KR20140147605A - 형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법 - Google Patents

형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140147605A
KR20140147605A KR1020130071184A KR20130071184A KR20140147605A KR 20140147605 A KR20140147605 A KR 20140147605A KR 1020130071184 A KR1020130071184 A KR 1020130071184A KR 20130071184 A KR20130071184 A KR 20130071184A KR 20140147605 A KR20140147605 A KR 20140147605A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
indocyanine green
perfluorocarbon
nanoemulsion
phosphate
group
Prior art date
Application number
KR1020130071184A
Other languages
English (en)
Inventor
정봉현
배판기
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020130071184A priority Critical patent/KR20140147605A/ko
Publication of KR20140147605A publication Critical patent/KR20140147605A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A61K49/0034—Indocyanine green, i.e. ICG, cardiogreen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 인도사이아닌 그린(Indocyanine green)이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인도사이아닌 그린이 포함된 지질 함유 유화제 수용액에 퍼플루오르카본을 혼합함으로써, 인도사이아닌 그린의 근적외선 광학적 특성과 퍼플루오르카본의 플루오르 기반 자기공명특성을 동시에 가지는 인도사이아닌-퍼플루오르카본 나노에멀젼의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼은 생체적합성이 매우 뛰어나고, 광학적 특성과 자기공명 특성을 동시에 갖춘 다중모드 분자영상용 조영제로 사용될 수 있으며, 인도사이아닌 그린의 단점인 형광특성과 물리화학적 특성이 크게 개선되어 생물학 및 의료분야 등과 같은 다양한 분야에 활용할 수 있다.

Description

형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법 {Indocyanine Green-Perfluorocarbon Nanoemulsion with Improved Fluorescence Characteristic and Method for Preparing the Same}
본 발명은 인도사이아닌 그린(Indocyanine green)이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인도사이아닌 그린이 포함된 지질 함유 유화제 수용액에 퍼플루오르카본을 혼합함으로써, 인도사이아닌 그린의 근적외선 광학적 특성과 퍼플루오르카본의 플루오르 기반 자기공명특성을 동시에 가지는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼의 제조방법에 관한 것이다.
자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging: MRI) 기법은 고해상도의 영상을 빠르게 얻을 수 있다는 장점으로 인해, 실제 임상분야에서 널리 활용되고 있다. 현재, 자기공명영상 분야에서는 수소(1H) 기반 자기공명영상 신호를 증폭하기 위하여 2가지 형태의 조영제가 사용되고 있다. 첫째는 T1-계열의 조영제로서 상자성 (paramagnetic) 특성이 있는 가돌리늄(Gd) 이나 망간(Mn) 계열의 물질을 사용하는 것이고, 두 번째는 T2-계열의 조영제로서 초상자성(superparamagnetic) 특성이 있는 산화철 계열의 물질을 사용한다.
그러나, T1-계열의 조영제는 실제 임상분야에서 원하는 정도의 영상신호를 얻기 위해서 고농도로 사용하기 때문에 인체에 유해한 문제점이 있으며 (Caravan, P. Strategies for increasing the sensitivity of gadolinium based MRI contrast agents. Chemical Society reviews 35, 512-523 (2006)), T2-계열의 조영제는 주파수 변위(frequency shift)를 일으키는 요인이 있어서 영상신호를 얻는데 어려운 점이 있다(Bulte, J.W. ＆ Kraitchman, D.L. Iron oxide MR contrast agents for molecular and cellular imaging. NMR in biomedicine 17, 484-499 (2004)). 또한 수소(1H) 기반 자기공명영상을 이용하는 기법은 다양한 파장을 방출할 수 있는 광학영상 조영제에 비하여, 다중분석(multiplexed analysis)영상을 얻을 수 없으며, 양전자 방사 단층촬영법(PET: poistron emission tomography) 또는 단일광자 방출단층촬영법(SPECT: single-photon emission computerized tomography)과 같은 영상기법에 비해 민감도(sensitivity)가 떨어지는 단점을 가지고 있다.
