KR20140145789A - 호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 호흡기 감염균 검출 방법 - Google Patents

호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 호흡기 감염균 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 호흡기 감염균 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 호흡기 감염균 검출 방법은 예비 증폭에 의하여 혼성화 시간을 감소시켜 종래 방법보다 더 효율적으로 호흡기 감염균에 대해 정확한 다중 검출이 가능하다.

Description

호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 호흡기 감염균 검출 방법 {probes for detecting respiratory tract infectious pathogens, and a method for detecting respiratory tract infectious pathogen using the same}
본 발명은 호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 호흡기 감염균 검출 방법에 관한 것이다.
호흡기 감염의 경우, 전 세계적으로 죽음의 주요 원인 중 하나로 알려져 있다. 2010년 보고에 의하면, 2002년의 경우 호흡기 감염으로 인한 2002년 사망자가 전 세계의 약 7%, 4백만 명에 이르는 것으로 알려져 있다. 그렇기에 넓은 범위의 호흡기 감염균을 빠르게 검출할 수 있는 방법이 필요하다.
주요 호흡기 감염균들로는 Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Klebsiellapneumoniae (　
Figure pat00001
Figure pat00002
　2012, Vol. 14
Figure pat00003
Issue (12): 898-902), Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa , methicillin - resistant S. aureus (J Infect Dev Ctries. 2013 Apr 17;7(4):312-7. doi: 10.3855/jidc.2604), Streptococcus pneumoniae (J Zoo Wildl Med. 2013 Mar;44(1):105-15) 등이 존재한다.
호흡기 감염균을 검출하기 위해서 불필요한 처방 또는 항생제 투여를 방지하기 위해 빠르고 민감한 검출을 할 수 있는 것이 중요하다. 하지만 기존의 호흡기 감염균 검출방법의 경우, 검출까지 수 일이 소요되거나 또는 감염균들을 검출하지 못하는 경우가 있기에 빠른 치료를 위한 진단에는 적합하지 않다는 단점을 지닌다. 이러한 방법을 대신하기 위해, PCR을 사용하는 분자 생물학적 진단방법이 널리 이용되게 있다. 특히 다양한 호흡기 감염균을 동시에 검출하기 위한 다중 증폭 (multiplex PCR)을 사용하는 방법이 사용되고 있다. 하지만 이러한 다중검출의 경우, 여러 종류의 프라이머 세트 (primer sets)가 genomic DNA 에 붙어 비특이적 혼성화를 형성하여 검출하려고 하는 증폭산물 외의 다른 산물들을 증폭시켜 결과 분석에 오류를 나타낼 수 있다.
MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification)는 DNA의 특정 염기서열만을 검출하는 방법으로 유전자 발현, CNV(copy number variation)의 검출 및 분석 등의 실험에 사용되어 왔다. 또한, 이러한 MLPA 실험은 한번의 실험으로 다중검출이 가능하다는 장점을 가지기 때문에 새로운 병원균 검출방법으로도 제안된 바 있다.
MLPA에 있어서는 타겟 시료에 혼성 결합하는 서열과 프라이머 서열을 포함하는 2개의 프로브를 사용한다. 상기 2개의 프로브가 각각 타겟 유전자와 혼성 결합하고, 혼성 결합된 2개의 프로브 사이가 라이게이션(ligation)되어 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성하여야만 이후 증폭 반응에 있어서 2개의 프로브 각각이 포함하는 프라이머에 의해 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 한 증폭 반응이 가능해진다. 따라서, 프로브가 타겟 유전자에 혼성 결합되고 라이게이션(ligation)되어 얻어진 프로브 어셈블리(probe assembly)의 양에 따라 증폭량 및 이에 대한 검출량이 달라지게 되므로 특정 유전자를 검출할 수 있게 되는 것이다. 기존의 MLPA의 경우 CE(capillary electrophoresis)를 사용하여 검출하기 때문에, 검출을 위한 프로브 디자인(probe design) 과정에서 길이의 차이를 가질 수 있도록 디자인한 스터퍼 서열(stuffer sequence)가 존재한다. 스터퍼 서열(stuffer sequence)이란 단순히 길이의 차이를 가질 수 있도록 디자인된 서열로써, 다른 프로브의 혼성화 서열 (hybridization sequence), 다른 프로브의 스터퍼 서열(stuffer sequence) 또는 DNA의 다른 염기서열과 결합(binding)을 하지 않는 염기서열이다. 하지만 이 스터퍼 서열(stuffer sequence)의 경우 위에서 설명한 바와 같이 다른 염기서열과 어떠한 상호작용도 없어야 하기 때문에 그 디자인 자체가 매우 어렵다는 단점을 가진다. 또한 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 위한 염기서열을 디자인하더라도 최대 400nt정도의 길이를 가지는 스터퍼 서열(stuffer sequence)로 인해 프로브 간의 길이 차이가 증가하게 되고, 이로 인하여 전체 산물의 증폭효율이 달라져 정확한 검출이 어렵다는 단점을 가지게 된다.
