치환기는 하이드록실, 술포닐, 카보닐, 아미노, 시아노, 할로겐, 알콕시, 아릴, 및 헤테로아릴을 포함하고; 및
b) 아릴 및 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고; 치환기는 하이드록실, 할로겐, 아미노, 카보닐, 시아노, 니트로, 술포닐, 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 및 헤테로시클로알킬을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물:
화학식 II의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 전구 약물에 있어서,

여기서 B는
a) 수소, 알킬 및 치환된 알킬, 알케닐 및 치환된 알케닐, 알키닐 및 치환된 알키닐, 시클로알킬 및 치환된 시클로알킬, 헤터로시클로알킬 및 치환된 헤터로시클로알킬; 여기서 각각의 치환기는 독립적으로 하이드록실, 술포닐, 카보닐, 아미노, 시아노, 할로겐, 알콕시, 아릴, 및 헤테로아릴이고; 및
b) 아릴 및 치환된 아릴, 헤테로아릴 및 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고; 여기서 각각의 치환기는 하이드록실, 할로겐, 아미노, 카보닐, 시아노, 니트로, 술포닐, 알킬, 알콕시, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 3 항에 있어서,
상기 화합물은 다음으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물:
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 약학적 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 조성물은 경구, 비강, 정맥내, 경피, 비경구, 피하, 근육내, 안구내, 및 복막 경로로 이루어진 군에서 선택되는 경로를 통해 포유동물에 투여되기 적합한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 암은 뇌 및 신경혈관 종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 중피종(mesothelioma), 림프암, 위암, 신장암, 신장암종, 간암 및 간경화증, 난소암, 난소 자궁내막증, 고환암, 피부암, 흑색종, 신경 및 모든 내분비암, 비장암, 췌장암, 호지킨암(Hodgkin's cancer), 림프종, 백혈병과 같은 혈액 증식 질환, 및 제어되지 않는 세포 증식으로 인한 모든 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
대상에서 면역 매개 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 면역 매개 질환은 심장, 신장, 간, 골수, 피부, 각막, 폐, 췌장, 소장(intestinum tenue), 사지, 근육, 신경, 십이지장, 소장(small-bowel), 또는 이자섬 세포(pancreatic-islet-cell)의 이식에 의한 저항; 골수 이식으로 인한 이식편 대 숙주 질환(graft-versus-host disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 면역 매개 질환은 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 제1형 당뇨병, 포도막염(uveitis), 알러지성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis), 또는 사구체신염(glomerulonephritis)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 면역 매개 질환은 골수 이식으로 인한 이식편 대 숙주 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
암 또는 면역 매개 질환의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
제 14 항에 있어서,
상기 암은 뇌 및 신경혈관 종양, 두경부암, 유방암, 폐암, 중피종, 림프암, 위암, 신장암, 신장암종, 간암 및 간경화증, 난소암, 난소 자궁내막증, 고환암, 피부암, 흑색종, 신경 및 모든 내분비암, 비장암, 췌장암, 호지킨암(Hodgkin's cancer), 림프종, 백혈병과 같은 혈액 증식 질환, 및 제어되지 않는 세포 증식으로 인한 모든 암 질환으로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 면역 매개 질환은 심장, 신장, 간, 골수, 피부, 각막, 폐, 췌장, 소장(intestinum tenue), 사지, 근육, 신경, 십이지장, 소장(small-bowel), 또는 이자섬 세포(pancreatic-islet-cell)의 이식에 의한 저항; 골수 이식으로 인한 이식편 대 숙주 질환(graft-versus-host disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.