상기 단점을 극복하기 위하여, 유기형광 다이(dye) 또는 양자점 나노입자와 같은 형광특성을 나타내는 물질을 자기공명영상 조영제와 결합시켜, 광학적인 특성과 자기공명 특성을 모두 측정 가능한 이중 영상조영제(bimodal imaging contrast agents)가 활발히 연구되고 있다 (Mulder, W.J. et al. Magnetic and fluorescent nanoparticles for multimodality imaging. Nanomedicine 2, 307-324 (2007), Uzgiris, E.E. etal. A multimodal contrast agent for preoperative MR Imaging and intraoperative tumor margin delineation. Technology in cancer research ＆ treatment 5, 301-309 (2006), Yang, H., Santra, S., Walter, G.A. ＆ Holloway, P.H. GdIII-functionalized fluorescent quantum dots as multimodal imaging probes. Advanced materials 18, 2890-2894 (2006)).
근적외선 형광 염료인 인도사이아닌 그린(Indocyanine green, ICG)은 미국 FDA (Food and Drug Administration)에서 심장, 간 혈관 시스템 및 림프계 진단에 사용허가를 받은 물질이다. 특히, 유방암의 조기 진단을 위한 전이성 림프노드 (Lymph node)의 이미징 및 센티넬 림프노드 (Sentinel lymph node)의 맵핑(mapping)에 우수한 프로브로 알려져 있다.
그러나 인도사이아닌 그린은 친수성, 광안정성 및 광자 수율이 낮고, 감도가 떨어지는 단점을 가지고 있다. 비특이적 응집에 취약하고, 외부 광, 용매 및 온도변화에 의해 쉽게 화학적으로 분해되는 단점이 있다. 낮은 분자량과 소수성과 친수성을 동시에 가지는 특성 때문에, 혈청내 존재하는 단백질과 결합하여 신장을 거쳐 빠르게 제거된다. 혈액 내에서 인도사이아닌 그린은 약 2~4분 정도의 반감기를 가지기 때문에, 진단 효율을 높이기 위해서는 혈액 내에서 반감기가 긴 인도사이아닌 그린-기반 프로브의 개발이 절실히 요구되고 있다.
또한, 생체내에서 인도사이아닌 그린은 쉽게 확산되기 때문에, 인도사이아닌 그린을 이용한 센티넬 림프 노드의 절개 시술은 30분 내에 수행되어야 하며, 생체내 깊은 곳에 존재하는 림프 노드는 찾을 수 없는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하고자, 나노물질 기반 인도사이아닌 그린 프로브, 예를 들면, 나노입자, 리포솜, 마이셀 등이 연구되어 왔으며, 나노파티클에 인도사이아닌 그린을 포집하거나, 폴리머, 인지질 및 칼슘 포스페이트로 구성된 마이셀 등을 이용하여, 인도사이아닌 그린의 in vivo 및 in vitro에서의 안정성을 증가시킨 연구가 있어왔다 (A.K. Kirchherr et al., Mol Pharm. 6:480, 2009, V.B. Rodriguez et al., J Biomed Opt. 13:14, 2008; E.I. Altinoglu et al, Nano. 2:2075, 2008).
한편, 퍼플루오르카본(perfluorocarbon)은 현재 분자 이미징 기술에 사용되는 조영제로서 이용되고 있다. 퍼플루오르카본은 발암, 돌연변이 및 기형발생 등 부작용을 발생하지 않고, 생체내 존재하지 않는 원소를 이용하여 이미징 조영제로 이용함으로써 낮은 배경을 가져 높은 해상도를 가지며, 우수한 퍼짐성과 높은 기체 용해성, 윤활제 성질과 물과 가까운 자화율(magnetic susceptibility)를 가질 뿐만 아니라, 생체내 면역반응이 일어나지 않는 등 생리학적으로 비활성이고 생체 적합성이 높은 것으로 알려져 있기 때문에, 특히 생체 활성물질을 국소부위에 전달 및 치료목적으로 연구되어 왔다 (Lanza, G. M., et al., Current Topics in Developmental Biology, 70:57, 2005; Ahrens, E. T., et al., Nature Biotechnology, 23:983, 2005; Higucchi, M., Nature Neuroscience, 2005; Krafft, M. P., Advanced Drug Delivery Reviews, 47:209, 2001).
