KR101572041B1

KR101572041B1 - 식중독균 검출용 프로브 조성물

Info

Publication number: KR101572041B1
Application number: KR1020130109987A
Authority: KR
Inventors: 오미화; 박범영; 함준상; 설국환; 김현욱; 정석근; 한기성; 주재웅; 김소영; 장진희; 정규열; 정보람
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-11-27
Also published as: KR20150030565A

Abstract

본 발명은 MLPA-CE-SSCP 기술을 활용하여 종래 식중독균 검출용 프로브보다 개선된 프로브 조성물에 관한 것이다. 각각의 프로브가 검출하고자 하는 식중독균에 대해 하나의 피크만을 나타내는 특이성을 가지는 본 발명에 따른 식중독균 검출용 프로브 조성물을 사용함으로써 복수의 식중독균에 대한 신속·정확 및 효과적인 검출 및 동정이 가능하다.

Description

식중독균 검출용 프로브 조성물{Probe composition for detecting food borne pathogens}

본 발명은 MLPA-CE-SSCP 기술을 활용하여 종래 식중독균 검출용 프로브보다 검출능이 개선된 프로브 조성물 및 상기 식중독균 검출용 프로브 조성물의 용도에 관한 것이다.

식중독은 세계적으로 사람의 건강에 대한 주요 문제 중 하나로 손꼽히고 있으며 이에 따른 식품산업, 공공 건강 기관, 미생물 테러 등 중요 분야에서 식중독균의 빠른 검출에 대한 관심을 가지고 있다. 주요 식중독균들로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 대장균 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 살모넬라(Salmonella spp), 시겔라(Shigella spp), 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus), 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii), 캄필러박터 콜라이(Campylobacter coli), 엔테로로커스(Enterococcus spp.) 등이 존재한다. 이와 같은 식중독균의 검출은 인간의 건강 관리 및 식품산업에서 매우 중시되고 있으며, 특히 식중독 검출에 대하여 빠른 검출과 식중독균의 검출에 대한 민감도가 중요한 요건으로 자리잡고 있다.

기존에 사용되고 있는 생화학적 식중독균 진단 방법의 경우, 정확한 검출이 가능하다는 장점을 가지고 있으나 일반적으로 검출 시 2~3일 정도의 시간이 요구되어 식중독에 대한 빠른 대응이 힘들다는 단점이 있으며, 다중 검출이 어려워 하나의 식중독균에 대하여 각각 실험을 진행해야 하기 때문에 많은 시료를 처리하기 힘들고 또한 원인 식중독균의 검출에 더 많은 시간이 요구된다는 문제점을 가지고 있다.

식중독균의 빠른 다중검출을 위해 핵산기반의 검출방법이 보고되었으며, 이 방법 중 식중독균 DNA의 특정 염기서열을 증폭시켜 검출시키는 PCR(중합연쇄반응)을 일반적으로 사용하고 있다. PCR을 사용하는 경우, 소량의 샘플로도 증폭과정을 거치기 때문에 높은 민감도를 가지며, 빠른 검출이 가능하다는 장점을 가지게 되나, PCR시 사용되는 프라이머의 수가 많아질수록 비특이적 결합으로 인한 문제점이 제기되어 식중독균 다중 검출에 사용되기에는 문제점을 가지고 있다. 또한 균주들 사이에서도 비슷한 속에 속하는 균주들의 경우 DNA의 유사성과 다양성으로 인해 위양성(false positive) 또는 위음성(false negative)의 결과를 나타낼 수 있다는 문제점을 가진다.

최근 들어, cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기술이 병원성 미생물의 분석에 적용되어 왔으며(Burton et al. 2005. Molecular and Cellular Probes. 19: 349-357), 하나의 칩으로 4종의 식중독균을 검출할 수 있는 연구가 보고되었다(Sergeev et al. 2004. Biosensors and Bioelectronics. 20: 684-698). 이러한 기존의 연구들에서 제작된 프로브들은 미생물의 플라젤린(flagelline) 유전자나 독성 유전자(병원성 관련 유전자 포함), 16S rRNA 또는 23S rRNA 서열에서 제작되었다. 그러나 이러한 표적 유전자들은 같은 속의 미생물들 간에 그 서열을 공유하고 있으며, 이는 교차-혼성화(cross-hybridization)의 결과를 초래할 가능성이 높다. 또한, 이러한 연구들은 혼성화 전에 PCR을 수행하는데, 이 방법은 사용 가능한 프로브의 수가 제한적일 수밖에 없으며 이는 다수의 병원균을 검출하는데 무리가 있다(Chizhikov et al. 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3258-3263).

MLPA (Multiplex ligation dependant probe amplification)는 DNA의 특정 염기 서열만을 검출하는 방법으로 유전자 발현, CNV의 검출 및 분석 등의 실험에 사용되어 왔다. 또한 이러한 MLPA 실험은 한 번의 실험으로 다중검출이 가능하다는 장점을 가지기 때문에 새로운 병원균 검출방법으로도 제안된 바 있다. MLPA 방법으로 식중독균을 검출하는 과정은 도 1에 도시되어 있다.

도 1에서 보는 바와 같이 MLPA 방법은 샘플을 변성(denaturation)시키고, 타겟 유전자에 2개의 프로브를 혼성 결합시키는 단계, 상기 2개의 프로브를 라이게이션(ligation) 시키는 단계, 라이게이션된 프로브를 PCR 증폭시키는 단계 및 증폭 산물을 검출하는 단계로 구성된다.

MLPA 에 있어서는 프로브는 타겟 시료에 혼성 결합하는 서열과 프라이머 서열을 포함하는 RHO 프로브, LHO 프로브로 구성된다. 상기 RHO 프로브, LHO 프로브 각각이 타겟 유전자와 혼성 결합하고, 혼성 결합된 상기 RHO 프로브, LHO 프로브 사이가 라이게이션되어 프로브 어셈블리(probe assembly)를 형성하여야만 이후 증폭 반응에 있어서 상기 RHO 프로브, LHO 프로브 각각이 포함하는 프라이머에 의해 프로브 어셈블리를 주형으로 한 증폭 반응이 가능해진다. 따라서, RHO 프로브, LHO 프로브가 타겟 유전자에 혼성 결합되는 정도 및 RHO 프로브, LHO 프로브가 라이게이션되어 프로브 어셈블리가 형성되는 정도에 따라 증폭량 및 이에 대한 검출량이 달라지게 되므로 특정 유전자를 검출할 수 있게 되는 것이다.

