KR20140132382A - 암의 후생적 결함을 교정하기 위한 작동자 단백질의 상호작용을 리프로그래밍하는 방법 - Google Patents

암의 후생적 결함을 교정하기 위한 작동자 단백질의 상호작용을 리프로그래밍하는 방법 Download PDF

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Abstract

동족 (또는 천연) 마크 이외의 다른 후생적인 마크를 인지하기 위해 후생 마크 리더와 이레이저를 "리프로그래밍"하는 방법이 제공된다. 리더 또는 이레이저의 리프로그래밍은, 암과 같은 특정 질환 상태에 기여할 수 있는, 비정상적인 라이터 활성 (예, 기능 상실 또는 과다 활성)의 효과를 상쇄시킬 수 있다. 이러한 방법에 의해 동정되는 리프로그래밍 화합물들의 상기한 질환 상태를 치료하기 위한 용도도 제공된다. 이러한 방법에 의해 타겟팅할 수 있는 마크 리더의 예로는 BPTF와 CBX2를 포함한다.

Description

암의 후생적 결함을 교정하기 위한 작동자 단백질의 상호작용을 리프로그래밍하는 방법 {REPROGRAMMING EFFECTOR PROTEIN INTERACTIONS TO CORRECT EPIGENETIC DEFECTS IN CANCER}
본 발명은 치료학 분야, 보다 상세하게는 후생적 조절 이탈로 유발된 암 또는 그외 장애를 치료하기 위해, 히스톤 변형 유전자에서 발암성 기능 부전과 돌연변이를 간접적으로 교정하기 위한 소분자 화합물의 이용 방법, 시스템 및 분석에 관한 것이다.
후생적인 유전자 조절 기전과 경로에 대한 파괴는 암을 비롯한 다양한 중대 질환 상태에 중요하게 작용한다 (Mai & Altucci, 2009, Int. J. Biochem. Cell Biol. 41:199-213).
비-호지킨 림프종 (NHL)에서, 체세포 돌연변이에 대한 게놈-와이드 스크리닝 결과는 후생적인 유전자 발현 조절에 관여하는 유전자/단백질에서 돌연변이가 고빈도로 발생되는 것을 보여주고 있다. 메틸트랜스퍼라제 단백질 EZH2에 대한 재발성 체세포 돌연변이는, 구성 단백질인 PRC2의 활성 증가를 통해 NHL 발생에 기여할 가능성이 높은 것으로 확인되었다. EZH2는 히스톤 H3 라이신 27 (H3K27me3)의 트리메틸화를 촉매하는 히스톤 마크 "라이터 (writer)"이다. EZH2에 돌연변이가 발생한 NHL 종양은 히스톤 H3K27을 트리메틸화하는 PRC2의 활성 증가를 보이며, 그에 따라, 유전자의 발현 억제는 강화되고, 종양이 발생되게 된다 (Morin, et al., 2010, Nat. Genet., 42(2):181-185).
EZH2의 과다 활성 및/또는 과다 발현은, 유방암, 폐암, 전립선암 (특히, 후기 전립선암), 다발성 골수종 및 신경계 암을 비롯한, 다수의 기타 암들과 연관되어 있다. 많은 경우에, EZH2의 과다 활성 및/또는 과다 발현은 이들 암들의 공격적인 형태 또는 약물 내성 형태와도 관련되어 있다. H3K27me3 마크는 단백질 CBX2에 의해 판독 (read)된다.
메틸트랜스퍼라제 MLL2는 활성형의 히스톤 마크를 기입 (write)한다. 이러한 히스톤의 변형은 리더 (reader)인 단백질 BPTF에 의해 인지 (interprete)된다. 또한, MLL2에서의 돌연변이는 비-호지킨 림프종에서 흔한 편이며, DLBCL 사례의 32%와 여포성 림프종의 89%에서 관찰되고 있다 (Morin, et al, 2011, Nature 476: 298-303). 이들 종양들에서의 MLL2 돌연변이 프로파일은 전체적으로 기능 상실과 일치한다. MLL2는 활성형 마크 H3K4me3를 배치하는데 관여하며 (Yap, et al, 2011, Blood 117:2451-2459; Sneeringer, et al, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107:20980-20985), 전사 프로그램의 억제에 의해서가 아니라, 전-분화성 전사 프로그램 (pro-differentiation transcriptional program)을 활성화할 수 없는 세포 불능을 통해, 이러한 능력을 상실하게 되면, 세포는 증식성 상태로 유지되게 된다. 또한, MLL 유전자의 돌연변이는 위 선암종, 백혈병, 방광암 및 결장직장암에서도 확인된 바 있다 (Gui, et al, 2011, Nat. Genet. 43:875-878; Watanabe, et al, 2011, PLoS One 6:e23320; Ziemin-van der Poel, et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:10735-10739).
BPTF가 트리메틸화된 H3K4를 판독하는 능력은 단백질의 PHD 핑거 도메인내의 티로신 하나를 글루탐산으로 치환 조작함으로써, 변경되었는데, 이로 인해 H3K4에서 결합의 우선도가 트리메틸-라이신에서 다이메틸-라이신으로 바뀌었다 (Li, et al., 2007, Molecular Cell, 28:677-691).
히스톤 마크 리더의 결합의 저해 또는 파괴는 암을 비롯한 질환을 치료하기 위한 방법으로서 보고되고 있다. 특히, 저해의 경우, 히스톤 탈메틸화 효소가 타겟이 되었다 (Rotili & Mai, 2011, Genes & Cancer, 2:663-679; 국제 특허 출원 공개번호 WO2012/071469).
국제 특허 출원 공개번호 WO2011/143669는, 브로모도메인 및 엑스트라-말단 (bromodomain and extra-terminal: BET)-패밀리 단백질과 히스톤 N-말단 테일 상의 아세틸-라이신 변형과의 상호작용을 파괴하기 위한 화합물과 방법들을 기술하고 있다. 특히, 이들 화합물은 아세틸-라이신에 BET 패밀리 단백질이 결합되는 것을 저해한다. 암과 염증성 질환을 치료하기 위한 이들 화합물의 용도도 개시되어 있다.
국제 특허 출원 공개번호 WO2012/123119는 히스톤 테일과 상호작용하는 단백질 및 이들 단백질과 상호작용하는 화합물을 동정할 수 있는 바이오틴과 스트렙타비딘을 이용하는 시험관내 방법을 개시하고 있다.
국제 특허 출원 공개번호 WO2012/116170은 CREB-결합 단백질 (CBP)의 브로모도메인의 아세틸-라이신 결합 활성을 저해하는 화합물들을 개시하고 있다.
이러한 배경 정보는 본 출원인이 본 발명과 관련성이 있을 수 있다고 생각하는 공지 정보를 제공하기 위한 목적으로 제공된다. 이는, 이러한 정보 중 그 어느 것도 본 발명에 대한 종래 기술을를 구성한다는 것을 인정하거나 또는 그러한 의도로 해석되어서는 아니된다는 것을 의미한다.
본 발명은 광의적으로 암의 후생적 결함을 교정하기 위한 작동자 (effector) 단백질 상호작용을 리프로그래밍하는 방법에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 히스톤 테일에 대한 히스톤 마크 리더 단백질의 결합성을 조절하는 후보 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 타겟 히스톤 테일 마크 (histone tail mark)와의 복합체에서, 리더 단백질의 활성부에 대한 구조 모델을 컴퓨터 연산으로 제작하는 단계로서, 상기 구조 모델은 동족 (cognate) 히스톤 테일 마크와 복합체를 형성한 리더 단백질의 활성부에 대한 컴퓨터 연산 모델 (computational model)을 토대로 하는 것인 제작 단계; (b) 상기 리더 단백질의 활성부에서 상기 타겟 히스톤 테일 마크의 결합에 필요한 하나 이상의 기능적 특징을 동정하는 단계; 및 (c) 후보 화합물을 스크리닝하여, 상기 활성부내 잔기 및 상기 타겟 히스톤 테일 마크와 함께, 단계 (b)에서 동정된 기능적 특징을 실질적으로 재현하는, 후보 화합물을 동정하는 단계.
다른 측면에서, 본 발명은 메틸화된 히스톤 테일에 대한 히스톤 메틸화 마크 리더 단백질의 결합성을 조절하는 후보 화합물을 동정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 메틸화된 타겟 히스톤 테일 마크와의 복합체에서, 리더 단백질의 활성부에 대한 구조 모델을 컴퓨터 연산으로 제작하는 단계로서, 상기 구조 모델은 메틸화된 동족 히스톤 테일 마크와 복합체를 형성한 리더 단백질의 활성부에 대한 컴퓨터 연산 모델을 기반으로 하는 것인, 제작 단계; (b) 상기 리더 단백질의 활성부에서 메틸화된 타겟 히스톤 테일 마크의 결합에 필요한 하나 이상의 기능적 특징을 동정하는 단계; 및 (c) 후보 화합물을 스크리닝하여, 상기 활성부내 잔기 및 메틸화된 타겟 히스톤 테일 마크와 함께, 단계 (b)에서 동정된 기능적 특징을 실질적으로 재현하는 후보 화합물을 동정하는 단계.
다른 측면에서, 본 발명은 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위한, 일반식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00001
상기 식에서,
X는 C=O 또는 S(O)2이고,
R1은 H, C1-C4 알킬 또는 C1-C4 알콕시이고,
R2는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
를 형성하며,
R4는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고,
R5는 H, CH2NMe2 또는
Figure pct00004
이고,
R6는 H이고, R7는 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성하며,
R5가 H이고, R6와 R7이 함께 =CH2를 형성하며, X가 S(O)2인 경우, 그리고 R4가 C1 알킬이고, R5가 CH2NMe2이고, R6와 R7이 함께 =CH2를 형성하는 경우, R1, R2 및 R3 중 하나 이상은 H 이외의 것이거나;
또는
(b) X는 NH2이고,
R1 및 R2는 H이고,
R3와 R4는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00005
또는
Figure pct00006
를 형성하며,
R5는 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이며,
R6와 R7은 함께 =O를 형성한다.
다른 측면에서, 본 발명은 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 상기와 같이 정의된 일반식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위해 사용하기 위한, 상기와 같이 정의된 일반식 I의 화합물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기와 같이 정의된 일반식 I의 화합물을 BPTF와 접촉시키는 단계를 포함하는, 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 상기와 같이 정의된 일반식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조에 있어서의 상기와 같이 정의된 일반식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암을 치료하기 위해 사용하기 위한 상기와 같이 정의된 일반식 I의 화합물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기와 같이 정의된 일반식 I의 화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 용도에 관한 것이다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
및
Figure pct00012
다른 측면에서, 본 발명은 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키는 약제를 제조함에 있어서의 상기에 정의된 군으로부터 선택되는 화합물의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키는데 사용하기 위한 상기에 정의된 군으로부터 선택되는 화합물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 BPTF에 상기에 정의된 군으로부터 선택되는 화합물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암을 치료하기 위한 상기에 정의된 군으로부터 선택되는 화합물의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조에 있어서의 상기에 정의된 군으로부터 선택되는 화합물의 용도에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 암 치료에 사용하기 위한 상기에 정의된 군으로부터 선택되는 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 특징들과 그외 특징들은 첨부된 도면을 참조하여 후술하는 상세한 설명으로부터 보다 명확해질 것이다.
도 1은 BPTF, 화합물 2 및 H3K4me1 펩타이드의 "트리플 리프로그래밍 복합체" 모델을 도시한 것이다.
도 2는 (A) MLL2 동형접합성 indel 돌연변이 세포주 SU-DHL-9 및 Pfeiffer에 대한 화합물 1-3의 활성과, (B) SU-DHL-9 세포주와 Pfeiffer 세포주에서 화합물 3의 농도 의존적인 저해 활성을 조사한 실험 결과를 도시한 것이다.
도 3은 BPTF 타겟화된 화합물 2 및 3의 세포독성 효과에 대한 특이성, (A) 여러가지 림프종 세포주에서의 화합물 3의 세포독성, (B) 2종의 MLL2 돌연변이 세포주에서 화합물 3의 용량 반응 및 (C) MLL2 돌연변이 세포주에서 화합물 2의 용량 반응을 입증하는, 실험의 결과들을 도시한 것이다.
도 4는 실시예 5에서 사용된 H3K4 메틸화된 테일과의 상호작용을 분석하기 위한 BPTF 풀 다운 분석 (pull down assay)에 대한 일반적인 개요를 도시한 것이다. 이 개요는 H3K4me1의 결합성을 안정시키는 화합물과 H3K4me3 결합성을 입체적으로 방해하는 화합물을 설명해준다.
도 5는 (A) 화합물 3 및 (B) 화합물 2의 존재 및 부재 시, BPTF를 이용한 H3K4 결합성에 대한 풀 다운 분석 결과를 보여주는 웨스턴 블롯 결과를 도시한 것이다.
도 6은 마우스 이종 모델에서의 화합물 2 및 3의 생체내 검사 결과를 도시한 것으로, (A) 화합물 3와 (B) 화합물 2는 마우스 이종 모델에서 SU-DHL-9 (MLL2 돌연변이된) 세포주를 이용한 9일 동안 종양 증가가 감소됨을 보여준다.
도 7은 화합물 50 (NSC112372)의 존재 시 다양한 림프종 세포주들의 세포 생존 능력을 측정하기 위한 시험관내 분석 결과를 도시한 것으로; DoHH-2: EZH2, MEF2B 및 MLL2에 대한 야생형; WSU-DLCL2: EZH2 돌연변이 Y641F (MEF2B 및 MLL2에 대한 야생형); DB: EZH2 돌연변이 Y641N, MEF2B 돌연변이 D83V 및 MLL에서의 3종의 돌연변이.
도 8은 마우스에 비히클, 1 mg/kg 또는 4 mg/kg의 화합물 50을 처리하였을 때, WSU-DLCL2 인간 미만성 라지 세포 림프종 세포주를 이용한 이종이식 실험의 결과들을 도시한 것이다 (대조군과 4 mg/kg 군 간에 p = 0.0047).
도 9는 화합물 51 (NSC2450)의 존재 시 다양한 림프종 세포주의 세포 생존 능력을 측정하기 위한 시험관내 분석 결과를 도시한 것이다 (도 1에서의 세포주; SU-DHL-9: EZH2 야생형, MEF2B 야생형, MLL2 indel).
도 10은 마우스를 비히클로 처리하거나, 또는 5일간 화합물 51을 4 mg/kg으로 처리한 후 5일간 2 mg/kg으로 처리한, WSU-DLCL2 인간 미만성 라지 세포 림프종 세포주를 이용한 이종이식 실험의 결과를 도시한 것이다.
도 11은 화합물 50 또는 화합물 51의 존재 시 다양한 유방암 세포주의 세포 생존 능력을 측정하기 위한 시험관내 분석 결과를 도시한 것이다.
도 12는 CBX2, CBX2 리프로그래밍 화합물 및 H3K4me1 펩타이드로 구성된 "트리플 리프로그래밍 복합체" 모델을 도시한 것이다.
본 발명은, 광의적으로, 동족 (또는 천연) 마크 이외의 다른 후생적 마크를 판독하기 위한 후생적 마크 리더 (reader) 또는 이레이저 (eraser)를 "리프로그래밍"하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방식으로 리더 또는 이레이저를 리프로그래밍함으로써, 특정 질환 상태에 기여할 수 있는 비정상적인 라이터 활성 (예, 기능 상실 또는 과다 활성)의 효과를 상쇄시킬 수 있다. 이러한 방법을 통해 동정되는 리프로그래밍 화합물들은, 따라서, 상기한 질환 상태들을 치료하는데 잠재적인 치료학적 용도를 가진다.
이에, 본 발명은, 광의의 측면에서, 해당 "라이터"에 의해 배치된 대응되는 히스톤 마크에 대한 히스톤 마크 "리더"의 친화성 및/또는 선택성을 변형시키는, 소분자 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 리더 단백질과 히스톤 상의 변형된 라이신 잔기 간의 상호작용은, 예를 들어, 히스톤 라이신 테일, 개재성 (intervening) 소분자 화합물 및 마크 리더 상의 라이신 테일 결합 포켓 간에 '트리플 리프로그래밍 복합체'의 형성을 통해 변형시킴으로써, (예로, 유전자 발현을 구현하기 위한) 마크 리더의 하류에 의해 전이되는 히스톤 마크 신호를 유익하게 바꾸거나/변형시킬 수 있다. 따라서, 이러한 방식으로 동정된 소분자 화합물은, 리더와 변형된 라이신 잔기 간의 새로운 상호작용을 도입함으로써, 마크 라이터에 의해 배치된 히스톤 상의 변형된 라이신 잔기 (마크)와 마크 신호 작동자 단백질 (리더) 사이의 결합 상호작용을 조절한다. 특정 히스톤 마크에 의해 전이되는 하류 신호들을 변형시키기 위해, 히스톤 후생 마크와 대응되는 마크 리더 간에 새로운 결합 상호작용을 도입하는데 소분자 화합물을 이용하는 이러한 방법은, 후행적인 신호전달 단백질들의 다양한 라이터/리더 쌍들에 적용할 수 있다. 히스톤 마크 리더가 히스톤 상의 이의 기질인 라이신 잔기의 다양한 변형 상태들에 대한 신호들을 전이시키는 방식을 변형시킴으로써, 암과 같은 질환 상태를 유리하게 치료하도록 병인성 마크 또는 비정상적인 후행 마크들의 유해한 효과들을 교정하거나 반전시킬 수 있는데, 여기서, 특정 라이터는 돌연변이되며 (마크의 수준 또는 타입에 변화가 유발됨), 돌연변이된 라이터는 암 유발체 (cancer driver) (즉, 암에 기여하거나 암을 유발함)이다.
히스톤 마크 리더를 '리프로그래밍'하는 본 발명에 따른 소분자 화합물은, 히스톤/라이신 테일, 개재성 화합물 및 마크 리더의 라이신 테일에 대한 결합 포켓을 포함하는 트리플 '리프로그래밍 복합체'를 형성하며, 리더의 변형된 라이신 테일 결합 포켓내 주요 결합 잔기들과 히스톤 마크 유래의 라이신 테일을 포함하는 도킹 구조에 대해 소분자 '가상' 화합물 라이브러리를 컴퓨터 연산으로 스크리닝함으로써, 동정할 수 있다. 소분자 '리프로그래밍' 화합물은, 예를 들어, 리더 단백질과 후생 '마크'를 포함하는 히스톤/라이신 테일 사이에 새로운 상호작용을 도입할 수 있으며, 리더 단백질은 라이신 테일 (마크)의 변형 상태에도 불구하고 라이신 테일에 결합할 수 있다. 소분자 '리프로그래밍' 화합물은 라이신 테일/마크의 변형 (예, 메틸화) 상태에 따라 특정 라이신 테일에 대한 리더 단백질의 친화성/결합성을 높이거나 또는 낮출 수 있다. 이런 방식으로 확립된 새로운 상호작용을 통해, 소분자 '리프로그래밍' 화합물은 특정 마크 (예, 메틸화된 히스톤 라이신 잔기)에 대한 마크 리더의 기질 특이성을 바꿀 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 히스톤 마크 리더는 CBX2이며, 이것은 히스톤 마크 라이터인 EZH2 메틸트랜스퍼라제 (PRC2 단백질 복합체의 구성 요소)에 의해 배치된 마크를 판독한다. 일반적으로, EZH2는 억제성 마크를 기입하며 (write), 최종 결과로 유전자 활성이 억제된다. 야생형 EZH2의 발현 (및 그에 따른 마크 라이터 활성) 증가 뿐만 아니라 EZH2에서의 특정 체세포성 미스센스 돌연변이 (비제한적인 예로, 티로신 잔기 641을 포함함)는 H3K27에서 메틸 마크의 양 또는 원자가 (valency) (즉, 모노, 다이 또는 트리-메틸화)를 변형시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 EZH2에서의 변화는 정상적인 상태에 비해 유전자의 억제를 증가하게 되며, 이는 병인성이며 질환과 관련있는 것으로 공지된 바 있다. 특히, 이는 틀림없이 발암성일 것이거나, 또는 몇가지 유형의 암에 대해 변형/돌연변이를 유도한다. CBX2 (PRC1 단백질 복합체의 구성 요소임)는 EZH2 메틸 마크들에 대한 작동자로서 작용하며, 정상적인 기능에서 뿐만 아니라 EZH2 발현 또는 활성이 변형된 질환 상태에서도 EZH2에 대한 억제성 (또는 유전자 침묵화) 신호를 전이하는데 필수적이다. 본원에 기술된 방법들을 이용하여, CBX2의 메틸화된-라이신 결합 포켓에 결합하여, CBX2, 소분자 화합물 및 메틸화된 라이신 테일로 구성된 트리플 리프로그래밍 복합체의 형성을 통해, 메틸화된 라이신 27 (H3K27)에 대한 CBX2의 기질 특이성을 바꾸게 되는 소분자 화합물 (리프로그래밍 화합물)들이, 현재 동정되고 있다. 이들 소분자 CBX2 리프로그래밍 화합물들은 림프종 (Tyr-641 돌연변이를 가진) 세포와 종양들에 대해 시험관내 및 생체내에서 항암 활성을 가지는 것으로 확인된다. EZH2에 대한 리더 (CBX2)를 리프로그래밍하는 이들 소분자 화합물의 이점은, 원칙적으로, 이들이 라이터 (EZH2)에서의 교란과는 독립적으로 EZH2 마크에서의 질환 유발성 (암 경우에 발암성) 변화를 교정할 수 있는 유효한 약물일 것이다. 따라서, 이들 화합물들은 EZH2 단백질 또는 EZH2 유전자 발현을 직접 타겟팅하는 다른 화합물들에 비해 유익할 것이다.
본 발명의 다른 측면에서, 히스톤 마크 리더는, 히스톤 마크 라이터인 MLL2 메틸트랜스퍼라제에 의해 배치된 마크를 판독하는, BPTF이다. MLL2는 히스톤 H3 (H3K4)의 라이신 잔기 4에 메틸기를 부가한다. 일반적으로, MLL2 활성과 그 결과로 형성된 메틸 히스톤 마크는 활성형이며, 그에 따라 유전자 활성이 증가된다. MLL2 유전자 발현 감소 또는 MLL2의 특정 돌연변이들은 질환 상태와 관련있는 것으로 알려져 있다. 특히, MLL2의 기능 상실 (LoF) 돌연변이는 매우 잦은 편이며, 비호지킨 림프종 또는 기타 암에서의 발암성 '유발자 (driver)' 돌연변이임에 틀임없다. BPTF는, MLL2 활성이 교란된 질환 상태와 정상 상태 둘다에서, 하류 신호전달 경로에서 MLL2 라이터 단백질과 관련된 신호를 전이하는, 필수적인 작동자 단백질이다. 본원에 기술된 방법을 이용하여, MLL2 라이터에 대응되는 H3K4 마크에 대한 BPTF의 기질 특이성을 바꿀 수 있는 소분자 리프로그래밍 화합물이 이제 동정되었다. 화합물, H3K4 마크 및 BPTF의 메틸 H3K4 결합 포켓 간에 '트리플 리프로그래밍 복합체'를 형성하며, H3K4 마크에 대한 BPTF 단백질의 기질 특이성을 바꾸는, 화합물들이 동정되었다. 이들 방법에 의해 동정된 BPTF 리프로그래밍 화합물은, MLL2 단백질에서의 발현 감소 또는 기능 상실 돌연변이를 비롯한, MLL2 단백질에서의 발암성 교란 효과를 극복하여 교정할 수 있다. 이들 화합물은 돌연변이 MLL2에 의해 유발되거나 또는 MLL2의 발현이 감소된 림프종 또는 그외 암을 치료하는데 유효한 약물일 것이다. 이런 방식으로 발굴된 BPTF 리프로그래밍 방법 및 화합물의 구체적인 이점은, 이것이 후생적 조절 결함을 교정하고, MLL2에 소분자에 의해 직접 타겟팅할 수 없는 기능 상실 돌연변이를 수반한 림프종 등의 질환을 치료하는데 유용한 약물이라는 것이다.
본 발명의 특정 측면에서, 본원에 기술된 바와 같이 후생적 마크 리더의 소분자 리프로그래밍은, 비제한적인 예로, 림프종, 폐암, 유방암 및 신경계 암 등의 암을 비롯하여, HMT EZH2 및 MLL2의 교란 또는 돌연변이를 수반하는 질환 또는 장애에 유용하다.
본 발명의 다른 구현예에서, 암 또는 그외 후생적 조절 장애 (특히 히스톤 변형)를 치료하는데 유용한 소분자는, 트리플 리프로그래밍 복합체의 형성을 통해 동정하여, 히스톤내 메틸화된 아미노산 잔기에 대한 메틸화된 마크 리더의 기질 특이성 또는 결합 친화성을 바꿀 수 있다.
본 발명의 특정 측면은, 비제한적인 예로, 아세틸화 등의, 다른 타입/클래스의 마크 및 이의 대응되는 라이터 및 리더에 대해 본 발명의 방법을 적용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 다양한 히스톤 마크들에 대한 리더의 기질 특이성 또는 결합 친화성을 변형시키기 위한 본원에 기술된 본 발명의 방법에 의해 동정된 리프로그랭 화합물들의 특성을 확인하고 검증하기 위한 생화학적 결합 분석에 관한 것이다. 이런 분석은 메틸화된 히스톤 라이신 잔기 (마크), 마크 리더의 메틸화된 라이신 결합 포켓 및 개재성 소분자 리프로그래밍 화합물 간에 형성된 트리플 리프로그래밍 복합체를 기초로 한다. 결합 분석은 특정 리프로그래밍 후보 단백질의 존재 또는 부재 하에 대응되는 리더 단백질을 이용하여 "풀 다운 (pull down)"한 특정 히스톤 라이신 잔기의 메틸화 상태를 측정한다.
본 발명의 특정 측면은, 그외 타입/클래스의 후생적 마크와, 이에 대응되는 라이터 및 생화학적 기능이 히스톤 마크 (메틸 기 또는 아세틸 기)를 제거하는 것인 히스톤 마크 '이레이저' (즉, 탈메틸효소 또는 탈아세틸효소)에 본 발명의 방법을 적용하는 것에 관한 것이다. 이레이저에 결합하거나 및/또는 이레이저와 상호작용하여 이레이저의 활성을 저해하는 소분자 화합물은, 수종의 상이한 타입의 암들에서 다수의 히스톤 이레이저 단백질들이 과다 발현되는 것으로 알려져 있기 때문에, 암을 치료하기 위한 후보 약물이 된다. 히스톤 마크 이레이저의 타겟 후보 단백질의 예로는, 생화학적 기능이 H3K4 (me2/1) 메틸 마크로부터 메틸 잔기를 제거하는 것인 LSD1, 생화학적 기능이 H3K4 (me3/2) 메틸 마크로부터 메틸 잔기를 제거하는 것인 PLU1, 생화학적 기능이 H3K9 (me3/2) 메틸 마크로부터 메틸 잔기를 제거하는 것인 GASC1, 그리고 저해로 MLL2에서 기능 상실 돌연변이의 발암성 효과를 교정하거나 또는 상쇄시킬 수 있는, 그외 H3K4 마크 이레이저를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, MLL2 히스톤 메틸트랜스퍼라제에서의 기능 상실 돌연변이가 원인인 암 또는 기타 장애를 치료하기 위한, H3K4 이레이저의 저해제 (비제한적인 예로, LSD1 및 PLU1)와 (본원에 기술된) 소분자 BPTF 리프로그래밍 화합물의 조합에 관한 것이다.
본 발명의 다른 광의의 측면은, 비호지킨 림프종 (NHL) 및 기타 암 치료용 치료제를 개발하기 위한 방법으로서 MLL2 단백질 기능에 대한 인공적인 시뮬레이션에 관한 것이다.
본 발명의 특정 측면들은, 비-호지킨 림프종 (NHL), 히스톤 메틸트랜스퍼라제 단백질 MLL2에 LoF 돌연변이가 있는 미만성 라지 B 세포 림프종의 배중심 B (GCB) 서브타입 (DLBCL), 히스톤 메틸트랜스퍼라제 단백질 MLL2에 LoF 돌연변이가 있는 미만성 라지 B 세포 림프종의 활성화된 B 세포-유사 (ABC) 서브타입 (DLBCL), 및/또는 비제한적인 예로, 폐암, 유방암 및 신경계 암을 비롯하여, 비활화된 MLL2 단백질을 가진 암의 치료용 치료제를 개발하기 위한 타겟으로서 전사인자 BPTF에 관한 것이다.
본 발명의 특정 측면은, BPTF 단백질과 상호작용하거나 이에 결합하여, 히스톤 H3 단백질의 라이신 4의 메틸화된 형태에 대한 BPTF 특이성이 바뀌는 것으로 예측되는 화합물로서, 화합물 NSC382001 (화합물 1), NSC304107 (화합물 2), NSC127763 (화합물 3) 및 비제한적인 예로 본원의 표 2, 3 및 4에 열거된 화합물을 비롯한 그외 화합물들에 관한 것이다.
본 발명의 특정 측면은, NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL, 및/또는 비제한적인 예로 폐암, 유방암 및 신경계 암을 비롯한 저활성 단백질을 가진 암을 치료하기 위한 잠재적인 제제로서, 화합물 NSC382001 (화합물 1), NSC304107 (화합물 2), NSC127763 (화합물 3) 및 비제한적인 예로 본원의 표 2, 3 및 4에 열거된 화합물을 비롯한 그외 화합물들에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, a) 히스톤 메틸트랜스퍼라제 MLL2가 돌연변이되거나, b) 히스톤 메틸트랜스퍼라제 단백질 MLL2에 LoF 돌연변이가 있어, 히스톤 H3내 라이산 4 잔기의 트리메틸화가 감소되거나, 또는 c) MLL2 단백질이 정상 상태 또는 야생형에 비해 낮은 활성을 가지는, NHL, ABC-DLBCL 또는 GCB-DLBCL을 치료하기 위한 잠재적인 새로운 제제로서, 화합물 즉, NSC382001 (화합물 1), NSC304107 (화합물 2), NSC127763 (화합물 3), 및 비제한적인 예로 본원의 표 2, 3 및 4에 열거된 화합물을 비롯한 그외 화합물들에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, MLL2에 LoF 돌연변이가 있으며 EZH2 활성이 (EZH2 단백질 돌연변이나 발현 증가를 통해) 증가된 암을 치료하기 위한, 단백질 CBX2와 상호작용/이에 결합하는 화합물들 (예, 본원의 표 5에 열거된 것)과 조합된 형태의, BPTF 상호작용성/결합성 화합물 (비제한적인 예로, NSC382001 (화합물 1), NSC304107 (화합물 2), NSC127763 (화합물 3) 및 비제한적인 예로 본원의 표 2, 3 및 4에 열거된 화합물을 비롯한 그외 화합물들)에 관한 것이다. 그 예로는, 비제한적으로, NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL, 여포성 림프종, 폐암, 유방암, 전립선 암 및 신경계 암을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은, 비제한적인 예로, NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL, 여포성 림프종, 폐암, 유방암, 전립선 암 및 신경계 암을 비롯한, MLL2 단백질 활성이 (예, LoF 돌연변이에 의해) 저하된 암을 치료하기 위한 표준 암 치료제 (타겟형 또는 비-타겟형) 또는 신생 치료제들과 조합된 형태의, 화합물들, 즉 NSC382001 (화합물 1), NSC304107 (화합물 2), NSC127763 (화합물 3) 및 비제한적인 예로 본원의 표 2, 3 및 4에 열거된 화합물을 비롯한 그외 화합물들에 관한 것이다. 특정 구현예들에서, 이러한 조합은 단백질 CBX2와 상호작용/이에 결합하는 화합물 (예, 본원의 표 5에 열거된 것)을 추가로 포함할 수 있다.
정의
달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다.
본원에서, 용어 "약"은 주어진 값에서 대략 +/-10% 편차를 지칭한다. 이러한 편차는 구체적인 언급 여부에 상관없이 본원에 제시된 임의의 소정의 값에 항상 포함되는 것으로 이해된다.
용어 "복수"는 본원에서 하나 보다 많은, 예를 들어 2 이상, 3 이상, 4 이상 등을 의미한다.
본원에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 용어 "하나 (a, an)"의 사용은 "1개"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "1개 또는 1개 보다 많은"의 의미와 동일하다.
본원에서, 용어 "포함하는", "가지는", "비롯하여", "함유하는" 및 이들의 문법적인 변형 형태들은 포괄적이며 제한이 없으며, 부가적인, 언급되지 않은 요소 및/또는 방법 단계들을 배제하지 않는다. 용어 "로 필수적으로 구성된"은, 본원에서 조성물, 용도 또는 방법과 연계하여 사용되는 경우, 부가적인 요소 및/또는 방법 단계들이 존재할 수 있지만, 이들 부가 요소들이 언급된 조성물, 방법 또는 용도가 기능하는 방식에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 표시한다. 용어 "로 구성된"은, 본원에서 조성물, 용도 또는 방법과 연계하여 사용되는 경우, 부가적인 요소 및/또는 방법 단계들의 존재를 배제한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 것으로서 본원에 기술된 조성물, 용도 또는 방법은, 또한, 이들 구현예들이 구체적으로 언급되거나 언급되지 않던 간에, 특정 구현예들에서는, 이들 요소 및/또는 단계들로 필수적으로 구성될 수 있으며, 다른 구현예들에서는, 이들 요소 및/또는 단계들로 구성될 수 있다.
"치료 (therapy)" 및 "치료 (treatment)"는 본원에서 상호 호환적으로 사용되며, 질환과 관련된 증상을 완화하거나, 질환 발병을 예방하거나 또는 질환의 병원성을 변형시키는 의도로 수행되는 개입을 지칭한다. 즉, 특정 구현예들에서, 용어 치료 및 치료는 가장 넓은 의미로 사용되며, 다양한 구현예들에서, 질환을 다양한 단계에서 예방 (예방학적), 완화, 경감 및/또는 치유하는 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 치료/치료가 필요한 개체는 질환을 이미 앓고 있는 개체 뿐만 아니라 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 발병 위험성이 있는 개체 및 질환을 예방해야하는 개체를 포함할 수 있다.
용어 "개체" 및 "환자"는 본원에서 치료가 필요한 동물을 지칭한다.
용어 "동물"은 본원에서 인간과 인간을 제외한 동물 둘다를 지칭한다.
본 발명의 화합물을 하나 이상의 다른 치료학적 제제와 "조합하여" 투여하는 것은, 동시 (병용) 투여 및 연속적인 투여를 포함하는 것으로 의도된다. 연속 투여는 치료학적 제제(들)와 본 발명의 화합물(들)을 개체에게 매우 다양한 순서로 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되며, 치료학적 제제(들)와 화합물(들)의 투여는 단기 (예, 수분) 또는 장기 (예, 수일 또는 수주) 일 수 있는 정해진 시간 간격으로 떨어져 있다.
용어 "C1-C4 알킬"은 탄소 원자 1-4개로 구성된 직쇄 또는 분지형 알킬기를 지칭한다. 그 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec부틸 및 tert-부틸 (t-부틸)을 포함한다.
용어 "할로겐" 및 "할로"는 F, Br, Cl 및 I 원자를 지칭한다.
용어 "C1-C4 알콕시"는 R이 C1-C4 알킬인 -OR 기를 지칭한다.
타겟 단백질
본 발명의 방법에 적합한 타겟 단백질로는 히스톤 마크 리더와 이레이저를 포함한다. 그 예로, 비제한적으로, 리더 단백질 CBX2, BPTF, HP1, 53BP1 및 L3MBTL1과 아미노 옥시다제에 속하는 히스톤 Lys 탈메틸효소 (KDM) 이레이저 단백질 또는 LSD1, PLU1 및 GASC1 등의 JmjC 도메인 함유성 단백질 패밀리를 포함한다.
본 발명의 특정 구현예들에서, 타겟 단백질은 히스톤 마크 리더, 예컨대 CBX2, BPTF, HP1, 53BP1 또는 L3MBTL1이다. 일부 구현예들에서, 타겟 단백질은 히스톤 메틸화 마크 리더이다.
특정 구현예들에서, 타겟 단백질은 히스톤 테일내 트리메틸화된 라이신 잔기를 선호적으로 판독하는 히스톤 메틸화 마크 리더이다. 이러한 리더 단백질의 예로는, 비제한적으로, BPTF, CBX2 및 HP1을 포함한다.
특정 구현예들에서, 타겟 단백질은 CBX2이다. 또한, CBX2는 크로모박스 호몰로그 (chromobox homolog) 2, MGC10561, 세포 분열 주기 관련 6, M33, 크로모박스 호몰로그2 (Drosophila Pc class), CDCA6, 크로모박스 호몰로그 2 (Pc class homolog, Drosophila), 크로모박스 단백질 호몰로그 2, 모디파이어 (modifier) 3 및 Pc 클래스 호몰로그로서 알려져 있다. CBX2에 대한 데이타베이스 식별자로는 UniProtKB/Swiss-Prot: CBX2_HUMAN, Q14781; HGNC: 15521 및 Entrez Gene: 847332를 포함한다.
특정 구현예들에서, 타겟 단백질은 BPTF이다. BPTF는 또한 브로모도메인 PHD 핑거 전사 인자, FAC1, 태아성 알츠하이머 항원 (Fetal Alzheimer antigen), FALZ Alz-50 클론 1 단백질 및 OTTHUMP00000163084로 알려져 있다. BPTF의 데이타베이스 식별자로는 HGNC: 3581; Entrez Gene: 2186; Ensembl: ENSG00000171634; OMIM: 601819 및 UniProtKB: Q12830을 포함한다.
리프로그래밍 방법
특정 측면에서, 본 발명은 타겟 단백질의 이의 동족 히스톤 마크에 대한 선택성을 변형시킬 수 있는 후보 화합물 ("리프로그래밍 화합물")을 동정하는 컨퓨터 연산 방법 (computational method)에 관한 것이다. 본 화합물들은 이의 동족 히스톤 테일 마크를 구성하는 변형된 아미노산 잔기에 타겟 단백질이 결합하였을 때에는 존재하지만, 잔기의 변형 상태가 다를 경우에는 존재하지 않는, 특정한 결합 상호작용을 이들 화합물이 보완할 수 있다는 사실을 토대로 동정한다. 일반적으로, 본 방법은 변형된 히스톤 라이신 테일, 후보 화합물 및 라이신 테일에 결합하는 타겟 단백질의 활성부내 주요 잔기들 간에 '트리플 리프로그래밍 복합체'를 형성하는 단계를 포함한다.
리프로그래밍 방법은 리더 단백질에 관한 구현예로서 본원에 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 이레이저 단백질에도 적용할 수 있으며, 따라서 본 발명의 특정 구현예들이 이레이저 단백질을 리프로그래밍하는 방법에 관한 것임을 알 것이다.
특정 구현예들에서, 본 방법은, 리더가 "타겟 히스톤 테일 마크"에) 결합하도록 리프로그래밍화되는, 비-동족 히스톤 테일 마크와 복합체를 형성한 리더 단백질의 활성부에 대해 구조 모델을 컴퓨터 연산으로 제작하는 단계를 포함한다. 이 구조 모델은, 전형적으로, 활성부에서 동족 히스톤 테일 마크에 대한 결합성을 규정하는 하나 이상의 기능적 특징들을 동정하는, 동족 히스톤 테일 마크와의 복합체에서 리더 단백질의 활성부에 대한 공지된 컴퓨터 연산 모델 (computational model)을 기반으로 한다. "기능적 특징"은, 활성부에서 동족 히스톤 마크에 대한 결합성 또는 안정화에 기여하는 특징을 의미한다. 이러한 특징으로는, 예를 들어, 수소 결합, 반데르 발스 상호작용, 정전기적 상호작용 및/또는 소수성 상호작용과 같은 특정인 비-공유적 상호작용의 존재 또는 부재; 수소 결합 공여체, 수소 결합 억셉터, 수소성 잔기 또는 기, 방향족 잔기 또는 기 등의 특정 기 또는 잔기의 존재 또는 부재; 활성부에서 기능성 기들 및/또는 동족 히스톤 마크 간의 간격, 지방족 체인의 길이 등의 구조적 특징을 포함할 수 있다. 다양한 리더 단백질의 활성부에 대한 컴퓨터 연산 모델들은, 미국 샌디에고 캘리포니아 대학과 뉴저지 주입대, 러트거스에 의해 유지되는 단백질 데이타은행 등의 공공으로 접근가능한 데이타베이스로부터 입수할 수 있다.
그런 후, 타겟 히스톤 테일 마크와 복합체를 이루었을 때의 리더 단백질 활성부에 대한 구조 모델을 이용하여, 리더 단백질의 활성부에서 타겟 히스톤 테일 마크과 결합하는데 필요한 하나 이상의 부가적인 기능적 특징들을 동정할 수 있다. 예를 들어, 이 모델에 대한 정밀 검사 또는 컴퓨터 연산 분석을 통해, 수소 결합 또는 소수성 상호작용 등의 부가적인 기능적 특징이 리더 단백질의 활성부에서 타겟 히스톤 마크를 안정시키기 위해 부가 또는 제거되어야 하는 지를 확인할 수 있다. 리프로그래밍 후보 화합물에 의한 이러한 부가적인 기능적 특징 제시는 리더의 활성부에 타겟 히스톤 마크와의 결합을 허용할 것이다.
3분자 복합체는 2분자 복합체에 비해 본래 엔트로피적으로 비우호적이기 때문에, 변형된 히스톤 라이신 테일, 후보 화합물 및 활성부내 주요 잔기로 구성된 최종 트리플 리프로그래밍 복합체는, 3분자 복합체와 관련된 엔트로피 감소와 그에 따른 자유 에너지 발생을 생각하여야 한다. 이는, 예를 들어, 타겟 히스톤 마크에 비-경쟁적으로 결합하는 것으로 선별된 일련의 주형 ("프로브") 구조체들을 사용함으로써 달성될 수 있으며, 에너지 측면에서 가장 안정적인 트리플 리프로그래밍 복합체를 제공하는 프로브 구조를 동정하기 위해 시스템의 행태를 전체적으로 모니터링하면서 반복하여 개선할 수 있다.
즉, 특정 구현예들에서, 적절한 후보 화합물을 동정하기 위해, 안정적인 트리플 리프로그래밍 복합체에 대한 기능적인 필수 특징을 제공하는 프로브 구조체를 제작할 수 있다. 프로브 구조체는, 예를 들어, 적절하게 안정한 구조를 동정하기 위한 분자 동역학 시뮬레이션 및/또는 시각적 검사를 이용한, 예컨대 일련의 프로브 구조체들의 반복적인 개선을 통해, 제작할 수 있다. 활성부에서 복합체를 형성하는 최종 프로브 구조체는 이후 후보 화합물을 동정하기 위한 토대로서 사용할 수 있다.
후보 화합물들은, 예를 들어, Zinc 데이타 베이스, 국립 암 연구소의 다이버서티 세트, 국립 암 연구소의 오픈 케미컬 리포시토리, 캠브리지 라이브러리 DIVERSet, 메이브릿지 라이브러리, 아시넥스 및 천연 산물 라이브러리의 플라티늄 콜렉션에 의해 제공되는 등과 같은 화합물의 가상 라이브러리를 스크리닝함으로써, 동정할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 동정된 기능적 특징을 제공하는 능력에 대해 화학적 화합물을 스크리닝하는데 다양한 방법들을 이용할 수 있다. 전체 프로세스는, 예를 들어, 컴퓨터 스크린 상에서 활성부와 프로브 구조체를 시각적으로 조사하는 것으로 개시할 수 있다. 그런 다음, 선택된 화학적 화합물을, 이들이 프로브 구조체의 기능적 특징을 적절하게 재현하는지를 확인하기 위해, 활성부 안에서 다양한 배향성으로 배치시키거나 또는 도킹시킬 수 있다. 도킹은 Quanta (Accelrys, Inc., Madison, WI), FlexX (TRIPOS, St. Louis, Minn.) 및 DOCK 등의 다양한 시판 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 도킹 이후에, CHARMM 및 AMBER (Accelrys, Inc., Madison, WI)과 같은 표준 분자 역학 역장 (standard molecular mechanics force field)을 이용한 에너지 최소화 및 분자 동역학이 후행될 수 있다. 당해 기술 분야에 공지되어 있거나 및/또는 시판되는 그외 특수 컴퓨터 프로그램들도 후보 화합물을 선택하는 프로세스에 도움이 될 수 있다.
다른 예로, 적절한 기능적 특성을 제공하는 후보 화합물들을 표준 컴퓨터 연산 방법을 이용하여 새롭게 제작할 수 있다. 다양한 새로운 설계 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
화합물이 일단 설계 또는 선택되면, 그 화합물이 타겟 히스톤 마크와 상호작용할 수 있는 효율과 리더의 활성부를 테스트하여, 필요에 따라 컴퓨터를 이용한 평가에 의해 최적화할 수 있다. 화합물 변형 에너지 및 정전기적 상호작용을 평가하기 위한 구체적인 컴퓨터 소프트웨어는 당해 기술 분야에서 이용가능하다. 이러한 용도로 고안된 프로그램의 예로는 AMBER, QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., Madison, WI) 등을 포함한다.
시험관내 평가
본원에 기술된 리프로그래밍 방법을 이용하여 동정한 후보 화합물들을, 후속적으로, 예를 들어 리더 단백질이 타겟 히스톤 마크에 결합하는 것을 조절하는 능력 및/또는 동족 라이터 단백질의 비정상적인 활성과 관련된 질환 상태 (예, 암)에서의 활성에 대해, 시험관내에서 평가할 수 있다.
리더 단백질이 타겟 히스톤 마크에 결합하는 것을 조절하는 후보 화합물의 조절 능력은 표면 플라스몬 공명 또는 형광 편광과 같은 다양한 표준적인 시험관내 기법을 통해 분석할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예들은 타겟 마크에 대한 후보 화합물의 결합성을 특정화하기 위한 "풀 다운" 분석의 이용에 관한 것이다. BPTF에 적용되는 바와 같은 이러한 분석에 대한 전체적인 개요는 도 4에 나타내며, 실시예 5에 기술되어 있다. 간략하게는, BPTF의 GST-표지된 PHD 핑거-브로모도메인을, 후보 화합물, 및 펩타이드 상의 바이오틴 분자를 통해 스트렙타비딘-표지된 dynabead에 커플링된 H3K4me0, me1, me2 또는 me3 펩타이드와 인큐베이션하였다. 적정 완충제로 헹군 다음, 결합된 단백질을 비드에서 용출시켜, SDS-PAGE로, 선택적으로 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 당해 기술 분야의 당업자는, 이러한 분석을 다른 리더/이레이저 및 히스톤 마크에 맞게 쉽게 조절할 수 있다는 것을 알 것이다.
다른 예로, 퍼킨엘머 사에서 개발한 알파 테크놀로지 등의 기법을 이용하여, 타겟 히스톤 마크에 대한 리더의 결합성을 조절하는 후보 화합물의 능력을 평가할 수 있다. 이러한 기법들은 이러한 평가법이 고속 대량 처리를 기반으로 수행되게 할 수 있다. 알파 테크놀로지 분석은, 예를 들어, 스트렙타비딘이 접합된 알파 도너 비드와 글루타티온이 접합된 알파 억셉터 비드의 사용을 요한다. 리더의 상호작용 도메인을 글루타티온-S-트랜스퍼라제 테그를 도입하는 구조체에 클로닝하여, 글루타티온을 통한 알파 억셉터 비드와 커플링을 가능하게 할 수 있다. 특이적인 후생적 변형을 가진 바이오틴화된 히스톤 펩타이드를 상업적으로 구입하여, 스트렙타비딘을 통해 알파 도너 비드에 커플링시킬 수 있다. 상호작용 도메인이 히스톤 펩타이드에 결합하면, 알파 도너와 억셉터 비드는 서로 매우 근접해져, 도너 비드가 특정 파장의 광으로 여기되었을 때, 산소 분자가 방출되어 억셉터 비드와 반응함으로써, 결합 상호작용에 대한 아웃풋 신호로서 발광이 발생되게 될 것이다.
후보 화합물의 활성을 평가하는데, 라이터 단백질의 비정상적인 활성과 관련된 질환 상태 (예, 암)에 대한 다양한 시험관내 분석들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 화합물의 세포독성을 적정 세포주, 전형적으로 암 세포주를 이용하여 시험관내에서 분석할 수 있다. 일반적으로, 선택한 테스트 세포주의 세포를 적정 밀도로 배양하고, 후보 화합물을 첨가한다. 적절한 배양 시간 (예, 약 48 - 72시간) 경과 후, 세포 생존 능력을 평가한다. 세포 생존 능력을 측정하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있으며, 비제한적인 예로, 레사주린 환원 테스트 (resazurin reduction test) (Fields & Lancaster (1993) Am. Biotechnol. Lab. 11:48-50; O'Brien et al., (2000) Eur. J. Biochem. 267:5421-5426 및 미국 특허 5,501,959), 설포로다민 분석 (Rubinstein et al., (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82:113-118) 또는 중성 레드 염료 테스트 (Kitano et al., (1991) Euro. J. Clin. Investg. 21:53-58; West et al., (1992) J. Investigative Derm. 99:95-100)를 포함한다. 세포독성은 처리한 배양물에서 세포 생존성을 하나 이상의 대조군 배양물, 예컨대, 무처리 배양물 및/또는 대조군 화합물 (전형적으로 공지 치료제)로 사전 처리된 배양물에서의 세포 생존성과 비교함으로써, 결정한다.
암 세포의 시험관내 증식을 억제하는 화합물을 능력은, 예를 들어, 적정 배지에서 대상 암 세포주의 세포를 배양함으로써, 평가할 수 있다. 적정 배양 시간이 경과한 후, 세포에 후보 화합물을 처리하여, 다시 일정 기간 배양할 수 있다. 그런 후, 세포를 계수하여, 적정 대조군과 비교한다. 적정 대조군은, 예를 들어, 표준 화학치료제로 처리한 세포 및/또는 무처리 세포를 포함한다.
다른 예로, 화합물은, 종양 세포의 고정-비의존적인 증식을 저해하는 능력을 측정함으로써, 시험관내에서 테스트할 수 있다. 고정-비의존적인 증식은 우수한 종양형성 지표인 것으로 당해 기술 분야에 알려져 있다. 일반적으로, 고정-비의존적인 증식은 선택한 암 세포주의 세포를 소프트 아가 상에 접종하고, 적정 배양 시간 경과 후 형성된 콜로니의 수를 측정함으로써, 분석한다. 그런 후, 후보 화합물로 처리된 세포의 증식을 (전술한) 대조군 세포의 증식과 비교할 수 있다.
또한, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 다른 분석들도 이용할 수 있다.
후보 화합물을 테스트하는데 적합한 다양한 암 세포주들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 다수는 시판되고 있다 (예, American Type Culture Collection, Manassas, VA).
필요에 따라, 화합물의 독성을 표준 기법으로 시험관내에서 먼저 평가할 수 있다. 예를 들어, 인간의 일차 섬유모세포에 후보 화합물을 시험관내에서 처리한 다음, 전술한 분석법 또는 트립판-블루 배제 분석 등의 표준 생존성 분석을 이용하여 생존성에 대해 처리 후 여러 시간대에 테스트할 수 있다. 또한, 예를 들어, 티미딘 병합 분석을 이용하여 DNA 합성 능력에 대해, 그리고 예를 들어 형광유세포측정 세포 분류기 (FACS)가 연계된 표준 세포 분류 분석을 이용하여, 세포 주기 동역학에서의 변화에 대해, 세포를 분석할 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 특정 구현예들은 본원에 기술된 방법에 의해 동정된 리프로그래밍 화합물과 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 약학 조성물은 잘 공지되어 있으며, 쉽게 이용가능한 성분들을 이용하여 공지 공정에 따라 제조한다.
리프로그래밍 화합물 또는 이 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 기존의 무독성의 약제학적으로 허용가능한 담체, 보강제 및 비히클을 함유한 투약 단위 제형 (dosage unit formulation)의, 경구 (예, 볼 또는 설하 포함), 국소, 비경구, 흡입 또는 분무에 의한, 또는 직장 투여용으로 제형화할 수 있다. 전형적으로, 화합물을 허용가능한 비히클에 투입하여, 시럽제, 엘릭서제, 정제, 트로키제, 로젠제, 연질 또는 경질 캡슐제, 환제, 좌제, 오일성 또는 수성 현탁제, 분산성 산제 또는 과립제, 유제, 주사제 또는 용액제 등의, 투여에 적합한 형태로 제형화한다. 용어 비경구는, 본원에서, 피하 주사, 진피내, 관절내, 정맥내, 근육내, 혈관내, 흉골내, 척수강내 주사 또는 주입 기법들을 포함한다.