이에 본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, 인도사이아닌 그린(ICG)이 함유된 퍼플루오르카본 기반 나노에멸전을 사용하는 경우 인도사이아닌 그린의 형광강도, 외부광선에 대한 광안전성 그리고 이화학적 안전성이 현저히 향상되어 자기공명영상 (magnetic resonance imaging, MRI) 및 광학 이미징(optical imaging, OI)을 in vivo에서 동시에 수행할 수 있는 다기능성 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 형광특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 지질을 용해시킨 후 인도사이아닌 그린을 첨가하여 인도사이아닌 그린 함유 유화제 수용액을 제조하는 단계; (b) 상기 인도사이아닌 그린 함유 유화제 수용액을 건조시킨 다음, 초음파 처리하여 리포좀 현탁액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 리포좀 현탁액에 퍼플루오르카본을 첨가한 다음, 미세유동화시켜 나노에멀젼을 제조하는 단계를 포함하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되는, 인도사이아닌 그린의 근적외선 광학적 특성과 퍼플루오르카본의 플루오르 기반 자기공명 특성을 동시에 가지는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제공한다.
본 발명에 따르면, 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼은 생체적합성이 매우 뛰어나고, 광학적 특성과 자기공명 특성을 동시에 갖춘 다중모드 분자영상용 조영제로 사용될 수 있으며, 인도사이아닌 그린의 단점인 형광특성과 물리화학적 특성이 크게 개선되어 생물학 및 의료분야 등과 같은 다양한 분야에 활용할 수 있다.
도1은 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 제조방법을 나타낸 모식도이다.
도2는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 TEM 사진을 나타낸 것이다.
도3는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 흡수스펙트럼을 나타낸 것이다.
도4는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 형광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도5는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 19F 핵자기공명 분광스펙트럼을 나타낸 것이다.
도6는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 농도에 따른 형광세기를 나타낸 것이다.
도7는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 온도에 따른 안정성을 나타낸 것이다.
도8는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 외부 빛에 대한안정성을 확인한 결과로서, a)는 환경광(ambient light), b)는 근적외선(NIR)에 대한 안정성을 나타낸 것이다.
도9는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 동물모델에서 형광이미징 결과로서, a)는 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼에 의한 형광이미징, b)는 자유 인도사이아닌 그린에 의한 형광이미징을 나타낸 것이다.
도 10는 본 발명에 따른 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 동물모델에서 자기공명영상으로서, a)는 1H 자기공명을 이용한 이미징, b)는 19F 자기공명 이미징을 나타낸 것이다.
본 발명에서는, 인도사이아닌 그린의 형광특성을 향상시키기 위해 인도사이아닌 그린을 함유하는 리포좀 현탁액에 퍼플루오르카본을 첨가하고 미세유동화하여 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 포스파티딜콜린과 콜레스테롤을 클로로포름에 용해시킨 용액에 인도사이아닌 그린을 다양한 농도로 첨가한 후, 건조시키고 초음파 처리하여 리포좀 현탁액을 제조하였다. 또한 리포좀 현탁액에 퍼플루오르카본을 넣고 미세유동화기(Microfluidizer)로 미세유동화함으로써 상기의 특징을 모두 가지는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하였다.
