JP6137703B2 - 癌におけるエピジェネティックな欠陥を修復するためのエフェクタータンパク質相互作用のリプログラミング - Google Patents

Description

本発明は、治療の分野に関し、より詳細には、エピジェネティックな制御異常に起因する癌またはその他の障害を治療するための、ヒストン修飾遺伝子における発癌性機能障害および変異を間接的に修復する小分子化合物を利用した方法、システム、およびアッセイに関するものである。

エピジェネティック機構および遺伝子調節経路の障害（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）は、癌を含む広範囲の重大な疾病状態において、重要な役割を果たしている（Ｍａｉ ＆ Ａｌｔｕｃｃｉ， ２００９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４１：１９９−２１３（非特許文献１））。

非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の体細胞突然変異のゲノムワイドスクリーニングにより、遺伝子発現のエピジェネティック調節に関与する遺伝子／タンパク質において、変異が高率で発生していることがわかった。メチルトランスフェラーゼタンパク質ＥＺＨ２において体細胞突然変異が繰り返し起こると、ＥＺＨ２を構成成分とするＰＲＣ２の活性が増加し、ＮＨＬ発生の原因となる可能性が高いことが判明した。ＥＺＨ２は、ヒストンＨ３リジン２７（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）のトリメチル化を触媒するヒストンマーク「ライター」である。ＥＺＨ２変異を伴うＮＨＬ腫瘍では、ＰＲＣ２のヒストンＨ３Ｋ２７トリメチル化活性が高くなっており、これにより、遺伝子発現の抑制の増大と腫瘍形成が引き起こされることがわかっている（Ｍｏｒｉｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ４２（２）：１８１−１８５（非特許文献２））。

ＥＺＨ２の過剰活性および／または過剰発現は、乳癌、肺癌、前立腺癌（特に、末期前立腺癌）、多発性骨髄腫、および神経系の癌を含む、その他多数の癌との関連が示されている。多くの場合、ＥＺＨ２の過剰活性／過剰発現は、これらの癌の侵攻性または薬剤耐性との関連が示されている。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３マークは、タンパク質ＣＢＸ２によって読み取られる。

メチルトランスフェラーゼＭＬＬ２は、活性化ヒストンマークを書き込む。このヒストン修飾は、リーダータンパク質ＢＰＴＦにより、解釈される。ＭＬＬ２における変異は、非ホジキンリンパ腫においても多く見られ、ＤＬＢＣＬの３２％、濾胞性リンパ腫の８９％にこれらの変異が見られる（Ｍｏｒｉｎ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， Ｎａｔｕｒｅ ４７６： ２９８−３０３（非特許文献３））。これらの腫瘍におけるＭＬＬ２内の変異プロファイルは、機能喪失と完全に一致していた。ＭＬＬ２は、活性化マークであるＨ３Ｋ４ｍｅ３の付与に関与し（Ｙａｐ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， Ｂｌｏｏｄ １１７：２４５１−２４５９（非特許文献４）；Ｓｎｅｅｒｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ， ２０１０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０７：２０９８０−２０９８５（非特許文献５））、この能力が欠失すると、細胞の増殖状態が、転写プログラムの抑制によってではなく、前記細胞が分化促進転写プログラムを活性化できないことによって維持される。ＭＬＬ遺伝子における変異は、胃腺腫、白血病、膀胱癌、および結腸直腸癌においても見られる（Ｇｕｉ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４３：８７５−８７８（非特許文献６）；Ｗａｔａｎａｂｅ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２３３２０（非特許文献７）；Ｚｉｅｍｉｎ−ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｅｌ， ｅｔ ａｌ， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８８：１０７３５−１０７３９（非特許文献８））。

ＢＰＴＦのトリメチル化Ｈ３Ｋ４読み取り能は、当該タンパク質のＰＨＤフィンガードメイン内において単一のチロシンをグルタミン酸に置換するよう設計し、これにより、結合の優先傾向を、Ｈ３Ｋ４についてトリメチルリジンからジメチルリジンへと逆転させることによって、調節されている（Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ２８：６７７−６９１（非特許文献９））。

癌を含む疾患を治療するためのアプローチとして、ヒストンマークリーダーの結合を阻害または分断することが報告されている。特に、ヒストン脱メチル化酵素が、阻害の対象とされている（Ｒｏｔｉｌｉ ＆ Ｍａｉ， ２０１１， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ， ２：６６３−６７９（非特許文献１０）；国際公開第２０１２／０７１４６９号パンフレット（特許文献１）参照）。

国際公開第２０１１／１４３６６９号パンフレットには、ＢＥＴ（ブロモドメインおよび特異的末端（ｅｘｔｒａ−ｔｅｒｍｉｎａｌ））ファミリーに属するタンパク質と、ヒストンＮ末端テール上のアセチル−リジン修飾との相互作用を阻害する化合物および方法が記載されている。具体的に、前記化合物は、前記ＢＥＴファミリータンパク質の前記アセチル−リジンへの結合を抑制する。前記化合物を使用した癌および炎症性疾患の治療についても記載されている。

国際公開第２０１２／１２３１１９号パンフレットには、ヒストンテールと相互作用するタンパク質、およびそのようなタンパク質と相互作用する化合物の同定を可能にする、ビオチンおよびストレプトアビジンを使用したインビトロ法が記載されている。

国際公開第２０１２／１１６１７０号パンフレットには、前記ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）のブロモドメインのアセチル‐リジン結合活性を抑制する化合物が記載されている。

この背景情報は、出願人が本発明に関連する可能性があると考える情報を明らかにするために提供するものである。前記情報のいずれかが本発明に対する先行技術であることを必ずしも認めるものではなく、またそのように解釈されるべきではない。

国際公開第２０１２／０７１４６９号パンフレット

Ｍａｉ ＆ Ａｌｔｕｃｃｉ， ２００９， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４１：１９９−２１３ Ｍｏｒｉｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０１０， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ．， ４２（２）：１８１−１８５ Ｍｏｒｉｎ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， Ｎａｔｕｒｅ ４７６： ２９８−３０３ Ｙａｐ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， Ｂｌｏｏｄ １１７：２４５１−２４５９ Ｓｎｅｅｒｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ， ２０１０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １０７：２０９８０−２０９８５ Ｇｕｉ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， Ｎａｔ． Ｇｅｎｅｔ． ４３：８７５−８７８ Ｗａｔａｎａｂｅ， ｅｔ ａｌ， ２０１１， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２３３２０ Ｚｉｅｍｉｎ−ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｅｌ， ｅｔ ａｌ， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８８：１０７３５−１０７３９ Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ， ２８：６７７−６９１ Ｒｏｔｉｌｉ ＆ Ｍａｉ， ２０１１， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ， ２：６６３−６７９

本発明は、全般的には、癌におけるエピジェネティックな欠陥を修復するためのエフェクタータンパク質相互作用のリプログラミング方法に関する。

一態様においては、本発明は、以下の工程を含む、ヒストンマークリーダータンパク質のヒストンテールへの結合を調節する候補化合物の同定方法に関する。
（ａ）標的ヒストンテールマークと複合体を形成した状態の前記リーダータンパク質の活性部位の構造モデルを、コンピュータにより作成する工程であり、前記構造モデルが、コグネイトヒストンテールマークと複合体を形成した状態の前記リーダータンパク質の活性部位のコンピュータモデルに基づいて作成される工程
（ｂ）前記リーダータンパク質の活性部位における前記標的ヒストンテールマークの結合に必要な機能的特徴を１以上同定する工程
（ｃ）前記（ｂ）工程で同定された機能的特徴を、前記活性部位における残基および前記標的ヒストンテールマークと共に、実質的に再現する化合物を同定することにより、候補化合物をスクリーニングする工程

別の態様においては、本発明は、以下の工程を含む、ヒストンメチル化マークリーダータンパク質のヒストンメチル化テールへの結合を調節する候補化合物の同定方法に関する。
（ａ）標的メチル化ヒストンテールマークと複合体を形成した状態の前記リーダータンパク質の活性部位の構造モデルを、コンピュータにより作成する工程であり、前記構造モデルが、コグネイトメチル化ヒストンテールマークと複合体を形成した状態の前記リーダータンパク質の活性部位のコンピュータモデルに基づいて作成される工程
（ｂ）前記リーダータンパク質の活性部位における前記標的メチル化ヒストンテールマークの結合に必要な機能的特徴を１以上同定する工程
（ｃ）前記（ｂ）工程で同定された機能的特徴を、前記活性部位における残基および前記標的メチル化ヒストンテールマークと共に、実質的に再現する化合物を同定することにより、候補化合物をスクリーニングする工程

別の態様においては、本発明は、ヒストン３のモノまたはジメチル化リジン４へのＢＰＴＦの結合を増加させるための、下記一般式Ｉの化合物の使用に関する。
一般式Ｉ中、
Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＳ（Ｏ）_２であり、
Ｒ_１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはＣ_１−Ｃ_４アルコキシであり、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはハロであり、Ｒ_３は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_２およびＲ_３は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_２ＮＭｅ_２、または下記式であり、
Ｒ_６は、Ｈであり、Ｒ_７は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_６およびＲ_７が、一体となって＝ＣＨ_２を形成し、
ここで、
Ｒ_５がＨであり、かつＲ_６およびＲ_７が一体となって＝ＣＨ_２を形成している場合、Ｘは、Ｓ（Ｏ）_２であり、
Ｒ_４がＣ_１アルキルであり、Ｒ_５がＣＨ_２ＮＭｅ_２であり、かつＲ_６およびＲ_７が一体となって＝ＣＨ_２を形成している場合、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３の少なくとも１つが、Ｈ以外であり；
あるいは、
（ｂ）Ｘは、ＮＨであり、
Ｒ_１およびＲ_２は、Ｈであり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_５は、各置換基がハロゲンである置換Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたは非置換Ｃ_２−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_６およびＲ_７は、一体となって＝Ｏを形成している。

別の態様においては、本発明は、ヒストン３のモノまたはジメチル化リジン４へのＢＰＴＦの結合を増加させるための医薬品の製造における、先に定義した一般式Ｉの化合物の使用に関する。

別の態様においては、本発明は、ヒストン３のモノまたはジメチル化リジン４へのＢＰＴＦの結合を増加させるために使用される、先に定義した一般式Ｉの化合物に関する。

別の態様においては、本発明は、ヒストン３のモノまたはジメチル化リジン４へのＢＰＴＦの結合を増加させる方法であり、先に定義した一般式Ｉの化合物にＢＰＴＦを接触させることを含む方法に関する。

別の態様においては、本発明は、癌の治療のための、先に定義した一般式Ｉの化合物の使用に関する。

別の態様においては、本発明は、癌治療用の医薬品の製造における、先に定義した一般式Ｉの化合物の使用に関する。

別の態様においては、本発明は、癌の治療に使用するための、先に定義した一般式Ｉの化合物に関する。

別の態様においては、本発明は、対象における癌の治療方法であり、先に定義した一般式Ｉの化合物を前記対象に投与することを含む方法に関する。

別の態様においては、本発明は、以下に示す化合物からなる群から選択された化合物の使用に関する。

別の態様においては、本発明は、ヒストン３のモノまたはジメチル化リジン４へのＢＰＴＦの結合を増加させるための医薬品の製造における、先に定義した群から選択された化合物の使用に関する。

別の態様においては、本発明は、ヒストン３のモノまたはジメチル化リジン４へのＢＰＴＦの結合を増加させるために使用される、先に定義した群から選択された化合物に関する。

別の態様においては、本発明は、ヒストン３のモノまたはジメチル化リジン４へのＢＰＴＦの結合を増加させる方法であり、先に定義した群から選択された化合物にＢＰＴＦを接触させることを含む方法に関する。

別の態様においては、本発明は、癌の治療のための、先に定義した群から選択された化合物の使用に関する。

別の態様においては、本発明は、癌治療用の医薬品の製造における、先に定義した群から選択された化合物の使用に関する。

別の態様においては、本発明は、癌の治療に使用するための、先に定義した群から選択された化合物に関する。

本発明のこれらおよびその他の特徴は、添付図面を参照した以下の詳細な説明により、より明らかとなる。

図１は、ＢＰＴＦ、化合物２、およびＨ３Ｋ４ｍｅ１ペプチドで構成される「トリプルリプログラミング複合体」のモデルを示した図である。 図２は、下記（Ａ）および（Ｂ）を調べた実験の結果を示した図である：（Ａ）ＭＬＬ２ホモ接合型挿入欠失変異細胞株であるＳＵ−ＤＨＬ−９およびＰｆｅｉｆｆｅｒに対する化合物１〜３の活性；（Ｂ）ＳＵ−ＤＨＬ−９およびＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞株における化合物３の抑制活性の濃度依存性。 図３は、ＢＰＴＦ標的化合物２および３の細胞毒性効果の特異性を実証する実験の結果を示した図である。（Ａ）異なるリンパ腫細胞株における化合物３の細胞毒性、（Ｂ）２種類のＭＬＬ２変異細胞株における化合物３の用量反応、（Ｃ）ＭＬＬ２変異細胞株における化合物２の用量反応。 図４は、実施例５で用いられた、Ｈ３Ｋ４メチル化テールとの相互作用を評価するためのＢＰＴＦプルダウンアッセイの概略図である。この概略図は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１の結合を安定化し、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の結合を立体的に妨げる化合物を図示している。 図５は、（Ａ）化合物３の存在下および不存在下、ならびに、（Ｂ）化合物２の存在下および不存在下において、ＢＰＴＦと結合したＨ３Ｋ４に対するプルダウンアッセイの結果を示したウエスタンブロットを示す図である。 図６は、化合物２および３について、マウス異種移植モデルにおけるインビボ検査の結果を示した図である。（Ａ）化合物３および（Ｂ）化合物２は、ＳＵ−ＤＨＬ−９（ＭＬＬ２変異）細胞株をマウス異種移植モデルで使用した際、９日間にわたり、腫瘍増加の低減を示した。 図７は、化合物５０（ＮＳＣ１１２３７２）の存在下での各種リンパ腫細胞株の細胞生存性を求めたインビトロアッセイの結果を示した図である。ＤｏＨＨ−２：ＥＺＨ２、ＭＥＦ２Ｂ、およびＭＬＬ２が野生型ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２：ＥＺＨ２の変異Ｙ６４１Ｆ（ＭＥＦ２ＢおよびＭＬＬ２が野生型）ＤＢ：ＥＺＨ２の変異Ｙ６４１Ｎ、ＭＥＦ２Ｂの変異Ｄ８３Ｖ、およびＭＬＬ２に３つの変異 図８は、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２ヒトびまん性大細胞型リンパ腫細胞株を使用した異種移植実験の結果を示した図である。これらの実験では、マウスを１ｍｇ／ｋｇの賦形剤または４ｍｇ／ｋｇの化合物５０で処理した（コントロールおよび４ｍｇ／ｋ処理群間において、ｐ＝０．００４７）。 図９は、化合物５１（ＮＳＣ２４５０）の存在下での各種リンパ腫細胞株（図１に示した細胞株；ＳＵ−ＤＨＬ−９：ＥＺＨ２野生型、ＭＥＦ２Ｂ野生型、ＭＬＬ２挿入欠失変異）の細胞生存性を求めたインビトロアッセイの結果を示した図である。 図１０は、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２ヒトびまん性大細胞型リンパ腫細胞株を使用した異種移植実験の結果を示した図である。これらの実験では、マウスを５日間、４ｍｇ／ｋｇの賦形剤または化合物５１で処理し、次いで、さらに５日間、２ｍｇ／ｋｇの賦形剤または化合物５１で処理した（ｐ＝０．０１２５）。 図１１は、化合物５０または化合物５１の存在下での各種乳癌細胞株の細胞生存性を求めたインビトロアッセイの結果を示した図である。 図１２は、ＣＢＸ２、ＣＢＸ２リプログラミング化合物、およびＨ３Ｋ４ｍｅ１ペプチドで構成される「トリプルリプログラミング複合体」のモデルを示した図である。

本発明は、全般的には、エピジェネティックマークリーダーまたはイレーザを、コグネイト（または自然な）マーク以外のエピジェネティックマークを認識するように「リプログラミング」する方法に関する。前記リーダーまたはイレーザをこのようにリプログラミングすることにより、ある種の疾病状態の原因となり得る異常ライター活性（例えば、機能喪失または過剰活性）の影響を相殺できる。したがって、これらの方法で同定されたリプログラミング化合物は、このような疾病状態の治療に適用できる可能性がある。

したがって、広範な態様において、本発明は、ヒストンマーク「リーダー」の、対応「ライター」によって付与された対応ヒストンマークに対する親和性および／または選択性を改変する小分子化合物の同定方法に関する。リーダータンパク質とヒストン上の修飾リジン残基の相互作用を、例えば、前記ヒストンのリジンテール、介在小分子化合物、および前記マークリーダーのリジンテール結合ポケットで構成される『トリプルリプログラミング複合体』の形成により変更することで、前記マークリーダーにより下流に伝達されるヒストンマークシグナルを（例えば、遺伝子発現を起こすために）、有利に変化／変更できる。したがって、この方法で同定された小分子化合物は、マークライターによって付与されたヒストン上の修飾リジン残基（マーク）と、マークシグナルエフェクタータンパク質（リーダー）間の結合相互作用を、前記リーダーと前記修飾リジン残基の間に新たな結合相互作用を導入することによって調節する。あるヒストンマークによって伝達される下流シグナルを改変するために、小分子化合物を使用してヒストンエピジェネティックマークと対応マークリーダーの間に新たな結合相互作用を導入する（再プログラムする）この方法は、エピジェネティックなシグナル伝達タンパク質の種々のライター／リーダーの組み合わせに適用できる。ヒストンマークリーダーが、それらの基質であるヒストン上のリジン残基の様々な修飾状態に関するシグナルを伝達する方法を変更することにより、ある種のライターの変異（これによるマークのレベルまたは種類の変化）が見られ、これらの変異ライターが癌誘導因子（ｃａｎｃｅｒ ｄｒｉｖｅｒｓ）である（すなわち、癌の一因となるか、または癌を引き起こすもの）ことがわかっている癌等の疾病状態を有利に治療するという目的のため、病原性または異常なエピジェネティックマークの有害作用を修復または逆転させることができる。

本発明の小分子ヒストンマークリーダー「リプログラミング」化合物は、ヒストン／リジンテール、介在化合物、およびマークリーダーのリジンテール結合ポケットを含むトリプル「リプログラミング複合体」を形成するものである。本発明の小分子ヒストンマークリーダー「リプログラミング」化合物の同定は前記リーダーの前記修飾リジンテール結合ポケットにおけるキー結合残基および前記ヒストンマークの前記リジンテールを含むドッキング構造について、コンピュータにより小分子「仮想」化合物ライブラリーをスクリーニングすることで、行ってもよい。小分子『リプログラミング』化合物は、例えば、リーダータンパク質と、エピジェネティックな『マーク』を含むヒストン／リジンテールとの間に新たな相互作用を導入し、前記リジンテール（マーク）の修飾状態にかかわらず、前記リジンテールへの前記リーダータンパク質の結合を可能にしてもよい。小分子『リプログラミング』化合物は、リジンテール／マークの修飾（例えば、メチル化）状態に応じて、特定のリジンテールに対するリーダータンパク質の親和性／結合を増加または低減させるものであってもよい。このようにして確立された新たな相互作用により、小分子『リプログラミング』化合物は、特定のマーク（例えば、メチル化ヒストンリジン残基）に対するマークリーダーの基質特異性を変化させてもよい。

本発明の一態様においては、前記ヒストンマークリーダーは、ＣＢＸ２である。ＣＢＸ２は、ヒストンマークライターであるＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ（ＰＲＣ２タンパク質複合体の成分）によって付与されたマークを読み取る。ＥＺＨ２は、ヒストンＨ３のリジン残基２７（Ｈ３Ｋ２７）にメチル基を付与する。一般的には、ＥＺＨ２は、抑制マークを書き込み、これにより、遺伝子活性の抑制という最終結果が得られる。野生型ＥＺＨ２の発現増加（および、これに応じたマークライター活性の増加）、ならびに、ＥＺＨ２におけるある種の体細胞ミスセンス突然変異（チロシン残基６４１を含むが、これに制限されない）が、Ｈ３Ｋ２７のメチルマークの量または原子価（すなわち、モノ、ジ、またはトリメチル化）を変化させることが知られている。ＥＺＨ２におけるこれらの変化により、正常状態と比べておよび遺伝子抑制が増大され、病原性となり、疾患に関連することがわかっている。特に、これらは発癌性であるか、あるいは、数種類の癌を誘導する変化／変異である可能性が高い。ＣＢＸ２（ＰＲＣ１タンパク質複合体の成分）は、ＥＺＨ２メチルマークのエフェクターとして作用し、正常な機能状態、ならびにＥＺＨ２発現または活性が変化した疾病状態において、ＥＺＨ２に対する抑制（または遺伝子サイレンシング）シグナルの伝達に必須である。本明細書に記載の方法を使用することにより、以下の小分子化合物（リプログラミング化合物）が同定された。すなわち、ＣＢＸ２のメチル化−リジン結合ポケットに結合し、ＣＢＸ２、前記小分子化合物、およびメチル化リジンテールを含むトリプルリプログラミング複合体の形成により、メチル化リジン２７（Ｈ３Ｋ２７）に対するＣＢＸ２の基質特異性を変化させる小分子化合物である。これらの小分子ＣＢＸ２リプログラミング化合物は、リンパ腫（Ｔｙｒ−６４１変異を有するもの）細胞および腫瘍に対し、インビトロおよびインビボで抗癌活性を示すことがわかっている。ＥＺＨ２に対するリーダー（ＣＢＸ２）をリプログラムするこれら小分子化合物の利点は、原理上は、ライター（ＥＺＨ２）における攪乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）とは無関係に、ＥＺＨ２マークにおける疾患を引き起こす（癌の場合には、発癌性の）変化を修復できる、効果的な薬剤になると考えらえることである。したがって、これらの化合物は、ＥＺＨ２タンパク質またはＥＺＨ２遺伝子発現を直接的に標的とするその他の化合物よりも、有利であると考えられる。

本発明の別の態様においては、前記ヒストンマークリーダーは、ＢＰＴＦである。ＢＰＴＦは、ヒストンマークライターであるＭＬＬ２メチルトランスフェラーゼによって付与されたマークを読み取る。ＭＬＬ２は、ヒストンＨ３のリジン残基４（Ｈ３Ｋ４）にメチル基を付与する。一般的には、ＭＬＬ２活性、およびこれにより生じるメチルヒストンマークは、活性化作用があり、遺伝子活性を増加させる。ＭＬＬ２遺伝子発現の低下、またはＭＬＬ２のある種の変異は、疾病状態と関連があることが知られている。特に、ＭＬＬ２における機能喪失型（ＬｏＦ）変異は、極めて高頻度で起こり、非ホジキンリンパ腫またはその他の癌において、発癌「誘導（ｄｒｉｖｅｒ）」変異となる可能性が高い。ＢＰＴＦは、正常状態およびＭＬＬ２活性が乱れている疾病状態の両方で、下流シグナル伝達経路におけるＭＬＬ２ライタータンパク質に関連するシグナルの伝達に必須のエフェクタータンパク質である。本明細書に記載の方法を使用することにより、ＭＬＬ２ライターに対応するＨ３Ｋ４メチルマークに対するＢＰＴＦの基質特異性を変化させることが可能な小分子リプログラミング化合物が同定された。同定された化合物は、前記化合物、Ｈ３Ｋ４マーク、およびＢＰＴＦにおけるメチルＨ３Ｋ４結合ポケットで構成される「トリプルリプログラミング複合体」を形成し、その結果、前記Ｈ３Ｋ４マークに対する前記ＢＰＴＦタンパク質の基質特異性を変化させる化合物である。これらの方法で同定されたＢＰＴＦリプログラミング化合物は、発現低下またはその後に起こる機能喪失型変異を含むＭＬＬ２タンパク質の攪乱による発癌効果を、克服および修復できる。これらの化合物は、変異型ＭＬＬ２またはＭＬＬ２の発現低下に起因するリンパ腫またはその他の癌の治療に効果的な薬剤となると考えらえる。前記ＢＰＴＦリプログラミングアプローチ、ならびにこの手段によって発見された化合物の特に有利な点は、これらは、エピジェネティック調節の不具合の修復に有用であり、直接的に小分子の標的とすることができないＭＬＬ２の機能喪失型変異を伴うリンパ腫等の疾患の治療に有用な薬剤になると考えらえることである。

本発明のある態様においては、本明細書に開示するエピジェネティックマークリーダーの小分子によるリプログラミングは、ＨＭＴであるＥＺＨ２およびＭＬＬ２の攪乱または変異を伴う疾患または障害（リンパ腫、肺癌、乳癌、神経系の癌等の癌を含むが、これらに限定されない）に有用である。

本発明の別の実施形態においては、癌またはその他のエピジェネティック調節（特に、ヒストン修飾）の障害の治療に有用な小分子を、トリプルリプログラミング複合体を形成し、ヒストンにおけるメチル化アミノ酸残基に対するメチル化マークリーダーの基質特異性または結合親和性を変化させることによって同定してもよい。

本発明のある態様は、アセチル化を含むが、これに限定されず、別のタイプ／クラスのエピジェネティックマーク、ならびにこれらに対応するライターおよびリーダーへの、本発明の方法の応用に関するものである。

本発明の別の態様は、本明細書に開示の本発明の方法によって同定されたリプログラミング化合物について、種々のヒストンマークに対するリーダーの基質特異性または結合親和性を改変するその特性を、検証し裏付ける生化学結合アッセイに関する。このアッセイは、メチル化ヒストンリジン残基（マーク）、マークリーダーメチル化リジン結合ポケット、および介在小分子リプログラミング化合物で形成されたトリプルリプログラミング複合体に基づいている。当該結合アッセイは、対応するリーダータンパク質によって「プルダウン」させた特定のヒストンリジン残基のメチル化状態を、特定のリプログラミング候補化合物の存在下または不在在下で測定するものである。

本発明のある態様は、別のタイプ／クラスのエピジェネティックマーク、ならびに、これらに対応するライターおよびその生化学機能がヒストンマーク（メチル基またはアセチル基）の除去であるヒストンマーク「イレーザ」（すなわち、脱メチル化酵素または脱アセチル化酵素）への、本発明の方法の応用に関する。多くのヒストンイレーザタンパク質が、数種類の異なる癌において過剰発現していることが知られていることから、イレーザと結合および／または相互作用してイレーザ活性を抑制する小分子化合物は、癌治療の候補薬剤となる。候補ヒストンマークイレーザ標的タンパク質の例としては、その生化学機能がＨ３Ｋ４（ｍｅ２／１）メチルマークからのメチル残基の除去であるＬＳＤ１、その生化学機能がＨ３Ｋ４（ｍｅ３／２）メチルマークからのメチル残基の除去であるＰＬＵ１、その生化学機能がＨ３Ｋ９（ｍｅ３／２）メチルマークからのメチル残基の除去であるＧＡＳＣ１、および、抑制すればＭＬＬ２の機能喪失型変異の発癌効果を修復または打ち消すことができると考えらえるその他のＨ３Ｋ４マークイレーザが挙げられる。

本発明の別の態様は、ＭＬＬ２ヒストンメチルトランスフェラーゼの機能喪失型変異に起因する癌またはその他の障害の治療のための、Ｈ３Ｋ４イレーザ（ＬＳＤ１およびＰＬＵ１を含むが、これらに限定されない）阻害剤と、小分子ＢＰＴＦリプログラミング化合物（本明細書中に記載のもの）との併用に関するものである。

本発明の別の広範な態様は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびその他の癌を治療するための療法の開発アプローチとしての、ＭＬＬ２タンパク質機能の人工的なシミュレーションに関する。

本発明のある態様は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼタンパク質ＭＬＬ２がＬｏＦ変異を有するびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の濾胞中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）亜型、ヒストンメチルトランスフェラーゼタンパク質ＭＬＬ２がＬｏＦ変異を有するびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）亜型、および／または、肺癌、乳癌、および神経系の癌を含むが、これらに限定されない、不活性化ＭＬＬ２タンパク質が関連する癌を治療するための療法の開発において、標的として用いられる転写因子ＢＰＴＦに関する。

本発明のある態様は、ＢＰＴＦタンパク質と相互作用または結合し、これにより、ヒストンＨ３タンパク質のリジン４のメチル化形態に対するＢＰＴＦの特異性を変化させると予測される化合物として、化合物ＮＳＣ３８２００１（化合物１）、ＮＳＣ３０４１０７（化合物２）、ＮＳＣ１２７７６３（化合物３）、ならびに、その他の化合物（本明細書中の表２、３、および４に列挙したものを含むが、これらに限定されない）に関する。

本発明のある態様は、ＮＨＬ、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ、ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ、および／または、低活性タンパク質発現を伴う癌（肺癌、乳癌および神経系の癌を含むが、これらに限定されない）の治療に有望な作用物質として、化合物ＮＳＣ３８２００１（化合物１）、ＮＳＣ３０４１０７（化合物２）、ＮＳＣ１２７７６３（化合物３）、ならびに、その他の化合物（本明細書中の表２、３、および４に列挙したものを含むが、これらに限定されない）に関する。

本発明の別の態様は、下記ａ）、ｂ）またはｃ）であるＮＨＬ、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ、またはＧＣＢ−ＤＬＢＣＬの治療に有望な新規作用物質として、化合物ＮＳＣ３８２００１（化合物１）、ＮＳＣ３０４１０７（化合物２）、ＮＳＣ１２７７６３（化合物３）、ならびに、その他の化合物（本明細書中の表２、３、および４に列挙したものを含むが、これらに限定されない）に関する。
ａ）ヒストンメチルトランスフェラーゼＭＬＬ２の変異が見られる
ｂ）ヒストンメチルトランスフェラーゼタンパク質ＭＬＬ２がＬｏＦ変異を有し、ヒストンＨ３におけるリジン４残基のトリメチル化が低減している
ｃ）ＭＬＬ２タンパク質の活性が正常状態または野生型と比べて低い

本発明のさらに別の態様は、ＭＬＬ２のＬｏＦ変異および（変異またはＥＺＨ２タンパク質発現の増加のいずれかを原因とする）ＥＺＨ２活性の増加の両方が見られる癌の治療を目的とした、ＢＰＴＦと相互作用／結合する化合物、すなわち、ＮＳＣ３８２００１（化合物１）、ＮＳＣ３０４１０７（化合物２）、ＮＳＣ１２７７６３（化合物３）、ならびに、その他の化合物（本明細書中の表２、３、および４に列挙したものを含むが、これらに限定されない）と、タンパク質ＣＢＸ２と相互作用／結合する化合物（例えば、本明細書中の表５に示すもの）との併用に関する。例としては、ＮＨＬ、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ、ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌および神経系の癌が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の別の態様は、ＭＬＬ２タンパク質の活性低下（例えば、ＬｏＦ変異による）を伴う癌（ＮＨＬ、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ、ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌および神経系の癌を含むが、これらに限定されない）の治療のための化合物、すなわち、化合物ＮＳＣ３８２００１（化合物１）、ＮＳＣ３０４１０７（化合物２）、ＮＳＣ１２７７６３（化合物３）、ならびに、その他の化合物（本明細書中の表２、３、および４に列挙したものを含むが、これらに限定されない）と、標準治療（標的または非標的）または新生の治療との併用に関する。ある実施形態では、タンパク質ＣＢＸ２（例えば、本明細書中の表５に示すもの）と相互作用／結合する化合物を、さらに併用してもよい。

＜定義＞
特に定義しない限り、本明細書中で使用するあらゆる技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書中で使用される「約」という用語は、所与の数値から±１０％前後の変動を指す。そのような変動は、本明細書中に記載のあらゆる数値に常に含まれるものと解釈すべきである。

本明細書中で使用される「複数」という用語は、１以上、例えば、２以上、３以上、４以上等を意味する。

本明細書中で「ａ」または「ａｎ」という単語を「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と共に使用した場合、それは「１」を意味する場合もあるが、「１以上」、「少なくとも１」、および「１または１を超える」という意味も有しうる。

本明細書中で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、ならびにその文法的変化形は、包括的または非限定的な表現であり、記載されていない追加の構成要素や方法工程を除外するものではない。本明細書中で「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を、組成物、使用、または方法に関連して使用した場合、それは、追加の構成要素および／または方法工程が存在する場合があるが、これらの追加は、記載の組成物、方法、または使用の機能に実質的な影響を及ぼさないことを示す。本明細書中で「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語を、組成物、使用、または方法に関連して使用した場合、それは、追加の構成要素および／または方法工程の存在を除外するものである。本明細書中に、ある構成要素および／または工程を含むと記載された組成物、使用、または方法は、ある実施形態では、これらの構成要素および／または工程から本質的になるものであってもよいし、また別の実施形態では、これらの構成要素および／または工程からなるものであってもよく、これらの実施形態が具体的に記載されているか否かにかかわらず認められる。

「療法」および「治療」という用語は、本明細書中で同義に用いられており、ある疾患に対し、症状の緩和、進行の防止、または病状の変更を意図して行われる介入を指す。よって、ある実施形態において、療法および治療という用語は、最も広い意味で使用されており、種々の実施形態において、様々な病期の疾患に対する予防、緩和、軽減、および／または治癒の１以上を包含してもよい。したがって、療法／治療を要するものとは、前記疾患を既に有するものに加え、前記疾患、障害、もしくは状態を起こしやすいか、または、これらを発症するリスクがあるもの、前記疾患を予防する必要があるものを含んでもよい。

本明細書で使用される「対象」および「患者」という用語は、治療を必要とする動物を指す。

本明細書で使用される「動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。

さらに１以上の別の治療薬と「組み合わせた」本発明の化合物の投与とは、同時（並行）投与および連続投与を含むことを意図している。連続投与とは、（１以上の）前記治療薬および本発明の（１以上の）化合物について、種々の順序での対象への投与を包含することを意図するものであり、前記治療薬および前記化合物の投与の間隔は、短く設定されてもよいし（例えば、数分程度）、長く設定されてもよい（例えば、数日または数週間程度）。

「Ｃ_１−Ｃ_４アルキル」という用語は、炭素数１〜４の直鎖または分枝アルキル基を指す。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−ブチル）が挙げられる。

「ハロゲン」および「ハロ」という用語は、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素原子を指す。

「Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ」という用語は、ＲがＣ_１−Ｃ_４アルキルである‐ＯＲ基を指す。

＜標的タンパク質＞
本発明の方法に好適な標的タンパク質としては、ヒストンマークリーダーおよびイレーザが挙げられる。これらの例は、前記リーダータンパク質としてＣＢＸ２、ＢＰＴＦ、ＨＰ１、５３ＢＰ１、およびＬ３ＭＢＴＬ１、ならびに、前記イレーザータンパク質として、アミノオキシダーゼファミリーまたはＪｍｊＣドメイン含有タンパク質ファミリーに属するヒストンＬｙｓ脱メチル化酵素（ＫＤＭ）イレーザタンパク質であるＬＳＤ１、ＰＬＵ１、およびＧＡＳＣ１等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のある実施形態では、前記標的タンパク質は、ＣＢＸ２、ＢＰＴＦ、ＨＰ１、５３ＢＰ１、またはＬ３ＭＢＴＬ１等のヒストンマークリーダーである。いくつかの実施形態では、前記標的タンパク質は、ヒストンメチル化マークリーダーである。

ある実施形態では、前記標的タンパク質は、ヒストンテールにおけるトリメチル化リジン残基を優先的に認識するヒストンメチル化マークリーダーである。このようなリーダータンパク質の例として、ＢＰＴＦ、ＣＢＸ２、およびＨＰ１が挙げられるが、これらに限定されない。

ある実施形態では、前記標的タンパク質は、ＣＢＸ２である。ＣＢＸ２は、クロモボックス相同体（ｃｈｒｏｍｏｂｏｘ ｈｏｍｏｌｏｇ）２、ＭＧＣ１０５６１、細胞分裂周期関連因子（ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｃｙｃｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）６、Ｍ３３、クロモボックス相同体２（ショウジョウバエ属のＰｃクラス）、ＣＤＣＡ６、クロモボックス相同体２（Ｐｃクラス相同体、ショウジョウバエ属）、クロモボックスタンパク質相同体２、修飾因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）３、およびＰｃクラス相同体としても知られている。ＣＢＸ２のデータベース識別子としては、「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：ＣＢＸ２＿ＨＵＭＡＮ，Ｑ１４７８１」、「ＨＧＮＣ：１５５２１」、および「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８４７３３２」が挙げられる。

ある実施形態では、前記標的タンパク質は、ＢＰＴＦである。ＢＰＴＦは、ブロモドメインＰＨＤフィンガー転写因子、ＦＡＣ１、胎児性アルツハイマー抗原（Ｆｅｔａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ａｎｔｉｇｅｎ、ＦＡＬＺ、ＮＵＲＦ３０１、ブロモドメイン、およびＰＨＤフィンガー含有転写因子、胎児性Ａｌｚ−５０クローン１タンパク質（Ｆｅｔａｌ Ａｌｚ−５０ ｃｌｏｎｅ １ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＯＴＴＨＵＭＰ０００００１６３０８４としても知られている。ＢＰＴＦのデータベース識別子としては、「ＨＧＮＣ：３５８１」、「Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２１８６」、「Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１７１６３４」、「ＯＭＩＭ：６０１８１９」、および「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１２８３０」が挙げられる。

＜リプログラミング方法＞
ある態様では、本発明は、前記標的タンパク質について、そのコグネイトヒストンマークに対する選択性を改変可能な候補化合物（「リプログラミング化合物」）を同定するための、コンピュータを用いた方法に関する。前記化合物の同定は、前記標的タンパク質が、そのコグネイトヒストンテールマークを構成する修飾アミノ酸残基に結合する場合には存在するが、前記残基の修飾状態が異なる場合には存在しない、ある種の結合相互作用を、前記化合物が打ち消すことができるか否かに基づいて行われる。通常、前記方法は、修飾ヒストンリジンテールと、候補化合物と、前記リジンテールに結合する標的タンパク質の活性部位におけるキー残基とで構成される、「トリプルリプログラミング複合体」を生成することを含む。

前記リプログラミング方法は、本明細書中では、リーダータンパク質に関する実施形態を用いて説明されているが、当業者であれば、前記リプログラミングをイレーザタンパク質にも適用できることを理解するものである。よって、本発明のある実施形態は、イレーザタンパク質のリプログラミング方法に関する。

ある実施形態では、前記方法は、リーダータンパク質の活性部位の構造モデルを、再プログラムにより、前記リーダーの結合対象とされる非コグネイトヒストンテールマーク（標的ヒストンテールマーク）との複合体を形成した状態で、コンピュータを用いて生成することを含む。この構造モデルは、典型的には、コグネイトヒストンテールマークとの複合体を形成したリーダータンパク質の活性部位の公知のコンピュータモデルであり、前記活性部位における前記コグネイトヒストンテールマークの結合を特徴づける１以上の機能的特徴が既に同定されているモデルに基づいている。「機能的特徴」とは、活性部位におけるコグネイトヒストンマークの結合または安定化に貢献する特徴を意味する。このような特徴としては、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、および／または疎水性相互作用等の、ある種の非共有相互作用の有無；水素結合供与体、水素結合受容体、疎水性の残基または基、芳香族の残基または基等の、ある種の基または残基の有無；活性部位における官能基および／またはコグネイトヒストンマーク間の間隔、脂肪族鎖の長さ等の、立体構造に関する特徴が挙げられる。種々のリーダータンパク質活性部位のコンピュータモデルは、ラトガース大学、ニュージャージー州立大学、およびカリフォルニア大学サンディエゴ校によって管理される蛋白質構造データバンク等の、公衆にアクセス可能なデータベースより入手できる。

標的ヒストンテールマークとの複合体を形成したリーダータンパク質の活性部位の構造モデルは、次に、前記リーダータンパク質の活性部位における前記標的ヒストンテールマークの結合に必要な１以上の追加の機能的特徴の同定に使用できる。例えば、前記モデルのコンピュータによる検査解析により、前記リーダータンパク質の活性部位における前記標的ヒストンマークを安定化するために、水素結合または疎水性相互作用等の追加の機能的特徴を追加または除去する必要があると示される場合がある。候補リプログラミング化合物により、このような追加の機能的特徴を提供する際には、前記リーダーの活性部位における前記標的ヒストンマークの結合を考慮する必要がある。

三分子複合体は、二分子複合体と比べて本質的にエントロピー的に好ましくないため、修飾ヒストンリジンテールと、候補化合物と、活性部位におけるキー残基とを含む最終形のトリプルリプログラミング複合体は、前記三分子複合体に付随するエントロピー損失と、結果的に生じる自由エネルギーに対処しなくてはならない。これは、例えば、前記標的ヒストンマークと非競合的に結合するよう選択された、一連の鋳型（「プローブ」）構造の使用によって成し得る。前記一連のプローブ構造は、エネルギー的に最も安定なトリプルリプログラミング複合体を提供するプローブ構造を同定するため、システム全体の挙動を観察しながら、繰り返し選別され得る。

したがって、ある実施形態では、適切な候補化合物を同定するため、安定したトリプルリプログラミング複合体に必要不可欠な機能的特徴を提供するプローブ構造を生成してもよい。前記プローブ構造は、例えば、一連のプローブ構造を、例えば、分子動力学シミュレーションおよび／または目視検査を使用して繰り返し選別し、好適な安定構造を同定することにより、生成してもよい。活性部位に結合した最終的なプローブの構造を、引き続き、候補化合物を同定するための基礎として使用できる。

候補化合物は、例えば、Ｚｉｎｃ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｏｐｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙ ＤＩＶＥＲＳｅｔ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｌｉｂｒａｒｙ、ＡｓｉｎｅＸ社のＰｌａｔｉｎｕｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、およびＮａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓによって提供されるもの等の、化合物の仮想ライブラリーのスクリーニングによって同定してもよい。

同定された機能的特徴を提供する化合物の能力をスクリーニングする様々な方法が、当業者に利用可能である。例えば、コンピュータスクリーン上での活性部位およびプローブ構造の目視検査から、前記プロセス全体を開始してもよい。次に、選択した化合物を、活性部位内において、様々な向きで配置するか、またはドッキングさせ、これらの化合物が、前記プローブ構造の機能的特徴を十分に再現可能であるかどうかを決定できる。ドッキングは、Ｑｕａｎｔａ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、ＦｌｅｘＸ（ＴＲＩＰＯＳ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｎｎ．）、およびＤＯＣＫ等の、様々な市販のソフトウェアを用いて行えばよい。ドッキングに次いで、エネルギー最小化、およびＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）等の標準的な分子力学力場を用いた分子動力学を、行うことができる。当該技術分野当該技術分野で公知および／または市販のその他の専門的なコンピュータプログラムにより、候補化合物の選択プロセスを補佐してもよい。

あるいは、前記適切な機能的特徴を提供する候補化合物を、コンピュータを用いた標準的な方法を用いて新たに生成してもよい。様々なデノボ設計方法が、当該技術分野当該技術分野で公知である。

化合物を設計または選択してしまえば、必要に応じて、前記化合物が前記標的ヒストンマークおよび前記リーダーの活性部位と相互作用する効率を、コンピュータによる評価により、検査および最適化してもよい。化合物の変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価するための特殊なコンピュータソフトウェアが、当該技術分野当該技術分野において利用可能である。このような用途のために設計されたプログラムの例としては、ＡＭＢＥＲ、ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）等が挙げられる。

＜インビトロ評価＞
本明細書に記載のリプログラミング方法を用いて同定された候補化合物は、次に、例えば、標的ヒストンマークへのリーダータンパク質の結合を調節するその能力、および／または、そのコグネイトライタータンパク質の異常活性が関与する疾病状態（癌等）における活性を、インビトロで評価できる。

標的ヒストンマークへのリーダータンパク質の結合を調節する候補化合物の能力は、表面プラズモン共鳴または蛍光偏光等、様々な標準的なインビトロ技術によって評価できる。

本発明のある実施形態は、標的マークへの候補化合物の結合を特徴付けるための「プルダウン」アッセイの使用に関する。ＢＰＴＦに適用したこのようなアッセイの概略図を図４に示し、その説明を実施例５に記載している。簡潔には、ＢＰＴＦのＧＳＴ標識ＰＨＤフィンガーブロモドメインを、前記候補化合物、および、Ｈ３Ｋ４ｍｅ０、ｍｅ１、ｍｅ２またはｍｅ３ペプチドであって前記ペプチド上のビオチン分子を介してストレプトアビジン標識ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に結合させたものと共に、インキュベートした。適切な緩衝液で洗浄した後、結合したタンパク質を前記ビーズから溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび任意にウエスタンブロットによって評価した。当業者であれば、このアッセイは、その他のリーダー／イレーザおよびヒストンマークに容易に適合可能であることを理解できる。

上記に代わる方法として、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社によって開発されたアルファ技術等の技術を、標的ヒストンマークへのリーダーの結合を調節する候補化合物の能力を評価するために使用してもよい。このような技術によれば、このような評価がハイスループットで行える。前記アルファ技術によるアッセイでは、例えば、ストレプトアビジンに結合したアルファ供与体ビーズと、グルタチオンに結合したアルファ受容体ビーズを使用する必要がある。前記リーダーの相互作用ドメインは、グルタチオンを介したアルファ受容体ビーズとのカップリングを可能にするグルタチオンＳ−転移酵素タグを導入するコンストラクトに、クローニングできる。特異的なエピジェネティック修飾を有するビオチン化ヒストンペプチドは、市販のものを購入可能であり、ストレプトアビジンを介して前記アルファ供与体ビーズに結合させることができる。前記相互作用ドメインが前記ヒストンペプチドに結合すれば、前記アルファ供与体および受容体ビーズが互いに近接する。そして、前記供与体ビーズがある波長の光で励起されると、酸素分子を放出し、この酸素分子が前記受容体ビーズと反応して、前記受容体ビーズに、結合相互作用を起こす出力シグナルとして、化学発光を生じさせる。

ライタータンパク質の異常な活性が関連する疾病状態（癌等）についての様々なインビトロアッセイを、前記候補化合物の活性の評価に使用してもよい。例えば、前記化合物の細胞毒性を、好適な細胞株、典型的には癌細胞株を使用して、インビトロで評価できる。一般的には、検査細胞株から選択した細胞を、適切な密度となるまで成長させ、前記候補化合物を添加する。適切なインキュベート時間（例えば、約４８時間から７２時間）の後、細胞生存を評価する。細胞生存を求める方法は、当該技術分野当該技術分野において周知であり、レサズリン還元試験（Ｆｉｅｌｄｓ ＆ Ｌａｎｃａｓｔｅｒ （１９９３） Ａｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌａｂ． １１：４８−５０； Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７：５４２１−５４２６、および米国特許第５，５０１，９５９号明細書参照）、スルホローダミンアッセイ（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８２：１１３−１１８）、またはニュートラルレッド色素試験（Ｋｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｅｕｒｏ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｇ． ２１：５３−５８； Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍ． ９９：９５−１００）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞毒性は、処理した培養物中の細胞生存を、１以上のコントロール培養物（例えば、非処理の培養物および／またはコントロール化合物（典型的には、公知の治療薬）で前処理した培養物）中の細胞生存と比較することにより、求められる。

前記化合物の癌細胞の増殖抑制能は、例えば、対象の癌細胞株の細胞を好適な培地で培養することにより、インビトロで評価できる。適切なインキュベート時間の後、前記細胞を前記候補化合物で処理し、さらにインキュベートできる。次に、細胞を計数し、適切なコントロールと比較する。好適なコントロールとしては、例えば、標準的な化学療法剤で処理した細胞および／または非処理の細胞が挙げられる。

上記に代わる方法として、前記化合物について、腫瘍細胞の足場非依存性増殖の抑制能を求めるインビトロ検査を行うことができる。足場非依存性増殖は、腫瘍形成能の良好な指標であることが、当該技術分野当該技術分野では公知である。一般的に、足場非依存性増殖は、選択した癌細胞株由来の細胞を軟寒天上に播種し、適切なインキュベート時間の後、形成されたコロニーの個数を求めることによって評価される。そして、前記候補化合物で処理した細胞の成長を、コントロール細胞（前述のとおり）の成長と比較できる。

当該技術分野当該技術分野で公知のその他の様々なアッセイを使用してもよい。

前記候補化合物の検査に好適な様々な癌細胞株が、当該技術分野当該技術分野で公知であり、また、その多くが市販されている（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）。

必要であれば、前記化合物の毒性を、標準的な技術を用い、最初にインビトロで評価することもできる。例えば、ヒト初代線維芽細胞を前記候補化合物でインビトロ処理し、処理後の異なる時点において、前述のアッセイ等の標準的な生存性アッセイ、またはトリパンブルー色素排除アッセイを使用した検査を行うことができる。また、細胞のＤＮＡ合成能については、例えば、チミジン取り込みアッセイを用いて、さらに、細胞周期動力学（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ）における変化については、例えば、標準的な細胞分類アッセイを、蛍光サイトメーターセルソーター（ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）（ＦＡＣＳ）と共に用いて評価できる。

＜医薬組成物＞
本発明のある実施形態は、本明細書に記載の方法によって同定されたリプログラミング化合物と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または医薬品添加物とを含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、公知の手法により、容易に入手可能な周知の成分を使用して調製される。

前記リプログラミング化合物または当該化合物を含む医薬組成物は、経口投与（例えば、口腔または舌下投与を含む）、局所投与、非経口投与、吸入もしくは噴霧による投与、または経直腸投与用に、従来使用されている非毒性の薬学的に許容可能な担体、補助剤、および賦形剤を含有する投与単位製剤の形で調製してもよい。典型的には、前記化合物を、許容可能な賦形剤に混合し、投与に適した形態、すなわち、シロップ剤、エリキシル剤、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、硬カプセルもしくは軟カプセル、丸薬、坐薬、油性もしくは水性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒剤、エマルション、注射剤、または溶液等に製剤する。本明細書中で使用される非経口という用語は、皮下注射および皮内、関節腔内、静脈内、筋肉内、血管内、胸骨内、髄腔内への注射または注入技術を含む。

経口使用を意図した組成物は、固体または流体のいずれの単位剤形で調製してもよい。流体の単位剤形は、当該技術分野で公知の医薬組成物の製造手法によって調製でき、このような組成物は、薬学的に洗練された、口当たりの良い製剤を提供するため、甘味料、香味料、着色剤、および保存料からなる群から選択された１以上の作用物質を含んでもよい。エリキシル剤は、糖およびサッカリン等の好適な甘味料を含む含水アルコール（例えば、エタノール）賦形剤を、芳香族香味料と共に使用して調製される。懸濁液は、水性賦形剤を、アラビアゴム、トラガカントゴム、メチルセルロース等の懸濁化剤と共に用いて調製できる。

錠剤等の固形製剤は、有効成分を、錠剤の製造に好適な、非毒性かつ薬学的に許容可能な医薬品添加物との混合物として含有する。これらの医薬品添加物としては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤；例えば、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸等の造粒剤および崩壊剤；例えば、デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石のような潤滑剤；ならびに、リン酸二カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、ラクトース、メチルセルロース、および機能的に類似した材料等、従来使用されているその他成分が挙げられる。錠剤はコーティングしなくてもよいし、あるいは、公知の技術によってコーティングを施し、胃腸管における崩壊と吸収を遅延させ、これにより、より長期間にわたる持続的作用を与えてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の時間遅延物質を使用してもよい。

経口使用のための製剤は、有効成分が不活性固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセルとして、あるいは、有効成分が水または油性媒質（例えば、、ラッカセイ油、流動パラフィン、またはオリーブ油）と混合されている軟ゼラチンカプセルとして、提供してもよい。軟ゼラチンカプセルは、前記化合物のスラリーを、許容可能な植物油、軽流動ワセリン、または他の不活性油で、機械によりカプセル封入することにより調製される。

水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な医薬品添加物と混合した活物質を含有する。このような医薬品添加物としては、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような懸濁化剤；天然由来のホスファチド、例えば、レシチン、または脂肪酸とアルキレンオキシドとの縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、または長鎖脂肪アルコールとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ヘプタ−デカエチレンオキシセタノール、または脂肪酸とヘキシトールとから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、または脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン等の分散剤または湿潤剤が挙げられる。前記水性懸濁液はまた、１以上の保存料、例えば、エチルもしくはｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、１以上の着色剤、１以上の香味料、またはスクロースもしくはサッカリン等の１以上の甘味料を含有してもよい。

例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油等の植物油、または流動パラフィンのような鉱物油に有効成分を懸濁することにより、油性懸濁液を調製してもよい。前記油性懸濁液は、例えば、蜜ろう、固形パラフィン、またはセチルアルコールのような増粘剤を含有してもよい。上述のような甘味料、および香味料を添加し、口当たりのよい経口製剤を提供してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤を添加して保存してもよい。

水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性粉末および顆粒は、有効成分を、分散剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤、および１以上の保存料との混合物の形態で提供する。好適な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤の例としては、上述のものが挙げられる。追加の医薬品添加物、例えば、甘味料、香味料、および着色剤を含有させてもよい。

本発明の医薬組成物は、水中油型エマルションとして製剤してもよい。油相は、例えば、オリーブ油もしくはラッカセイ油のような植物油、または、例えば、流動パラフィンのような鉱物油、あるいはこれらの混合物とすることができる。好適な乳化剤としては、天然由来のゴム、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴム；天然由来のホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン；ならびに、脂肪酸およびヘキシトールに由来するエステルもしくは部分エステル、無水物、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、およびエチレンオキシドと前記部分エステルとの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンが挙げられる。前記エマルションは、甘味料および香味料を含有してもよい。

前記医薬組成物は、滅菌注射用の水性または油性懸濁液の形態としてもよい。この懸濁液は、前述のような好適な分散剤もしくは湿潤剤と懸濁化剤とを使用して、公知の技術により調製すればよい。滅菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液とすることができ、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液とすることができる。使用してもよい許容可能な賦形剤および溶媒として、水、リンゲル液、および等張食塩水が挙げられる。これらに加え、滅菌された不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として従来使用されている。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含むあらゆる無刺激性不揮発性油を使用できる。さらに、オレイン酸等の脂肪酸も、注射剤の製剤に使用できる。局所麻酔薬、保存料、および緩衝剤等の補助剤を、前記注射用溶液または懸濁液に含有させることもできる。

直腸投与用の組成物を、前記薬剤を、常温では固体であるが直腸温度では液体であり、よって直腸で溶解して前記薬剤を放出する好適な非刺激性医薬品添加物と混合することにより、調製できる。このような材料としては、カカオ脂およびポリエチレングリコールが挙げられる。

他の医薬組成物および医薬組成物の調製方法が当該技術分野で公知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（以前の「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。

＜使用＞
本発明のある実施形態は、エピジェネティックな制御異常に起因する癌またはその他の障害を治療するための、本明細書に開示の方法で同定された、ヒストン修飾タンパク質における機能障害および変異を間接的に修復するリプログラミング化合物の使用に関する。いくつかの実施形態では、前記化合物は、ヒストンマークリーダーまたはイレーザタンパク質の結合活性を、前記タンパク質が、そのコグネイトマーク以外のマークに結合可能となるように調節する。このようにして、前記化合物の使用により、癌等の特定の疾病状態を特徴付ける異常ライター活性の悪影響を、相殺または逆転させることができる。

ある実施形態では、前記リプログラミング化合物は、ヒストンメチル化リーダーの結合活性を調節するものであり、したがって、例えば、ＥＺＨ２またはＭＬＬ２等のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ライター）の異常活性を特徴とする疾患の治療に有用である可能性がある。

本発明のある実施形態は、ＭＬＬ２のメチル化活性の低下を特徴とする疾患の治療において、ＢＰＴＦの結合活性を、例えば、モノまたはジメチル化Ｈ３Ｋ４に対するＢＰＴＦの結合能を増大させることによって調節するリプログラミング化合物の使用を提供する。例えば、ＢＰＴＦリプログラミング化合物を、癌の治療、特に、ＭＬＬ２のメチル化活性の低下を特徴とする癌の治療に使用できる。ＭＬＬ２の機能喪失型変異が関連する癌としては、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）型びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、不活性化ＭＬＬ２タンパク質が関連する癌としては、肺癌、乳癌、および神経系の癌挙げられるが、これらに限定されない。

したがって、本発明のある実施形態は、ＮＨＬ、ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ、肺癌、乳癌、または神経系の癌の患者において、モノまたはジメチル化Ｈ３Ｋ４へのＢＰＴＦの結合能を増大させるための、ＢＰＴＦリプログラミング化合物の使用に関する。

本発明のある実施形態は、ＥＺＨ２のメチル化活性の増加を特徴とする疾患の治療において、ＣＢＸ２の結合活性を、例えば、モノまたはジメチル化Ｈ３Ｋ２７に対するＣＢＸ２の結合能を増大させることによって調節するリプログラミング化合物の使用を提供する。例えば、ＣＢＸ２リプログラミング化合物を、癌の治療、特に、ＥＺＨ２のメチル化活性の増加を特徴とする癌の治療に使用できる。ＥＺＨ２の過剰発現は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮体癌、肺癌、多発性骨髄腫、神経系の癌、およびリンパ腫を含む、多数の癌に関連することがわかっている。いくつかの実施形態は、ＥＺＨ２の過剰発現との関連性が明らかとなっている侵攻性、薬剤耐性、または難治性の癌の治療における、ＣＢＸ２リプログラミング化合物の使用を提供する。

本発明のある実施形態は、ＥＺＨ２の変異型、例えば、６４１位のチロシンが別のアミノ酸に置換されているＥＺＨ２の変異型（Ｙ６４１変異体）を有する癌の治療における、ＣＢＸ２リプログラミング化合物の使用に関する。このような癌の例としては、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）および濾胞中心Ｂ細胞型びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ）等）、前立腺癌、乳癌、肺癌、および神経系の癌が挙げられるが、これらに限定されない。

＜併用療法＞
癌の治療のためのリプログラミング化合物の使用に関する本発明のある実施形態では、前記化合物を、１以上の化学療法剤と併用してもよい。

様々な化学療法剤が当該技術分野当該技術分野で公知であり、このような化学療法剤としては、ドキソルビシン、カペシタビン、ミトキサントロン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、シスプラチン、およびゲムシタビン等、特定の癌に特異的なもの、ならびに広範な癌に適用可能なものが挙げられる。

固形腫瘍の治療に一般的に使用される化学療法剤としては、例えば、ゲムシタビン（例えば、ジェムザール（登録商標））、シクロホスファミド、カペシタビン（例えば、ゼローダ（登録商標））、イホスファミド、パクリタキセル（例えば、タキソール（登録商標））、シスプラチン、ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））、カルボプラチン、エピドキソルビシン（エピルビシン）、ドキソルビシン（例えば、アドリアマイシン（登録商標））、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が挙げられる。

乳癌の治療に一般的に使用される化学療法剤としては、例えば、カペシタビン（例えば、ゼローダ（登録商標））、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カルボプラチン、パクリタキセル（例えば、タキソール（登録商標））、シスプラチン、ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））、イホスファミド、エピドキソルビシン（エピルビシン）、ドキソルビシン（例えば、アドリアマイシン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、およびタモキシフェンが挙げられる。

非ホジキンリンパ腫の治療に一般的に使用される化学療法剤としては、例えば、プロカルバジン（例えば、マチュレーン（登録商標））、シタラビン、リツキシマブ（例えば、リツキサン（登録商標））、およびエトポシドが挙げられる。

前立腺癌の治療に一般的に使用される化学療法剤としては、例えば、ゴセレリンアセテート（例えば、ゾラデックス（登録商標））、ミトキサントロン（例えば、ノバントロン（登録商標））、プレドニゾン（例えば、デルタゾン（登録商標））、リアロゾール、ニルタミド（例えば、ニランドロン（登録商標））、フルタミド（例えば、ユーレキシン（登録商標））、フィナステリド（例えば、プロスカー（登録商標））、テラゾシン（例えば、ハイトリン（登録商標））、ドキサゾシン（例えば、カルドゥーラ（登録商標））、シクロホスファミド、ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））、エストラムスチン、および黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニストが挙げられる。

本発明のいくつかの実施形態は、癌の治療を目的とした、ＣＢＸ２またはＢＰＴＦリプログラミング化合物等のリプログラミング化合物の、ＥＺＨ２を標的とする治療との併用に関する。このような化合物の例としては、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１３７５０８号明細書、米国特許出願第２０１１／０２５１２１６号明細書、米国特許出願第２０１２／００７１４１８号明細書、および米国特許出願第２０１１／０２３７６０６号明細書に記載の化合物が挙げられる。

本発明のある実施形態は、ＥＺＨ２の上向き調節／過剰活性の結果として薬剤耐性が生じた薬剤耐性腫瘍の治療を目的とした、ＣＢＸ２またはＢＰＴＦリプログラミング化合物等のリプログラミング化合物の、化学療法剤との併用に関する。

本発明のある実施形態は、ＭＬＬ２の機能喪失に起因する癌またはその他の障害の治療を目的とする、ＢＰＴＦリプログラミング化合物の、ＬＳＤ１またはＰＬＵ１等のＨ３Ｋ４イレーザ阻害剤との併用に関する。

本発明のある実施形態は、（例えば、ＬｏＦ変異による）ＭＬＬ２タンパク質活性の低下および／またはＥＺＨ２活性の増大が見られる癌（ＮＨＬ、ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ、ＧＣＢ−ＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、肺癌、乳癌、前立腺癌および神経系の癌を含むが、これらに限定されない）の治療における、ＢＰＴＦリプログラミング化合物の、ＣＢＸ２リプログラミング化合物との併用に関する。

＜キット＞
本発明のある実施形態は、リプログラミング化合物を１以上含むキット、例えば、治療用のパックまたはキットを提供する。リプログラミング化合物を併用療法の一部をなすものとして使用することを意図したこれらの実施形態では、前記キットは、前記併用療法の組み合わせを構成する他の治療薬（１以上）を任意に含んでもよい。

ある実施形態では、前記キットに含まれる成分の１以上を凍結乾燥させることができ、前記キットは、前記凍結乾燥させた成分の再構成に好適な溶媒を、さらに含むことができる。前記キットの個々の成分は、通常は、別個の容器内に包装され、そして、このような容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関が規定する形態の表示を付随する場合があり、このような表示は、ヒトまたは動物への投与について、製造、使用、または販売が当該機関に認可されていることを示している。

ある実施形態では、前記リプログラミング化合物は、対象への投与に好適な医薬組成物の形態で前記キットに組み込まれる。この場合、必要に応じ、前記容器自体を、吸入器、注射器、ピペット、点眼器、またはこれらに類する他の装置とし、この容器から前記組成物を対象に投与する構成としてもよい。

＜ＢＰＴＦリプログラミング化合物＞
一態様においては、本発明は、本明細書に記載の方法により同定されたＢＰＴＦリプログラミング化合物、これらの化合物を含む医薬組成物およびキット、ならびに、これらの化合物の前述のような使用に関する。

本発明のある実施形態は、ＢＰＴＦをリプログラミングするための、下記一般式Ｉを有する化合物に関する。

一般式Ｉ中、
Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＳ（Ｏ）_２であり、
Ｒ_１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはＣ_１−Ｃ_４アルコキシであり、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはハロであり、Ｒ_３は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_２およびＲ_３は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_２ＮＭｅ_２、または下記式であり、
Ｒ_６は、Ｈであり、Ｒ_７は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_６およびＲ_７が、一体となって＝ＣＨ_２を形成し、
ここで、
Ｒ_５がＨであり、かつＲ_６およびＲ_７が一体となって＝ＣＨ_２を形成している場合には、Ｘは、Ｓ（Ｏ）_２であり、
Ｒ_４がＣ_１アルキルであり、Ｒ_５がＣＨ_２ＮＭｅ_２であり、かつＲ_６およびＲ_７が一体となって＝ＣＨ_２を形成している場合には、Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_３の少なくとも１つが、Ｈ以外であり；
あるいは、
（ｂ）Ｘは、ＮＨであり、
Ｒ_１およびＲ_２は、Ｈであり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_５は、各置換基がハロゲンである、置換Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたは非置換Ｃ_２−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_６およびＲ_７は、一体となって＝Ｏを形成している。

本発明のいくつかの実施形態は、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物であり、前記一般式Ｉ中、
Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＳ（Ｏ）_２であり、
Ｒ_１は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはＣ_１−Ｃ_４アルコキシであり、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはハロであり、Ｒ_３は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_２およびＲ_３は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはハロであり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_２ＮＭｅ_２、または下記式であり、
Ｒ_６は、Ｈであり、Ｒ_７は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_６およびＲ_７が、一体となって＝ＣＨ_２を形成している化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物であり、前記一般式Ｉ中、
Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＳ（Ｏ）_２であり、
Ｒ_１は、ＨまたはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはハロであり、Ｒ_３は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_２およびＲ_３は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはハロであり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_２ＮＭｅ_２、または下記式であり、
Ｒ_６は、Ｈであり、Ｒ_７は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_６およびＲ_７が、一体となって＝ＣＨ_２を形成し、
ここで、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、およびＲ_４がそれぞれＨである場合には、Ｒ_５は、下記式である化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、下記式IIを有する、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

前記式II中、
Ｒ_１は、ＨまたはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_２は、Ｈまたはハロであり、Ｒ_３は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_２およびＲ_３は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはハロであり、
Ｒ_５は、ＣＨ_２ＮＭｅ_２または下記式であり、
Ｒ_６は、Ｈであり、Ｒ_７は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_６およびＲ_７が、一体となって＝ＣＨ_２を形成している。

本発明のいくつかの実施形態は、各Ｃ_１−Ｃ_４アルキルが、Ｍｅである、一般式ＩまたはIIのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、Ｒ_１およびＲ_４が、ＨまたはＭｅであり、Ｒ_２およびＲ_３がＨである、一般式ＩまたはIIのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、Ｒ_１およびＲ_３が、Ｈであり、Ｒ_２およびＲ_４が、Ｈまたはハロである、一般式ＩまたはIIのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物であり、前記一般式Ｉ中、
Ｘは、Ｓ（Ｏ）_２であり、
Ｒ_１は、ＨまたはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはハロであり、Ｒ_３は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_２およびＲ_３は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_４は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはハロであり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_２ＮＭｅ_２、または下記式であり、
Ｒ_６は、Ｈであり、Ｒ_７は、Ｈであるか、あるいは、Ｒ_６およびＲ_７が、一体となって＝ＣＨ_２を形成している化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物であり、前記一般式Ｉ中、
Ｘは、ＮＨであり、
Ｒ_１およびＲ_２は、Ｈであり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_５は、各置換基がハロゲンである、置換Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたは非置換Ｃ_２−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_６およびＲ_７は、一体となって＝Ｏを形成している化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物であり、前記一般式Ｉ中、
Ｘは、ＮＨであり、
Ｒ_１およびＲ_２は、Ｈであり、
Ｒ_３およびＲ_４は、それらが結合しているＣ原子と共に下記式を形成し、
Ｒ_５は、各置換基がハロゲンである、置換Ｃ_１−Ｃ_４アルキルまたは非置換Ｃ_２−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_６およびＲ_７は、一体となって＝Ｏを形成している化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、各ハロ（ゲン）がＣｌである、上述の実施形態のいずれかに記載の一般式ＩまたはIIのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、以下に示す化合物からなる群から選択された、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、以下に示す化合物からなる群から選択された、ＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、以下に示す化合物からなる群から選択された、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、以下に示す化合物からなる群から選択された、一般式ＩのＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

本発明のいくつかの実施形態は、以下に示す構造を有するＢＰＴＦリプログラミング化合物に関する。

＜ＣＢＸ２リプログラミング化合物＞
一態様においては、本発明は、本明細書に記載の方法により同定されたＣＢＸ２リプログラミング化合物、これらの化合物を含む医薬組成物およびキット、ならびに、これらの化合物の前述のような使用に関する。

本発明のある実施形態は、ＣＢＸ２をリプログラミングするための、下記一般式IIIを有する化合物に関する。

前記式III中、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_４およびＲ_８は、それぞれ独立にＨまたはハロであり；
Ｒ_３は、Ｈ、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはフェニルであり、Ｒ_９は、Ｈまたはハロであるか、あるいは、Ｒ_３およびＲ_９は、それらが結合しているＣ原子と共にフェニルを形成し、
Ｒ_５は、ＯＲ_７または＝Ｏであり、
Ｒ_６は、Ｘ、ＣＨ_２Ｘ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、ＮＨ−ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＲ_１０、下記式、またはピペリジニルであり、
Ｒ_７は、ＨまたはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、
Ｒ_１０は、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはＣＨ_２−フェニルであり、
Ｘは、ハロである。

いくつかの実施形態では、前記一般式III中において、
Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_４は、それぞれ独立にＨまたはハロであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはフェニルであり、Ｒ_９は、Ｈまたはハロであるか、あるいは、Ｒ_３およびＲ_９は、それらが結合しているＣ原子と共にフェニルを形成し、
Ｒ_５は、ＯＨまたは＝Ｏであり、
Ｒ_６は、Ｘ、ＣＨ_２Ｘ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、ＮＨ−ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＲ_１０、またはピペリジニルであり、
Ｒ_８は、Ｈであり、
Ｒ_１０は、Ｃ_２−Ｃ_３アルキルまたはＣＨ_２−フェニルであり、および
Ｘは、ハロである。

いくつかの実施形態では、前記式III中において、
Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_４は、それぞれ独立にＨまたはハロであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、またはフェニルであり、Ｒ_９は、Ｈまたはハロであるか、あるいは、Ｒ_３およびＲ_９は、それらが結合しているＣ原子と共にフェニルを形成し、
Ｒ_５は、ＯＨまたは＝Ｏであり、
Ｒ_６は、ＣＨ_２Ｘまたはピペリジニルであり、
Ｒ_８は、Ｈであり、
Ｒ_１０は、Ｃ_２−Ｃ_３アルキルまたはＣＨ_２−フェニルであり、
Ｘは、ハロである。

いくつかの実施形態では、一般式IIIの化合物は、下記式IVを有する。

前記式IV中において、
Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_４は、それぞれ独立にＨまたはハロであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ハロまたはフェニルであり、
Ｒ_５は、ＯＨまたは＝Ｏであり、
Ｒ_６は、Ｘ、ＣＨ_２Ｘ、またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、
Ｘは、ハロである。

いくつかの実施形態では、前記式IV中において：
Ｒ_１、Ｒ_２、およびＲ_４は、それぞれ独立にＨまたはハロであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ハロまたはフェニルであり、
Ｒ_５は、＝Ｏであり、
Ｒ_６は、ＣＨ_２Ｘであり、
Ｘは、ハロである。

いくつかの実施形態では、一般式IIIの化合物は、式Ｖを有する：

前記式Ｖ中において、
Ｒ_１およびＲ_４は、それぞれ独立にＨまたはハロであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ハロ、またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ_９は、Ｈまたはハロであるか、あるいは、Ｒ_３およびＲ_９は、それらが結合しているＣ原子と共にフェニルを形成し、
Ｒ_５は、ＯＨまたは＝Ｏであり、
Ｒ_６は、ＮＨ−ＮＨ_２、ＣＨ_２ＮＲ_１０、またはピペリジニルであり、
Ｒ_１０は、Ｃ_２−Ｃ_３アルキルまたはＣＨ_２−フェニルである。

いくつかの実施形態では、前記式Ｖ中において、
Ｒ_１およびＲ_４は、それぞれ独立にＨまたはハロであり、
Ｒ_３は、Ｈ、ハロ、またはＣ_１−Ｃ_４アルキルであり、Ｒ_９は、Ｈまたはハロであるか、あるいは、Ｒ_３およびＲ_９は、それらが結合しているＣ原子と共にフェニルを形成し、
Ｒ_５は、ＯＨであり、
Ｒ_６は、ピペリジニルであり、
Ｒ_１０は、Ｃ_２−Ｃ_３アルキルまたはＣＨ_２−フェニルである。

本発明のある実施形態では、前記式III、IV、またはＶの化合物において、各ハロは、ＣｌまたはＢｒである。

いくつかの実施形態では、式IIIまたはＶの化合物において、Ｘは、Ｂｒである。

本発明のいくつかの実施形態では、一般式IIIの化合物は、以下に示す構造を有する。

上述のＢＰＴＦおよびＣＢＸ２リプログラミング化合物は、例えば、国立癌研究所（ＮＣＩ）／国立衛生研究所（ＮＩＨ）における、ＮＣＩ開発途上治療プログラム（ＮＣＩ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ：ＤＴＰ）の一般に公開されているケミカルレポジトリ等、様々なレポジトリより入手する／これらをソースとすることができる。

ある実施形態では、式Ｉ、II、III、IV、およびＶの化合物は、十分に酸性の基、十分に塩基性の基、またはその両方の官能基を有してもよく、したがって、種々の有機塩基および無機塩基または有機酸および無機酸と反応して薬学的に許容可能な塩を形成し得るものである。本明細書中で使用される「薬学的に許容可能な塩」という用語は、生体に対して実質的に非毒性である化合物の塩を指す。薬学的に許容可能な塩の典型例としては、式Ｉ、II、III、IV、またはＶの化合物を、薬学的に許容可能なミネラルもしくは有機酸、または有機塩基もしくは無機塩基と反応させて調製される塩が挙げられる。このような塩は、酸付加塩および塩基付加塩として公知である。

酸付加塩の形成によく使用される酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸、およびｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸が挙げられる。このような薬学的に許容可能な塩の例としては、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、塩酸塩、二塩酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，６−二酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸、フタル酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩が挙げられる。特に注目すべき薬学的に許容可能な酸付加塩は、塩化水素酸および臭化水素酸等の鉱酸を用いて形成される酸付加塩、ならびに、マレイン酸およびメタンスルホン酸等の有機酸を用いて形成される酸付加塩である。

アミン基の塩は、アルキル、低級アルケニル、置換低級アルケニル、低級アルキニル、置換低級アルキニル、またはアラルキル部分等の好適な有機基を有するアミノ窒素を含む四級アンモニウム塩を含んでもよい。

塩基付加塩としては、アンモニウムまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等、無機塩基由来の塩基付加塩が挙げられる。したがって、薬学的に許容可能な塩の調製に有用な塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。

当業者であれば、塩全体が薬理学的に許容可能であり、対イオンが塩全体に望ましくない性質を付与しない限り、薬学的に許容可能な塩の一部を形成する特定の対イオンは、通常、決定的に重要な性質ではないことを理解するであろう。

いくつかの実施形態では、本発明はさらに、式Ｉ、II、III、IV、またはＶの化合物の薬学的に許容可能な溶媒和物を含む。式Ｉ、II、III、IVおよびＶの化合物の多くは、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル等の溶媒と結合して、対応する水和物、メタノラート、エタノラート、およびアセトニトリラート等の薬学的に許容される溶媒和物を形成できる。

ある種の式Ｉ、II、III、IVまたはＶの化合物は、１以上の非対称（キラル）中心および／または１以上の不飽和結合を有してもよい。この結果、これらの化合物は、ラセミ化合物、単体の鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、単体のジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物、単体の異性体、および異性体の混合物として存在することができる。本発明のある実施形態は、式Ｉ、II、III、IV、またはＶの化合物を、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、または異性体の形態で提供するか、あるいは、鏡像異性体、ジアステレオ異性体、または異性体の混合物として提供する。

ある実施形態では、本発明は、式Ｉ、II、III、IV、またはＶの化合物のプロドラッグを提供する。本明細書中で使用される「プロドラッグ」という用語は、さらなる化学基の置換または付加等の化学的誘導を受けて、その物理化学的性質の１以上が（医薬品としての用途のために）変更されており、対象への投与後に、単一または一連の代謝的変換により、それ自体が活性化合物となる化合物を指す。前記化合物のプロドラッグ形態への変換により変更してもよい物理化学的性質としては、例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、吸収性、分布、部位特異性、安定性、遊離特性、毒性等が挙げられる。式Ｉ、II、III、IV、およびＶの化合物をプロドラッグへと変換するために調製してもよい、前記化合物の化学的誘導体の例としては、エステル誘導体、エーテル誘導体、カルバメート誘導体、アミド誘導体、イミン誘導体、および直接またはリンカー基を介して適切な担体部分を有する誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。プロドラッグ、および所与の作用化合物のプロドラッグの製造方法の例は、当業者に周知であり、例えば、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎら（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ （Ａｐｒｉｌ ２００２））に記載がある。

塩、溶媒和物、およびプロドラッグの調製は、当該技術分野で公知の方法で行うことができる。薬学的に許容可能でない塩、溶媒和物、またはプロドラッグが、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、またはプロドラッグの調製に有用な場合もあることから、これらもまた、本発明の範囲内であると解釈される。

本明細書に記載した発明のさらなる理解のため、以下に実施例を挙げる。これらの実施例は、本発明の例示的な実施形態について説明することを意図したものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと理解すべきである。

［実施例１：ＢＰＴＦの小分子リプログラミング］
＜分子モデリング＞
ＧＲＯＭＡＣＳ−４．０．５パッケージを、ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｏｒｇで実行される化学構造サーチ用ソフトウェアと共に使用して行った分子力学シミュレーション（ＭＤ）を、この調査におけるメインのモデリングツールとした。ＩＣＭパッケージ（Ｍｏｌｓｏｆｔ ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた分子ドッキング法は、精度が悪く、概して満足な結果が得られなかった。

Ｌｉ，Ｈ．ら（２００６， Ｎａｔｕｒｅ， ４４２：９１−９５）に記載のＨ３Ｋ４のＮ末端テールペプチドと複合体を形成した状態のＢＰＴＦタンパク質の３Ｄモデルを使用した（蛋白質構造データバンク、アクセスコード２ＦＵＵ）。シミュレーションに先立ち、前記モデルを、単純点電荷（ｓｉｍｐｌｅ ｐｏｉｎｔ Ｃｈａｒｇｅ：ＳＰＣ）水（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｏｒｃｅｓ １９８１，３３１−３４２）の三斜ボックス（ｔｒｉｃｌｉｎｉｃ ｂｏｘ）内に配置し、そこに、中和対イオンを含む１００ｍＭのＮａＣｌを等量添加した。周期境界を、全方向に適用した。全タンパク質分子のＮ末端とＣ末端を、イオン化した。その他の全アミノ酸に対し、生理的ｐＨでのこれらの正準状態を割り当てた。ＧＲＯＭＯＳ９６ ４３ａ１のパラメータ集合（Ｓｃｏｔｔ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ Ａ １９９９， １０３，３ ５９６−３６０７）のエネルギー項を、系内の全分子種に適用した。２個のＺｎ^２＋イオンを扱うため、前記パラメータ集合をアップデートし、以下の８個の配位化学結合（および、対応する角度）を新たに組み込んだ：１つ目の亜鉛原子から、Ｃ１１のＳＧ原子、Ｃ１３のＳＧ原子、Ｈ３４のＮＤ１原子、およびＣ３７のＳＧ原子への結合；２つ目の亜鉛原子から、Ｃ２６のＳＧ原子、Ｃ２９のＳＧ原子、Ｃ５３のＳＧ原子、およびＣ５６のＳＧ原子への結合。また、対応残基上の電荷分布を、以下のいずれかの通りアップデートした：第１のＺｎ^２＋配位錯体について、Ｈ３４イミダゾール環に沿って１つの電子を平滑化し、第２のＺｎ^２＋配位錯体を、亜鉛原子とＣｙｓ残基の３個の硫黄原子間で等分割するか；前記２つ目の亜鉛原子について、電荷を−０．４ｅに設定し、２つの電子の残分を、Ｃｙｓ残基の４つの硫黄原子間で等分割した。

ヒストンペプチドのＫ４ｍｅ３残基を、３つのメチル基のうち２つを、水素原子と置き換えるように編集した。ＧＲＯＭＯＳ９６力場には陽イオン−π間の相互作用に関する正確なパラメータが欠けているため、ＢＰＴＦ芳香族ケージ内における、Ｙ１７残基のものを除く芳香環の全原子およびモノメチル化Ｌｙｓ４のＮＺ原子を、堅固で調和的な位置拘束として、２ＦＵＵ構造におけるこれらの座標に１０００ｋＪ・ｍｏｌ^−１・ｎｍ^−２で凍結した。

Ｙ１７側鎖の立体構造を、二面角を中心とした回転により手作業で編集し、元のモデルにおいてヒドロキシフェニル環が存在していた空洞に、前記ヒドロキシフェニル環が不在となるようにし、代わりに、前記ヒドロキシフェニル環を、Ｙ１７ＣＡ原子と反対側に配置した。そして、空いた空洞を、トリプル複合体モデルの初期構造における、小型の有機化合物のドッキング部位として使用した。複合体は全て、ＰＲＯＤＲＧサーバ（Ｓｃｈｕｔｔｅｌｋｏｐｆ， Ａ． Ｗ． ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ２００４， ６０：１３５５−１３６３）において、真空下で最適化した化合物について、回転、翻訳、二面角の変更を行うことにより、手作業で構築した。ＰＲＯＤＲＧ（Ｌｅｍｋｕｌ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ． ２０１０， ５０：２２２１−２２３５）によって生成したパラメータ集合の精度に若干の不備があるため、化合物の非結合パラメータを、集中的に手作業で編集し、特に、各化合物について電荷分布を書き直した。

ＭＤ計算は全て、非結合相互作用を若干矯正して行った。すなわち、レナードジョーンズおよびクーロンポテンシャルによる近距離相互作用を、近傍検索の半径を１．５ｎｍに設定した状態で、１．３ｎｍで切り替え、１．４ｎｍで消滅させ、ＭＤ積分器により１０工程ずつ繰り返した。長距離静電的相互作用を、ＰＭＥ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｍｅｓｈ Ｅｗａｌｄ）アルゴリズム（Ｅｓｓｍａｎｎ，Ｕ． ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ．１９９５，１０３：８５７７−８５９３）を用いてモデル化した。溶媒和された複合体をモデル化するため、前記構造を、ｌ−ｂｆｇｓ法による最小化（Ｌｉｕ， Ｄ． Ｃ． ａｎｄ Ｎｏｃｅｄａｌ， Ｊ． Ｍａｔｈ． Ｐｒｏｇｒａｍ． １９８９， ４５：５０３−５２８）によって緩和させ、定容（ＮＶＴ）アンサンブルでシミュレートされるタンパク質と化合物の両方の重原子の位置を拘束した状態で、５０ピコ秒の分子力学シミュレーションを行った。アニーリングのシミュレーション（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８３， ２２０：６７１−６８０， Ｃｅｒｎｙ Ｖ． Ｊ． Ｏｐｔｉｍｉｚ． Ｔｈｅｏｒｙ Ａｐｐｌ． １９８５， ４５：４１−５１）を使用し、ボルツマン分布に従って割り当てた初速度から、Ｔ＝１０Ｋ〜Ｔ＝３１０Ｋでシステムをウォームアップした。ＮＶＴウォームアップに引き続き、１００ピコ秒の定圧（ＮＰＴ）平衡化を行った。複合体と他の原子とを、異なる温度の結合浴槽で結合させ、前記温度をＴ＝３１０Ｋに維持した。平衡化のため、弱結合（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ， Ｈ． Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． １９８４， ８１：３６８４−３６９０）を使用して、圧力を等方的に１．０ｂａｒに維持し、Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎの弱結合法（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ， １９８４，同箇所）を使用して定温を維持した。これに続く実計算（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｒｕｎｓ）は全て、より正確なＮｏｓｅ‐Ｈｏｏｖｅｒサーモスタット（Ｎｏｓｅ， Ｓ． Ｍｏｌ． Ｐｈｙｓ． ２００２， １００：１９１−１９８， Ｈｏｏｖｅｒ， Ｗ． Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ａ １９８５， ３１：１６９５−１６９７）を０．１ｐｓの温度結合時定数で、Ｐａｒｒｉｎｅｌｌｏ−Ｒａｈｍａｎ圧調節器（Ｐａｒｒｉｎｅｌｌｏ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ． １９８１， ５２：７１８２−７１９０， Ｎｏｓｅ， Ｓ． ａｎｄ Ｋｌｅｉｎ， Ｍ． Ｌ． Ｍｏｌ． Ｐｈｙｓ． １９８３， ５０：１０５５−１０７６）を１．０ｐｓの圧力結合時定数で用い、ＮＰＴアンサンブルで行った。このサーモスタットと圧調節器の組み合わせにより、真のＮＰＴアンサンブルのサンプルが確実に得られ、わずかな人為構造は、仮にあったとしても、極めて小型（原子２２個）でコンパクトな芳香族ケージから生じたものである。ＭＤ軌道の目視検査のため、ＶＭＤビューア（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ， Ｗ．； ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ． １９９６， １４：３３−８， ２７−８）を使用した。

＜結果と考察＞
ＭＬＬ２における機能喪失型（ＬｏＦ）変異により、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２およびＨ３Ｋ４ｍｅ３エピジェネティックマークが喪失すると予測される。これは、ＭＬＬが、これらのマークに対する唯一のエフェクタータンパク質であることによる。Ｈ３Ｋ４のメチル化は、周知の活性化マークであることから、ＭＬＬ２不活性化の発癌機能は、Ｈ３Ｋ４メチルマークによって通常活性化される遺伝子の発現から、癌細胞を保護する可能性がある。

Ｈ３Ｋ４ｍｅ２およびｍｅ３マークのリーダーは、ＢＰＴＦタンパク質である。ＢＰＴＦは、ｍｅ２およびｍｅ３マークに結合するが、Ｈ３Ｋ４ｍｅ０、１マークには結合しない（Ｌｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ．， ２８：６７７−６９１）。Ｈ３Ｋ４ｍｅ０、１マークに結合するのは、Ｌ３ＭＢＴＬタンパク質である（Ｌｉ Ｈ．， ｅｔ ａｌ．の同箇所）。本明細書において、正常型よりも高い親和性でＨ３Ｋ４ｍｅ０、１マークに結合するＢＰＴＦを再プログラムする化合物を設計し、かつこのようにＭＬＬ２活性をシミュレート可能であることを示している。前記リプログラミングは、ＢＰＴＦ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ０またはｍｅ１テール、および小分子化合物のトリプル複合体を、Ｈ４Ｋ４ｍｅ０および／またはｍｅ１へのＢＰＴＦの結合に好適な環境がもたらされるように形成することにより達成される。

集中的な計算プロトコル（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を使用し、Ｈ３Ｋ４ｍｅ０、１への親和性を示すようにＢＰＴＦを再プログラムするのに有望な候補を同定した。ＢＰＴＦは、４個の芳香族残基（Ｗ３２、Ｙ１０、Ｙ２３、およびＹ１７）によって形成された芳香族ケージを介してトリメチル化リジンを認識する。前記ケージは、３Ｄ空間内にボックスを形成する。前記ボックスの４面は、これらの芳香族残基によって形成され、その一面にＫ４骨格が存在し、最終面は、水を受け入れるために空いている。前記ケージ内に水素結合モチーフが存在していないため、前記ケージは、ＮＺ原子に水素原子を有していないトリメチル化リジンに選択的に結合する。ＢＰＴＦの特異性を再プログラムするには、Ｈ３Ｋ４ｍｅ０、１を含むトリプル複合体の形成を可能にする水素結合モチーフを提供する活性部位内またはその近傍に、化合物を固定する必要がある。

採用したアプローチは、前記芳香族ケージ面のうちの一面を分解（ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）し、化合物固定のための部位および水素受容体モチーフを供給するための活性部位へ、アクセスの両方を提供することである。

ＢＰＴＦ−Ｈ３Ｋ４ｍｅ１テールペプチド複合体のモデルを、Ｌｉ，Ｈ．，ら（２００６， Ｎａｔｕｒｅ， ４４２：９１−９５）を参照して得た。ＢＰＴＦの芳香族ケージ（残基Ｗ３２、Ｙ１０、およびＹ２３の側鎖）およびヒストンテールペプチドのＫ４のＮＺ原子を位置拘束し、前記モデルの分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを２ナノ秒間行った。前記芳香族ケージの最も保存度の低い残基であるＹ１７を、再構築対象に選択した。

仮想化合物（表１）のプローブを使用し、ＢＰＴＦの活性部位中のＹ１７を置換した。化合物Ｖ１およびＶ２を使用した２つの別個のランをまず使用し、トリプル複合体について、６ナノ秒間のＭＤをシミュレートした。前記プローブが解離してＹ１７と競合しなくなるにしたがい、前記化合物のこの機能喪失の原因となる領域を、ＭＤ軌道を調べることで同定し、この領域を変異させた。このようにして得たプローブ化合物の評価は、以下の通りである。

Ｖ１→Ｖ１１→Ｖ１２→Ｖ１３→Ｖ１４→Ｖ３←Ｖ２３←Ｖ２２←Ｖ２１←Ｖ２

最終仮想プローブＶ３は、６ナノ秒のＭＤ中に安定な複合体を提供した。Ｖ３は、Ｙ１７に打ち勝って前記芳香族ケージ表面を形成し、ケトン酸素およびＫ４の２つの水素原子Ｈ２＋、ｍｅ１）間に２つの良好な水素結合を形成できた。

次に、前記最終Ｖ３プローブを含む複合体の平均的タンパク質構造を使用して、有用なＢＰＴＦリプログラミング化合物となる実在の化合物を、国立癌研究所（ＮＣＩ）のライブラリーにおける化合物からドッキングにより選択した。ＮＣＩライブラリーの化合物の中から、上位約５０００個の複合体を手作業で確認した後、安定したトリプル複合体の６ナノ秒ＭＤを提供する候補構造を２２個選択した。選択に際し、ＧＲＯＭＯＳ９６力場は特殊な陽イオン−πパラメータを有さないという事実を考慮し、シミュレーション中に脂肪族環を有するプローブが安定であることが分かった場合には、この固定環（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｒｉｎｇ）が芳香族である構造を、好ましい構造として選択した。

選択した化合物一式について、ＳＵ−ＤＨＬ−９細胞株（ホモ接合型ＬｏＦＭＬＬ２変異体）における活性を、実施例３に概要を述べるプロトコルを用いてインビトロで検査した。さらに、活性化合物の類似性に基づく最適化により、ＭＬＬ２二重ＬｏＦ変異体細胞株に対しては活性であるが、野生型細胞に対しては不活性である化合物一式（ＮＳＣ３８２００１（化合物１）、ＮＳＣ３０４１０７（化合物２）、およびＮＳＣ１２７７６３（化合物３））を同定した（表２参照）。化合物２、ＢＰＴＦ、およびＨ３Ｋ４ｍｅ１ペプチドで構成される「トリプルリプログラミング複合体」のモデルを、図１に示す。

その他の同定された化合物で、ＭＬＬ２ＬｏＦホモ接合型変異を有する細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−９およびＰｆｅｉｆｆｅｒを選択的に殺傷する能力がインビトロで実証されたものについても、表２に示す。これらの化合物は、これらの検査において、およそ１μＭの濃度で活性を示した。

［実施例２：さらに別のＢＰＴＦリプログラミング化合物の同定、検査、および分析］
候補ＢＰＴＦリプログラミング化合物（実施例１参照）の初回スクリーニングの結果、２つの有望な骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）（下記ＡおよびＢ）が同定された。これらを、構造活性相関（ＳＡＲ）アプローチ（図１参照）を用いて手作業でさらに最適化し、表３および４に示すさらに別の候補ＢＰＴＦリプログラミング化合物を同定した。これらの化合物について、前記ＳＵ−ＤＨＬ−９およびＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞株におけるインビトロでの活性を、実施例３に概要を述べるプロトコルを用いて検査した。最も高活性な化合物の活性は、ＳＵ−ＤＨＬ−９細胞株では２μＭ前後、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ細胞株では６μＭ前後であり、ネガティブコントロールに対しては、１０μＭでも細胞毒性は観察されなかった。

＜構造活性相関（ＳＡＲ）＞
両活性骨格に関し、ＳＡＲ解析（ＳＵ−ＤＨＬ−９に対する選択毒性、表２および３）は、概ねトリプル複合体の分子モデルと一致している。骨格Ａに関するＭＤモデル（図１）によれば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、疎水性とすべきであり、これらのうち、異なる位置のＹ１７を安定化するＲ４以外は全て、ヒドロキシフェニル結合部位に適合するよう、回転可能な結合を最小量備えた、十分に小型のものとすべきである。活性化合物１および２と、不活性または最小活性の化合物１６、１７、および１９とを比較した結果、小型で疎水性のＲ１およびＲ３は、活性に悪影響を与え、化合物１５および２０の活性からわかるように、このような悪影響は、Ｒ２の置換によってもわずかしか改善されないことが確認された。小型だが回転可能なメトキシ基を、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の位置に有する化合物１８の活性はそれほど高くないが、ジオキソール環におけるメトキシの回転が著しく制限された場合には、化合物７からわかるように、前記活性が正常に回復する。Ｒ４はより複雑な効果をもたらし、（化合物１１に見られるような）Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の欠如を完全に補うことができるか、化合物８のように、何ら効果を及ぼさない。この複雑さは、メチル−ピペリジンテールは空洞外で安定化できるが、ｔ−ブチル−メチル−アミンはできないという構造のＹ１７側鎖との競合作用によって、説明できる可能性がある。

Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のいずれもが置換されていない場合には、予想通り、活性に深刻な悪影響がもたらされる（化合物１３参照）。対称置換を有する化合物１４もまた、活性を欠き、これはおそらく、小型のＲ２が望ましいことを示している。

リプログラミングモチーフＡ１の重大な効果を、この位置にカルボニル基を欠いている化合物２１が裏付けている。Ａ０モチーフの重要性がＡ１と比べてかなり低いことが、化合物６によって示されており、Ｒ４がこの化合物に含まれなくても、活性は中程度であった。Ａ２は、予想通り、決定的に重要ではないと思われる（以下の化合物対の比較より：化合物１／化合物２および化合物１７／化合物１９）。

骨格Ｂについても、ＳＡＲ分析による同様の結論を得ることができる。ＮＣＩライブラリーにおいて、活性化合物３（ＮＣＩ１２７７６３）の構造類似体化合物は比較的少ないものの、化合物３および部分活性化合物２２と、不活性化合物２３（Ｒ４疎水性）および２４（Ｒ４長さ）との比較により、長い疎水性Ｒ_４類似体の重要性が確認された。分子間リプログラミング水素結合の重大な効果は、化合物３／化合物９のペアにより確認される。

空間モデルによれば、前記結果は、Ｙ１７結合ポケットを占める分子の芳香族部分が、アミド酸素リプログラミングＢＰＴＦと脂肪族テールと共に、前記Ｙ１７側鎖の新たな位置を安定化していると解釈できる。

［実施例３：化合物１〜３のインビトロ活性］
化合物１〜３（表２参照）について、ＤｏＨＨ−２（ＭＬＬ２野生型）、ＳＵ−ＤＨＬ−９、およびＰｆｅｉｆｆｅｒ（ＭＬＬ２ホモ接合型挿入欠失変異）細胞株の成長を抑制する能力を、インビトロで検査した。結果を図２Ａに示している。さらに、化合物３の活性の濃度依存性についても調べた。結果を図２Ｂに示している。

＜方法＞
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株を、５％ＣＯ_２、加湿雰囲気の３７℃の培養器内で、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ培地１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に維持した。細胞株ＤＯＨＨ２は、ＤＳＭＺより入手した。Ｐｆｅｉｆｆｅｒは、ＡＴＣＣより入手した。ＳＵ−ＤＨＬ−９は、Ｍａｒｔｉｎ Ｄｙｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ， ＵＫ）より入手した。

化合物を、まず、１０ｍＭ濃度のＤＭＳＯに可溶化させた。この化合物溶液を、さらに、ＲＰＭＩ培地１６４０中で１：１００に希釈し、最終濃度を１００μＭとした。４×１０^５細胞／ｍＬの濃度に維持した細胞９０μＬを、ＭＩＣＲＯＴＥＳＴ（商標）９６穴アッセイプレート、ＯｐｔｉｌｕＸ（商標）（ＢＤ）のウェルに分注した。次に、前記１００μＭ化合物溶液を１０μＬ、前記細胞に添加し、最終化合物濃度を１０μＭとした。各化合物に対し、３回ずつ検査を行った。また、担体コントロールとして、ＤＭＳＯ対ＲＰＭＩ培地１６４０の比率が１：１００の溶液１０μＬを、細胞９０μＬに添加した。さらに、各プレートは、バックグラウンドノイズコントロールとして機能するＲＰＭＩ培地１６４０のみを含むウェル、ならびに全く非処理の細胞を含んでいた。アラマーブルー（登録商標）細胞増殖アッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に先立ち、化合物を、前記細胞と共に、５％ＣＯ_２、加湿雰囲気の３７℃の培養器内で４８時間インキュベートした。未処理の蛍光単位を、バックグラウンドノイズを考慮して修正し、前記担体処理コントロールを基準に正規化した。

［実施例４：化合物２および３のインビトロ活性］
化合物３のインビトロでの活性を、さらに細胞株ＤｏＨＨ−２、ＯＣＩ−ＬＹ３、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（全てＭＬＬ２野生型）、およびＳＵ−ＤＨＬ９を使用して調べた。これに加え、化合物２の用量反応を、ＭＬＬ２が変異体またはＭＬＬ２とＥＺＨ２の両方が変異体である細胞株において調べた。化合物３の用量反応を、ＭＬＬ２変異細胞株において調べた。方法は、実施例３で述べた通りである。細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２は、ＤＳＭＺより入手し、ＯＣＩ−Ｌｙ細胞株３は、Ｌｏｕｉｓ Ｓｔａｕｄｔ（米国国立衛生研究所）より入手した。

結果を、図３Ａ〜３Ｃに示す。化合物３は、ＭＬＬ２が野生型である細胞に対しては、明らかな効果を及ぼさず、前記化合物は、一般的な有毒性を有していないことを示していた。

［実施例５：化合物２および３のＢＰＴＦとの相互作用］
代表的な化合物２および３が、ＢＰＴＦ標的と相互作用し、ＢＰＴＦ標的のＨ３のヒストンテールへの結合能に影響を与えることを実証するため、ＢＰＴＦプルダウンアッセイを採用した。前記アッセイを、概略的に図４に示すと共に、以下に詳細に説明する。

このアッセイを使用し、化合物３が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１のＢＰＴＦとの結合を安定化できること（図５Ａ）、一方、思いがけないことに、化合物２が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２の結合を安定化できること（図５Ｂ）がわかった。図５Ａにおいて、ＧＳＴ抗体染色は、化合物３およびＨ３Ｋ４ｍｅ１の存在下におけるＢＰＴＦタンパク質の増加、ならびに、同化合物およびＨ３Ｋ４ｍｅ３の存在下における結合の減少を示している。濃度測定値は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１＋化合物３＝１３３３５、Ｈ３Ｋ４ｍｅ−化合物３＝９３５０、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３＋化合物３＝４２２７、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３−化合物３＝２５４５であった。図５Ｂにおいて、ＧＳＴ抗体染色は、化合物２およびＨ３Ｋ４ｍｅ２の存在下におけるＢＰＴＦタンパク質の増加、ならびに、同化合物およびＨ３Ｋ４ｍｅ３の存在下における結合の減少を示している。

＜方法＞
全長ヒトＢＰＴＦコンストラクトを、ロックフェラー大学、クロマチン生物学研究室のＣ． Ｄａｖｉｄ Ａｌｌｉｓ氏より入手した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６，同箇所）。前記ヒトＢＰＴＦ（ｇｉ：３１３２２９４２）由来の二重（ｄｕａｌ）ＰＨＤフィンガーブロモドメイン（残基２５８３〜２７５１）を、Ｎ末端ＧＳＴタグの付与を可能にするＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング技術を用いて、ｐＤＥＳＴ１５ベクターにクローニングした（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。前記ＧＳＴ−ＢＰＴＦ二重ＰＨＤフィンガーブロモドメイン過剰発現のＢＬ２１−ＡＩ（商標）化学的コンピテント大腸菌細胞内での誘導を、１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．２％Ｌ−アラビノースを添加したＬＢ培地を使用し、３７℃の振盪培養器内で２時間行った。ＧＳＴ−ＢＰＴＦ二重ＰＨＤフィンガーブロモドメインを、グルタチオンセファロース４Ｂ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製し、一晩、ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して透析した。

ペプチドプルダウン実験を、基本的には、これまでに報告された記載された方法により行った（Ｒｕｔｈｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１１， Ｃｅｌｌ， １４５（５）：６９２−７０６．）。Ｍ−２８０ストレプトアビジンを結合させたダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５０μＬを、１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、５０μＬのＰＢＳで３回洗浄した。次に、前記ビーズを、Ｃ末端ビオチン化Ｈ３Ｋ４ｍｅ０、ｍｅ１、ｍｅ２、またはｍｅ３ペプチド２１アミノ酸長（Ａｎａｓｐｅｃ）と共に、飽和条件下において４℃で１時間回転させながらインキュベートした。前記ビーズを、１００μＬのＨＢＳ−ＴＤ（１０ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍＭ ＤＴＴ）で３回洗浄し、６．８μＭのＧＳＴ−ＢＰＴＦを、ＤＭＳＯ対ＰＢＳが１：１００の溶液中に含まれる薬剤６８μＭまたは担体のみと共に使用して、４℃で３時間回転させながらインキュベートした。次に、前記ビーズを、２００μＬのＨＢＳ−ＴＤ中で１０回洗浄した。前記タンパク質を、２×ＬＤＳ試料緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１×還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、８５℃で１０分間溶出させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＧＳＴ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）のいずれかを用いてバンドを可視化した。バンドの定量は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。

［実施例６：化合物３のインビボ活性］
化合物２および３について、マウス異種移植モデルにおける腫瘍成長の低減能を検査した。

＜異種移植モデル＞
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ^null（ＮＳＧ）マウスを、地元のＢＣＣＲＣ動物施設で繁殖させた。原発性腫瘍を樹立するため、５０μｌのＰＢＳに含有させたヒトびまん性組織球性リンパ腫細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−９の細胞１×１０^７個を、雄のＮＳＧマウスの側腹部領域に接種した。皮下腫瘍形成後、マウスを屠殺し、前記腫瘍（〜２０ｍｇ）の小断片を、１３Ｇのトロカール針を使用し、麻酔をかけた週齢６〜１０週の雄のＮＳＧレシピエントマウスの右側腹部の皮下に移植した。前記腫瘍が触知可能となった時点で、処理を開始した。腫瘍の長さおよび幅を、カリパスで測定し、腫瘍体積を、改変した楕円体式である（長さ×幅^２）／２により算出した。

＜有効性の検証＞
各化合物を、５０％ＤＭＳＯおよび５０％ポリエチレングリコール２００の混合物で希釈した。一群あたり８匹の担癌マウスに対し、８日間にわたり、毎日、１ｍｇ／ｋｇもしくは４ｍｇ／ｋｇ（化合物３；ＮＳＣ１２７７６３）、４ｍｇもしくは１２ｍｇ／ｋｇ（化合物２；ＮＳＣ３０４１０７）、またはコントロールである賦形剤を腹腔内注射により投与した。２日ごとに体重を、４日ごとに腫瘍サイズを記録し、他に副作用が見られないか、マウスを観察した。９日目に実験動物を屠殺し、腫瘍体積を求め、最初の腫瘍体積を正規化した後、スチューデントのｔ検定により差異の有意性を求めた。

図６に示すように、前記化合物はいずれも、このマウス異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示した。化合物３（図６Ａ）は、この急速成長モデルにおいて、当該化合物が比較的低レベルな４ｍｇ／ｋｇの濃度で存在する場合にも、腫瘍成長中央値が５６３％である非処理のコントロールと比べ、腫瘍成長中央値を３６２％まで低下させることができた。化合物２（図６Ｂ）は、１２ｍｇ／ｋｇの投与量で、腫瘍成長中央値が１７５５％である非処理のコントロールと比べ、腫瘍成長中央値を１３０５％まで低下させることができた。これらの化合物の投与形態または剤形を最適化していないことから、これらの結果は、特に有望である。

［実施例７：ＣＢＸ２の小分子リプログラミング］
コンピュータを用いたアプローチを、ｆｌｙ Ｐｏｌｉｃｏｍｂタンパク質（ＣＢＸ２の類似体）の構造に基づき、ヒストンメチル化マークリーダーＣＢＸ２に適用し、これにより、多数の候補ＣＢＸ２リプログラミング化合物を同定した（表５）。

＜ファルマコフォアに関する説明＞
ＣＢＸ２は、３つの残基（Ｆ１１、Ｗ２２、およびＷ２５）で形成された芳香族ケージを有する正電荷メチル化エピジェネティックマークに結合する。芳香族ケージが４つの残基で形成されるＢＰＴＦとは異なり、ＣＢＸ２は、開面構造（ｏｐｅｎ ｆａｃｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有する。したがって、化合物における十分な大きさの芳香族基であれば、メチル化Ｌｙｓバインダーに典型的な、より普通の４面芳香族ケージの形成の完了に使用できる。ＢＰＴＦと同様に、ＣＢＸ２、Ｈ３Ｋ２７Ｈ［３、２、１］ｍｅ［０、１、２］ペプチド、およびリプログラミング化合物のトリプルリプログラミング複合体の安定化は、部分メチル化Ｌｙｓ２７および前記化合物間の水素結合によって達成できる。前記芳香族ケージにおけるこのような水素結合の不在が、Ｋ２７ｍｅ３マークに対するＣＢＸ２の選択的親和性の原因である可能性が高い。表５に示すリプログラミング化合物に関し、より大きな芳香族部分近傍に水素受容体が存在することが、トリメチル化ヒストンテールに対するＣＢＸ２の本来の親和性を乱す原因であると予測される、決定的に重要な要素である。前記化合物によって提供される追加の水素受容体モチーフは、ナフタレン様部分付近にケトンモチーフを含むこれらの化合物における、ヒドロキシルモチーフに対する優位性を説明する。同様の説明が、Ｒ_２ＮＨ部分含有化合物の、Ｒ_４Ｎ部分含有化合物に対する明白な優位性についてもあてはまる。水素受容体モチーフの第２の隣接成分である疎水性部分もまた、重要と考えられ、Ｌｙｓ２７ｍｅ２側鎖の長い炭化水素部分によって説明できる。活性部位における芳香族ケージは、リジンメチル化窒素と相互作用するが、炭化水素Ｃβ、Ｃγ、およびＣδは、極性の水媒質に対してオープンである。したがって、ＣＨ２ＢｒまたはＣＨ２Ｐｈ（ＮＳＣ１４７５５の場合）等、適度な大きさを有する部分は、Ｈ３ペプチドのこの領域をカバーし、前記複合体の安定性にさらに貢献すると予測される。

［実施例８：化合物５０のインビトロ活性］
ＥＺＨ２遺伝子に各種変異を有するリンパ性悪性腫瘍では、残基リジン２７におけるヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ２７）のトリメチル化におけるＰＲＣ２の活性増加が見られることが分かっている。化合物５０について、標準的な手法を用い、３種類のリンパ腫細胞株のインビトロでの生存性に対する効果を検査した。検査を行った細胞株は、以下の通りである：ＤｏＨＨ−２（ＥＺＨ２、ＭＥＦ２Ｂ、およびＭＬＬ２は野生型）；ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２（ＥＺＨ２変異Ｙ６４１Ｆ（ＭＥＦ２ＢおよびＭＬＬ２は野生型））およびＤＢ（ＥＺＨ２変異Ｙ６４１Ｎ、ＭＥＦ２Ｂ変異Ｄ８３Ｖ、およびＭＬＬ２における３つの変異（うち２つは、残基Ｑ２７３６以降が短縮されたタンパク質をもたらし、３つの目の対立遺伝子は、残基Ｐ４８０における１塩基対欠失を有する）。

結果を図７に示す。これらの結果は、化合物５０は、３種類の細胞株全ての生存性を用量依存的に低下させたが、ＥＺＨ２Ｙ６４１変異を有する細胞株ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２に対する活性が最も高かったことを示している。

［実施例８：マウス異種移植モデルにおける腫瘍成長に対する化合物５０の効果］
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２腫瘍断片を、雄のＮＳＧマウスの側腹部の皮下に移植した。前記マウスの週齢が９．０週〜９．３週のときに移植を行い、前記マウスの週齢が１２．９週〜および１３．１週のときに処理を開始した。一群あたり８匹のマウスを使用した。処理は、１０日間毎日行い、１２日目に評価を行った。腫瘍サイズを、４日ごとにカリパスで測定し、腫瘍体積を、長さ×幅^２／２の式により算出した。

前記マウス群を、賦形剤（コントロール）、１ｍｇ／ｋｇの化合物５０、または４ｍｇ／ｋｇの化合物５０を腹腔内注射することによって処理した。前記賦形剤として、５０％ＤＭＳＯ／５０％ＰＥＧ−４００を用いた。

結果を図８に示す。これらの結果は、化合物５０が、いずれの投与量においても、腫瘍体積を減少させることができたことを実証している。

［実施例１０：リンパ腫細胞株の増殖に対する化合物５１の効果］
化合物５１（ＮＳＣ２５４０）について、標準的な手法を用い、４種類のリンパ腫細胞株のインビトロでの生存性に対する効果を検査した。検査を行った細胞株は、以下の通りである：ＤｏＨＨ−２、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、ＤＢ、およびＳＵ−ＤＨＬ−９（ＥＺＨ２野生型、ＭＥＦ２Ｂ野生型、ＭＬＬ２挿入欠失変異）。

結果を図９に示す。これらの結果は、化合物５１は、ＤｏＨＨ−２、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２、およびＳＵ−ＤＨＬ−９細胞株の生存性を低下させることができたことを実証している。

［実施例１１：マウス異種移植モデルにおける腫瘍成長に対する化合物５１の効果］
ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２腫瘍断片を、雄のＮＳＧマウスの側腹部の皮下に移植した。前記マウスの週齢が５．３週〜９．４週のときに移植を行い、前記マウスの週齢が８．６週〜および１２．７週のときに処理を開始した。８匹のマウスをコントロール群として使用し、６匹のマウスを化合物５１による処理群として使用した。処理は１０日間毎日行い、１２日目に評価を行った。腫瘍サイズを、４日ごとにカリパスで測定し、腫瘍体積を、長さ×幅^２／２の式により算出した。

前記マウス群を、賦形剤（コントロール）または化合物５１を、下記の通り腹腔内注射することにより処理した：最初の１５日間：４ｍｇ／ｋｇ、その後の５日間：２ｍｇ／ｋｇ。前記賦形剤として、５０％ＤＭＳＯ／５０％ＰＥＧ−４００を用いた。

結果を図１０に示す。これらの結果は、化合物５１は、腫瘍体積を有意に減少させることができたことを実証している。

［実施例１２：乳癌細胞株の増殖に対する化合物５０および５１の効果］
化合物５０および５１について、標準的な手法を用い、４種類の乳癌細胞株のインビトロでの生存性に対する効果を検査した。検査を行った細胞株は、以下の通りである：ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ２０２（ＣＲＬ−２３１６）、およびＨＣＣ１５００（ＣＲＬ−２３２９）。

結果を図１１に示す。これらの結果は、化合物５１は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＣＣ２０２（ＣＲＬ−２３１６、およびＨＣＣ１５００（ＣＲＬ−２３２９）細胞株の生存性を低下させることができたことを実証している。

本明細書中に引用した全ての特許、公開された特許出願を含む刊行物、およびデータベースエントリによる開示内容は、その全体が、このような別個の特許、刊行物、およびデータベースエントリのそれぞれを明示的かつ個々に援用した場合と同程度に、本明細書に援用されるものとする。

本発明をある特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の趣旨および範囲内における種々の変更例が、当業者には明白であると考えられる。当業者に明白なこのような全ての変更例が、以下に記載の特許請求の範囲内に含まれるものと意図している。

Claims (14)

1. 以下の工程を含む、ヒストンマークリーダータンパク質のヒストンテールへの結合を調節する候補化合物の同定方法。
   （ａ）標的ヒストンテールマークと複合体を形成した状態の前記リーダータンパク質の活性部位の構造モデルを、コンピュータにより（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ）作成する工程であり、前記構造モデルが、コグネイトヒストンテールマークと複合体を形成した状態の前記リーダータンパク質の活性部位のコンピュータモデルに基づいて作成される工程
   （ｂ）前記標的ヒストンテールマークと前記リーダータンパク質の活性部位との安定したトリプルリプログラミング複合体を形成するために必要な機能的特徴を提供するプローブ構造を生成する工程
   （ｃ）前記（ｂ）工程で同定された前記プローブ構造の機能的特徴を、前記活性部位における残基および前記標的ヒストンテールマークと共に、実質的に再現する化合物を同定することにより、候補化合物をスクリーニングする工程
2. 前記プローブ構造の作成が、一連のプローブ構造について、前記標的ヒストンテールマークと結合した前記活性部位における分子動力学シミュレーションを繰り返し行い、前記プローブ構造、前記活性部位における残基、および前記標的ヒストンテールマークで構成される安定な複合体を提供する最適プローブ構造を同定することを含む、請求項１記載の方法。
3. 候補化合物のスクリーニングが、前記安定な複合体に基づく平均的タンパク質構造に、候補化合物をドッキングさせることを含む、請求項２記載の方法。
4. 候補化合物のスクリーニングが、分子動力学シミュレーション、コンピュータ上（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）でのドッキング法、構造類似性検索、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１または２記載の方法。
5. 前記標的ヒストンテールマークおよび前記コグネイトヒストンテールマークが、メチル化リジンマークである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記コグネイトヒストンテールマークが、トリメチル化リジンであり、前記標的ヒストンテールマークが、ジ、モノ、または非メチル化リジンである、請求項５記載の方法。
7. 前記１以上の機能的特徴が、前記活性部位における３個以上の芳香族残基によって形成される芳香族ケージを含む、請求項６記載の方法。
8. 前記１以上の機能的特徴が、水素結合を含む、請求項６または７記載の方法。
9. 前記コグネイトヒストンテールマークが、トリメチル化リジンであり、前記標的ヒストンテールマークが、ジ、モノ、または非メチル化リジンであり、前記プローブ構造が、水素受容体を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記プローブ構造が、６員環の脂肪族構造または芳香環構造をさらに備む、請求項９記載の方法。
11. 前記候補化合物が、仮想小分子ライブラリーから選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ヒストンマークリーダータンパク質が、ＣＢＸ２またはＢＰＴＦである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記（ｃ）工程で同定された候補化合物が、ＥＺＨ２のメチル化活性の増加を特徴とする癌またはＭＬＬ２のメチル化活性の低下を特徴とする癌の治療のための候補である、請求項１２記載の方法。
14. 前記（ｃ）工程で同定された候補化合物を、１以上のインビトロアッセイにより検査し、前記リーダータンパク質の前記標的ヒストンテールマークへの結合の調節を評価することをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。