경구 용도로 의도된 조성물은 고형 또는 유동성의 단위 투약 형태 (unit dosage form)로 조제될 수 있다. 유동성의 단위 투약 형태는 약학 조성물을 제조하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 공정에 따라 제조할 수 있으며, 이 조성물은, 약제학적으로 멋지고 맛있는 조제물을 제공하기 위해, 감미제, 착향제, 착색제 및 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 엘릭서제는 방향성 착향제와 더불어 하이드로알코올 (예, 에탄올) 비히클을 당 및 사카린 등의 적정 감미제와 함께 이용함으로써 조제한다. 현탁제는 아카시아, 트라가칸트, 메틸셀룰로스 등의 현탁화제를 이용하여, 수성 비히클로 조제할 수 있다.
정제와 같은 고형 제형은 정제 제조에 적합한 무독성의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합물 형태로 활성 성분을 포함한다. 이들 부형제는, 예를 들어, 불활성 희석제, 예로 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토스, 칼슘 포스페이트 또는 소듐 포스페이트: 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 또는 알긴산: 결합제, 예를 들어, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크; 및 그외 일반적인 성분들, 예로, 다이칼슘 포스페이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 칼슘 설페이트, 전분, 락토스, 메틸셀룰로스, 및 기능적으로 유사한 물질일 수 있다. 정제는 코팅되지 않거나, 또는 위장관에서 분해와 흡수를 지연하기 위한 공지 기법으로 코팅하여, 보다 장기간 지연된 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다.
또한, 경구로 사용하기 위한 제형은, 활성 성분을 불활성의 고형 희석제, 예컨대, 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트 또는 카올린과 혼합한 경질 젤라틴 캡슐제, 또는 활성 성분을 물 또는 오일 매질, 예컨대, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합한 연질 젤라틴 캡슐제로서 조제할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐제는 화합물과 허용가능한 식물성 오일, 라이트 액체 바셀린 또는 그외 불활성 오일의 슬러리를 머신 캡슐화함으로써 조제한다.
수성 현탁제는 활성 물질을 수성 현탁제를 제조하는데 적합한 부형제와 혼합된 형태로 포함한다. 이러한 부형제는, 현탁화제, 예를 들어 소듐 카르복실메틸셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 하이드로프로필메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이며; 분산제 또는 습윤제는 천연성 포스파티드, 예컨대, 레시틴 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 산물, 예로, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 산물, 예로 헵타-데카에틸렌옥시세타놀, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 유래 부분 에스테르의 축합 산물 및 헥시톨, 예로, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올리에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 유래 부분 에스테르의 축합 산물, 및 헥시톨 무수물, 예로, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올리에이트일 수 있다. 또한, 수성 현탁제는 하나 이상의 보존제, 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필- p-하이드록시 벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 착향제 또는 하나 이상의 감미제, 예컨대 슈크로스 또는 사카린을 포함할 수 있다.
오일성 현탁제는 활성 성분을 식물성 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일, 또는 액체 파라킨과 같은 미네랄 오일에 현탁함으로써, 제형화할 수 있다. 오일성 현탁제는 증점제, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 포함할 수도 있다. 맛있는 경구 조제물을 제공하기 위해, 전술한 물질 등의 감미제와 착향제를 첨가할 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산 등의 항산화제를 첨가함으로써 보존시킬 수 있다.
물을 첨가함으로써 수성 현탁물의 제조에 적합한 분산성 산제 및 과립제는 활성 성분을 분산화제, 습윤제, 현탁화제 및 하나 이상의 보존제와 혼합된 형태로 제공한다. 적합한 분산화제, 습윤제 및 현탁화제는 상기에 전술된 것들로 예시된다. 부가적인 부형제, 예를 들어, 감미제, 착향제 및 착색제도 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 수중유 유제 형태일 수도 있다. 오일 상은 식물성 오일, 예컨대, 올리브 오일 또는 땅콩 오일, 또는 미네랄 오일, 예컨대 액체 파라민 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적정 유화제는 천연성 검, 예컨대, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검, 천연 포스파티드, 예로, 소이 빈, 레시틴 및 지방산 유래 에스테르 또는 부분 에스테르 및 헥시톨, 무수물, 예컨대 소르비탄 모노올리레이트, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 산물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트일 수 있다. 또한, 유제는 감미제와 착향제를 포함할 수 있다.
약학 조성물은 살균 주사용 수성 또는 유성 현탁물 형태일 수 있다. 이 현탁물은 전술한 적합한 분산화제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다. 살균 주사용 조제물은 또한 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매, 예를 들어, 1,3-부타다이올 중의 용액으로서, 살균 주사용액 또는 현탁물일 수 있다. 사용할 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매는 특히 물, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이다. 아울러, 용매 또는 현탁 매질로서 살균한 고정 오일이 통상적으로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드 등의 임의 블랜드의 고정 오일이 사용될 수 있다. 아울러, 올레산 등의 지방산도 주사제 제조에 사용된다. 국소 마취제, 보존제 및 완충제 등의 보강제도 주사용 용액 또는 현탁물에 포함될 수 있다.
직장 투여를 위해, 약물을, 통상의 온도에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이어서 직장 안에서는 약물이 방출되는, 적합한 비-자극성 부형제와 혼합함으로써, 조제할 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터와 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
그외 약학 조성물들과 약학 조성물의 그외 제조 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (종래, "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, PA (2000)에 기술되어 있다.
용도
본 발명의 특정 구현예들은, 후생적인 조절 이탈이 원인인 암 또는 기타 장애를 치료하기 위해, 히스톤 변형성 단백질에서의 기능 부전과 돌연변이를 간접적으로 교정하기 위한, 본원에 기술된 방법으로 동정한 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 화합물은, 단백질이 이의 동족 마크 이외의 마크에 결합할 수 있도록, 히스톤 마크 리더 또는 이레이저 단백질의 결합 활성을 조절한다. 이런 방식으로, 화합물의 사용은 암과 같은 특정 질환 상태를 특정짓는 비정상적인 라이터 활성의 유해한 효과를 상쇄시키거나 반전시킬 수 있다.
특정 구현예들에서, 리프로그래밍 화합물은 히스톤 메틸화 리더의 결합 활성을 조절하며, 따라서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (라이터), 예컨대, EZH2 또는 MLL2의 비정상적인 활성이 특징적인 질환을 치료하는데 유용성을 가질 수 있다.
본 발명의 특정 구현예는, 예를 들어, MLL2의 메틸화 활성 감소가 특징적인 질환을 치료하는데 있어, 모노- 또는 다이-메틸화된 H3K4에 결합하는 BPTF의 결합력을 높이므로써, BPTF의 결합 활성을 조절하는 리프로그래밍 화합물의 용도를 제공한다. 예를 들어, BPTF 리프로그래밍 화합물은 암 치료에, 특히 BPTF의 메틸화 활성 감소가 특징적인 암의 치료에 사용할 수 있다. BPTF에서의 기능 상실 돌연변이와 관련된 암으로는, 비제한적으로, 비-호지킨 림프종 (NHL), 미만성 라지 B 세포 림프종의 배중심 B (GCB) 서브타입 (DLBCL), 미만성 라지 B 세포 림프종의 활성화된 B 세포-유사 (ABC) 서브타입 (DLBCL)을 포함하며, MLL2 단백질이 비활성화된 암으로는, 비제한적으로, 폐암, 유방암 및 신경계 암을 포함한다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예는, NHL, GCB- DLBCL, ABC-DLBCL, 폐암, 유방암 또는 신경계 암을 앓고 있는 환자에서, 모노- 또는 다이-메틸화된 H3K4에 결합하는 BPTF 결합력을 높이기 위한 BPTF 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예는, EZH2의 메틸화 활성 증가가 특징적인 질환을 치료하기 위한, 예를 들어, 모노- 또는 다이-메틸화된 H3K27에 결합하는 CBX2 결합력을 높임으로써, CBX2의 결합 활성을 조절하는 리프로그래밍 화합물의 용도를 제공한다. 예를 들어, CBX2 리프로그래밍 화합물은 암을 치료하는데, 특히 EZH2의 메틸화 활성 증가가 특징적인 암을 치료하는데 사용할 수 있다. EZH2의 과다 발현은, 유방암, 전립선 암, 난소암, 자궁내막암, 폐암, 다발성 골수종, 신경계 암 및 림프종 등의 다수의 암과 관련되어 있다. EZH2 과다 발현과 관련있는 것으로 입증된 바 있는, 공격적이거나, 약물 내성형이거나 또는 불응성인 암을 치료하는데 있어, CBX2 리프로그래밍 화합물의 사용을 제공한다.
본 발명의 특정 구현예는 EZH2의 돌연변이 형태, 예를 들어, 641번 위치의 티로신이 대체 아미노산 (Y641 돌연변이)로 치환된 EZH2 돌연변이 형태를 가지는, 암을 치료하는데 있어, CBX2 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 것이다. 이러한 암의 예로는, 비제한적으로, 림프종 (예, 비-호지킨 림프종 (NHL), 여포성 림프종 (FL) 및 미만성 라지 세포 림프종의 배아 중심 B 서브타입 (GCB-DLBCL)), 전립선 암, 유방암, 폐암 및 신경계 암을 포함한다.
조합 요법 (Combination Therapy)
암을 치료하기 위한 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 본 발명의 특정 구현예에서, 본 화합물은 하나 이상의 화학치료제와 조합하여 사용할 수 있다.
당해 기술 분야에 다양한 화학치료제들이 공지되어 있으며, 특정 타입의 암의 치료에 특이적인 요법제 뿐만 아니라 다양한 암에 적용가능한 요법제, 예컨대 독소루비신, 카페시타빈 (capecitabine), 미톡산트론 (mitoxantrone), 이리노테칸 (Irinotecan) (CPT-11), 시스플라틴 (cisplatin) 및 겜시타빈을 포함한다.
고형 종양을 치료하는데 전형적으로 사용되는 화학치료제로는, 예를 들어 겜시타빈 (예, Gemzar®), 사이클로포스파미드, 카페시타빈 (capecitabine) (예, Xeloda®), 이포스파미드 (ifosfamide), 파클리탁셀 (예, Taxol®), 시스플라틴 (cisplatin), 독세탁셀 (docetaxel) (예, Taxotere®), 카보플라틴 (carboplatin), 에피-독소루비신 (에피루비신 (epirubicin)), 독소루비신 (예, Adriamycin®) 및 5-플루오로우라실 (5-FU)을 포함한다.
유방암을 치료하는데 전형적으로 사용되는 화학치료제로는, 예를 들어, 카페시타빈 (예, Xeloda®), 사이클로포스파미드, 5-플루오로우라실 (5-FU), 카보플라틴, 파클리탁셀 (예, Taxol®), 시스플라틴, 독세탁셀 (예, Taxotere®), 이포스파미드, 에피-독소루비신 (에피루비신), 독소루비신 (예, Adriamycin®), 트라스투주맵 (Herceptin®) 및 타목시펜 (Tamoxifen)을 포함한다.
비-호지킨 림프종을 치료하는데 전형적으로 사용되는 화학치료제로는, 예를 들어, 프로카바진 (procarbazine)(예, Matulane®), 시타라빈 (cytarabine), 리툭시맵 (rituximab) (예, Rituxan®) 및 에토포시드를 포함한다.
전립선 암을 치료하는데 전형적으로 사용되는 화학치료제로는, 예를 들어, 고세렐린 (goserelin) 아세테이트 (예, Zoladex®), 미톡산트론 (mitoxantrone) (예, 노반트론 (novantrone)®), 프레드니손 (prednisone) (예, Deltasone®), 리아로졸 (Liarozole), 닐루타미드 (예, Nilandron®), 플루타미드 (예, Eulexin®), 피나스테라이드 (Finasteride) (예, Proscar®), 테라조신 (Terazosin) (예, Hytrin®), 옥사조신 (Doxazosin) (예, Cardura®), 사이클로포스파미드, 독세탁셀 (예, Taxotere®), 에스트라무스틴 (estramustine) 및 황체화 호르몬 분비 호르몬 작용제를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예는, 암을 치료하기 위한, EZH2를 타겟팅하는 치료제와 조합되는, CBX2 또는 BPTF 리프로그래밍 화합물과 같은 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 것이다. 이러한 화합물의 예로는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 2009/0137508, 2011/0251216, 2012/0071418 및 2011/0237606에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예는, 약물 내성이 EZH2의 상향조절/과다-활성의 결과인, 약물 내성 종양을 치료하기 위한, 화학치료제와 조합되는, CBX2 또는 BPTF 리프로그래밍 화합물과 같은 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구현예는, MLL2에서의 기능 상실 돌연변이가 원인인 암 또는 기타 장애를 치료하기 위한, LSD1 또는 PLU1 등의 H3K4 이레이저 저해제와 조합되는, BPTF 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구현예는, 비제한적인 예로, NHL, ABC-DLBCL, GCB-DLBCL, 여포성 림프종, 폐암, 유방암, 전립선 암 및 신경계 암 등의, MLL2 단백질 활성이 (예로, LoF 돌연변이에 의해) 감소되거나 및/또는 EZH2 활성이 증가된 암을 치료함에 있어, CBX2 리프로그래밍 화합물과 조합되는, BPTF 리프로그래밍 화합물의 용도에 관한 것이다.
키트
본 발명의 특정 구현예는, 하나 이상의 리프로그래밍 화합물을 포함하는 키트, 예컨대 치료 팩 또는 키트를 제공한다. 리프로그래밍 화합물이 조합 치료의 일부로서 사용인 의도된 구현예에서, 키트는 선택적으로 조합물을 구성하는 다른 치료제(들)를 포함할 수 있다.
특정 구현예들에서, 키트의 한가지 이상의 구성 성분은 동결건조될 수 있으며, 키트는 부가적으로 동결건조된 성분을 재구성하기 위한 적정 용매를 포함할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 전형적으로 개별 용기 안에 포장될 것이며, 이들 용기에, 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 구제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 고지가 첨부될 것이며, 고지는 인간 또는 동물 투여용으로 사용 또는 판매하기 위한 제조사가 승인을 받았다는 것을 나타낸다.
특정 구현예들에서, 리프로그래밍 화합물(들)은 개체에게 투여하기 적합한 형태의 약학 조성물로 키트에서 제공된다. 이 경우, 필요에 따라, 용기는 그 자체가 개체에게 조성물을 투여할 수 있는, 흡입기, 시린지, 파이펫, 점적기 또는 그외 유사 장치일 수 있다.
BPTF 리프로그래밍 화합물
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 동정된 BPTF 리프로그래밍 화합물 뿐만 아니라 이들 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 키트, 및 전술한 이들 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예는 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00013
상기 식에서,
(a) X는 C=O 또는 S(O)2이고,
R1은 H, C1-C4 알킬 또는 C1-C4 알콕시이고,
R2는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께 또는
Figure pct00015
를 형성하며,
R4는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고,
R5는 H, CH2NMe2 또는
Figure pct00016
이고,
R6는 H이고, R7는 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성하며,
여기서, R5가 H이고, R6 및 R7이 함께 =CH2를 형성하고, X가 S(O)2일 경우, 그리고 R4가 C1 알킬이고, R5가 CH2NMe2이고, R6 및 R7이 함께 =CH2를 형성하는 경우, R1, R2 및 R3 중 하나 이상은 H 이외의 것이거나;
또는
(b) X는 NH2이고
R1 및 R2는 H이고,
R3 및 R4는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00017
또는
Figure pct00018
를 형성하며,
R5는 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이고,
R6 및 R7은 함께 =O를 형성한다.
본 발명의 일부 구현예들은, 하기로 정의되는, 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
X는 C=O 또는 S(O)2이고,
R1은 H, C1-C4 알킬 또는 C1-C4 알콕시이고,
R2는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00019
또는
Figure pct00020
를 형성하며,
R4는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고,
R5는 H, CH2NMe2 또는
Figure pct00021
이고,
R6는 H이고, R7는 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성한다.
본 발명의 일부 구현예들은, 하기로 정의되는, 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
X는 C=O 또는 S(O)2이고,
R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고,
R2는 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00022
또는
Figure pct00023
를 형성하며,
R4는 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고,
R5는 H, CH2NMe2 또는
Figure pct00024
이고,
R6는 H이고, R7는 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성하며,
여기에서, R1, R2, R3 및 R4가 각각 H이면, R5는
Figure pct00025
이다.
본 발명의 일부 구현예들은 하기 식 II을 가지는 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00026
상기 식에서,
R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고,
R2는 H 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00027
를 형성하며,
R4는 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고,
R5는 CH2NMe2 또는
Figure pct00028
이고,
R6는 H이고, R7은 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성한다.
본 발명의 일부 구현예들은 각각의 C1-C4 알킬이 Me인 일반식 I 또는 II의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구현예들은 하기와 같이 정의되는 일반식 I 또는 II의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
R1 및 R4는 H 또는 Me이고,
R2 및 R3는 H임.
본 발명의 일부 구현예들은 하기와 같이 정의되는 일반식 I 또는 II의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
R1 및 R3는 H이고,
R2 및 R4는 H 또는 할로임.
본 발명의 일부 구현예들은, 하기로 정의되는, 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
X는 S(O)2이고,
R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고,
R2는 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00029
또는
Figure pct00030
를 형성하며,
R4는 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고,
R5는 H, CH2NMe2 또는
Figure pct00031
이고,
R6는 H이고, R7은 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성함.
본 발명의 일부 구현예들은, 하기로 정의되는, 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
X는 NH2이고,
R1 및 R2는 H이고,
R3 및 R4는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00032
또는
Figure pct00033
를 형성하며,
R5는 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이고,
R6 및 R7은 함께 =O를 형성함.
본 발명의 일부 구현예들은, 하기로 정의되는, 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
X는 NH2이고,
R1 및 R2는 H이고,
R3 및 R4는 이들이 부착된 C 원자와 함께
Figure pct00034
를 형성하며,
R5는 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이고,
R6 및 R7은 함께 =O를 형성함.
본 발명의 일부 구현예들은 각각의 할로(겐)가 Cl인 전술한 임의의 구현예에 기술된 일반식 I 또는 II의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구현예들은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
및
Figure pct00039
본 발명의 일부 구현예들은 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
및
본 발명의 일부 구현예들은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00046
Figure pct00047
및
Figure pct00048
본 발명의 일부 구현예들은 하기 화합물 군으로부터 선택되는 일반식 I의 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00049
및
Figure pct00050
본 발명의 일부 구현예들은 하기 구조를 가지는 BPTF 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00051
또는
Figure pct00052
CBX2 리프로그래밍 화합물
일 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 동정된 CBX2 리프로그래밍 화합물 뿐만 아니라 이 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 키트, 및 전술한 이들 화합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 특정 구현예는 일반식 III를 가지는 CBX2 리프로그래밍 화합물에 관한 것이다:
Figure pct00053
상기 식에서,
R1, R2, R4 및 R8는 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;
R3는 H, 할로, C1-C4 알킬 또는 페닐이고, R9은 H 또는 할로이거나, 또는 R3 및 R9은 이들이 부착된 C 원자와 함께 페닐을 형성하며;
R5는 OR7 또는 =O이고;
R6는 X, CH2X, C1-C4 알킬, NH-NH2, CH2NR10,
Figure pct00054
또는 피페리디닐이고;
R7은 H 또는 C1-C4 알킬이고;
R10은 H, C1-C4 알킬 또는 CH2-페닐이고,
X는 할로이다.
일부 구현예들에서, 일반식 III에서,
R1, R2 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;
R3는 H, 할로, C1-C4 알킬 또는 페닐이고, R9은 H 또는 할로이거나, 또는 R3 및 R9은 이들이 부착된 C 원자와 함께 페닐을 형성하며;
R5는 OH 또는 =O이고;
R6는 X, CH2X, C1-C4 알킬, NH-NH2, CH2NR10 또는 피페리디닐이고;
R8은 H이고;
R10은 C2-C3 알킬 또는 CH2-페닐이고,
X는 할로이다.
일부 구현예들에서, 일반식 III에서,
R1, R2 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;
R3는 H, 할로, C1-C4 알킬 또는 페닐이고, R9은 H 또는 할로이거나, 또는 R3 및 R9은 이들이 부착된 C 원자와 함께 페닐을 형성하며;
R5는 OH 또는 =O이고;
R6는 CH2X 또는 피페리디닐이고;
R8은 H이고;
R10은 C2-C3 알킬 또는 CH2-페닐이고,
X는 할로이다.
일부 구현예들에서, 일반식 III의 화합물은 식 IV를 가진다:
Figure pct00055
상기 식에서,
R1, R2 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;
R3는 H, 할로 또는 페닐이고;
R5는 OH 또는 =O이고;
R6는 X, CH2X 또는 C1-C4 알킬이고,
X는 할로이다.
일부 구현예들에서, 식 IV에서,
R1, R2 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;
R3는 H, 할로 또는 페닐이고;
R5는 =O이고;
R6는 CH2X이고,
X는 할로이다.
일부 구현예들에서, 일반식 III의 화합물은 식 V를 가진다:
Figure pct00056
상기 식에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;
R3는 H, 할로 또는 C1-C4 알킬이고, R9은 H 또는 할로이거나, 또는 R3 및 R9은 이들이 부착된 C 원자와 함께 페닐을 형성하며;
R5는 OH 또는 =O이고;
R6는 NH-NH2, CH2NR10, 또는 피페리디닐이고;
R10은 C2-C3 알킬 또는 CH2-페닐이다.
일부 구현예들에서, 식 V에서,
R1 및 R4는 각각 독립적으로 H 또는 할로이고;
R3는 H, 할로 또는 C1-C4 알킬이고, R9은 H 또는 할로이거나, 또는 R3 및 R9은 이들이 부착된 C 원자와 함께 페닐을 형성하며;
R5는 OH이고;
R6는 피페리디닐이고;
R10은 C2-C3 알킬 또는 CH2-페닐이다.
본 발명의 특정 구현예들에서, 식 III, IV 또는 V의 화합물에서, 각각의 할로는 Cl 또는 Br이다.
일부 구현예들에서, 식 III 또는 V의 화합물에서, X는 Br이다.
본 발명의 일부 구현예들에서, 일반식 III의 화합물들은 하기 구조들을 가진다:
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
전술한 BPTF 및 CBX2 리프로그래밍 화합물은 다양한 저장소로부터, 예를 들어 국립 암 연구소 (NCI)/국립 보건 기구 (NIH)의 NCI 개발 치료제 프로그램 (DTP) 오픈 케미컬 리포지터리로부터 수득하거나/이로 기원할 수 있다.
특정 구현예들에서, 식 I, II, III, IV 및 V의 화합물은 충분한 산성 기, 충분한 염기성 기 또는 이들 2가지 기능성 기를 가질 수 있으며, 따라서 다수의 유기 염기, 무기 염기, 유기 산 또는 무기 산과 반응하여 약제학적으로 허용가능한 염을 형성할 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은, 본원에서, 살아있는 유기체에 실질적으로 무독성인 화합물 염을 지칭한다. 전형적인 약제학적으로 허용가능한 염은 식 I, II, III, IV 또는 V의 화합물을 약제학적으로 허용가능한 미네랄 또는 유기산, 유기 염기 또는 무기 염기와 반응시켜 제조된 염을 포함한다. 이러한 염은 산 부가 염 및 염기 부가 염으로 알려져 있다.
산 부가 염을 제조하는데 일반적으로 사용되는 산은, 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 요오드수소산, 황산, 인산, 등, 및 유기 산, 예컨대 p-톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 옥살산, p-브로모페닐설폰산, 탄산, 숙신산, 시트르산, 벤조산, 아세트산, 등이다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 염의 예는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 포스페이트, 모노하이드로겐포스페이트, 다이하이드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 브로마이드, 아이오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 하이드로클로라이드, 다이하이드로클로라이드, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 서베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-다이오에이트, 헥신-1,6-다이오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 자일렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 사이트레이트, 락테이트, 감마-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등이다. 특정 대상에 대한 약제학적으로 허용가능한 산 부가 염은, 염산 및 브롬화수소산 등의 미네랄 산과 형성된 염, 및 말레산 및 메탄설폰산 등의 유기 산과 형성된 염이다.
또한, 아민 기의 염은 아미노 질소가 알킬, 저급 알케닐, 치환된 저급 알케닐, 저급 알키닐, 치환된 저급 알키닐 또는 아랄킬 모이어티 등의 적합한 유기 기를 가지고 있는, 4급 암모늄 염을 포함할 수 있다.
염기 부가 염은 암모늄과 같은 무기 염기, 또는 알칼리 또는 알칼리 토금속 하이드록사이드, 카보네이트, 바이카보네이트 등으로부터 유래된 염을 포함한다. 따라서, 약제학적으로 허용가능한 염을 제조하는데 사용가능한 염기로는, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드, 암모늄 하이드록사이드, 포타슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 소듐 바이카보네이트, 포타슘 바이카보네이트, 칼슘 하이드록사이드, 칼슘 카보네이트, 등을 포함한다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 약제학적으로 허용가능한 염의 일부를 형성하는 특정 반대이온은, 통상적으로, 염이 전체로서 약리학적으로 허용가능하며 반대이온이 전체로서 염에 부적절한 특성을 부여하지 않는 한, 결정적인 특징이 아니라는 것을 이해할 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 식 I, II, III, IV 및 V의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 용매화물을 추가로 포괄한다. 다수의 식 I, II, III, IV 및 V의 화합물들은 물, 메탄올, 에탄올 및 아세토니트릴과 같은 용매와 조합되어, 대응되는 수화물, 메탄올레이트, 에탄올레이트 및 아세토니트릴레이트 등의 약제학적으로 허용가능한 용매화물을 형성할 수 있다.
식 I, II, III, IV 또는 V의 특정 화합물은 하나 이상의 비대칭적인 (키랄) 센터 및/또는 하나 이상의 불포화 결합을 가질 수 있다. 그 결과, 이들 화합물은 라세메이트, 개별 거울상 이성질체, 거울상 이성질체들의 혼합물, 개별 부분입체이성질체, 부분입체이성질체들의 혼합물, 개별 이성질체 및 이성질체들의 혼합물로서 존재할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예는 거울상 이성질체 형태, 부분입체이성질체 형태, 이성질체 형태, 또는 거울상 이성질체들의 혼합물, 부분입체이성질체들의 혼합물 또는 이성질체들의 혼합물로서 식 I, II, III, IV 또는 V의 화합물을 제공해준다.
특정 구현예들에서, 본 발명은 식 I, II, III, IV 또는 V의 화합물의 프로드럭을 제공한다. 용어 "프로드럭"은, 본원에서, 한가지 이상의 물리-화학적 특성을 (약제학적 용도를 위해) 바꾸기 위해 다른 화학적 기를 치환 또는 부가하는 등의 화학적 유도체화를 거치고, 개체에게 투여한 후 대사적 변환 한가지 또는 시리즈에 의해 그 자체로 활성 화합물이 되는, 화합물을 지칭한다. 화합물의 프로드럭으로의 변환에 의해 바뀔 수 있는 물리-화학적 특성으로는, 예를 들어, 용해성, 생체이용성, 흡수, 분포, 부위 특이성, 안정성, 방출 특성, 독성 등을 포함한다. 화합물을 프로드럭으로 변환하기 위해 제조될 수 있는 식 I, II, III, IV 및 V의 화합물의 화학적 유도체의 예로는, 비제한적으로, 에스테르 유도체, 에테르 유도체, 카바메이트 유도체, 아미드 유도체, 이민 유도체, 및 적절한 담체 모이어티와 직접 또는 링커 기를 통한 유도체화를 포함한다. 프로드럭 및 해당 작용 화합물의 프로드럭을 제조하는 방법에 대한 예들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Krogsgaard-Larsen et al. (Textbook of Drug Design and Discovery, Taylor & Francis, New York, NY (April 2002))에서 확인할 수 있다.
염, 용매화물 및 프로드럭의 제조는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 비-약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭은, 이들이 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭의 제조에 유용할 수 있기 때문에, 본 발명의 범위에 또한 포함되는 것으로 이해될 것이다.
본원에 기술된 본 발명에 대해 보다 나은 이해를 위해, 아래 실시예들이 제공된다. 이들 실시예들은 본 발명의 예시적인 구현예들을 설명하기 위한 것일 뿐 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 의도는 아닌 것으로 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: BPTF의 소분자 리프로그래밍
분자 모델링. www.pubchem.org에서 구현되는 화학 구조체 검색용 소프트웨어와 GROMACS-4.0.5 패키지를 이용하여 수행된 분자 다이나믹 시뮬레이션 (MD)은, 본 실험에서 메인 모델링 툴이었다. ICM 패키지 (Molsoft LLC, San Diego, CA)를 이용한 분자 도킹 방법은 정확도가 낮았으며, 일반적으로 결과가 만족스럽지 않았다.
Li, H., et al (2006, Nature, 442:91-95)로부터 유래된 BPTF 단백질과 H3K4 N-말단 테일 펩타이드의 복합체에 대한 3D 모델을 이용하였다 (단백질 데이타은행 접근 코드 2FUU). 시뮬레이션하기 전에, 모델을 100 mM NaCl 당량이 첨가된 중화성 반대이온 (neutralizing counterion)이 포함된 심플 포인트 차지 (SPC: simple point charge) 워터의 트리클리닉 박스에 넣었다 (Berendsen, H. et al. Intermolecular Forces 1981, 331-342). 모든 방향으로 주기적인 경계를 적용하였다. 모든 단백질 분자의 N-말단과 C-말단을 이온화하였다. 다른 모든 아미노산에는 생리학적 pH에서 캐노니칼 상태 (canonical state)를 지정하였다. GROMOS96 43a1 파라미터 세트 (Scott, W. et al. J Phys Chem A 1999, 103, 3596-3607) 유래의 에너지 조건들은 시스템의 모든 분자 종들에게 적용하였다. 2개의 Zn2+ 이온을 다루기 위해, 파라미터 세트를 8개의 새로운 배위 화학 결합 (및 대응되는 각도)으로 업데이트하였다: 첫번째 아연 원자의 경우, C11의 SG 원자, C13의 SG 원자, H34의 ND1 및 C37의 SG 원자; 두번째 아연 원자의 경우, C26의 SG 원자, C29의 SG 원자, C53의 SG 원자 및 C56의 SG 원자. 해당 잔기들에 대한 전하 분포를 어느 쪽으로 업데이트하였다: 첫번째 Zn2+ 배위 복합체의 경우, 전자 1개는 H34 이미다졸 고리를 따라 스무딩하며, 두번째는 아연 원자와 Cys 잔기의 황 원자 3개에 동등하게 분할되어 있으며; 두번째 아연 원자의 경우, 전하가 -0.4e로 설정되었으며, 나머지 전자 2개는 Cys 잔기의 황 원자 4개에 동등하게 분할되었다.
히스톤 펩타이드의 K4me3 잔기는 메틸기 3개 중 2개를 수소 원자로 치환하는 수정을 실시하였다. GROMOS96 역장 (force field)에서 양이온-π 상호작용에 대한 정확한 파라미터가 없기 때문에, BPTF 방향족 케이지에서, Y17 잔기의 고리를 제외한 방향족 고리의 모든 원자들과 모노-메틸화된 Lys 4의 NZ 원자는, 하드 하모니 포지션 제한으로서, 1000 kJ·mol-1·nm2로 2FUU 구조에서 이들의 배위에 고정시켰다.
Y17 측쇄의 구조는, 하이드록시페닐 고리가 더 이상 오리지날 모델에서 점유한 공동을 점유하진 않지만 Y17 CA 원자에 대한 사이트의 맞은편에 위치하도록, 대략 이면각으로 회전시키는 수정을 수동으로 행하였다. 그런 후, 빈 공동은 트리플 복합체 모델의 초기 배열 (configuration)에서 소형 유기 화합물의 도킹 사이트로서 사용하였다. 모든 복합체들은 PRODRG 서버에서 진공에서 최적화된 화합물의 회전, 병진 이동 (translation) 및 이면각 교체에 의해 수동으로 설계하였다 (Schuttelkopf, A. W. et al, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2004, 60:1355-1363). PRODRG에 의해 작성된 파라미터 세트에는 정확도가 일부 미비하므로 (Lemkul, J. A. et al. J. Chem. Inf. Model. 2010, 50:2221-2235), 화합물들의 비-결합형 파라미터들을 수동으로 집중적으로 수정하였으며, 특히 각 화합물에 전하 분포를 다시 기재하였다.
모든 MD 계산은 다소 직선형의 비-결합형 상호작용으로 수행하였다: Leonard-Jones 및 Coulomb 단거리 상호작용 (short range interaction)들 모두 1.3 nm에서 스위칭하였고, 1.4nm에서 소실시켰으며, 이웃-서칭 반경은 1.5nm로 설정하였고, MD 인테그레이터의 10개의 단계들을 각각 반복하였다. 장거리 정전기 상호작용은 입자 메쉬 에발 (particle mesh Ewald: PME) 알고리즘으로 모델을 작성하였다 (Essmann, U. et al. J. Chem. Phys. 1995, 103:8577-8593). 용매화된 복합체의 모델을 작성하기 위해, l-bfgs 최소화 (Liu, D. C. and Nocedal, J. Math. Program. 1989, 45:503-528), 및 정적 (NVT) 앙상블 하에 시뮬레이션한 단백질과 화합물 둘다의 중원자 위치를 제한한 분자 다이나믹 시뮬레이션 50ps에 의해, 구조체들을 이완시켰다. 모의 어닐링 (Kirkpatrick, S. et al. Science 1983, 220:671-680, Cerny V. J. Optimiz. Theory Appl. 1985, 45:41-51)을 이용하여, T=10K - T=310K에서 볼츠만 분포에 따라 할당된 초기 속도로 시스템을 웜업시켰다. NVT 웜업 후, 100 ps의 정압 (NPT) 평형을 수행하였다. 복합체와 다른 원자들은 개별 온도 커플링 배쓰와 커플링시키고, 온도를 T=310K로 유지하였다. 평형화를 위해, 약한 커플링 (Berendsen, H. J. C. et al. J. Chem. Phys. 1984, 81:3684-3690)을 이용하여 압력을 등방향으로 1.0 bar로 유지시켰으며, 베렌드센의 약한 커플링 방법 (Berendsen, 1984, ibid.)을 이용하여 일정한 온도로 유지시켰다. 이후의 모든 생산적인 작업 (productive run)들은, 보다 정확한 Nose-Hoover 서모스탯 (Nose, S. Mol. Phys. 2002, 100:191-198, Hoover, W. Physical Review A 1985, 31:1695-1697)와 0.1 ps로 일정한 온도 커플링 시간으로, 그리고 파리넬로-라만 바로스탯 (Parrinello, M. et al. J. Appl. Phys. 1981, 52:7182-7190, Nose, S. and Klein, M. L. Mol. Phys. 1983, 50:1055-1076)와 NPT 앙상블 하 1.0 ps로 일정한 압력 커플링 시간으로 수행하였다. 이러한 서모스탯과 바로스탯의 병용은 트루 NPT 앙상블을 샘플링하고, 작고 (원자 22개) 컴팩트한 방향족 케이지 구속으로부터있다하더라도 오직 소형 인공물만 발생되게 보장하였다. MD 궤적을 시각적으로 검사하기 위해, VMD 뷰어 (Humphrey, W.; et al. J. Mol. Graph. 1996, 14:33-8, 27-8)를 사용하였다.
결과 및 고찰: MLL2에서 기능 상실 (LoF) 돌연변이는, MLL이 이들 마크에 대한 유일한 작동자 단백질이기 때문에, H3K4me2와 H3K4me3 후생 마크들의 소실로 이어질 것으로 예상된다. H3K4의 메틸화는 잘 공지된 활성화 마크이므로, MLL2 비활성화로 인한 발암성 기능은 H3K4 메틸 마크로 정상적으로 활성화되는 유전자의 발현을 암 세포에서 방지하는 결과가 나타날 수 있다.
H3K4me2 마크와 me3 마크의 리더는 BPTF 단백질이다. BPTF는 me2 마크와 me3 마크에 결합하지만, H3K4me0,1 마크에는 결합하지 않는다 (Li H., et al., 2007, Mol. Cell., 28:677-691). H3K4me0,1 마크는 L3MBTL 단백질 (Li H., et al., ibid.)에 결합한다. 본원에서는, BPTF가 H3K4me0,1 마크에 결합하도록 리프로그래밍하며, 정상 보다 친화성이 높고, 그러한 방식으로 MLL2 활성을 시뮬레이션하는, 화학적 화합물을 설계할 수 있다는 것을 보여준다. 리프로그래밍은, BPTF, H3K4me0 또는 me1 테일 및 소분자 화합물의 트리플 복합체를 형성하고, 그래서 소분자 화합물이 H4K4me0 및/또는 me1에 대한 BPTF의 결합에 호의적인 환경을 구축함으로써, 달성된다.
집중적인 컴퓨터 연산 프로토콜을 이용하여, H3K4me0,1에 대한 친화성을 나타내도록 BPTF를 리프로그래밍하는 기대되는 후보체들을 동정하였다. BPTF는 4개의 방향족 잔기에 형성된 방향족 케이지 (cage)를 통해 트리-메틸화된 라이신을 인지한다: W32, Y10, Y23 및 Y17. 이 케이지는, 4면이 이들 방향족 잔기로 구성된 박스를 3D 공간에서 형성하며, 한면에서는 K4 벡본이 확인되며, 마지막 면은 물에 오픈되어 있다. 케이지 안에 존재하는 임의의 수소결합 모티프 없이도, 케이지는 선택적으로 트리-메틸화된 라이신에 결합할 수 있으며, NZ 원자에는 수소 원자가 없다. BPTF의 특이성을 리프로그래밍하기 위해서는, H3K4me0,1과의 트리플 복합체 형성이 가능하도록 수소 결합 모티프를 제공하는 활성부 안에 또는 근접하여 화합물을 고정시켜야 한다.
수행한 방법은 화합물을 고정하기 위한 부위와 수소 억셉터 모티프를 공급하기 위한 활성부로의 접근을 제공하기 위해, 방향족 케이지의 면들 중 한면을 해체하는 것이었다.
BPTF-H3K4me1 테일 펩타이드 복합체 모델은 Li, H., et al (2006, Nature, 442:91-95)에서 취하였다. 이 모델은 BPTF의 방향족 케이지 (W32, Y10 및 Y23 잔기들의 측쇄)와 히스톤 테일 펩타이드의 K4의 NZ 원자에 적용된 위치 제한을 이용하여 2 ns 동안 분자 동역학 (MD)으로 시뮬레이션하였다. 방향족 케이지에서 가장 보존적이 낮은 잔기, Y17을 해체 대상으로 선정하였다.
가상 화합물 프로브 (표 1)를 이용하여 BPTF 활성부의 Y17을 치환하였다. 화합물 V1과 V2를 이용하여 수행한 2번의 독립적인 실험을 먼저 이용하였으며, 트리플 복합체는 6 ns MD로 시뮬레이션하였다. 프로브가 해리되어 Y17과의 경쟁에 실패하면, 실패의 원인이 되는 화합물의 부위를 MD 궤적을 리뷰함으로써 파악하였으며, 이 부위를 돌연변이시켰다. 이런 방식으로, 프로브 화합물들을 진화시켰다:
V1→V11→V12→V13→V14→ V3 ←V23←V22←V21←V2
최종 가상 프로브 V3는 6 ns MD 동안에 안정한 복합체를 제공하였다. V3는 방향족 케이지의 면에 대해 Y17 보다 우수하였으며, 케톤 산소와 K4(H2+,me1)의 2개의 수소 원자들 간의 2개의 양호한 수소 결합을 형성할 수 있었다.
표 1: 프로브 화합물의 구조
구조 명칭 (프로브 번호)
Figure pct00067
 6-사이클로헥실-헥사노익산 펜에틸 에스테르 (V1)
Figure pct00068
 {5-벤질옥시카르보닐아미노-1-[10-(2,6-비스-벤질옥시카르보닐아미노0헥사노일아미노)-데실카바모일]-펜틸}-카르밤산 벤질 에스테르 (V2)
Figure pct00069
 1-사이클로헥실-9-페닐-노난-1-온 (V11)
Figure pct00070
 1-[4-(4-페닐-부틸)-사이클로헥실]-프로판-1-온 (V12)
Figure pct00071
 1-[3-(5-페닐-부틸)-사이클로헥실]-프로판-1-온 (V13)
Figure pct00072
 1-[4-(8-페닐-옥틸)-사이클로헥실]-프로판-1-온 (V14)
Figure pct00073
 1-[4-(3-펜에틸-10페닐-데실)-사이클로헥실]-프로판-1-온 (V22)
Figure pct00074
 N-(6-페닐-헥실)-3-(4-프로피오닐-사이클로헥실)-프로피온아미드 (V23)
Figure pct00075
 4-(3-{1-[4-(4-아크릴로일-사이클로헥실)-부틸]-6-페닐-헥실}-우레이소메틸)-벤조산 메틸 에스테르 (V21)
Figure pct00076
 3-[4-(4-아크릴로일-2,3-다이클로로-사이클로헥실)-부틸]-8-페닐-옥탄산 아미드 (V3)
V3 프로브와의 최종 복합체에서 평균 단백질 구조를 이용하여, 국립 암 연구소 (NCI) 라이브러리로부터 화합물을 도킹함으로써, 잠재적인 BPTF 리프로그래밍 화합물로서, 리얼 화합물을 선별하였다. NCI 라이브러리의 화합물들 중 약 5000개의 상위 랭킹된 복합체들을 수동으로 리뷰한 후, 안정적인 6 ns MD 트리플 복합체를 제공하는 후보 구조체 22개를 선별하였다. 선별하는 동안, GROMOS96 역장이 특수 양이온-π 파라미터를 가지지 않는다는 사실은, 지방족 고리를 가진 프로브가 시뮬레이션하는 동안 안정적인 것으로 확인된다면, 이의 고정 고리가 방향족인 구조체들을 바람직한 구조체로서 선별되게 하였다.
선별된 화합물 세트에 대해, 실시예 3에 개괄된 프로토콜을 이용하여 SU-DHL-9 세포주 (동형접합성 LoF MLL2 돌연변이)에서의 활성을 시험관내에서 테스트하였다. 활성 화합물들의 유사성을 기초로 한 추가적인 최적화로, MLL2 이중 LoF 돌연변이 세포주에 대해 활성형이지만 아생형 세포에 대해서는 비활성인 화합물 세트 (NSC382001 (화합물 1), NSC304107 (화합물 2) 및 NSC127763 (화합물 3))를 동정하였다 (표 2). 화합물 2, BPTF 및 H3K4me1 펩타이드의 "트리플 리프로그래밍 복합체"를 나타낸 모델을 도 1에 도시한다.
동정되고, MLL2 LoF 동형접합성 돌연변이를 가지고 있는, 세포주 SU-DHL-9와 Pfeiffer를 선택적으로 사멸시키는 시험관내 능력이 입증된 그외 화합물들도 표 2에 나타낸다. 이들 화합물은 본 테스트에서 대략 1 μM의 농도에서 활성을 나타내었다.
표 2: BPTF 리프로그래밍 후보 화합물
화합물 구조 명칭 (NSC 번호)
1
Figure pct00077
 2-다이메틸아미노메틸-1-(2,5-다이메틸-페닐)-프로페논 (NSC382001)
2
Figure pct00078
 1-(2,4-다이클로로-페닐)-3-다이메틸아미노-프로판-1온 (NSC304107)
3
Figure pct00079
 2,3-다이클로로-N-(9,10-다이옥소-9,10-다이하이드로-안트라센-1-일)-프로피온아미드 (NSC127763)
4
Figure pct00080
 7-메틸-7-아자-바이사이클로[4.1.1]옥탄 (NSC79037)
5
Figure pct00081
 tert-부틸 4-[(2,5-다이하이드록시페닐)메틸아미노] 벤조에이트 (NSC677696)
6
Figure pct00082
 2-에테닐설포닐나프탈렌 (NSC202577)
7
Figure pct00083
 1-(1,3-벤조다이옥소l-5-일)-2-[(다이메틸아미노)메틸]프로프-2-en-1-온 (NSC382006)
8
Figure pct00084
 2-[(tert-부틸아미노)메틸]-1-페닐프로프-2-en-1-온 (NSC313429)
9
Figure pct00085
 2,2-다이클로로-N-(9-옥소플루오렌-4-일)아세트아미드 (NSC74980)
10
Figure pct00086
 2-[(2-에톡시카르보닐페닐)카바모일]바이사이클로[2.2.1]헵트-5-ene-3-카르복시산 (NSC270155)
11
Figure pct00087
 2-(모르폴린-4-일메틸)-1-페닐프로프-2-en-1-온 (NSC372471)
실시예 2: 추가적인 BPTF 리프로그래밍 화합물의 동정, 테스트 및 분석
후보 BPTF 리프로그래밍 화합물 (실시예 1 참조)에 대한 첫 스크리닝을 통해 2종의 기대되는 스캐폴드 (하기 A와 B)를 동정하였으며, 이를 구조-활성 상관성 (SAR) 방법 (도 1 참조)을 이용하여 수동으로 더욱 최적화함으로써, 표 3 및 4에 나타낸 바와 같이 추가적인 후보 BPTF 리프로그래밍 화합물들을 동정하였다. 이들 화합물에 대해 실시예 3에 개략적으로 기술된 프로토콜을 이용하여 SU-DHL-9 세포주와 Pfeiffer 세포주에서 시험관내 활성을 테스트하였다. 가장 활성이 높은 화합물의 활성은 SU-DHL-9 세포주에 대해서는 약 2 μM이었으며, Pfeiffer 세포주에 대해서는 약 6 μM이었으며, 음성 대조군에 대해서는 10 μM에서 세포독성이 관찰되지 않았다
Figure pct00088
스캐폴드 A 스캐폴드 B
표 3: 스캐폴드 A를 기본으로 하는 BPTF 리프로그래밍 후보 화합물
화합물 구조 NSC 번호 세포 증식율 %
1
Figure pct00089
 382001 <10
12
Figure pct00090
 685405 105
13
Figure pct00091
 174109 137
8
Figure pct00092
 313429 92
14
Figure pct00093
 382008 93
2
Figure pct00094
 304107 <10
11
Figure pct00095
 372471 26
15
Figure pct00096
 382000 61
16
Figure pct00097
 382002 107
17
Figure pct00098
 382003 89
18
Figure pct00099
 382005 80
19
Figure pct00100
 382011 77
20
Figure pct00101
 603553 83
7
Figure pct00102
 382006 29
6
Figure pct00103
 202577 69
21
Figure pct00104
 54367 105
표 4: 스캐폴드 B를 기본으로 하는 BPTF 리프로그래밍 후보 화합물
화합물 구조 NSC 번호 세포 증식율 %
22
Figure pct00105
 123818 86
9
Figure pct00106
 74980 117
23
Figure pct00107
 134391 114
3
Figure pct00108
 127763 <10
24
Figure pct00109
 30421 107
구조-활성 상관성 (SAR): 활성형 스캐폴드 2종 모두, SAR 분석 (SU-DHL-9에 대한 선택적인 독성, 표 2 및 3)은 일반적으로 트리플 복합체의 분자 모델과 일치한다. 스캐폴드 A의 MD 모델 (도 1)에 따르면, R1, R2, R3 및 R4는 소수성이어야 하며, 다른 위치에서 Y17을 안정시키는 R4를 제외한 나머지 모두는 하이드록시페닐 결합부에 딱 맞기 위해 회전가능한 결합이 최소화되고 알맞게 소형이어야 한다. 활성형 화합물 1과 2를 비활성형 또는 최소 활성의 화합물들 16, 17 및 19와 비교한 바, 작은 소수성 R1과 R3가 활성에 부정적인 효과를 가지므로, R2 치환에 의해 매우 약간 보완될 수 있으며 - 이는 화합물 15와 20의 활성에서도 볼 수 있다. 작지만 회전가능한 메톡시 기를 R1, R2 및 R3 위치에 가지고 있는 화합물 18은, 가장 약한 활성을 나타내지만, 메톡시 회전이 다이옥솔 고리에서 상당히 억제된다면, 활성이 화합물 7에서 볼 수 있는 바와 같이 회복된다. R4는 보다 복합적인 효과를 발휘하여, (화합물 11에서와 같이) R1, R2 및 R3의 결손을 충분히 보완할 수 있거나, 또는 화합물 8에서와 같이 효과가 없을 수 있다. 이러한 복합성에 대한 가능한 설명은 Y17 측쇄와의 경쟁일 수 있으며, 메틸-피페리딘 테일은 공동의 바깥쪽을 안정시킬 수 있지만 t-부틸-메틸-아민은 그렇지 않다.
R1, R2, R3 및 R4에 임의의 치환이 없으면 예상한 바와 같이 활성에 강력한 부정적인 효과가 있었다 (화합물 13 참조). 또한, 대칭적인 치환을 가진 화합물 14는 활성이 불량하여, 작은 크기의 R2가 바람직하다는데 유리할 가능성을 입증해준다.
모티프 A1의 주요한 리프로그래밍 효과는 이 위치에 카르보닐기가 없는 화합물 21에 의해 검증된다. 이 화합물에 R4가 없을 경우, 겨우 중간 수준의 활성이 나타남에도 불구하고, A0 모티프의 중요성이 훨씬 낮다는 것은 화합물 6에 의해 입증된다. A2는 예상된 바와 같이 결정적인 것은 아닌 것으로 보인다 (화합물 1/화합물 2과 화합물 17/화합물 19의 쌍들을 비교함).
유사한 SAR 결론은 스캐폴드 B에서도 나타날 수 있다. NCI 라이브러리는 활성형 화합물 3 (NCI127763)의 구조 상동체인 화합물들을 비교적 적게 포함하고 있음에도 불구하고, 화합물 3 및 부분 활성형 화합물 22를 비활성형 화합물 23 (R4 소수성) 및 24 (R4 길이)와 비교함으로써, 긴 소수성 R4 유사체의 중요성이 검증된다. 분자간 리프로그래밍 수소 결합의 결정적인 영향은 화합물 3/화합물 9 쌍에 의해 검증된다.
공간적 모델에 있어서, 그 결과는, 분자의 방향족 파트가 Y17 결합 포켓을 점유하며, 아미드 산소 리프로그래밍 BPTF와 지방족 테일이 Y17 측쇄의 새로운 위치를 안정시키는 것으로, 해석될 수 있다.
실시예 3: 화합물 1-3의 시험관내 활성
화합물 1-3 (표 2 참조)을 대상으로, DoHH-2 (야생형 for MLL2), SU-DHL-9 및 Pfeiffer (MLL2 동형접합성 indel 돌연변이) 세포주에 대한 증식 저해력을 시험관내에서 테스트하였다. 그 결과를 도 2A에 나타낸다. 또한, 화합물 3의 활성의 농도 의존성도 조사하였다. 그 결과는 도 2B에 나타낸다.
방법: 미만성 라지 B-세포 림프종의 세포주를 10% (v/v) 소 태아 혈청 (Life Technologies)과 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Life Technologies)이 보충된 RPMI 배지 1640 (Life Technologies) 중에서, 37℃ 배양기에서 5% CO2, 습윤 대기 하에 유지시켰다. 세포주 DOHH2는 DSMZ로부터 입수하였다. Pfeiffer는 ATCC로부터 입수하였다. SU-DHL-9는 Martin Dyer (University of Leicester, UK)로부터 입수하였다.
화합물을 먼저 10 mM 농도로 DMSO에 용해하였다. 이 화합물 용액을 RPMI 배지 1640에 1:100으로 추가로 희석하여 최종 농도 100 μM을 만들었다. 4 x 105 cells/mL 농도로 유지시킨 세포 90 ㎕를 MICROTEST™ 96-웰 어세이 플레이트, Optilux™ (BD)의 웰에 분배하였다. 그런 후, 상기 100 μM 화합물 용액 10 ㎕를 세포에 첨가하여, 최종 화합물 농도 10 μM을 만들었다. 각 화합물은 3번 테스트하였다. 1:100의 DMSO : RPMI 배지 1640 용액 10 ㎕를 담체 대조군으로서 세포 90 90 ㎕에 첨가하였다. 아울러, 각 플레이트에는 오직 RPMI 배지 1640이 든 웰을 포함시켜, 완전히 무처리한 세포와 백그라운드 노이즈 대조군으로서 사용하였다. 화합물들은 37℃ 배양기에서 5% CO2, 습윤 대기 하에, 48시간 세포와 함께 인큐베이션한 다음, alamarBlue® 세포 증식 분석 (Life Technologies)을 수행하였다. 미가공 (Raw) 형광 단위를 백그라운드 노이즈로 보정하고, 담체-처리 대조군에 대해 정규화하였다.
실시예 4: 화합물 2 및 3의 시험관내 활성
화합물 3의 시험관내 활성을 세포주 DoHH-2, OCI-LY3, WSU-DLCL2 (모두 MLL2에 대해 야생형임) 및 SU-DHL9을 이용하여 추가로 조사하였다. 아울러, 화합물 2의 농도 반응은 MLL2 돌연변이 세포주와 MLL2와 EZH2가 모두 돌연변이인 세포주에서 조사하였다. 화합물 3의 농도 반응은 MLL2 돌연변이 세포주에서 조사하였다. 방법은 실시예 3에 기술된 바와 동일하였다. 세포주 WSU-DLCL2는 DSMZ에서 입수하였고, OCI-Ly lines 3는 Louis Staudt (US National Institutes of Health)에서 입수하였다.
그 결과들은 도 3A-C에 나타낸다. 또한, 화합물 3가 MLL2가 야생형인 세포에서는 명백한 효과가 없으며, 이는 화합물이 일반 독성 특성을 가지고 있지 않다는 것을 의미함에 유념하여야 한다.
실시예 5: 화합물 2 및 3와 BPTF의 상호작용
대표 화합물 2 및 3이 BPTF 타겟과 상호작용하여 H3의 히스톤 테일에 결합하는 능력에 영향을 미친다는 것을 입증하기 위해, BPTF 풀 다운 분석을 채용하였다. 본 분석은 도 4에 개략적으로 도시되어 있으며, 아래에서 상세하게 설명한다.
이 분석을 이용하여, 화합물 3가 H3K4me1과 BPTF의 결합을 안정시킬 수 있으며 (도 5A), 화합물 2는 뜻하지 않게도 H3K4me2의 결합성을 안정시킬 수 있다 (도 5B)는 것을 확인하였다. 도 5A에서, GST 항체 염색은 화합물 3와 H3K4me1 존재 시 BPTF 단백질이 증가되며, 이 화합물과 H3K4me3 존재 시에는 결합이 감소됨을 보여준다. 밀도계측 값 H3K4me1 + 화합물 3 = 13335, H3K4me - 화합물 3 = 9350, H3K4me3 + 화합물 3 = 4227, H3K4me3 - 화합물 3 = 2545. 도 5B에서, GST 항체 염색은 화합물 2와 H3K4me2의 존재 시 BPTF 단백질이 증가되며, 이 화합물과 H3K4me3 존재 시에는 결합이 감소됨을 보여준다.
방법: 전장 인간 BPTF 구조체를 C. David Allis of the Laboratory of Chromatin Biology, Rockefeller University (Li et al., 2006, ibid)으로부터 입수하였다. 인간 BPTF (gi:31322942) 유래의 듀얼 PHD 핑거-브로모도메인 (2583-2751의 잔기들)을 N-말단 GST 테그를 허용하는 Gateway® 클로닝 기법을 이용하여, pDEST15 벡터에 클로닝하였다 (Life Technologies). BL21-AI™ 화학적인 컴피턴트 E. coli 세포에서, 1 mM IPTG와 0.2% L-아라비노스가 첨가된 LB 배지를 이용하여 2시간 동안 교반 배양기에서 GST-BPTF 듀얼 PHD 핑거-브로모도메인의 과다 발현을 유도하였다. 글루타티온 세파로스 4B 매질 (GE Healthcare Life Sciences)을 이용하여 GST-BPTF 듀얼 PHD 핑거-브로모도메인을 정제한 다음 PBS (Life Technologies)로 밤새 투석하였다.
펩타이드 풀-다운 실험은 기본적으로 종래 방식에 따라 수행하였다 (Ruthenburg et al., 2011, Cell, 145(5):692-706). 1.5 mL 마이트로튜브에 M-280 스트렙타비딘-커플링된 Dynabeads® (Life Technologies) 50 ㎕를 넣고, PBS에서 3 x 50 ㎕로 헹구었다. 그런 후, 비드를 C-말단에 바이오틴이 달린 H3K4me0, me1, me2 또는 me3 펩타이드 21개의 아미노산 길이 (Anaspec)와 1시간 동안 4℃에서 교반하면서 포화 조건 하에 인큐베이션하였다. 비드를 HBS-TD (10 mM Na-HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween-20, 2 mM DTT)에서 3 x 100 ㎕로 헹구고, 1:100의 DMSO/PBS 용액 중의 68 μM 약물 또는 담체 단독과 더불어, 6.8 μM GST-BPTF와 함께 3시간 동안 4℃에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 그 후, 비드를 HBS-TD에서 10 x 200 ㎕로 헹구었다. 단백질은 2x LDS 샘플 완충액 (Life Technologies)과 1x 환원제 (Life Technologies)를 10분간 85℃에서 사용하여 용리시켰다. 샘플을 SDS-PAGE 수행한 다음, SimplyBlue 염료 (Life Technologies) 또는 GST 항체 (Santa Cruz)를 사용하여 밴드를 가시화하였다. ImageJ 소프트웨어로 밴드를 정량하였다.
실시예 6: 화합물 3의 생체내 활성
화합물 2와 3을 마우스 이종이식 모델에서의 종양 증식 감소력에 대해 테스트하였다.
이종이식 모델. NOD/SCID/γnull (NSG) 마우스를 로컬 BCCRC 동물 시설에서 사육하였다. 원발성 종양을 확립하기 위해, 수컷 NSG 마우스에 인간 미만성 조직구성 림프종 세포주 SU-DHL-9 세포 1x107개를 50 ㎕ PBS 중에서 옆구리 부위에 접종하였다. s.c. 종양이 발생된 후, 마우스를 희생시키고, 종양의 소형 단편 (~20 mg)을 마취한 6-10주령의 수컷 NSG 수여 마우스의 우측 옆구리에 13 G 트로카 바늘을 이용하여 s.c.로 이식하였다. 종양이 촉진가능해지면 처리를 개시하였다. 종양의 길이와 폭을 캘리퍼로 측정하고, 변형된 타원체 공식 (길이 x 폭2)/2으로 종양의 체적을 계산하였다.
효능 실험. 화합물을 50% DMSO와 50% 폴리에틸렌 글리콜 200의 혼합물에 희석하였다. 그룹 당 종양을 가지고 있는 마우스 8마리에, 화합물을 1 mg/kg 또는 4 mg/kg (화합물 3; NSC 127763), 4 mg 또는 12 mg/kg (화합물 2; NSC 304107)의 용량으로, 또는 대조군으로 비히클을 8일간의 기간 동안 매일 복막내 주사함으로써, 투여하였다. 체중은 2일 마다, 종양의 크기는 4일 마다 기록하였으며, 임의의 다른 부가적인 유해 효과를 모니터링하였다. 실험 동물은 9일에 희생시키고, 종양 체적을 측정한 다음, 초기 종양 체적에 대해 정규화한 후 스튜던트의 t-검사에 의해 유의성 차이를 결정하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 2종의 화합물들 모두 이러한 마우스 이종이식 모델에 항-종양 활성을 나타내었다. 화합물 3 (도 6A)의 경우, 이러한 신속 증식 모델에서, 비교적 낮은 용량인 4 mg/kg으로 화합물 존재 시, 종양 증식율 중앙값이 563%인 무처리 대조군에 비해 종양 증식율 중앙값을 362%로 감소시킬 수 있었다. 화합물 2 (도 6B)는, 용량 12 mg/kg에서, 종양 증식율 중앙값이 1755%인 무처리 대조군에 비해 종양 증식율 중앙값을 1305%로 감소시킬 수 있었다. 이들 결과는 특히, 이들 화합물의 투여 또는 제형이 최적화되지 않았다는 것으로 기대된다.
실시예 7: CBX2의 소분자 리프로그래밍
파리의 Policomb 단백질 (CBX2의 유사체)의 구조를 기초로 히스톤 메틸화 마크 리더 CBX2에 컴퓨터 연산 방식을 적용하여, CBX2 리프로그래밍 후보 화합물 다수 (표 5)를 동정하였다 (표 5).
약리단 설명: CBX2는 양으로 하전된 메틸화된 후생 마크에 3개의 잔기, F11, W22 및 W25에 의해 형성된 방향족 케이지를 이용하여 결합한다. 방향족 케이지가 잔기 4개로 형성되는 BPTF와는 달리, CBX2는 개방면 구조를 가진다. 따라서, 충분히 큰 방향족 기를 가진 화합물을 이용하여, 메틸화된 Lys 결합제로서 전형적인 보다 일반적인 4-면 방향족 케이지의 구축을 완성할 수 있다. BPTF와 마찬가지로, CBX2, H3K27H[3,2,1]me[0,1,2] 펩타이드 및 리프로그래밍 화합물로 구성된 트리플 리프로그래밍 복합체의 안정화는, 일부 메틸화된 Lys27과 상기 화합물 간의 수소 결합을 이용하여 달성할 수 있다. 방향족 케이지 안에 이러한 수소 결합의 부재는 K27me3 마크에 대한 CBX2의 선택적인 친화성에 틀림없는 요인일 것이다. 표 5에 나타낸 리프로그래밍 화합물의 경우, 보다 큰 방향족 모이어티의 주변에서 수소 억셉터의 존재는, 트리메틸화된 히스톤 테일에 대한 CBX2의 천연 친화성을 교란시키는 역할을 할 것으로 예상되는 결정적인 요소이다. 화합물에 의해 제공되는 부가적인 수소 억셉터 모티프는 나프탈렌-유사 모이어티 근처에 케톤 모티프를 포함하는 화합물이 하이드록시 모티프 보다 우월하다는 것을 설명해준다. 유사한 논거는 R2NH 모이어티를 포함하는 화합물이 R4N 모이어티에 비해 명백하게 우수하다는 것에도 적용된다. 또한, 수소 억셉터 모티프의 제2 측면 요소 (second flanking component)로서 소수성 모이어티 역시 중요할 수 있는데, 이는 Lys27me2 측쇄의 긴 탄화수소 부분으로 해명될 수 있다. 활성부의 방향족 케이지는 라이신 메틸화된 질소와 상호작용하고, 탄화수소 Cβ, Cγ 및 Cδ는 극성 물 매질에 대해 열려있다. 즉, CH2Br 또는 CH2Ph (NSC14755의 경우)와 같이 적절하게 큰 모이어티는 H3 펩타이드의 이 영역을 덮게 되어, 부가적으로 복합체의 안정성에 기여하게 되는 것으로 예측된다.
표 5: CBX2 리프로그래밍 후보 화합물
화합물 구조 NSC 번호 세포 생존능력에 대한 효과 (생존율 %)
DoHH2 세포 WSU-DLCL2 세포
25
Figure pct00110
 NSC40830 100 60
26
Figure pct00111
 NSC400906 100 90
27
Figure pct00112
 NSC25671 90 40
28
Figure pct00113
 NSC25767 100 100
29
Figure pct00114
 NSC25676 100 80
30
Figure pct00115
 NSC40304 60 40
31
Figure pct00116
 NSC40409 100 100
32
Figure pct00117
 NSC112362 100 90
33
Figure pct00118
 NSC402675 100 100
34
Figure pct00119
 NSC402677 100 90
35
Figure pct00120
 NSC40004 20 17
36
Figure pct00121
 NSC400930 100 90
37
Figure pct00122
 NSC400924 100 80
38
Figure pct00123
 NSC5489 100 80
39
Figure pct00124
 NSC23924 60 20
40
Figure pct00125
 NSC13316 100 50
41
Figure pct00126
 NSC14224 17 10
42
Figure pct00127
 NSC305758 30 10
43
Figure pct00128
 NSC16001 40 10
44
Figure pct00129
 NSC13480 10 10
45
Figure pct00130
 NSC4378 100 80
46
Figure pct00131
 NSC401591 100 90
47
Figure pct00132
 NSC32936 100 100
48
Figure pct00133
 NSC146840 90 40
49
Figure pct00134
 NSC14755 70 50
50
Figure pct00135
 NSC112372
51
Figure pct00136
 NSC2450
실시예 8: 화합물 50의 시험관내 활성
EZH2 유전자에 다양한 돌연변이를 가진 림프구성 악성 종양들은 라이신 27 (H3K27) 잔기에서의 트리-메틸화 히스톤 H3에 증가된 PRC2 활성을 가지는 것으로 입증된 바 있다. 화합물 50을 3종의 림프종 세포주들의 시험관내 생존 능력에 대한 효과를 표준 방법을 이용하여 테스트하였다. 테스트한 세포주들은 DoHH-2 (EZH2, MEF2B 및 MLL2에 대한 야생형); WSU-DLCL2 (EZH2 돌연변이 Y641F (MEF2B 및 MLL2에 대한 야생형)) 및 DB (EZH2 돌연변이 Y641N, MEF2B 돌연변이 D83V 및 MLL2에서의 3개의 돌연변이 (이중 2개는 잔기 Q2736 다음에 절단된 단백질을 만들어내며, 3번째 대립유전자는 잔기 P480에 1개의 염기쌍 결손을 가짐))이었다.
결과들을 도 7에 나타내며, 화합물 50이 용량 의존적인 방식으로 3종의 세포주 모두의 생존 능력을 감소시키지만, EZH2 Y641 돌연변이를 가지고 있는 세포주 WSU-DLCL2에서 가장 높은 활성을 나타냄을 보여준다.
실시예 8: 마우스 이종이식 모델에서 종양 증식에 대한 화합물 50의 효과
WSU-DLCL2 종양 단편을 수컷 NSG 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스는 이식시 9.0 - 9.3 주령이었으며, 마우스가 12.9 - 13.1 주령되었을 때 처리를 개시하였다. 그룹 당 마우스 8마리를 사용하였고, 10일 동안 매일 처리하고, 12일째에 평가하였다. 4일 마다 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하고, 길이 x 폭2 /2으로 종양 체적을 계산하였다.
마우스 그룹들에, 비히클 (대조군), 1 mg/kg 화합물 50 또는 4 mg/kg 화합물 50을 복막내 주사에 의해 처리하였다. 비히클은 50% DMSO/50% PEG-400이었다.
결과는 도 8에 나타내며, 화합물 50은 2가지 용량에서 종양 체적을 감소시킬 수 있다는 것을 입증해준다.
실시예 10: 림프종 세포주의 증식에 대한 화합물 51의 효과
화합물 51 (NSC2540)은 4종의 림프종 세포주들의 생존 능력에 대한 효과를 표준 방법으로 시험관내에서 테스트하였다. 테스트한 세포주들은 DoHH-2, WSU-DLCL2, DB 및 SU-DHL-9 (EZH2 야생형, MEF2B 야생형, MLL2 indel)이었다.
결과는 도 9에 나타내며, 화합물 51이 DoHH-2, WSU-DLCL2 및 SU-DHL-9 세포주들의 생존 능력을 감소시킬 수 있었다는 것을 입증해준다.
실시예 11: 마우스 이종이식 모델에서 종양 증식에 대한 화합물 51의 효과
WSU-DLCL2 종양 단편을 수컷 NSG 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스는 이식시 5.3 - 9.4 주령이었으며, 마우스가 8.6 - 12.7 주령되었을 때 처리를 개시하였다. 대조군은 그룹 당 마우스 8마리를 사용하였고, 화합물 51 처리군에는 그룹 당 마우스 6마리를 사용하였다. 10일 동안 매일 처리하고, 12일째에 평가하였다. 4일 마다 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하고, 길이 x 폭2 /2으로 종양 체적을 계산하였다.
마우스 그룹들에, 비히클 (대조군)을 처리하거나, 또는 화합물 51을 처음 5일간 4 mg/kg으로, 그런 후 5일간 2 mg/kg으로 복막내 주사에 의해 처리하였다. 비히클은 50% DMSO/50% PEG-400이었다.
결과는 도 10에 나타내며, 화합물 51은 종양 체적을 상당히 감소시킬 수 있다는 것을 입증해준다.
실시예 12: 유방암 세포주의 증식에 대한 화합물 50의 효과
화합물 50과 화합물 51은 4종의 유방암 세포주들의 생존 능력에 대한 효과를 표준 방법으로 시험관내에서 테스트하였다. 테스트한 세포주들은 MCF-7, MDA-MB-231, HCC202 (CRL-2316) 및 HCC1500 (CRL-2329)이었다.
결과는 도 11에 나타내며, 화합물 51이 MDA-MB-231, HCC202 (CRL-2316) 및 HCC1500 (CRL-2329) 세포주들의 생존 능력을 감소시킬 수 있었다는 것을 입증해준다.
모든 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이타베이스의 내용들은, 이러한 각각의 개개 특허, 특허 출원, 간행물 및 데이타 베이스 엔트리가 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 포함되는 것으로 표시되는 바와 동일한 범위로 그 전체가 원용에 의해 구체적으로 포함된다.
본 발명은 임의의 특정 구현예들을 들어 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자에게는 본 발명의 사상과 범위로부터 이탈되지 않으면서 이에 대한 다양한 수정들이 자명할 것이다. 이러한 모든 수정들은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이 첨부된 청구항의 범위내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (41)

  1. 히스톤 테일 (histone tail)에 대한 히스톤 마트 리더 (histone mark reader) 단백질의 결합성을 조절하는 후보 화합물을 동정하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (a) 타겟 히스톤 테일 마크와의 복합체에서 상기 리더 단백질의 활성부의 구조 모델을 컴퓨터 연산으로 제작하는 단계;
    (b) 상기 리더 단백질의 활성부에서 상기 타겟 히스톤 테일 마크의 결합에 필요한 하나 이상의 기능적 특징을 동정하는 단계;
    (c) 후보 화합물들을 스크리닝하여, 상기 활성부내 잔기 및 상기 타겟 히스톤 테일 마크와 함께, 단계 (b)에서 동정된 상기 기능적 특징을 실질적으로 재현하는, 후보 화합물을 동정하는 단계를 포함하며,
    상기 구조 모델은 상기 리더 단백질의 동족 (cognate) 히스톤 테일 마크와 복합체를 형성한 상기 리더 단백질의 활성부에 대한 컴퓨터 연산 모델 (computational model)을 기반으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 (c)는, 상기 구조 모델을 이용하여, 상기 활성부내 잔기 및 상기 타겟 히스톤 테일 마크와 함께, 단계 (b)에서 동정된 상기 기능적 특징을 실질적으로 재현하는 프로브 구조를 제작하는 단계를 더 포함하며,
    상기 후보 화합물의 스크리닝은 상기 프로브 구조와 상기 구조 모델을 토대로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프로브 구조를 제작하는 단계는, 상기 프로브 구조, 상기 활성부내 잔기 및 상기 타겟 히스톤 테일 마크 간에 안정적인 복합체를 제공하는 최적의 프로브 구조를 동정하기 위해, 상기 타겟 히스톤 테일 마크와 함께 상기 활성부에서 일련의 프로브 구조들에 대한 반복적인 분자 동역학 시뮬레이션을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 후보 화합물을 스크리닝하는 단계는 상기 안정적인 복합체를 기본으로 하는 평균적인 단백질 구조를 가진 후보 화합물을 도킹 (docking)시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 후보 화합물을 스크리닝하는 단계는 분자 동역학 시뮬레이션, 인 실리코 도킹 방법 (in silico docking method), 구조 유사성 검색 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 타겟 히스톤 테일 마크와 상기 동족 히스톤 테일 마크가 메틸화된 라이신 마크인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 동족 히스톤 테일 마크가 트리메틸화된 라이신이고,
    상기 타겟 히스톤 테일 마크가 다이-메틸화된 라이신, 모노-메틸화된 라이신 또는 비-메틸화된 (un-methylated) 라이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 하나 이상의 기능적 특징이 상기 활성부내 3개 이상의 방향족 잔기에 의해 형성된 방향족 케이지 (aromatic cage)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    상기 하나 이상의 기능적 특징이 수소 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 동족 히스톤 테일 마크가 트리메틸화된 라이신이고,
    상기 타겟 히스톤 테일 마크가 다이-메틸화된 라이신, 모노-메틸화된 라이신 또는 비-메틸화된 라이신이고,
    상기 프로브 구조가 수소 억셉터 (hydrogen acceptor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 프로브 구조가 6원성 지방족 또는 방향족 고리 구조를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 후보 화합물이 가상 소분자 라이브러리로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 상기 히스톤 마크 리더 단백질이 CBX2 또는 BPTF인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 타겟 히스톤 테일 마크에 대한 상기 리더 단백질의 결합의 조절에 대해 평가하기 위해, 단계 (e)에서 동정된 상기 후보 화합물을 한가지 이상의 시험관내 분석으로 테스트하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위한, 일반식 I의 화합물의 용도:
    Figure pct00137

    상기 식에서,
    X는 C=O 또는 S(O)2이고,
    R1은 H, C1-C4 알킬 또는 C1-C4 알콕시이고,
    R2는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00138
    또는
    Figure pct00139
    를 형성하며,
    R4는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고,
    R5는 H, CH2NMe2 또는
    Figure pct00140
    이고,
    R6는 H이고, R7은 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성하되,
    R5가 H이고, R6와 R7이 함께 =CH2를 형성하고, X가 S(O)2인 경우, 그리고 R4가 C1 알킬이고, R5가 CH2NMe2이고, R6와 R7이 함께 =CH2를 형성하는 경우, R1, R2 및 R3 중 하나 이상은 H 이외의 것이며;
    또는
    (b) X는 NH2이고,
    R1 및 R2는 H이고,
    R3 및 R4는 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00141
    또는
    Figure pct00142
    를 형성하며,
    R5는 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이고,
    R6 및 R7은 함께 =O를 형성함.
  16. 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의,
    제15항에 따라 정의된 일반식 I의 화합물의 용도.
  17. 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위해 사용하기 위한, 제15항에 따라 정의된 일반식 I의 화합물.
  18. 암을 치료하기 위한 일반식 I의 화합물의 용도:
    Figure pct00143

    상기 식에서,
    X는 C=O 또는 S(O)2이고,
    R1은 H, C1-C4 알킬 또는 C1-C4 알콕시이고,
    R2는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00144
    또는
    Figure pct00145
    를 형성하며,
    R4는 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고,
    R5는 H, CH2NMe2 또는
    Figure pct00146
    이고,
    R6는 H이고, R7은 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성하되,
    R5가 H이고, R6와 R7이 함께 =CH2를 형성하고, X가 S(O)2인 경우, 그리고 R4가 C1 알킬이고, R5가 CH2NMe2이고, R6와 R7이 함께 =CH2를 형성하는 경우, R1, R2 및 R3 중 하나 이상은 H 이외의 것이며;
    또는
    (b) X는 NH2이고,
    R1 및 R2는 H이고,
    R3 및 R4는 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00147
    또는
    Figure pct00148
    를 형성하며,
    R5는 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이고,
    R6 및 R7은 함께 =O를 형성함.
  19. 암 치료용 약제의 제조에 있어서의,
    제18항에 따라 정의된 일반식 I의 화합물의 용도.
  20. 암을 치료하기 위해 사용하기 위한 제18항에 따라 정의된 일반식 I의 화합물.
  21. 제18항 또는 제19항, 또는 제20항에 있어서,
    상기 암이 MLL2의 활성 저하를 보이는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 암이 비-호지킨 림프종 (NHL), 미만성 라지 B 세포 림프종의 배중심 B (GCB) 서브타입 (DLBCL) (germinal centre B (GCB) subtype of diffuse large B-cell lymphoma), DLBCL의 활성화된 B 세포-유사 (ABC) 서브타입, 폐암, 유방암 또는 신경계 암인 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  23. 제18항 내지 제21항 중 어느 한항에 있어서, 상기 암이 NHL, GCB-DLBCL 또는 ABC-DLBCL인 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서,
    X가 C=O 또는 S(O)2이고,
    R1이 H, C1-C4 알킬 또는 C1-C4 알콕시이고,
    R2가 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고, R3가 H이거나, 또는 R2 및 R3가 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00149
    또는
    Figure pct00150
    를 형성하고,
    R4가 H, C1-C4 알킬, C1-C4 알콕시 또는 할로이고,
    R5가 H, CH2NMe2 또는
    Figure pct00151
    이고,
    R6가 H이고, R7이 H이거나, 또는 R6 및 R7이 함께 =CH2를 형성하는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  25. 제15항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서,
    X가 C=O 또는 S(O)2이고,
    R1이 H 또는 C1-C4 알킬이고,
    R2가 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고, R3가는 H이거나, 또는 R2 및 R3가 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00152
    또는
    Figure pct00153
    를 형성하고,
    R4가 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고,
    R5가 H, CH2NMe2 또는
    Figure pct00154
    이고,
    R6가 H이고, R7이 H이거나, 또는 R6 및 R7이 함께 =CH2를 형성하되,
    R1, R2, R3 및 R4가 각각 H이면, R5는
    Figure pct00155
    인 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  26. 제15항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 일반식 I의 화합물이 식 II를 가지는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물:
    Figure pct00156

    상기 식에서,
    R1은 H 또는 C1-C4 알킬이고,
    R2는 H 또는 할로이고, R3는 H이거나, 또는 R2 및 R3는 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00157
    를 형성하며,
    R4는 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고,
    R5는 CH2NMe2 또는
    Figure pct00158
    이고,
    R6는 H이고, R7은 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성함.
  27. 제15항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서,
    X가 S(O)2이고,
    R1이 H 또는 C1-C4 알킬이고,
    R2가 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고, R3가 H이거나, 또는 R2 및 R3가 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00159
    또는
    Figure pct00160
    를 형성하고,
    R4가 H, C1-C4 알킬 또는 할로이고,
    R5가 H, CH2NMe2 또는
    Figure pct00161
    이고,
    R6가 H이고, R7은 H이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 =CH2를 형성하는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  28. 제15항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서,
    X가 NH2이고,
    R1 및 R2가 H이고,
    R3 및 R4가 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00162
    또는
    Figure pct00163
    를 형성하고,
    R5가 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이고,
    R6 및 R7은 함께 =O를 형성하는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  29. 제15항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서,
    X가 NH2이고,
    R1 및 R2가 H이고,
    R3 및 R4가 이들이 부착된 C 원자와 함께
    Figure pct00164
    를 형성하고,
    R5가 치환된 C1-C4 알킬 또는 비치환된 C2-C4 알킬이되, 여기서 각각의 치환기는 할로겐이고,
    R6 및 R7은 함께 =O를 형성하는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  30. 제15항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서,
    각각의 C1-C4 알킬이 Me인 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  31. 제15항 내지 제30항 중 어느 한항에 있어서,
    각각의 할로가 Cl인 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  32. 제15항 내지 제23항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 화합물이 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물:
    Figure pct00165

    Figure pct00166

    Figure pct00167

    Figure pct00168
    및
    Figure pct00169
  33. 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위한, 하기 화합물들로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 용도:
    Figure pct00170

    Figure pct00171

    Figure pct00172

    Figure pct00173

    Figure pct00174
    및
    Figure pct00175
  34. 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위한 약제의 제조에 있어서의, 제33항에 따른 화합물의 용도.
  35. 히스톤 3의 모노- 또는 다이-메틸화된 라이신 4에 대한 BPTF의 결합을 증가시키기 위해 사용하기 위한, 제33항에 따른 화합물.
  36. 암을 치료하기 위한, 제33항에 따른 화합물의 용도.
  37. 암 치료용 약제의 제조에 있어서의, 제33항에 따른 화합물의 용도.
  38. 암을 치료하기 위해 사용하기 위한 제33항에 따른 화합물.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 암이 MLL2의 활성 저하를 보이는 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 암이 비-호지킨 림프종 (NHL), 미만성 라지 B 세포 림프종의 배중심 B (GCB) 서브타입 (DLBCL), DLBCL의 활성화된 B 세포-유사 (ABC) 서브타입, 폐암, 유방암 또는 신경계 암인 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
  41. 제36항 내지 제39항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 암이 NHL, GCB-DLBCL 또는 ABC-DLBCL인 것을 특징으로 하는 용도 또는 화합물.
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