따라서 본 발명은 일 관점에서, (a) 지질을 용해시킨 후 인도사이아닌 그린을 첨가하여 인도사이아닌 그린 함유 유화제 수용액을 제조하는 단계; (b) 상기 인도사이아닌 그린 함유 유화제 수용액을 건조시킨 다음, 초음파 처리하여 리포좀 현탁액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 리포좀 현탁액에 퍼플루오르카본을 첨가한 다음, 미세유동화시켜 나노에멀젼을 제조하는 단계를 포함하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼은 직경이 50 ~ 300 nm인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 지질은 포스포리피드(phospholipid), 지방산(fatty acid), 라이소리피드(lysolipid), 스핑고미엘린(sphingomyelin), 토코페롤(tocopherol), 글루콜리피드(glucolipid), 스테아릴아르나인(stearylarnine), 카디오리핀(cardiolipin) 및 중합리피드(polymerized lipid)로 구성된 군에서 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤(Cholesterol), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DSPE(1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 및 DOPA(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate)로 구성된 군에서 선택되는 리피드 또는 상기 리피드의 변형체인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 퍼플루오르카본은 티올(thiol), 포스핀(phosphine) 및 포스핀 옥사이드(phosphine oxide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 말단기를 갖는 퍼플루오르계(perfluorochemical), 또는 양쪽친매성 플루오리네이티드 하이드로카본(amphiphilic fluorinated hydrocarbon)인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하고, 퍼플루오리네이티드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated alcohol phosphate ester) 및 이의 염, 퍼플루오리네이티드 설폰아마이드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated sulfonamide alcohol phosphate ester) 및 이의 염, 퍼플루오리네이티드 알킬 설폰아마이드 알킬렌 4차 암모늄염(perfluorinated alkyl sulfonamide alkylene quaternary ammonium salt), N,N-(저급알킬로 치환된 카르복실) 퍼플루오리네이티드 알킬 설폰아마이드(N,N-(carboxyl-substituted lower alkyl) perfluorinated alkyl sulfonamide), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 퍼플루오리네이티드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated alcohol phosphate ester)는 모노(mono) 또는 비스(bis) (1H, 1H, 2H, 2H-퍼클루오르알킬(perfluoroalkyl))포스페이트(phosphate) 유래 디에탄올아민염(diethanolamine salt)의 유리산(free acid)을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 퍼플루오리네이티드 설폰아마이드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated sulfonamide alcohol phosphate ester)는 퍼클루오르-n-옥틸-N-에틸설폰아마이도에틸 포스페이트(perfluoro-n-octyl-Nethysulfonamidoethyl phosphate), 비스(퍼클루오르-n-옥틸-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluoro-n-octyl-N-ethylsulfonamidoethyl) phosphate), 비스(퍼클루오르-n-옥틸-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluoro-n-octyl-N-ethylsulfonamidoethyl)의 암모늄염, 비스(퍼클루오르데실-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluorodecyl-N-ethylsulfonamidoethyl) phosphate) 및 비스(퍼클루오르헥실-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluorohexy-N-ethylsulfonamidoethyl) phosphate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 나노에멀젼을 제조하고, 형광스펙트럼과 19F 핵자기공명 분광스펙트럼을 조사하여 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본이 광학적 특성과 자기공명특성을 동시에 가짐을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 인도사이아닌 그린이 포함된 지질 함유 유화제 수용액에 퍼플루오르카본을 혼합하여 인도사이아닌 그린 보다 형광강도, 광안전성, 열안전성 및 생체적합성이 향상되었음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어“리피드 변형체”란 리피드에 다른 물질을 화학적으로 수식하여 물성을 변화시킨 리피드를 의미한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 상세하게 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인도사이아닌 그린이 함유된 리포좀 현탁액의 제조
70 mol% 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, Egg PC, Avanti Polar Lipids Inc., USA), 20 mol% 콜레스테롤(Sigma-Aldrich Co., USA), 10 mol% DSPE-mPEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)2000], Avanti Polar Lipids Inc., USA)을 클로로포름에 용해 시킨 후, 0 ~ 50μM의 인도사이아닌 그린을 첨가하여 감압장치하에서 클로로포름을 1시간 이상 증발시키고, 클로로포름이 증발된 상기 복합체를 25°C 진공 오븐에서 하루동안 건조시켜 얇은 지질막을 형성시켰다. 상기 막에 멸균된 3차 증류수를 넣은 후 초음파기(Jeiotech, Korea)로 10분간 분산시켜 리포좀 현탁액을 제조하였다.
실시예 2: 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼 제조
실시예 1에서 제조된 2.0% w/v 유화제 수용액, 40% v/v 퍼플루오르카본을 넣은 후, 4분 동안 균질기(homogenizer, Fisher Scientific, USA)로 혼합하였다. 상기 혼합액을 미세유동화기(M-110s Microfluidizer,microfluidics Co., USA)를 사용하여 20000psi로 저온(4℃)에서 4분 동안 현탁시킨 다음, 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 탈염 컬럼(desalting column, GE Healthcare, UK)을 이용하여 잔여 인도사이아닌 그린을 제거하고 4°C 에 냉장보관하였다.