이러한 단점을 해결하기 위해 본 발명에서는 스터퍼 서열(stuffer sequence)이 없는 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA를 사용함으로써 프로브의 디자인 과정이 쉽고, 일정한 증폭효율을 가지게 됨으로써 정확한 검출이 가능하게 된다는 장점을 가지게 된다.
길이의 차이가 없는 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA의 프로브를 검출하기 위해 본 발명에서는 CE-SSCP(capillary electrophoresis single strand conformation polymorphism)을 적용하여 길이의 차이가 아닌 염기서열의 차이를 사용하여 프로브 검출을 수행한다.
스터퍼 프리(stuffer free) MLPA-CE-SSCP 방법으로 균주를 검출하는 과정을 도 1에 개략적으로 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이 MLPA 방법은 샘플을 변성(denaturation)시키고, 타겟 유전자에 2개의 프로브를 혼성 결합시키는 단계, 상기 2개의 프로브를 라이게이션(ligation)시키는 단계, 라이게이션(ligation)된 프로브를 PCR 증폭시키는 단계 및 증폭 산물을 검출하는 단계로 구성된다.
이와 같이 CE-SSCP를 사용한 분리 방법은 기존의 MLPA의 검출방법과는 상이한 방법으로, 각 프로브의 단일염기서열이 비변성 (non-denaturing) 조건에서 가지게 되는 3차원 구조의 차이에 의해 CE안에서 검출되는 방법으로 이 3차원 구조는 염기서열의 차이에 의해 결정되기 때문에 염기서열에 따른 분리검출 방법이라 할 수 있다.
하지만 종래 이러한 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA의 경우, 새로운 타겟에 대해 프로브의 디자인이 상대적으로 간편하며 정확한 다중 검출이 가능하다는 장점을 가지나, 검출을 위해서는 16 시간 이상의 혼성화 시간이 필요하기 때문에 전체적인 검출시간이 길어진다는 단점을 가지고 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 MLPA 방법에 의하여 호흡기 감염균 검출을 수행하기 위한 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 가지지 않는 스터퍼 프리(stuffer free) 호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 상기 호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트를 이용하여 혼성화 시간을 단축 시키면서도 높은 효율로 호흡기 감염균을 검출할 수 있는 호흡기 감염균 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여
정방향 프라이머 결합 영역, 및 표적 서열의 제 1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS(left hybridization sequence) 영역을 포함하는 LPO(left probe oligonucleotide); 및
상기 표적 서열의 상기 제 1 영역과 연속으로 연결된 제 2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS(right hybridization sequence) 및 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 RPO(right probe oligonucleotide);로 구성되고,
상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 서열 변호 1 및 서열 번호 2 인 제 1 프로브, 서열번호 3 및 서열번호 4 인 제 2 프로브, 서열번호 5 및 서열번호 6 인 제 3 프로브, 서열번호 7 및 서열번호 8 인 제 4 프로브, 서열번호 9 및 서열번호 10 인 제 5 프로브, 서열번호 11 및 서열번호 12 인 제 6 프로브, 서열번호 13 및 서열번호 14 인 제 7 프로브로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인 호흡기 감염균 검출용 프로브를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열 변호 1 및 서열 번호 2 인 제 1 프로브는 대장균(Escherichia coli ) 의 유전자 malB 의 서열 번호 15 에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 3 및 서열번호 4 인 제 2 프로브는 Streptococcus pneumoniae 의 유전자 Pneumolysin 의 서열 번호 16 에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 5 및 서열번호 6 인 제 3 프로브는 Acinetobacterbaumannii 의 유전자 BlaOXA 51 - like 의 서열 번호 17 에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 7 및 서열번호 8 인 제 4 프로브는 Methicillin -resistance Staphylococcus aureus 의 유전자 mecA 의 서열 번호 18 에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 9 및 서열번호 10 인 제 5 프로브는 Staphylococcus aureus 의 유전자 nuc 의 서열 번호 19 에 특이적으로 혼성 결합하고
상기 서열번호 11 및 서열번호 12 인 제 6 프로브는 Klebsiellapneumoniae 의 유전자 phoE 의 서열 번호 20 에 특이적으로 혼성 결합하고,
상기 서열번호 13 및 서열번호 14 인 제 7 프로브는 Pseudomonas aeruginosa 의 유전자 efcX 의 서열 번호 21 에 특이적으로 혼성 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브를 2 개 내지 7 개 포함하는 호흡기 감염균 검출용 프로브 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브, 또는 본 발명에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브 세트를 포함하는 호흡기 감염균 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 하기 단계를 포함하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
(1) 시료를 예비 증폭 시키는 단계;
(2) 예비 증폭된 시료를 제 1항의 호흡기 감염균 프로브와 접촉시켜 혼성화시키는 단계;
(3) 상기 시료와 혼성화된 프로브를 라이게이션(ligation)하여 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성시키는 단계;
(4)상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 PCR 증폭시키는 단계;
(5) 상기 증폭 산물을 분리 및 검출하는 단계; 및
(6) 상기 증폭 산물이 분리, 검출되는 경우 상기 시료 내에 상기 증폭된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 프로브가 상보적으로 결합하는 호흡기 감염균이 존재하는 것으로 판단하는 단계
본 발명에 있어서, 상기 시료를 예비 증폭시키는 제 1 단계에서는 제 1 프라이머 세트 내지 제 7 프라이머 세트를 이용하여 시료 내의 균주의 표적 서열의 제 1 영역 및 상기 제 1 영역과 연속으로 연결된 제 2 영역을 증폭시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열 변호 22 및 서열 번호 23 인 제 1 프라이머 세트는 대장균(Escherichia coli)의 유전자 malB 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 24 및 서열번호 25 인 제 2 프라이머 세트는 Streptococcus pneumoniae 의 유전자 Pneumolysin 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 26 및 서열번호 27 인 제 3 프라이머 세트는 Acinetobacterbaumannii 의 유전자 BlaOXA 51 - like 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 28 및 서열번호 29 인 제 4 프라이머 세트는 Methicillin -resistanceStaphylococcus aureus 의 유전자 mecA 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 30 및 서열번호 31 인 제 5 프라이머 세트는 Staphylococcus aureus 의 유전자 nuc 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 32 및 서열번호 33 인 제 6 프라이머 세트는 Klebsiellapneumoniae 의 유전자 phoE 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
상기 서열번호 34 및 서열번호 35 인 제 7 프라이머 세트는 Pseudomonas aeruginosa 의 유전자 efcX 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (2) 단계에서, 상기 시료의 표적 서열 제 1 영역과 상기 LPO 프로브의 LHS 가 혼성화되고, 상기 시료의 표적 서열 제 2 영역과 상기 RPO 프로브의 RHS 가 혼성화되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (2) 단계에서는 2시간 내지 4시간 동안 혼성화 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계에서, 상기 시료의 제 1 영역과 혼성 결합된 LPO 의 LHS 의 말단과 상기 시료의 제 2 영역과 혼성 결합된 RPO 의 RHS 의 말단을 라이게이션(ligation)하여 정방향 프라이머 결합 영역-LHS-RHS-역방향 프라이머 결합 영역으로 구성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (4) 단계에서, 상기 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 LPO(left probe oligonucleotide)가 포함하는 정방향 프라이머 결합 영역, 및 RPO(right probe oligonucleotide)가 포함하는 역방향 프라이머 결합 영역에 상보적으로 결합하는 프라이머 쌍을 사용하여 상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)가 PCR 증폭되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (5) 단계에서, 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 PCR 증폭된 정도를 CE-SSCP(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 이용하여 분리 및 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (2) 단계에서, 본 발명에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브 세트를 사용하여 복수의 호흡기 감염균의 존재를 한번에 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 호흡기 감염균 검출 방법은 호흡김 감염균의 특이적 서열을 예비 증폭함으로써 혼성화 시간을 감소시켜 종래 방법보다 더 효율적으로 호흡기 감염균에 대해 정확한 다중 검출이 가능하다.
도 1은 본 발명에 의한 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명에 의한 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 가지지 않는 호흡기 감염균 검출용 프로브의 구조를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 의한 스터퍼 서열(stuffer sequence)을 가지지 않는 호흡기 감염균 검출용 프로브를 디자인하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의하여 호흡기 감염균 검출용 프로브를 사용하여 MLPA를 수행하고, CE-SSCP를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의하여 호흡기 감염균 검출용 프라이머를 사용하여 예비 증폭을 수행한 후, MLPA 및 CE-SSCP를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 검출 대상이 되는 호흡기 감염균주의 서열 결정
호흡기 감염 균주로 널리 알려진 총 7개의 균주, Escherichia coli , Streptococcus pneumonia , Acinetobacterbaumannii , Methicillin - resistance Staphylococcus aureus , Staphylococcus aureus , Klebsiellapneumonia , Pseudomonas aeruginosa에 대하여 문헌 조사를 통해 각 균주 유전자의 검출에 사용되는 종 특이적 유전자 또는 서열을 선정하였다.
각 균주 유전자 검출에 사용되는 유전자와 염기서열의 확보 후 NCBI blast(basic local alignment search tool)를 사용하여 각각의 균주의 DNA 서열의 데이터베이스와 비교한 후 특이적 염기서열을 결정하였다.
각 균주가 공통으로 포함하는 서열 부분을 프로브가 특이적으로 혼성화하는 부분으로 결정하였다. 그 결과는 아래 표 1과 같다. 각 균주의 서열 부분은 LHS (left hybridization sequence)가 특이적으로 혼성화하는 표적 서열의 제 1 영역과 이와 연속으로 연결되는 RHS(right hybridization sequence)가 특이적으로 혼성화하는 표적 서열의 제 2 영역의 결합이다.
Species 혼성화 서열(Hybridization sequence) 서열번호
Escherichia coli GTTGTAGTGCTTTAAGGAATGTACTGGAGCCAAATCAAGTGTCTTCGGCA CAAGAGTAG 15
Streptococcus pneumoniae CCAGTTATTACAGGGTCGATCTTACGTCATACTTTTTTATTGCCGAGTGT CGTACCTTGTTGA 16
Acinetobacterbaumannii GGACGAAGCTGGAAGTTTTACGAATTACGAAACTAGCCGGAACTCGTGGT ATTCCGTTG 17
Methicillin - resistance
Staphylococcus aureus 		CCGAGTCCATGACGATAGGTGGGAGTTTGTCCACTTAATAATCGTGAACA TTCGTGTGG 18
Staphylococcus aureus GTAGGATTTTTTCCACATCTCTTTATACCAGGACTTCGTTCACGTAAATG CTTTTTCTACCA 19
Klebsiellapneumoniae CTACCGGACCTAGACTGGGACGTCATGGTCCCATTTTTGCTTCCGGCACT TCGCTTCTTTGTC 20
Pseudomonas aeruginosa GAAAGCGGGTCACCGACTTTACCGGCCCGGCCGTTAGCCAGCTCGTCGGC GCGCGTAAA 21
< 실시예 2> 균주 검출용 프로브 디자인
상기 실시예 1에서 결정된 특이적 서열을 기반으로 호흡기 감염균 검출용 프로브를 디자인하였다. 상기 선정된 유전자 또는 서열의 특이성(uniqueness)을 BLAST로 확인한 후, 상기 확인한 유전자 또는 서열 안에 라이게이션 자리(ligation site)가 들어갈 수 있도록 LHS(left hybridization sequence) 와 RHS(right hybridization sequence) 서열을 디자인하였다.
상기 LHS 와 RHS의 서열 길이는 각각 21nt~50nt가 되고, LHS 와 RHS의 Tm 을 각각 70~80 ℃ 및 GC 함량은 35~65 %가 되도록 디자인 하였다. 이와 같이 디자인된 LHS 와 RHS 서열의 특이성을 FASTA 또는 BLAST로 확인하였다.
상기 확인된 LHS, RHS의 모든 서열의 상동성을 비교하여 alignment score가 50 이하가 되도록 하고, 확인된 alignment score가 50 이하인 LHS, RHS에 공통 프라이머 결합 서열(common primer binding sequence)을 더하여 LHO(left hybridization oligonucleotide), RHO(right hybridization oligonucleotide)를 만들고 각각의 LHO, RHO의 DG값이 0 이상이 되도록 하여 호흡기 감염균 검출용 프로브를 완성하였다. 완성된 호흡기 감염균 검출용 프로브 다음 표 2와 같다.
Species Gene Position 프로브 서열 서열목록
Escherichia coli
malB LHS CAACATCACGAAATTCCTTACATGACCTCG 1
RHS GTTTAGTTCACAGAAGCCGTGTTCTCATC 2
Streptococcus pneumoniae Pneumolysin LHS GGTCAATAATGTCCCAGCTAGAATGCAGTATGAAA 3
RHS AAATAACGGCTCACAGCATGGAACAACT 4
Acinetobacterbaumannii BlaOXA 51 - like LHS CCTGCTTCGACCTTCAAAATGCTTAATGCTTTG 5
RHS ATCGGCCTTGAGCACCATAAGGCAAC 6
Methicillin - resistance
Staphylococcus aureus 		mecA LHS GGCTCAGGTACTGCTATCCACCCTCAA 7
RHS ACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAGCACACC 8
Staphylococcus aureus nuc LHS CATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCT 9
RHS GAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAGATGGT 10
Klebsiellapneumoniae phoE LHS GATGGCCTGGATCTGACCCTGCAGTACCAG 11
RHS GGTAAAAACGAAGGCCGTGAAGCGAAGAAACAG 12
Pseudomonas aeruginosa efcX LHS CTTTCGCCCAGTGGCTGAAATGGCCGGGC 13
RHS CGGCAATCGGTCGAGCAGCCGCGCGCATTT 14
< 실시예 3> 호흡기 감염균 검출용 프로브를 이용한 검출 실험
< 실시예 3-1> 균주의 DNA 시료 제작
여의도 성모병원에서 객담 배양 검사로 동정된 Methicillin - resistant Staphylococcus aureus ( MRSA ), Methicillin - susceptible Staphylococcus aureus(MSSA), Escherichia coli , Klepsiellapneumoniae , Streptococcus pneumonia, Pseudomonas aeruginosa , Acinetobacterbaumannii 를 호흡기 감염균으로 선정 하였다.
MRSA , MSSA , E. coli , K. pneumoniae , S. pneumoniae는 VITEK 2 system (bioMerieux, Durham, NC, USA)으로 동정하였으며, S. pneumoniae와 A. baumannii는 Microscan walkaway 96 SI system (Dade Behring, Sacramento, CA, USA)으로 동정하였다. S. aureus의 methicillin 에 대한 감수성 판정은 Vitek 2 system의 약물 감수성 검사 결과를 이용하였다.
각 균의 동정 후, S. pneumonia를 제외한 6 종의 균주는 nutrient broth에서, S. pneumonia 의 경우 5% sheep blood 가 포함된 trypticase soy agar에서 배양 후 GeneAll Cell SV kit (GeneAll biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.
< 실시예 3-2> MLPA 수행
MLPA는 MRC-Holland(www.MLPA.com)에서 Lig-5a kit 를 사용하였다.
상기 환자로부터 분리된 각각의 균주 gDNA 5ml 의 시료에 대하여 95℃에서 5분간 변성(denature)시킨 후 MLPA 버퍼(MRC Holland, Netherland) 1.5 ml, 호흡기 감염균 검출용 프로브 1.5 ml를 넣고 60℃ 에서 16시간 동안 반응 시켜서 상기 시료의 표적 서열과 LHO, RHO 2개의 프로브를 혼성화시켰다.
16시간 동안 혼성화 후 시료의 반응온도를 54℃로 낮춘 후 Ligase 65 1ml, Ligase-65 버퍼 A, B를 각각 3ml, 3차 증류수 25ml를 넣은 후 54℃에서 15분간 반응시킴으로써 혼성 결합된 LHO, RHO 2개의 프로브를 라이게이션(ligation)시켜 프로브 어셈블리(probe assembly)가 형성되도록 하였다. 이후, 98℃에서 5분간 효소를 불활성화 시켰다.
상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 LHO, RHO 2개의 프로브가 포함하는 프라이머 결합 영역에 공통 프라이머를 결합시킴으로써 PCR 증폭시켰다. 공통 프라이머는 정방향 프라이머(forward primer)로 GGGTTCCCTAAGGGTTGGA, 역방향 프라이머(reverse primer)로 TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC 를 사용하였다.
형성된 프로브 어셈블리(probe assembly) 2ml와 공통 프라이머인 정방향 프라이머 10mM, 역방향 프라이머 10mM에 3차 증류수를 사용하여 20ml로 조절한 혼합액을 pfu-PCR premix (Bioneer, Daejoen, Korea)를 사용하여 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 35회 수행하여 라이게이션(ligation) 된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 증폭시켰다
< 실시예 3-3> 증폭산물의 CE - SSCP 를 통한 검출
얻어진 스터퍼 프리(suffer free) MLPA 산물을 3차 증류수를 사용하여 희석 후 시료 1ml와 size standard(Applied Biosystem, Foster City, CA) 0.2ml, Hi-Di 8.8 ml를 혼합한 후 95℃에서 5분간 반응시키고 4℃에서 3분 이상 두었다. 이 시료를 Genetic analyzer 3130 xl (Applied Biosystem)를 사용하여 CE-SSCP의 결과를 확인하였다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에서 16시간 혼성화한 경우 호흡기 감염균 검출용 프로브를 개별적으로 사용하여 MLPA를 수행하고, 증폭된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 CE-SSCP를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4에서 본 발명에 따른 호흡기 감염균 검출용 프로브는 각각의 유전자에 대해 단일 피크를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 또한 복수개의 프로브를 사용하는 경우에도 해당 균주를 독립적으로 동시에 검출할 수 있으며 분석할 수 있음을 확인할 수 있다.
< 실시예 4> 예비증폭( preamplification ) 과정을 첨가한 검출 실험
< 실시예 4-1> 예비 증폭( preamplication )의 수행
상기 명시된 종 특이적 염기서열을 포함한 영역을 예비 증폭하기 위하여 유전자 특이적 프라이머를 'primer3(http://frodo.wi.mit.edu/)'를 사용하여 디자인하였으며, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Species Gene Primer Primer sequence 서열목록
Escherichia coli malB Forward TACGGCAACCTCTTTCCATC 22
Reverse CATGCCCTTCTCCCTTTGTA 23
Streptococcus pneumoniae Pneumolysin Forward AGCGGTAAACGATTTGTTGG 24
Reverse GATAGACTTGGCGCCCATAA 25
Acinetobacterbaumannii BlaOXA 51 - like Forward CAAATCACAGCGCTTCAAAA 26
Reverse AACCAACACGCTTCACTTCC 27
Methicillin - resistance
Staphylococcus aureus 		mecA Forward GGCTATCGTGTCACAATCGTT 28
Reverse TGGAACTTGTTGAGCAGAGG 29
Staphylococcus aureus nuc Forward AGCTCAGCAAATGCATCACA 30
Reverse AGCCAAGCCTTGACGAACTA 31
Klebsiellapneumoniae phoE Forward CTACGGCTCCTTCGATTACG 32
Reverse AGCAGGTTCTGATCGTTGGT 33
Pseudomonas aeruginosa efcX Forward CGTCTCGCATGCCTATCAG 34
Reverse AACTTGTGCAGGACGAACG 35
상기 실시예 3에서 준비된 환자로부터 분리된 시료를 Genomic DNA 5 ㎕와 상기 표 3의 합성된 정방향 프라이머(forward primer), 역방향 프라이머(reverse primer)를 각 10 mM 씩 넣고 3차 증류수를 사용하여 10㎕로 조절한 혼합액을 High fidelity DNA polymerase kit (New England Biolabs, DNA using a high-fidelity DNA polymerase kit (New England Biolabs, Ipswich) 를 사용하여 98℃ 10초, 51℃ 30초, 72℃ 60초를 35회 수행하여 프로브 특이적 염기서열을 포함한 영역을 예비 증폭시켰다.
< 실시예 4-2> MLPA 수행
MLPA는 MRC-Holland(www.MLPA.com)에서 Lig-5a kit 를 사용하였다.
상기 예비 증폭된 증폭산물 5ml의 시료에 대하여 95℃에서 5분간 변성(denature)시킨 후 MLPA 버퍼(MRC Holland, Netherland) 1.5ml, 상기 실시예 3에서 제조된 호흡기 감염균 검출용 프로브 혼합액 1.5ml를 넣은 후 60℃에서 상기 시료의 표적 서열과 LHO, RHO 2개의 프로브를 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간으로 혼성화 시간을 달리하면서 혼성화 시켰다.
혼성화 후 시료의 반응 온도를 54℃로 낮춘 후 Ligase 65 1ml, Ligase-65 버퍼 A, B각 3ml, 3차 증류수 25 ml를 넣은 후 54℃에서 15분간 반응시킴으로써 혼성 결합된 LHO, RHO 2개의 프로브를 라이게이션(ligation)시켜 프로브 어셈블리(probe assembly)가 형성되도록 하였다. 이후, 98℃에서 5분간 효소를 불활성화 시켰다.
상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 상기 프로브 어셈블리의 LHO, RHO 영역에 각각 공통 프라이머를 결합시킴으로써 PCR 증폭시켰다. 상기 공통 프라이머는 정방향 프라이머(forward primer)로 GGGTTCCCTAAGGGTTGGA, 역방향 프라이머(reverse primer)로 TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC 를 사용하였고, 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly) 2ml 와 정방향 프라이머 10 mM, 역방향 프라이머 10 mM에 3차 증류수를 사용하여 20ml로 조절한 혼합액을 pfuPCR premix (Bioneer, Daejoen, Korea)를 사용하여 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 35회 수행하여 프로브 어셈블리(probe assembly)를 증폭시켰다.
< 실시예 4-3> 증폭 산물의 CE - SSCP 를 통한 검출
상기 실시예 4-2에서 얻어진 증폭된 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA 산물을 3차 증류수를 사용하여 희석 후 시료 1ml와 size standard 0.2 ml, Hi-Di 8.8ml를 혼합한 후 95℃에서 5분간 반응시키고 4℃에서 3분 이상 두었다. 이 시료를 Genetic analyzer 3130 x l을 사용하여 CE-SSCP의 결과를 확인하였다.
도 5는 상기 표 3에서의 호흡기 감염균 검출용 프라이머를 사용하여 예비 증폭하고, 증폭된 영역에 대하여 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA-CE-SSCP를 수행하여 분석한 결과이다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의하여 예비 증폭 후 스터퍼 프리(stuffer free) MLPA를 수행하였을 때에도 상기 실시예 3에서의 도 4와 같이 7개의 균주의 동시 검출이 가능함을 알 수 있으며, 또한 혼성화 시간이 2시간인 경우에도 7개 균주의 동시 검출이 가능함을 확인할 수 있다.
<110> Pohang University of Science and Technology <120> probes for detecting respiratory tract infectious pathogens, and a method for detecting respiratory tract infectious pathogen using the same <130> DPP-2013-0103 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli malB LHS <400> 1 caacatcacg aaattcctta catgacctcg 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli malB RHS <400> 2 gtttagttca cagaagccgt gttctcatc 29 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus pneumoniae Pneumolysin LHS <400> 3 ggtcaataat gtcccagcta gaatgcagta tgaaa 35 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus pneumoniae Pneumolysin RHS <400> 4 aaataacggc tcacagcatg gaacaact 28 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacterbaumannii BlaOXA51-like LHS <400> 5 cctgcttcga ccttcaaaat gcttaatgct ttg 33 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacterbaumannii BlaOXA51-like RHS <400> 6 atcggccttg agcaccataa ggcaac 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methicillin-resistance mecA LHS <400> 7 ggctcaggta ctgctatcca ccctcaa 27 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methicillin-resistance mecA RHS <400> 8 acaggtgaat tattagcact tgtaagcaca cc 32 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphylococcus aureus nuc LHS <400> 9 catcctaaaa aaggtgtaga gaaatatggt cct 33 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphylococcus aureus nuc RHS <400> 10 gaagcaagtg catttacgaa aaagatggt 29 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiellapneumoniae phoE LHS <400> 11 gatggcctgg atctgaccct gcagtaccag 30 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiellapneumoniae phoE RHS <400> 12 ggtaaaaacg aaggccgtga agcgaagaaa cag 33 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas aeruginosa efcX LHS <400> 13 ctttcgccca gtggctgaaa tggccgggc 29 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas aeruginosa efcX RHS <400> 14 cggcaatcgg tcgagcagcc gcgcgcattt 30 <210> 15 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli <400> 15 gttgtagtgc tttaaggaat gtactggagc caaatcaagt gtcttcggca caagagtag 59 <210> 16 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus pneumoniae <400> 16 ccagttatta cagggtcgat cttacgtcat acttttttat tgccgagtgt cgtaccttgt 60 tga 63 <210> 17 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacterbaumannii <400> 17 ggacgaagct ggaagtttta cgaattacga aactagccgg aactcgtggt attccgttg 59 <210> 18 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methicillin-resistance <400> 18 ccgagtccat gacgataggt gggagtttgt ccacttaata atcgtgaaca ttcgtgtgg 59 <210> 19 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphylococcus aureus <400> 19 gtaggatttt ttccacatct ctttatacca ggacttcgtt cacgtaaatg ctttttctac 60 ca 62 <210> 20 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiellapneumoniae <400> 20 ctaccggacc tagactggga cgtcatggtc ccatttttgc ttccggcact tcgcttcttt 60 gtc 63 <210> 21 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas aeruginosa <400> 21 gaaagcgggt caccgacttt accggcccgg ccgttagcca gctcgtcggc gcgcgtaaa 59 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli malB Forward <400> 22 tacggcaacc tctttccatc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Escherichia coli malB Reverse <400> 23 catgcccttc tccctttgta 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus pneumoniae Pneumolysin Forward <400> 24 agcggtaaac gatttgttgg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus pneumoniae Pneumolysin Reverse <400> 25 gatagacttg gcgcccataa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacterbaumannii BlaOXA51-like Forward <400> 26 caaatcacag cgcttcaaaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acinetobacterbaumannii BlaOXA51-like Reverse <400> 27 aaccaacacg cttcacttcc 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methicillin-resistance mecA Forward <400> 28 ggctatcgtg tcacaatcgt t 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Methicillin-resistance mecA Reverse <400> 29 tggaacttgt tgagcagagg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphylococcus aureus nuc Forward <400> 30 agctcagcaa atgcatcaca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Staphylococcus aureus nuc Reverse <400> 31 agccaagcct tgacgaacta 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiellapneumoniae phoE Forward <400> 32 ctacggctcc ttcgattacg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiellapneumoniae phoE Reverse <400> 33 agcaggttct gatcgttggt 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas aeruginosa efcX Forward <400> 34 cgtctcgcat gcctatcag 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas aeruginosa efcX Revers <400> 35 aacttgtgca ggacgaacg 19

Claims (13)

  1. 정방향 프라이머 결합 영역, 및 표적 서열의 제 1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS(left hybridization sequence) 영역을 포함하는 LPO(left probe oligonucleotide); 및
    상기 표적 서열의 상기 제 1 영역과 연속으로 연결된 제 2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS(right hybridization sequence) 및 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 RPO(right probe oligonucleotide);로 구성되고,
    상기 LHS(left hybridization sequence) 및 상기 RHS(right hybridization sequence)가 서열 변호 1 및 서열 번호 2 인 제 1 프로브, 서열번호 3 및 서열번호 4 인 제 2 프로브, 서열번호 5 및 서열번호 6 인 제 3 프로브, 서열번호 7 및 서열번호 8 인 제 4 프로브, 서열번호 9 및 서열번호 10 인 제 5 프로브, 서열번호 11 및 서열번호 12 인 제 6 프로브, 서열번호 13 및 서열번호 14 인 제 7 프로브로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인 호흡기 감염균 검출용 프로브.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 서열 변호 1 및 서열 번호 2 인 제 1 프로브는 대장균(Escherichia coli) 의 유전자 malB 의 서열 번호 15 에 특이적으로 혼성 결합하고,
    상기 서열번호 3 및 서열번호 4 인 제 2 프로브는 Streptococcus pneumoniae 의 유전자 Pneumolysin 의 서열 번호 16 에 특이적으로 혼성 결합하고,
    상기 서열번호 5 및 서열번호 6 인 제 3 프로브는 Acinetobacterbaumannii 의 유전자 BlaOXA 51 - like 의 서열 번호 17 에 특이적으로 혼성 결합하고,
    상기 서열번호 7 및 서열번호 8 인 제 4 프로브는 Methicillin - resistance Staphylococcus aureus 의 유전자 mecA 의 서열 번호 18 에 특이적으로 혼성 결합하고,
    상기 서열번호 9 및 서열번호 10 인 제 5 프로브는 Staphylococcus aureus 의 유전자 nuc 의 서열 번호 19에 특이적으로 혼성 결합하고,
    상기 서열번호 11 및 서열번호 12 인 제 6 프로브는 Klebsiellapneumoniae 의 유전자 phoE 의 서열 번호 20 에 특이적으로 혼성 결합하고,
    상기 서열번호 13 및 서열번호 14 인 제 7 프로브는 Pseudomonas aeruginosa 의 유전자의 efcX 의 서열 번호 21에 특이적으로 혼성 결합하는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균 검출용 프로브.
  3. 제 1 항에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브를 2개 내지 7개 포함하는 호흡기 감염균 검출용 프로브 세트.
  4. 제 1 항의 호흡기 감염균 검출용 프로브, 또는 제 3 항의 프로브 세트를 포함하는 호흡기 감염균 검출용 키트.
  5. 하기 단계를 포함하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법:
    (1) 시료를 예비 증폭 시키는 단계;
    (2) 예비 증폭된 시료를 제 1 항의 호흡기 감염균 프로브 세트와 접촉시켜 혼성화시키는 단계;
    (3) 상기 시료와 혼성화된 프로브를 라이게이션(ligation)하여 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성시키는 단계;
    (4) 상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 PCR 증폭시키는 단계;
    (5) 상기 증폭 산물을 분리 및 검출하는 단계; 및
    (6) 상기 증폭 산물이 분리, 검출되는 경우 상기 시료 내에 상기 증폭된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 프로브가 상보적으로 결합하는 호흡기 감염균이 존재하는 것으로 판단하는 단계.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 시료를 예비 증폭시키는 단계에서는 제 1 프라이머 세트 내지 제 7 프라이머 세트를 이용하여 시료 내의 균주의 표적 서열의 제 1 영역 및 상기 제 1 영역과 연속으로 연결된 제 2 영역을 증폭시키는 것인 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 서열 변호 22 및 서열 번호 23 인 제 1 프라이머 세트는 대장균(Escherichia coli) 의 유전자 malB 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
    상기 서열번호 24 및 서열번호 25 인 제 2 프라이머 세트는 Streptococcus pneumoniae 의 유전자 Pneumolysin 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
    상기 서열번호 26 및 서열번호 27 인 제 3 프라이머 세트는 Acinetobacterbaumannii 의 유전자 BlaOXA 51 - like 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
    상기 서열번호 28 및 서열번호 29 인 제 4 프라이머 세트는 Methicillin -resistance Staphylococcus aureus 의 유전자 mecA 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
    상기 서열번호 30 및 서열번호 31인 제 5 프라이머 세트는 Staphylococcus aureus 의 유전자 nuc 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
    상기 서열번호 32 및 서열번호 33인 제 6 프라이머 세트는 Klebsiellapneumoniae 의 유전자의 phoE 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하고,
    상기 서열번호 34 및 서열번호 35 인 제 7 프라이머 세트는 Pseudomonas aeruginosa 의 유전자 efcX 의 제 1 영역 및 제 2 영역을 증폭하는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서, 상기 시료의 표적 서열 제 1 영역과 상기 LPO 프로브의 LHS가 혼성화되고, 상기 시료의 표적 서열 제 2 영역과 상기 RPO 프로브의 RHS 가 혼성화되는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서 2시간 내지 4시간 동안 혼성화 되는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서, 상기 시료의 제 1 영역과 혼성 결합된 LPO의 LHS의 말단과 상기 시료의 제 2 영역과 혼성 결합된 RPO의 RHS의 말단을 라이게이션(ligation)하여 정방향 프라이머 결합 영역-LHS-RHS-역방향 프라이머 결합 영역 으로 구성된 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성하는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 (4) 단계에서, 상기 프로브 어셈블리(probe assembly)를 구성하는 LPO(left probe oligonucleotide)가 포함하는 정방향 프라이머 결합 영역, 및 RPO(right probe oligonucleotide)가 포함하는 역방향 프라이머 결합 영역에 상보적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 상기 형성된 프로브 어셈블리(probe assembly)가 PCR 증폭되는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
  12. 제 5 항에 있어서,
    상기 (5) 단계에서, 프로브 어셈블리(probe assembly)를 주형으로 하여 PCR 증폭된 정도를 CE-SSCP(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 이용하여 분리 및 검출하는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
  13. 제 5 항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서, 제 3 항에 의한 호흡기 감염균 검출용 프로브 세트를 사용하여 복수의 호흡기 감염균의 존재를 한번에 검출하는 것을 특징으로 하는 호흡기 감염균의 존재를 검출하는 방법.
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KR101347735B1 (ko) * 2011-11-11 2014-01-07 포항공과대학교 산학협력단 식중독균 검출용 프로브, 프로브 세트 및 이를 이용한 식중독균의 검출방법

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