그러나, 기존의 MLPA의 경우 PCR 증폭 반응 후 CE(Capillary Electrophoresis)를 사용하여 프로브의 길이 차이로 특정 유전자의 증폭 여부를 검출하기 때문에, 검출을 위한 프로브 디자인 과정에서 각각의 프로브의 길이의 차이를 가질 수 있도록 디자인한 스터퍼 서열(stuffer-sequence)가 존재하였다.

스터퍼 서열(stuffer-sequence)이란 단순히 길이의 차이를 가질 수 있도록 디자인된 서열로써, 다른 프로브의 혼성화 서열(hybridization sequence), 다른 프로브의 스터퍼 서열(stuffer sequence) 또는 DNA의 다른 염기서열과 결합을 하지 않는 염기서열을 말한다.

하지만, 이러한 스터퍼 서열(stuffer sequence)의 경우 위에서 설명한 바와 같이 다른 염기서열과 어떠한 상호 작용도 없어야 하기 때문에 그 디자인 자체가 매우 어렵다는 단점을 가진다. 또한, 스터퍼(stuffer)를 위한 염기 서열을 디자인했다 하더라도 길게는 400 nt 정도의 길이를 가지는 스터퍼 서열(stuffer sequence)로 인해 프로브 간의 길이 차이가 증가하게 되고, 이로 인하여 전체 산물의 증폭 효율이 달라져 정확한 정량 검출이 어렵다는 문제점이 있었다.

종래 기술로는 한국공개특허공보 제2009-0124020호에 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트 및 상기 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이 및 한국공개특허공보 제2004-0055617호에 병원성 미생물 검출을 위한 올리고뉴클레오티드마이크로칩 및 이를 이용한 병원성 미생물 검출방법이 있다.

한국공개특허공보 제2009-0124020호 한국공개특허공보 제2004-0055617호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 MLPA-CE-SSCP 방법에 의하여 13종의 식중독균을 동시에 검출하기 위한, 스터퍼 서열을 가지지 않는 스터퍼-프리 식중독균 검출용 프로브 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 각각의 프로브에 따른 검출 피크가 서로 유사한 위치에서 검출(중첩)되지 않고, 동일한 균주라도 다양한 형태(종 또는 속 수준에서의 차이)를 취하는 균주를 모두 검출할 수 있는 식중독균 검출용 프로브 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따르면 정방향 프라이머 결합 영역 및 표적 서열의 제 1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS (left hybridization sequence) 영역을 포함하는 LHO (left hybridization oligonucleotide) 프로브; 및 상기 표적 서열의 상기 제 1 영역과 연속으로 연결된 제 2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS (right hybridization sequence) 및 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 RHO (right hybridization oligonucleotide) 프로브;로 구성되는 식중독균 검출용 프로브 조성물에 있어서, 상기 LHO (left hybridization oligonucleotide)의 LHS (left hybridization sequence) 및 상기 RHO (right hybridization oligonucleotide)의 RHS (right hybridization sequence)가 각각 서열번호 1 인 LHO 프로브 및 서열번호 2 인 RHO 프로브로 구성되는 제 1 프로브; 서열번호 3 및 서열번호 4 인 제 2 프로브; 서열번호 5 및 서열번호 6 인 제 3 프로브; 서열번호 7 및 서열번호 8 인 제 4 프로브; 서열번호 9 및 서열번호 10 인 제 5 프로브; 서열번호 11 및 서열번호 12 인 제 6 프로브; 서열번호 13 및 서열번호 14 인 제 7 프로브; 서열번호 15 및 서열번호 16 인 제 8 프로브; 서열번호 17 및 서열번호 18 인 제 9 프로브; 서열번호 19 및 서열번호 20인 제 10 프로브; 서열번호 21 및 서열번호 22인 제 11 프로브; 서열번호 23 및 서열번호 24인 제 12 프로브; 및 서열번호 25 및 서열번호 26인 제 13 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 프로브 조성물을 제공할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 LHO (left hybridization oligonucleotide)의 LHS (left hybridization sequence) 및 상기 RHO (right hybridization oligonucleotide)의 RHS (right hybridization sequence)가 각각 서열번호 1 및 서열번호 2 인 상기 제 1 프로브는 E.coli O157:H7의 서열번호 27 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 3 및 서열번호 4 인 상기 제 2 프로브는 Clostridium perfringens 의 서열번호 28 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 5 및 서열번호 6 인 상기 제 3 프로브는 Campylobacter jejuni 의 서열번호 29 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 7 및 서열번호 8 인 상기 제 4 프로브는 Listeria monocytogenes의 서열번호 30 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 9 및 서열번호 10 인 상기 제 5 프로브는 Staphylococcus aureus 의 서열번호 31 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 11 및 서열번호 12 인 상기 제 6 프로브는 Bacillus cereus 의 서열번호 32 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 13 및 서열번호 14 인 상기 제 7 프로브는 Yersinia enterocolitica 의 서열번호 33에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 15 및 서열번호 16 인 상기 제 8 프로브는 Shigella spp. 의 서열번호 34 에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 17 및 서열번호 18 인 상기 제 9 프로브는 Salmonella spp 의 서열번호 35에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 19 및 서열번호 20 인 상기 제 10 프로브는 Cronobacter sakazakii 의 서열번호 36에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 21 및 서열번호 22 인 상기 제 11 프로브는 Campylobacter coli 의 서열번호 37에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 23 및 서열번호 24 인 상기 제 12 프로브는 Vibrio vulnificus 의 서열번호 38에 특이적으로 혼성 결합하고, 서열번호 25 및 서열번호 26 인 상기 제 13 프로브는 Enterococcus spp. 의 서열번호 39에 특이적으로 혼성 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 프로브 조성물을 포함하는 식중독균 검출용 키트를 제공할 수 있다.

각각의 프로브가 검출하고자 하는 식중독균에 대해 하나의 피크만을 나타내는 특이성을 가지는 본 발명에 따른 식중독균 검출용 프로브 조성물을 사용함으로써 복수의 식중독균에 대한 신속·정확 및 효과적인 검출 및 동정이 가능하다.

도 1은 MLPA 방법을 개략적으로 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명에 의한 스터퍼 서열을 가지지 않는 식중독균 검출용 프로브의 구조를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 의한 스터퍼 서열을 가지지 않는 식중독균 검출용 프로브를 디자인하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 식중독균 검출용 프로브를 개별적으로 사용하여 MLPA를 수행하고, CE-SSCP (Capillary Electrophoresis - Single Strand Conformation Polymorphism)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 식중독균 검출용 프로브 조성물을 사용하여 MLPA를 수행하고, CE-SSCP (Capillary Electrophoresis - Single Strand Conformation Polymorphism)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 축산 식품(우유(1), 슬라이스햄(2) 및 분쇄 소고기(3))에 식중독균을 접종한 후 본 발명의 일 실시예에 따른 식중독균 검출용 프로브 조성물을 사용하여 MLPA를 수행하고, CE-SSCP (Capillary Electrophoresis - Single Strand Conformation Polymorphism)를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브" 란 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 개 내지 수 백 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 이후 증폭, 분리 및 검출에 의하여 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 것을 의미한다. 일 실시예에 있어서, 본 발명에서 사용되는 "프로브" 는 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

도 2에는 본 발명에 따른 스터퍼 서열을 가지지 않는 식중독균 검출용 프로브의 구조가 도시되어있다. 도 2에 도시된 바와 같이 본 발명의 식중독균 검출용 프로브는 LHO 프로브와 RHO 프로브로 구성되며, 상기 LHO (left hybridization oligonucleotide)는 표적 서열의 제 1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS (left hybridization sequence) 영역과 그 업스트림(upstream)에 연결된 정방향 프라이머 결합 영역으로 구성되고, 상기 RHO (right hybridization oligonucleotide)는 표적 서열의 시료의 상기 제 1 영역과 연속적으로 연결되는 제 2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS (right hybridization sequence)와 그 다운스트림(downstream)에 연결된 역방향 프라이머 결합 영역으로 구성된다.

이 때, 상기 제 1 영역은 본 발명의 서열목록 27 내지 39로 표현되는 표적 서열에 있어서 LHS가 특이적으로 혼성화하는 일련의 염기서열로 정의될 수 있다. 제 2 영역에 대한 정의 또한 RHS가 특이적으로 혼성화하는 일련의 염기서열로 정의될 수 있으며, 상기 제 1 영역에 연속적으로 연결된 서열로 정의될 수 있다.

이후 단계에서 상기 LHO와 상기 RHO가 라이게이션 됨으로써 프로브 어셈블리가 형성되고, 형성된 프로브 어셈블리를 주형으로 PCR 증폭 시키기 위한 DNA 중합효소가 결합하도록 하기 위해 LHS의 업스트림과 RHS의 다운스트림에 정방향 프라이머 결합 영역과 역방향 프라이머 결합 영역이 포함된다. 상기 정방향 프라이머 결합 영역과 역방향 프라이머 결합 영역은 타겟 서열인 식중독균의 특이적 서열에 결합하지 않도록 디자인되지만, 이에 특별히 제한되는 것은 아니며 일반적으로 PCR 증폭시 사용되는 프라이머를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 LHS (left hybridization sequence)가 특이적으로 혼성화 하는 표적 서열의 제 1 영역 및 상기 RHS (right hybridization sequence)가 특이적으로 혼성화하는 표적 서열의 제 2 영역은 서로 연속적으로 연결된다.

상기 LHS의 LHO (left hybridization oligonucleotide)및 RHS의 RHO (right hybridization oligonucleotide)는 각각 표적 서열의 제 1 혼성화 영역 및 제 2 혼성화 영역에 특이적으로 혼성화하며, 이 때, LHO (left hybridization oligonucleotide) 및 RHO (right hybridization oligonucleotide)가 시료의 정확한 위치에 혼성화가 이루어지면 연결 효소인 라이게이즈(ligase)에 의해 LHO의 말단과 RHO의 말단이 서로 연결되어 정방향 프라이머 결합 영역-LHO-RHO-역방향 프라이머 결합 영역으로 구성되는 프로브 어셈블리(probe assembly)가 형성된다.

이와 같이 프로브 어셈블리가 형성된 이후에는 상기 LHO (left hybridization oligonucleotide) 프로브와 RHO (right hybridization oligonucleotide) 프로브가 각각 포함하고 있던 정방향 프라이머 결합 영역 및 역방향 프라이머 결합 영역에 특이적인 프라이머가 결합되고, 이에 의하여 상기 프로브 어셈블리를 주형으로 하여 증폭되게 된다.

이에 비해 프로브 어셈블리가 형성되지 못하는 경우, 프로브 어셈블리의 증폭이 전혀 불가능하게 되므로 결과적으로 혼성화 정도에 따라 프로브 어셈블리의 증폭되는 정도가 달라지게 되며, 결과적으로 상기 프로브가 특이적으로 혼성화하는 유전자의 검출이 가능하게 된다. 이때 상기 프로브 어셈블리를 주형으로 증폭시키기 위해서는 PCR, MPCR, Real time RT-PCR 등 기술분야에 알려진 방법들을 적용하는 것이 가능하다.

일 실시예에 있어서, 식중독육 검출용 프로브를 제조하기 위해 우선 식중독균인 E.coli O157:H7, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Yersinia enterocolitica, Shigella spp., Salmonella spp, Cronobacter sakazakii, Campylobacter coli, Vibrio vulnificus 및 Enterococcus spp. 의 유전자를 확보하고(미국 국립생물정보 센터 등), 각각의 변종에 있어서 공통되는 부분의 유전자 서열을 확정한다. 이후 이와 같이 식중독균의 유전자 서열 중 프로브 어셈블리의 결합 서열로 결정된 서열을 LHS 와 RHS 로 포함하는 LHO, RHO 프로브로 나누어 디자인하였다. 이때, 일 실시예에 있어서, 스터퍼 서열을 가지지 않는 식중독균 검출용 프로브 LHS, RHS 및 이들이 라이게이션된 프로브 어셈블리를 디자인하기 위해 도 3에 나타난 순서에 따라 하기의 조건을 검토하였다.

① 서열의 길이

프로브 및 프로브 어셈블리의 길이는 필요에 따라 길어질 수 있지만, 길이가 너무 길면 특이성이 증가하는 것이 아니라 잘못된 혼성화의 가능성이 증가하여 이에 따른 프로브의 특이성이 저하될 가능성이 높아진다.

② 결합능

프로브와 표적 서열 사이의 결합능은 프로브 디자인에 가장 기본적인 요소의 하나이다. DNA와 DNA의 특이적 결합은 뉴클레오티드의 A, G, C, T의 특이적 결합에 의한 것으로 필연적으로 A, T 가 많은 프로브의 결합능력은 G, C 가 많은 프로브의 결합능력보다 약하다. DNA는 조건에 따라 특이성이 저하하여 미스매치(mismatch)가 발생하더라도 결합하는 경우(위양성)가 있기 때문에 특이적인 결합능이 중요하다.

올리고뉴클레오티드의 결합능은 일반적으로 Tm (melting temperature)으로 나타낼 수 있다. Tm은 올리고뉴클레오티드와 DNA가 혼성화되어진 것에 열을 가함으로서 혼성화가 해리되어 50% 올리오뉴클레오티드로 혼성화되고 나머지 50%의 DNA가 해리될 때의 온도를 말한다. 따라서 Tm의 조절로 결합능을 설정한다.

③ 이차구조

올리고뉴클레오티드는 프로브 간에 혼성화할 가능성이 크기 때문에 각 서열의

G값을 설정하였다.

④ 특이성

프로브 염기서열의 특이성을 살피기 위해 상동성(homology)을 검색하였으며(NCBI BLAST), 상기 서열 내에 결찰 부위(ligation site)가 포함될 수 있도록 하였다. 또한, 상동성은 유전자 염기서열의 유사도를 살펴보는 것이 목적이므로 상동성과 올리고뉴클레오티드의 결합능에는 차이가 있다. 이 때문에 Tm 값 외에 어라인먼트 스코어(Alignment score)도 설정하였다.

일 실시예에 있어서, 상기 식중독균 검출용 프로브 조성물은 제 1 프로브 내지 제 13 프로브 중 2 종 내지 13 종을 동시에 사용할 수 있다. 이에 따라, 대상이 되는 식중독균에 따라 프로브의 종류를 다양하게 구비할 수 있으며, 프로브의 종류에 따라 다양한 식중독균을 동시에 검출하는 것이 가능하다.

본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 식중독균 검출용 프로브 조성물을 사용하고, MLPA(Mutiplex ligation dependant probe amplification)-CE-SSCP(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)를 이용하여 분리 및 검출하는 식중독균을 검출하는 방법을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 본 발명은 종래의 모세관 전기영동(Capillary Electrophoresis)을 사용하여 분리, 검출하는 방법 대신 단일쇄 형태변환 다형성(Capillary Electrophoresis-Single strand conformation polymorphism)을 이용하여 분리 및 검출하기 때문에 스터퍼(stuffer) 염기서열이 포함되지 않고, 프로브의 길이가 동일하더라도 식중독균 유전자를 검출하는 것이 가능하게 된다.

단일쇄 형태변환 다형성(SSCP)은 DNA 뉴클레오티드 서열의 변화가 단일쇄 DNA의 구조적 접힘의 변화를 일으키고, 전기영동시 이동거리에 차이가 생기는 원리, 즉, DNA를 구성하는 염기들(A,T,C,G)이 전기에 끌려가는 정도가 다름을 이용한다. 방법적으로는 ds-DNA를 고온에서 열변성시키면 변성되어 ss-DNA로 변하게 되며 이를 급냉시키면 초기 상태의 ds-DNA로 돌아가지 못하고 ss-DNA 자체 내에서 염기 배열에 따라 서로 다른 특유의 유전자 입체구조를 형성하게 된다. 이러한 다양한 입체구조를 가진 유전자 조각들을 전기영동을 하게 되면 유전자 구조상의 변화로 인해 서로 다른 이동속도를 가지게 된다. 따라서 비록 같은 길이의 ds-DNA 서열이라 할지라도 다른 유전자 염기를 가지고 있으면 SSCP 방법에 의해 새로운 입체구조를 가진 각기 다른 유전자 조각들이 고분자 혼합젤이 충진된 모세관을 통과하면서 각기 다른 이동속도를 나타내어 염기서열의 판별이 가능하게 되는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 검출 대상이 되는 식중독균의 서열 결정

문헌 조사를 통해 각 식중독균의 유전자의 검출에 사용되는 종 특이적 유전자 또는 서열을 선정하였다. 각 식중독균 유전자 검출에 사용되는 유전자 염기서열의 확보 후 NCBI blast (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 각각의 식중독균의 DNA 서열의 데이터베이스와 비교한 후 특이적 염기서열을 결정하였다.

각 식중독균의 검출하기 위한 프로브의 염기 서열을 결정하기 위하여 고려한 균주들에 대한 출처는 하기의 표 1에 기재되어 있다.

No.	균주	Genebank No.	출처
1	E. coli O157:H7	U32312.1	농촌진흥청/포항공대
2	C. perfringens	CP00246.1	농촌진흥청/포항공대
3	C. jejuni	CP001900.1	농촌진흥청/포항공대
4	L. monocytogenes	FJ030561.1	농촌진흥청/포항공대
5	S. aureus	DQ399678.1	농촌진흥청
6	B. cereus	JN707605.1	농촌진흥청
7	Y. enterocolitica	AM286415.1	농촌진흥청
8	Shigella spp.	M32063.1	농촌진흥청
9	Salmonella spp.	DQ644615.1	농촌진흥청
10	C. sakazakii	L01755.1	농촌진흥청
11	C. coli	AF136494.1	농촌진흥청
12	V. vulnificus	HM195246.1	농촌진흥청
13	Enterococcus spp.	EF680395.1	농촌진흥청

상기의 표 1에 따른 각 식중독균에 대해 국내 및 국외에서 해당 식중독균을 검출하기 위해 사용되고 있는 유전자와 그에 따른 염기서열을 수집, 종합적으로 분석하였다. 그 후 각각의 식중독균에 있어 모든 박테리아 균주들이 공통으로 포함하는 염기서열 부분을 확보하였다. 그리고 그 염기서열을 기반으로 분석하고자 하는 식중독균만 독립적으로 검출할 수 있으며, 해당 식중독균이 아닌 다른 박테리아는 가지지 않는 특이적 염기서열을 확정하고 이 염기서열을 프로브가 혼성화하는 부분으로 결정하였다.

이에 따라 결정된 각 식중독균의 특이적 염기서열은 하기의 표 2에 기재되어 있다.

서열번호	균주	특이서열
27	E. coli O157:H7	TATATCCATAATCATTTTATTTAGAGGGAGGGAGGGGGGAAGTCTAACTAACGTCAATTTTTCAGG
28	C. perfringens	TGGCAAAGAGGAAACTATAAACAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAG
29	C. jejuni	TAAATCTTTATTTTCAACCTGCTGAAGAGGGTTTGGGTGGTGCTAAGGCAATGAT
30	L. monocytogenes	TGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAA
31	S. aureus	CCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAA
32	B. cereus	CCTTCACGAATCATAGCTTGTGCTAATACAGTTGCAGTTGTTGTTCCGTCACCAGCTACGTCATTTG
33	Y. enterocolitica	GCTCATGGAAAGGTTAAGGCATCTGTATTTGATGAATCAATCAGTGCAAGTAAGACGTC
34	Shigella spp.	CTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAAT
35	Salmonella spp.	CGATACGGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGAACAACCCAT
36	C. sakazakii	CTCGTCTGTACTAATTCCTCAGGGGATATTGTCCCCTGAAACAGACAGAGTAGTAGTTGTAGAGGCC
37	C. coli	GAGAGATTGCGGATGAAGTTGGAGCTTATCTTTTTGCAGACATTGCACACATTGCTGGAC
38	V. vulnificus	CTCAGTTTATGGTTCTGCGGGCTCATCAACCAACAGCAGTACCGTGAAACAAC
39	Enterococcus spp.	CGATTTCCCAGGCGATGATGTTCCAGTTATCGCAGGTTCTGCTTTGAAAGCTTTAG

실시예 2. 식중독균 검출용 프로브의 디자인

상기 표 2에 기재된 식중독균의 특이적 서열을 기반으로 식중독균 검출용 프로브를 디자인하였다. 상기 선정된 유전자 또는 서열의 독특성(uniqueness)을 FASTA 또는 BLAST(Basic local alignment search tool)로 확인한 후, 상기 확인한 유전자 또는 서열 안에 라이게이션 자리(ligation site)가 들어갈 수 있도록 LHS 와 RHS 서열을 디자인하였다. 상기 디자인된 LHS 와 RHS의 서열 길이는 각각 21 nt ~ 50 nt가 되도록, 상기 디자인된 서열 길이가 21 nt ~ 50 nt의 LHS 와 RHS의 Tm을 각각 70 ~ 80℃ 및 GC 함량은 35 ~ 65%가 되도록 한 후, 디자인된 LHS 와 RHS 서열의 독특성(uniqueness)을 FASTA 또는 BLAST(Basic local alignment search tool)로 확인하였다.

상기 확인된 LHS 및 RHS의 모든 서열의 상동성(homology)을 비교하여 어라인먼트 스코어(alignment score)가 50 이하가 되도록 하고, 확인된 어라인먼트 스코어가 50 이하인 LHS, RHS에 공통적인 프라이머 서열(common primer sequence)을 더하여 LHO, RHO를 만들고 각각의 LHO, RHO의

G값이 0 이상이 되도록 하여 식중독균 검출용 프로브를 완성하였다.

완성된 식중독균 검출용 프로브 하기의 표 3과 같다. 사용된 공통 프라이머(common primer) 로 LHS 에 결합한 5' 프라이머 결합 부분은 5'-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3', RHS 에 결합한 3' 프라이머 결합 부분은 5'-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3'를 사용하였다.

서열번호	균주	유전자	위치	혼성화 염기서열
1	E. coli O157:H7	eagA	LHS	TATATCCATAATCATTTTATTTAGAGGGAGGGAGGG
2	E. coli O157:H7	eagA	RHS	GGGAAGTCTAACTAACGTCAATTTTTCAGG
3	C. perfringens	plc	LHS	TGGCAAAGAGGAAACTATAAACAAGCTACATTC
4	C. perfringens	plc	RHS	TATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAG
5	C. jejuni	hip	LHS	TAAATCTTTATTTTCAACCTGCTGAAGAGGG
6	C. jejuni	hip	RHS	TTTGGGTGGTGCTAAGGCAATGAT
7	L. monocytogenes	hlv	LHS	TGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTA
8	L. monocytogenes	hlv	RHS	TCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAA
9	S. aureus	nuc	LHS	CCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATG
10	S. aureus	nuc	RHS	GTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAA
11	B. cereus	groEL	LHS	CCTTCACGAATCATAGCTTGTGCTAATACAGTTGC
12	B. cereus	groEL	RHS	AGTTGTTGTTCCGTCACCAGCTACGTCATTTG
13	Y. enterocolitica	16S rRNA	LHS	GCTCATGGAAAGGTTAAGGCATCTGTATT
14	Y. enterocolitica	16S rRNA	RHS	TGATGAATCAATCAGTGCAAGTAAGACGTC
15	Shigella spp.	ipaH	LHS	CTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTT
16	Shigella spp.	ipaH	RHS	CTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAAT
17	Salmonella spp.	inv	LHS	CGATACGGATAATATGGGGCGGAATAT
18	Salmonella spp.	inv	RHS	CATGACGCAGCTGTTGAACAACCCAT
19	C. sakazakii	MMS	LHS	CTCGTCTGTACTAATTCCTCAGGGGATATTGTCC
20	C. sakazakii	MMS	RHS	CCTGAAACAGACAGAGTAGTAGTTGTAGAGGCC
21	C. coli	glyA	LHS	GAGAGATTGCGGATGAAGTTGGAGCTTATCTT
22	C. coli	glyA	RHS	TTTGCAGACATTGCACACATTGCTGGAC
23	V. vulnificus	vvh	LHS	CTCAGTTTATGGTTCTGCGGGCTCAT
24	V. vulnificus	vvh	RHS	CAACCAACAGCAGTACCGTGAAACAAC
25	Enterococcus spp.	tuf	LHS	CGATTTCCCAGGCGATGATGTTCCAGTTAT
26	Enterococcus spp.	tuf	RHS	CGCAGGTTCTGCTTTGAAAGCTTTAG

(1) Staphylococcus aureus는 기존의 연구에서 E. coli O157:H7의 검출 피크와 유사한 위치에서 확인이 되어 동시 검출에 한계가 존재하였다. 이에 따라, 본 출원인은 Staphylococcus aureus의 nuc 유전자의 다른 영역을 타겟으로 함으로써 E. coli O157:H7의 검출피크와 상이한 위치에서 검출 피크가 나타나도록(또는 E. coli O157:H7의 검출피크와 중첩되지 않도록) 프로브를 설계하였다.

(2) Bacillus cereus는 구토형과 설사형의 독소를 생산하는 2종으로 분류가 될 수 있으며, 기존의 연구에 따른 프로브는 구토형만 검출이 가능한 한계를 가지고 있어 설사형의 독소를 생산하는 Bacillus cereus의 검출에 한계가 있었다. 이에 본 출원인은 모든 Bacillus cereus의 검출이 가능하도록 groEL 유전자를 타겟으로 프로브를 설계함으로써 상기의 문제점을 극복하였다.

(3) Yersinia enterocolitica는 인수공통전염병을 일으키는 주요 식중독균이다. 기존의 연구에 따른 프로브는 병원성 Yersinia enterocolitica 중 일부만이 검출 가능하도록 설계되어 있었다. 이에 본 출원인은 모든 Yersinia enterocolitica의 검출이 가능하도록 16S rRNA를 타겟으로 프로브를 설계함으로써 상기의 문제점을 극복하였다.

(4) Shigella는 종수준에서 인간에게 심각한 설사와 같은 식중독을 일으키는 주요 식중독균이다. Shigella는 속수준에서 4종류로 분류가 되는데 기존의 연구에 따른 프로브는 Shigella flexneri만 검출이 가능하다는 한계가 있었다. 이에 본 출원인은 모든 Shigella의 검출이 가능하도록 ipaH 유전자를 타겟으로 프로브를 설계함으로써 상기의 문제점을 극복하였다.

(5) Salmonella는 종수준에서 인간에게 식중독을 일으키는 주요 식중독균이다. Salmonella는 2500 여개가 넘는 혈청형을 가지고 있으며, 그 중 Typhimurium과 Enteritidis의 혈청형이 대표적으로 인간에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 기존의 연구에 따른 프로브는 Enteritidis만 검출이 가능하다는 한계가 있었다. 이에 본 출원인은 모든 Salmonella의 검출이 가능하도록 inv 유전자를 타겟으로 프로브를 설계함으로써 상기의 문제점을 극복하였다.

(6) 또한, Cronobacter sakazakii, Campylobacteri coli, Vibrio vulnificus 및 Enterococcus의 식중독균 역시 다른 식중독균의 검출 피크와 상이한 위치에서 피크가 검출되도록 각각 MMS, glyA, vvh 및 tuf 유전자를 타겟으로 프로브를 설계하였다.

실시예 3. 개별 프로브를 이용한 식중독균의 검출 실험

가. 식중독균의 DNA 시료 제작

각 식중독균별로 타겟으로 한 식중독균 중 4종의 DNA는 포항공과대학으로부터 입수하였으며, 나머지 9종의 DNA는 농업진흥청에서 수령하여 사용하였다. 검출에 사용된 각 식중독균의 번호는 표 1에 실린것과 같다. 상기 13 종의 식중독균 보유 특이 DNA 시료를 주형으로 하여 MLPA 검출 반응을 수행하였다.

나. MLPA 수행

식중독균 검출용 프로브 조성물을 이용한 MLPA 는 MRC-Holland(www.MLPA.com)에서 EK-1 키트를 통해 수행되었다. 각각의 식중독균 gDNA 5 ㎕의 시료에 대하여 95 ℃에서 5분간 변성 후 MLPA 버퍼(MRC Holland, Netherland) 1.5 ㎕, 식중독균 검출용 프로브 1.5 ㎕를 넣은 후 60 ℃에서 16시간 동안 반응시켜서 상기 시료의 표적 서열과 LHO, RHO 프로브를 혼성화시켰다.

16시간 후 시료의 반응온도를 54 ℃로 낮춘 후 Ligase-65 1㎕, Ligase-65 버퍼 A, B(MRC Holland, Netherland) 각 3 ㎕ 및 3차 증류수 25 ㎕를 넣은 후 54 ℃에서 15분간 반응시킴으로써 혼성 결합된 LHO, RHO 2개의 프로브를 라이게이션 시켜 프로브 어셈블리가 형성되도록 하였다. 이후, 98 ℃에서 15분간 효소를 불활성화시켰다.

LHO, RHO 프로브가 포함하는 프라이머 결합 영역에 프라이머를 결합시킴으로써 상기 프로브 어셈블리를 PCR 증폭시켰다. 즉, 형성된 프로브 어셈블리 2와 공통 프라이머 포워드 20 μM, 리버스 10 μM에 3차 증류수를 사용하여 20 ㎕로 조절한 혼합액을 pfu-PCR 프리믹스 (Bioneer, Daejoen, Korea)를 사용하여 95 ℃에서 30초, 60 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30 초를 35회 수행하여 라이게이션 된 프로브 어셈블리를 증폭시켰다

다. 증폭 산물의 CE-SSCP를 통한 검출

얻어진 MLPA 산물을 3차 증류수를 사용하여 희석 후 시료 1과 사이즈 스탠다드(size standard(ABI)) 0.3 ㎕, Hi-Di 8.7 ㎕를 혼합한 후 95 ℃에서 4분간 반응시키고 4 ℃에서 3분 이상 두었다. 이 시료를 3130xl(ABI)를 사용하여 CE-SSCP(Capillary Electrophoresis - Single strand conformation polymorphism)의 결과를 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 식중독균 검출용 프로브 조성물을 구성하는 프로브를 개별적으로 사용하여 MLPA를 수행하고, 증폭된 프로브 어셈블리를 CE-SSCP (Capillary Electrophoresis- Single Strand Conformation Polymorphism)를 이용하여 분석한 결과, 상기 식중독균 검출용 프로브는 각각의 식중독균의 특이 유전자에 대해 모두 단일 피크를 나타내는 것을 확인할 수 있다(도 4 참조).

실시예 4. 식중독균 검출용 프로브 조성물을 이용한 검출 실험

실시예 3과 동일한 방법으로, 각각의 식중독균에 대한 13개의 프로브를 모두 포함하는 프로브 조성물을 사용하여 다중 검출 실험을 수행하였다. 상기 결과는 도 5에 도시되어 있으며, 13개의 프로브를 모두 포함하는 프로브 조성물을 사용한 경우에도 각각의 식중독균에 대한 피크가 모두 선명하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기와 같은 방법으로 축산 식품인 우유(1), 슬라이스햄(2) 및 분쇄 소고기(3)에 직접 식중독균을 접종하여 식품에서도 상기 식중독균의 동시정량분석기 가능한지 여부를 실험한 결과, 각각의 식중독균에 대한 피크가 선명하게 검출된 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

따라서, 본 발명의 식중독균 검출용 프로브를 사용하고, MLPA 방법에 의하여 프로브 어셈블리를 증폭하고, 증폭 산물에 대해 CE-SSCP (Capillary Electrophoresis-Single Strand Conformation Polymorphism)를 이용하여 분리 검출하는 본 발명에 의한 식중독균의 존재를 검출하는 방법은 각각의 프로브가 검출하고자 하는 식중독균에 대해 하나의 피크만을 나타내는 특이성이 있으므로 검출이 정확할 뿐만 아니라, 식중독균 감염 여부 및 감염균을 확인하고자 할 경우 복수의 식중독균에 대해 동시에 신속하고 정확하며 효과적으로 검출 및 동정이 가능하게 된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Probe composition for detecting food borne pathogens <130> NPF-24115 <160> 39 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for eaeA gene of E.coli O157:H7 <400> 1 tatatccata atcattttat ttagagggag ggaggg 36 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for eaeA gene of E.coli O157:H7 <400> 2 gggaagtcta actaacgtca atttttcagg 30 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for plc gene of C. perfringens <400> 3 tggcaaagag gaaactataa acaagctaca ttc 33 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for plc gene of C. perfringens <400> 4 tatcttggag aggctatgca ctattttgga g 31 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for hip gene of C. jejuni <400> 5 taaatcttta ttttcaacct gctgaagagg g 31 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for hip gene of C. jejuni <400> 6 tttgggtggt gctaaggcaa tgat 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for hly gene of L. monocytogenes <400> 7 tgtgaatgca atttcgagcc taaccta 27 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for hly gene of L. monocytogenes <400> 8 tccaggtgct ctcgtaaaag cgaa 24 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for nuc gene of S. aureus <400> 9 cctgcgacat taattaaagc gattgatg 28 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for nuc gene of S. aureus <400> 10 gtgatacggt taaattaatg tacaaaggtc aa 32 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for groEL gene of B. cereus <400> 11 ccttcacgaa tcatagcttg tgctaataca gttgc 35 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for groEL gene of B. cereus <400> 12 agttgttgtt ccgtcaccag ctacgtcatt tg 32 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for 16S rRNA gene of Y. enterocolitica <400> 13 gctcatggaa aggttaaggc atctgtatt 29 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for 16S rRNA gene of Y. enterocolitica <400> 14 tgatgaatca atcagtgcaa gtaagacgtc 30 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for ipaH gene of Shigella spp <400> 15 ctccactgcc gtgaaggaaa tgcgttt 27 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for ipaH gene of Shigella spp <400> 16 ctatggcgtg tcgggagtga cagcaaat 28 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for inv gene of Salmonella spp. <400> 17 cgatacggat aatatggggc ggaatat 27 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for inv gene of Salmonella spp. <400> 18 catgacgcag ctgttgaaca acccat 26 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for MMS gene of C. sakazakii <400> 19 ctcgtctgta ctaattcctc aggggatatt gtcc 34 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for MMS gene of C. sakazakii <400> 20 cctgaaacag acagagtagt agttgtagag gcc 33 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for glyA gene of C. coli <400> 21 gagagattgc ggatgaagtt ggagcttatc tt 32 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for glyA gene of C. coli <400> 22 tttgcagaca ttgcacacat tgctggac 28 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for vvh gene of V. vulnificus <400> 23 ctcagtttat ggttctgcgg gctcat 26 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for vvh gene of V. vulnificus <400> 24 caaccaacag cagtaccgtg aaacaac 27 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> left hybridization sequence for tuf gene of Enterococcus spp. <400> 25 cgatttccca ggcgatgatg ttccagttat 30 <210> 26 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> right hybridization sequence for tuf gene of Enterococcus spp. <400> 26 cgcaggttct gctttgaaag ctttag 26 <210> 27 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia Coli O157:H7 <400> 27 tatatccata atcattttat ttagagggag ggagggggga agtctaacta acgtcaattt 60 ttcagg 66 <210> 28 <211> 64 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 28 tggcaaagag gaaactataa acaagctaca ttctatcttg gagaggctat gcactatttt 60 ggag 64 <210> 29 <211> 55 <212> DNA <213> Campylobacter jejuni <400> 29 taaatcttta ttttcaacct gctgaagagg gtttgggtgg tgctaaggca atgat 55 <210> 30 <211> 51 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 30 tgtgaatgca atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga a 51 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 31 cctgcgacat taattaaagc gattgatggt gatacggtta aattaatgta caaaggtcaa 60 <210> 32 <211> 67 <212> DNA <213> Bacillus cereus <400> 32 ccttcacgaa tcatagcttg tgctaataca gttgcagttg ttgttccgtc accagctacg 60 tcatttg 67 <210> 33 <211> 59 <212> DNA <213> Yersinia enterocolitica <400> 33 gctcatggaa aggttaaggc atctgtattt gatgaatcaa tcagtgcaag taagacgtc 59 <210> 34 <211> 55 <212> DNA <213> Shigella sp. <400> 34 ctccactgcc gtgaaggaaa tgcgtttcta tggcgtgtcg ggagtgacag caaat 55 <210> 35 <211> 53 <212> DNA <213> Salmonella sp. <400> 35 cgatacggat aatatggggc ggaatatcat gacgcagctg ttgaacaacc cat 53 <210> 36 <211> 67 <212> DNA <213> Cronobacter sakazakii <400> 36 ctcgtctgta ctaattcctc aggggatatt gtcccctgaa acagacagag tagtagttgt 60 agaggcc 67 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Campylobacter coli <400> 37 gagagattgc ggatgaagtt ggagcttatc tttttgcaga cattgcacac attgctggac 60 <210> 38 <211> 53 <212> DNA <213> Vibrio vulnificus <400> 38 ctcagtttat ggttctgcgg gctcatcaac caacagcagt accgtgaaac aac 53 <210> 39 <211> 56 <212> DNA <213> Enterococcus sp. <400> 39 cgatttccca ggcgatgatg ttccagttat cgcaggttct gctttgaaag ctttag 56

Claims

정방향 프라이머 결합 영역 및 표적 서열의 제 1 영역에 특이적으로 혼성화하는 LHS (left hybridization sequence) 영역을 포함하는 LHO (left hybridization oligonucleotide) 프로브; 및
상기 표적 서열의 상기 제 1 영역과 연속으로 연결된 제 2 영역에 특이적으로 혼성화하는 RHS (right hybridization sequence) 및 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 RHO (right hybridization oligonucleotide) 프로브;로 구성되는 식중독균 검출용 프로브 조성물에 있어서,
상기 LHO (left hybridization oligonucleotide)의 LHS (left hybridization sequence) 및 상기 RHO (right hybridization oligonucleotide)의 RHS (right hybridization sequence)가 각각 서열번호 1 인 LHO 프로브 및 서열번호 2 인 RHO 프로브로 구성되는 제 1 프로브;
서열번호 3 및 서열번호 4 인 제 2 프로브;
서열번호 5 및 서열번호 6 인 제 3 프로브;
서열번호 7 및 서열번호 8 인 제 4 프로브;
서열번호 9 및 서열번호 10 인 제 5 프로브;
서열번호 11 및 서열번호 12 인 제 6 프로브;
서열번호 13 및 서열번호 14 인 제 7 프로브;
서열번호 15 및 서열번호 16 인 제 8 프로브;
서열번호 17 및 서열번호 18 인 제 9 프로브;
서열번호 19 및 서열번호 20인 제 10 프로브;
서열번호 21 및 서열번호 22인 제 11 프로브;
서열번호 23 및 서열번호 24인 제 12 프로브; 및
서열번호 25 및 서열번호 26인 제 13 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 프로브 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 LHO (left hybridization oligonucleotide)의 LHS (left hybridization sequence) 및 상기 RHO (right hybridization oligonucleotide)의 RHS (right hybridization sequence)가 각각 서열번호 1 및 서열번호 2 인 상기 제 1 프로브는 E.coli O157:H7의 서열번호 27 에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 3 및 서열번호 4 인 상기 제 2 프로브는 Clostridium perfringens 의 서열번호 28 에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 5 및 서열번호 6 인 상기 제 3 프로브는 Campylobacter jejuni 의 서열번호 29 에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 7 및 서열번호 8 인 상기 제 4 프로브는 Listeria monocytogenes의 서열번호 30 에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 9 및 서열번호 10 인 상기 제 5 프로브는 Staphylococcus aureus 의 서열번호 31 에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 11 및 서열번호 12 인 상기 제 6 프로브는 Bacillus cereus 의 서열번호 32 에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 13 및 서열번호 14 인 상기 제 7 프로브는 Yersinia enterocolitica 의 서열번호 33에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 15 및 서열번호 16 인 상기 제 8 프로브는 Shigella spp. 의 서열번호 34 에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 17 및 서열번호 18 인 상기 제 9 프로브는 Salmonella spp. 의 서열번호 35에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 19 및 서열번호 20 인 상기 제 10 프로브는 Cronobacter sakazakii 의 서열번호 36에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 21 및 서열번호 22 인 상기 제 11 프로브는 Campylobacter coli 의 서열번호 37에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 23 및 서열번호 24 인 상기 제 12 프로브는 Vibrio vulnificus 의 서열번호 38에 특이적으로 혼성 결합하고,
서열번호 25 및 서열번호 26 인 상기 제 13 프로브는 Enterococcus spp. 의 서열번호 39에 특이적으로 혼성 결합하는 것을 특징으로 하는 식중독균 검출용 프로브 조성물.
제1항 또는 제2항에 기재된 프로브 조성물을 포함하는 식중독균 검출용 키트.