실시예 3: 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 물리적 특성 측정
실시예 2에서 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 1% 포스포텅스틱산(phosphotungstic acid, Sigma-Aldrich, USA)으로 염색을 한 후, 카본 코팅 그리드에 로딩하고 200kV 전계방출 투과전자현미경(field emission transmission electron microscope, JEM-2100F, Jeol Ltd.)을 이용하여 형태를 관찰 하였다. DLS(dynamic light scattering, Otsuka, Japan)을 이용하여 나노에멀젼 크기를 측정한 결과, 나노에멀젼의 직경이 100 ~ 200 nm임을 확인 할 수 있었다 (도 2).
실시예 2에서 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼이 인도사이아닌 그린의 형광특성을 나타내는지 확인하기 위하여 UV-vis 및 형광스펙트럼을 측정하였다. UV-vis 스펙트럼(Beckman Coulter, USA)은 600 ~ 900 nm의 영역에서 측정하였고 형광스펙트럼(PerkinElmer, USA)은 700 ~ 900 nm의 영역에서 측정한 결과 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼이 흡수 파장 800 nm, 발광 파장 825 nm 에서 최고의 세기를 가짐을 확인 하였다 (도 3, 도 4).
또한, 제조된 나노에멀젼의 자기공명 특성을 나타내는지 확인하기 위하여 19F 핵자기공명분광스펙트럼(Bruker, Germany) 분석을 한 결과 도 5와 같이 퍼플루오르카본의 고유한 19F 핵자기공명분광스펙트럼이 나타남을 관찰하여 나노에멀젼 내에 퍼플루오르카본이 내포 되어있음을 확인하였다.
형광분광기(LS55 Fluorescence spectrometer, PerkinElmer, USA)를 사용하여 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼의 형광 세기를 측정하였다. 대조군으로서 자유 인도사이아닌 그린을 사용하였으며, 인도사이아닌-퍼플루오르카본 나노에멀젼이 모든 농도 범위에서 동일 농도의 자유 인도사이아닌 그린보다 2배 이상 형광세기가 향상되는 것을 확인(도 6) 하였고, 특히 약 7μM 농도에서 형광의 강도가 최대에 이르는 것을 관찰 하였다.
실시예 4: 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 안정성 확인
실시예 2에서 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼의 온도에 따른 안정성을 측정하기 위해 4°C, 25°C, 37°C에서 90일까지 형광세기를 측정하였고, 대조군으로서 동일농도의 자유 인도사이아닌 그린을 사용하여 동일조건으로 동시에 측정하였다. 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼의 형광세기는 90일 후 25°C와 37°C에서 각각 초기 형광세기 대비 74.6%와 58.9%로 감소되었고, 4°C에서는 거의 감소 없이 유지되어 충분한 강도의 형광 검출이 가능하였다 (도 7). 그러나 자유 인도사이아닌 그린은 10일 이내에 모든 온도범위에서 형광 방출능력이 사라져 90일 후 매우 미약한 형광 방출능력을 보였다.
또한, 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼의 외부광에 대한 안정성을 측정하기 위해 가시광선의 환경광과 근적외선을 이용하여 측정하였다. 가시광선의 환경광은 144시간, 근적외선(여기파장 780 nm LED lamp, 9V)은 2시간까지 각각 측정하였다. 비교군으로서 동일농도의 자유 인도사이아닌 그린을 사용하여 동일조건으로 동시에 측정하였다. 자유 인도사이아닌 그린의 형광세기는 외부광 조사시 급격히 감소되는 반면 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼의 형광세기는 일정하게 유지되었다(도 8). 즉, 나노에멀젼 상태일 때 자유 상태일때보다 형광의 안정성이 크게 개선되는 것을 확인하였다.
실시예 5: 인도사이아닌 그린이 함유된 퍼플루오르카본 나노에멀젼의 동물모델에서의 형광 및 자기공명영상 측정
생체 내 형광이미징 및 자기공명영상 측정을 위해, 실시예 2에서 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 마취된 5 ~ 6주령 암컷 헤어리스 마우스 (Hoshino Laboratory Animals, Japan)의 앞발바닥에 피하 주입하였다. 비교군으로서 동일농도의 자유 인도사이아닌 그린을 동일조건으로 마취된 5 ~ 6주령 암컷 헤어리스 마우스에 주입하였다. 센티넬 림프노드의 생체 내 형광 이미징을 위해 인도사이아닌 그린 필터셋으로 IVIS Lumina imaging system (CaliperLife Science, USA)을 사용하여 측정하였다. 자유 인도사이아닌 그린은 6시간 내에 림프노드에서 형광이 사라져 관찰이 어려운 반면, 제조된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼은 72시간까지 형광이 유지되는 것을 확인(도 9) 하였다. 또한, 4.7T MRI Scanner (Bruker, Germany)를 이용하여 생체 내 19F 자기공명영상을 관찰한 결과 근적외선 영역에서 관찰되었던 부위와 동일한 위치에서 자기공명 신호를 검출할 수 있었다(도 10).
따라서, 본 발명에 따라 제조된 실시예 2의 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼은 형광특성 및 자성특성을 동시에 나타낼 뿐만 아니라, 인도사이아닌 그린의 형광 특성과 물리화학적 안정성을 크게 개선되었음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의한 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의 된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법:
    (a) 지질을 용해시킨 후 인도사이아닌 그린을 첨가하여 인도사이아닌 그린 함유 유화제 수용액을 제조하는 단계;
    (b) 상기 인도사이아닌 그린 함유 유화제 수용액을 건조시킨 다음, 초음파 처리하여 리포좀 현탁액을 제조하는 단계;
    (c) 상기 리포좀 현탁액에 퍼플루오르카본을 첨가한 다음, 미세유동화시켜 나노에멀젼을 제조하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계 이후에 탈염하여 잔여 인도사이아닌 그린을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 나노에멀젼은 직경이 50 ~ 300 nm인 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 지질은 포스포리피드(phospholipid), 지방산(fatty acid), 라이소리피드(lysolipid), 스핑고미엘린(sphingomyelin), 토코페롤(tocopherol), 글루콜리피드(glucolipid), 스테아릴아르나인(stearylarnine), 카디오리핀(cardiolipin) 및 중합리피드(polymerized lipid)로 구성된 군에서 하나 이상을 함유하는 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 지질은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤(Cholesterol), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOTAP(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane), DSPE(1,2-dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine) 및 DOPA( 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate)로 구성된 군에서 선택되는 리피드 또는 상기 리피드의 변형체인 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 퍼플루오르카본은 티올(thiol), 포스핀(phosphine) 및 포스핀 옥사이드(phosphine oxide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 말단기를 갖는 퍼플루오르계(perfluorochemical), 또는 양쪽친매성 플루오리네이티드 하이드로카본(amphiphilic fluorinated hydrocarbon)인 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 퍼플루오르카본은 퍼플루오리네이티드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated alcohol phosphate ester) 및 이의 염, 퍼플루오리네이티드 설폰아마이드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated sulfonamide alcohol phosphate ester) 및 이의 염, 퍼플루오리네이티드 알킬 설폰아마이드 알킬렌 4차 암모늄염(perfluorinated alkyl sulfonamide alkylene quaternary ammonium salt), N,N-(저급알킬로 치환된 카르복실) 퍼플루오리네이티드 알킬 설폰아마이드(N,N-(carboxyl-substituted lower alkyl) perfluorinated alkyl sulfonamide), 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 퍼플루오리네이티드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated alcohol phosphate ester)는 모노(mono) 또는 비스(bis) (1H, 1H, 2H, 2H-퍼클루오르알킬(perfluoroalkyl))포스페이트(phosphate) 유래 디에탄올아민염(diethanolamine salt)의 유리산(free acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 퍼플루오리네이티드 설폰아마이드 알콜 포스페이트 에스테르(perfluorinated sulfonamide alcohol phosphate ester)는 퍼클루오르-n-옥틸-N-에틸설폰아마이도에틸 포스페이트(perfluoro-n-octyl-Nethysulfonamidoethyl phosphate), 비스(퍼클루오르-n-옥틸-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluoro-n-octyl-N-ethylsulfonamidoethyl) phosphate), 비스(퍼클루오르-n-옥틸-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluoro-n-octyl-N-ethylsulfonamidoethyl)의 암모늄염, 비스(퍼클루오르데실-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluorodecyl-N-ethylsulfonamidoethyl) phosphate) 및 비스(퍼클루오르헥실-N-에틸설폰아마이도에틸) 포스페이트(bis(perfluorohexy-N-ethylsulfonamidoethyl) phosphate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼을 제조하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 인도사이아닌 그린과 퍼플루오르카본이 지질 리포좀에 포집되어 있어 인도사이아닌 그린의 근적외선 광학적 특성과 퍼플루오르카본의 플루오르 기반 자기공명특성을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼.
KR1020130071184A 2013-06-20 2013-06-20 형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법 KR20140147605A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130071184A KR20140147605A (ko) 2013-06-20 2013-06-20 형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130071184A KR20140147605A (ko) 2013-06-20 2013-06-20 형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140147605A true KR20140147605A (ko) 2014-12-30

Family

ID=52676348

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130071184A KR20140147605A (ko) 2013-06-20 2013-06-20 형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20140147605A (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017115991A1 (ko) * 2015-12-31 2017-07-06 한국과학기술원 항암제-인도시아닌 그린-리포좀 복합체를 포함하는 암 치료용 조성물
CN108379600A (zh) * 2018-02-26 2018-08-10 重庆医科大学 一种载氧液态氟碳的多功能造影剂及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017115991A1 (ko) * 2015-12-31 2017-07-06 한국과학기술원 항암제-인도시아닌 그린-리포좀 복합체를 포함하는 암 치료용 조성물
CN108379600A (zh) * 2018-02-26 2018-08-10 重庆医科大学 一种载氧液态氟碳的多功能造影剂及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Beziere et al. Dynamic imaging of PEGylated indocyanine green (ICG) liposomes within the tumor microenvironment using multi-spectral optoacoustic tomography (MSOT)
Ren et al. An NIR-II/MR dual modal nanoprobe for liver cancer imaging
Jarzyna et al. Iron oxide core oil-in-water emulsions as a multifunctional nanoparticle platform for tumor targeting and imaging
KR102210774B1 (ko) 세미플루오로탄소 화합물을 함유하는 조영제
Goutayer et al. Tumor targeting of functionalized lipid nanoparticles: assessment by in vivo fluorescence imaging
Ding et al. CT/fluorescence dual-modal nanoemulsion platform for investigating atherosclerotic plaques
US9289517B2 (en) Fluorescent emulsion of indocyanine green
Li et al. Delicately designed cancer cell membrane-camouflaged nanoparticles for targeted 19F MR/PA/FL imaging-guided photothermal therapy
US9072775B2 (en) Fluorescent emulsions for optical imaging
JP5642676B2 (ja) ナノ結晶のナノエマルション
US9132203B2 (en) Complex and contrast agent for photoimaging using the same
CN113713124A (zh) 脂质纳米颗粒在淋巴系统成像中的应用
Lin et al. Facile phase transfer of hydrophobic Fe 3 O 4@ Cu 2− x S nanoparticles by red blood cell membrane for MRI and phototherapy in the second near-infrared window
JP2014129318A (ja) インドシアニングリーン含有粒子、およびそれを有する光音響イメージング用造影剤
Fernandes et al. Multifunctional nanoparticles as theranostic agents for therapy and imaging of breast cancer
Gao et al. Near-infrared dye-loaded magnetic nanoparticles as photoacoustic contrast agent for enhanced tumor imaging
Bell et al. Functionalised iron oxide nanoparticles for multimodal optoacoustic and magnetic resonance imaging
Doan et al. The influence of Gd-DOTA conjugating ratios to PLGA-PEG micelles encapsulated IR-1061 on bimodal over-1000 nm near-infrared fluorescence and magnetic resonance imaging
Navarro et al. Cell tolerability and biodistribution in mice of indocyanine green-loaded lipid nanoparticles
Wang et al. cRGD-conjugated magnetic-fluorescent liposomes for targeted dual-modality imaging of bone metastasis from prostate cancer
KR20140147605A (ko) 형광 특성이 향상된 인도사이아닌 그린-퍼플루오르카본 나노에멀젼 및 그 제조방법
TWI703986B (zh) 新穎組成物及其用途
Key et al. Dual-modality in vivo imaging for MRI detection of tumors and NIRF-guided surgery using multi-component nanoparticles
Mendez et al. Short-Wave Infrared Emitting Nanocomposites for Fluorescence-Guided Surgery
Chen et al. Size-dependent biodistribution of iodinated oil nanoemulsions observed by dual-modal imaging in rats

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination