KR20140130593A - 신경 전구 세포의 증식 방법 및 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물 - Google Patents

신경 전구 세포의 증식 방법 및 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경 전구 세포의 증식 방법 및 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 태아 신경 전구 세포를 저산소 조건 하에서 및/또는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는 배지에서 배양할 경우, 세포 증식률이 향상되는 것을 확인하였다. 또한, 증식시 신경 세포로 분화되는 것을 방지하는 효과도 있어 신경 줄기 세포의 대량 생산에 기여할 수 있으며, 증식된 세포는 신경 질환의 치료에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신경 전구 세포의 증식 방법 및 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물{Method for proliferating neuronal progenitor cells and composition for treating nervous diseases comprising the neuronal progenitor cells}
본 발명은 신경 전구 세포의 증식 방법 및 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
신경계 질환은 중추신경계 또는 말초신경계의 신경 세포가 사멸하거나 기능 부전증을 보이는 광범위한 범주의 질환이다. 이 중 퇴행성 신경 질환은 나이가 들어감에 따라 뇌신경세포의 사멸, 뇌신경세포 사이의 시냅스 형성이나 기능상의 문제 등으로 인해 야기된다고 알려져 있다.
신경 줄기 세포는 미분화된 상태로 계속 증식하는 동시에, 여러 형태의 신경 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 신경 줄기 세포는 태아기에는 다양한 해부학적 부위에 존재하여 신경계를 형성하며, 한번 손상되면 재생되지 않는 것으로 알려져 있다. 신경 줄기 세포는 포유류의 성체 중추신경계에도 존재하며 일생을 통하여 증식·분화하여 새로운 신경 세포를 생성한다. 신경 줄기 세포는 시험관 내에서 장기 배양할 수 있고, 생체 내 이식 시 생착, 이주 및 분화하여 숙주 신경계에 통합될 수 있다. 이에 따라, 신경계 질환에서 신경 줄기 세포를 이용한 신경 재생치료 가능성에 대해 관심이 증가하고 있다.
신경 줄기 세포의 임상적 적용을 위해, 신경 줄기 세포의 증식, 성장, 분화 기전을 규명함으로써, 세포 이식에 충분한 수의 신경 줄기 세포를 안전하게 배양 및 증식하는 한편, 적절한 신경 세포로의 분화를 유도하는 기술을 확립하는 것이 필요하다. 신경 줄기 세포는 원하는 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가지므로, 신경 줄기 세포의 증식 능력을 개선함으로써 세포 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
일 양상은 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 증식시키는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법으로 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는, 신경 전구 세포의 미분화 증식용 배지 조성물을 제공한다.
일 양상은 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 증식시키는 방법을 제공한다.
상기 줄기 세포는 저산소 조건 (hypoxia condition)에서 배양되는 것일 수 있다. 상기 저산소 조건은 예를 들면, 대기 중 산소 농도로 0.1% 내지 10%, 1% 내지 10%, 1% 내지 8%, 1% 내지 5%, 2% 내지 5%, 또는 2% 내지 3%일 수 있다.
상기 방법으로 증식된 줄기 세포는 다양한 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 질환은 예를 들면, 혈관 또는 심혈관 질환, 동맥경화증, 당뇨병, 재생불량빈혈, 국소빈혈, 척수형성이상증, 심근 경색, 졸도 장애, 다발성 경화증, 발작, 뇌졸중, 저혈압, 심장 정지, 허혈, 염증, 노화-관련 인식 기능의 손실, 방사선 상해, 뇌성 중풍, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 파킨슨병성 치매(Parkinson's Disease Dementia), 헌팅톤병, 레이 병, AIDS 치매, 기억력 손실, 근위축성 측면경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 다계통위축증(multiple system atrophy), 허혈성 심장 질환, 뇌 또는 척수 상해, 척수손상에 의한 신경 질환, 심장-폐 바이패스, 녹내장, 망막 허혈, Niemarm-Pick, Fabry's, Gaucher's, Hunter's, Hurler's 신드롬과 같은 리소솜 축적병, 점액다당류증, 글리코겐증, 선천적 대사 장애, 아드레노류코이상증(adrenoleukodystrophy), 낭 섬유증, 글리코겐 축적 질환, 감상샘 저하증, 낫적혈구빈혈, Pearson 신드롬, Pompe 병, 페닐케토뇨증(PKU), 포르파린증, 단풍시럽뇨병, 호모시스틴뇨증, 점액다당류증, 만성 육아종 질환, 티로신혈증, Tay-Sachs 병, 암, 종양 및 다른 병리적 또는 종양적 병태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 줄기 세포는 예를 들면, 신경 전구 세포일 수 있다. 용어 "신경 전구 세포 (neuronal progenitor cell 또는 neuronal precursor cell)"는 여러 형태의 신경 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 신경 전구 세포는 신경 줄기 세포 (neural stem cell)와 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 신경 전구 세포는 신경 줄기 세포로부터 유래된 세포를 의미할 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 예를 들면, 포유 동물의 태아 또는 성체로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 예를 들면, 상기 태아의 뇌조직으로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 예를 들면, 상기 태아의 중뇌 조직으로부터 유래한 것일 수 있다.
상기 줄기 세포는 예를 들면, 미분화 상태로 증식되는 것일 수 있다. 용어 "증식"은 세포 수가 증가하는 것을 의미한다. 상기 미분화 증식은 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다.
상기 배지 중의 토코페롤 또는 토코페롤 아세테이트는 예를 들면, 알파-토코페롤 또는 알파-토코페롤 아세테이트일 수 있다. 상기 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물의 농도는 예를 들면, 0.01 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 40 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml, 또는 1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml일 수 있다. 상기 배지 중의 토코페롤 및 토코페롤 아세테이트의 혼합 비율은 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 1:4 내지 4:1, 1:3 내지 3:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1일 수 있다.
상기 배지는 예를 들면, 통상의 세포배양용 배지 중에 토코페롤 및/또는 토코페롤 아세테이트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포배양용 배지는, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA), MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA), BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA), RPMI 1640 (GIBCO, USA), DMEM/F10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA), DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12; GIBCO, USA), α-MEM(α-Minimal essential Medium; GIBCO, USA), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA) 등일 수 있다. 상기 배지는 항생제, B27 보충물 (supplement) 및/또는 성장 인자를 더 포함할 수 있다. 상기 항생제는 예를 들면, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 젠타마이신(gentamicin), 또는 프리모신(primocinTM)일 수 있다. 상기 성장 인자는 예를 들면, bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor) 및/또는 FGF4 (fibroblast growth factor 4)일 수 있다. 상기 배지 중의 bFGF, EGF 또는 FGF4의 농도는 예를 들면, 2 ng/ml 내지 100 ng/ml, 4 ng/ml 내지 80 ng/ml, 5 ng/ml 내지 50 ng/ml, 또는 10 ng/ml 내지 30 ng/ml일 수 있다.
상기 방법은 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는 배지 및 저산소 조건에서 신경 전구 세포를 배양하는, 신경 전구 세포를 증식시키는 방법일 수 있다. 상기 저산소 조건은 예를 들면, 대기 중 산소 농도로 0.1% 내지 10%, 1% 내지 10%, 1% 내지 8%, 1% 내지 5%, 2% 내지 4%, 또는 2% 내지 3%일 수 있다. 상기 신경 전구 세포는 미분화 상태로 증식되는 것일 수 있다. 상기 배지 중의 토코페롤 또는 토코페롤 아세테이트는 예를 들면, 알파-토코페롤 또는 알파-토코페롤 아세테이트일 수 있다. 상기 배지 중의 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물의 농도 및, 토코페롤 및 토코페롤 아세테이트의 혼합 비율에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 배지는 통상의 세포배양용 배지 중에 토코페롤 및/또는 토코페롤 아세테이트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포배양용 배지에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 배지는 예를 들면, 항생제, B27 보충물 및/또는 성장 인자를 더 포함할 수 있다. 상기 항생제 또는 상기 성장 인자에 대해서는 전술한 바와 같다.
다른 양상은, 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는 배지에서 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물을 제공한다.
상기 신경 전구 세포는 예를 들면, 저산소 조건에서 배양된 것일 수 있다. 상기 저산소 조건은 예를 들면, 대기 중 산소 농도로 0.1% 내지 10%, 1% 내지 10%, 1% 내지 8%, 1% 내지 5%, 2% 내지 4%, 또는 2% 내지 3%일 수 있다. 상기 배지 중의 토코페롤 또는 토코페롤 아세테이트는 예를 들면, 알파-토코페롤 또는 알파-토코페롤 아세테이트일 수 있다. 상기 배지 중의 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물의 농도는 예를 들면, 0.01 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 40 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml, 또는 1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml일 수 있다. 상기 배지 중의 토코페롤 및 토코페롤 아세테이트의 혼합 비율은 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 1:4 내지 4:1, 1:3 내지 3:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1일 수 있다. 상기 배지는 통상의 세포배양용 배지 중에 토코페롤 및/또는 토코페롤 아세테이트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포배양용 배지에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 배지는 예를 들면, 항생제, B27 보충물 및/또는 성장 인자를 더 포함할 수 있다. 상기 항생제 또는 상기 성장 인자에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 신경 질환은 예를 들면, 파킨슨 병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증, 다계통위축증, 파킨슨병성 치매, 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있다.
또 다른 양상은, 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는, 신경 전구 세포의 미분화 증식용 배지 조성물을 제공한다.
상기 배지 조성물 중의 토코페롤 또는 토코페롤 아세테이트는 예를 들면, 알파-토코페롤 또는 알파-토코페롤 아세테이트일 수 있다. 상기 배지 조성물 중의 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물의 농도는 예를 들면, 0.01 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 40 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 30 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 20 ㎍/ml, 0.01 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml, 또는 1 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml일 수 있다. 상기 배지 조성물 중의 토코페롤 및 토코페롤 아세테이트의 혼합 비율은 1:10 내지 10:1, 1:5 내지 5:1, 1:4 내지 4:1, 1:3 내지 3:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1일 수 있다. 상기 배지 조성물은 통상의 세포배양용 배지 중에 토코페롤 및/또는 토코페롤 아세테이트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포배양용 배지에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 배지 조성물은 예를 들면, 항생제, B27 보충물 및/또는 성장 인자를 더 포함할 수 있다. 상기 항생제 또는 상기 성장 인자에 대해서는 전술한 바와 같다.
일 양상에 따른 줄기 세포의 증식 방법은 줄기 세포의 대량 생산에 기여할 수 있다. 증식된 줄기 세포는 다양한 질환의 치료에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
도 1은 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, MTT 검정을 통해 세포 생존율을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, 각각 현미경으로 확인한 결과 (도 2a) 및 세포 계수 결과 (도 2b)를 나타낸다.
도 3a 내지 3d는 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, 면역염색하여 Ki67, Ki67+Nestin, 및 Dapi 마커의 발현율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 4e는 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, 면역염색하여 GFAP, Tuj1, GFAP+Tuj1, 및 Dapi 마커의 발현율을 비교한 결과를 나타낸다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5- 디페닐테트라졸리움 브로미드 ) 검정을 통한 세포 생존율 측정
14주령의 태아로부터 신경 전구 세포를 분리하였다. 상기 태아 샘플을 얻기 전에 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받았으며, 또한 차병원 기관연구윤리위원회로부터, 샘플의 수집 및 연구 목적을 위한 이들의 사용에 관하여 승인을 받았다. Storch et al. 2001; Milosevic et al. 2006, 2007 등에 개시된 방법에 따라, 14주령의 태아의 뇌 조직 중 중뇌 조직(ventral midbrain tissue)을 분리하고 0.1 mg/ml의 파페인(papain) 및 100ug/ml DNase를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 약 30분간 처리하여 단일 세포 현탁액으로 분리하였다. 이를 인산완충식염수(PBS)세척하고, 50 ㎍/ml의 안티페인(antipain) 중에서 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 얻어진 태아 신경 전구 세포를 15 ㎍/ml의 폴리-L-오르니틴 및 4 ㎍/ml의 피브로넥틴으로 코팅한 배양 접시에 30,000 cells/cm2의 밀도로 단일층으로 접종하여 배양하였다. 배양된 태아 신경 전구 세포를 96 well 플레이트에 1 X 104 cells/well로 접종하여 7일 동안 배양하고, MTT 시약 처리 후 흡광도 (570 nm)를 측정하여 세포 생존율을 분석하였다.
도 1은 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, MTT 검정을 통해 세포 생존율을 확인한 결과를 나타낸다. 항생제 0.5 ml의 primocin이 첨가된 500 ml의 DMEM/F12 (1:1)의 혼합 배지에 bFGF 및 EGF (Peprotech, R&D system) 각 20 ng/ml, 10 ml의 B27 supplement (GIBCO)를 첨가하고, 여기에 1 ㎍/ml의 디엘-알파-토코페롤 아세테이트(DL-alpha-tocopherol acetate)를 첨가하거나(M3), 1 ㎍/ml의 알파-토코페롤((±)-alpha-tocopherol)을 첨가하거나(M4), 또는 두 가지를 모두 첨가한(M5) 조건에서 세포를 배양하고, 이를 일반 배양 조건과 비교하였다. 일반 배양 조건으로 항생제 0.5 ml primocin이 첨가된 500 ml의 DMEM/F12 (1:1)의 혼합 배지에 bFGF 및 EGF 각 20 ng/ml 및 α supplement (2.5 mg insulin, 25 mg transferrin, 0.03 uM sodium selenite, 36.5 mg L-glutamin, 0.75 g L-glucose)를 첨가하여 세포를 배양하거나 (M1), 여기에 B27 supplement를 더 첨가하여 세포를 배양하였다 (M2).
그 결과, 일반 배양 조건에 비해 알파-토코페롤 및/또는 디엘-알파-토코페롤 아세테이트가 포함된 배지에서 통계적으로 유의하게 높은 세포 생존율을 보였다 (Ps < 0.02). 또한, 일반산소 조건 (normoxia)보다 0.1% 내지 10%의 저산소 조건 (hypoxia)에서 통계적으로 유의하게 높은 세포 생존율을 보였다 (M3: P < 0.009, M4: P < 0.01, M5: P < 0.001).
따라서, 디엘-알파-토코페롤 아세테이트 및/또는 알파-토코페롤을 처리할 경우 태아 신경 전구 세포의 생존율이 증가하며, 특히 저산소배양 조건에서 상승 효과를 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 2. 세포 계수
태아 신경 전구 세포를 6 well 플레이트에 2 X 105 cells/well로 접종하고 7일 동안 배양한 후 세포 수를 측정하였다.
도 2는 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, 현미경으로 확인한 결과 (도 2a) 및 세포 계수 결과 (도 2b)를 나타낸다. 각 배양 조건인 M1 내지 M5에 대해서는 실시예 1에 기재된 바와 같다. 태아 신경 전구 세포는 일반 배양 조건에 비해 1 ㎍/ml의 알파-토코페롤 및/또는 1 ㎍/ml의 디엘-알파-토코페롤 아세테이트가 포함된 배지에서 통계적으로 유의하게 세포 수가 증가하였다 (Ps < 0.0001). 저산소 조건에서는 디엘-알파-토코페롤 아세테이트 또는 알파-토코페롤만 첨가한 경우에 비해 두 가지를 모두 첨가한 경우에 통계적으로 유의하게 세포 수가 증가하였다 (M4 vs. M5: P < 0.003, M3 vs. M5: P < 0.0006). 일반산소 조건에서는 디엘-알파-토코페롤 아세테이트만 첨가한 경우에 비해 두 가지를 모두 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 세포 수가 증가하였다 (M3 vs. M5: P < 0.009).
결과적으로, 디엘-알파-토코페롤 아세테이트 및 알파-토코페롤을 함께 처리한 실험군에서 가장 많은 세포를 확인할 수 있었다.
실시예 3: 면역세포화학 분석 1
태아 신경 전구 세포를 24 well 플레이트에 1 X 105 cells/well로 접종하여 7일 배양한 후 Ki67, Nestin, 및 DAPI 마커를 이용한 면역세포화학 분석을 수행하였다.
도 3a 내지 3d는 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, 면역염색하여 Ki67, Ki67+Nestin, 및 Dapi 마커의 발현율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 3b에서, 태아 신경 전구 세포는 일반 배양 조건인 M1 및 M2에 비해 디엘-알파-토코페롤 아세테이트(M3), 알파-토코페롤(M4), 또는 두 가지를 모두(M5) 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 Ki67 발현이 증가되었다 (Ps < 0.0001). 저산소 조건에서는 알파-토코페롤만 첨가한 경우에 비해 두 가지를 모두 첨가한 경우 통계적으로 유의하지는 않지만 Ki67 발현이 높게 나타났다 (M4 vs. M5: P = 0.05). 일반 배양 조건에서 B27 보충물을 첨가한 경우(M2)는 B27 보충물을 첨가하지 않은 경우(M1)에 비해 통계적으로 유의하게 Ki67 발현이 증가되었다 (Ps < 0.03).
도 3c에서, 태아 신경 전구 세포는 일반 배양 조건에 비해 디엘-알파-토코페롤 아세테이트, 알파-토코페롤, 또는 두 가지를 모두 첨가한 경우에 통계적으로 유의하게 Ki67과 Nestin이 함께 발현하는 빈도가 높게 나타났다 (Ps ≤ 0.0001). 저산소배양조건 하에서는 알파-토코페롤만 첨가한 경우에 비해 두 가지를 모두 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 Ki67과 Nestin이 함께 발현하는 빈도가 높게 나타났다 (M4 vs. M5, P < 0.02).
도 3d에서, 태아 신경 전구 세포는 전반적으로 일반산소 조건에 비해 저산소 조건에서 Dapi수 발현율이 높은 것으로 나타났다 (F4, 48 = 57.91, P < 0.0001). 또한, 태아 신경 전구 세포는 일반적인 배양 조건에 비해 디엘-알파-토코페롤 아세테이트, 알파-토코페롤, 또는 두 가지를 모두 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 높은 Dapi수 발현율을 나타내었다 (Ps ≤ 0.0001). 저산소 조건에서는 디엘-알파-토코페롤 아세테이트 또는 알파-토코페롤만 첨가한 경우에 비해 두 가지를 모두 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 높은 Dapi수 발현율을 나타내었다 (M3 vs. M5, P < 0.0001, M4 vs. M5, P < 0.0002). 태아 신경 전구 세포는 알파-토코페롤만 첨가한 경우 및 디엘-알파-토코페롤 아세테이트와 알파-토코페롤을 모두 첨가한 경우에, 저산소 조건에서 일반산소 조건에 비해 통계적으로 유의하게 높은 Dapi수 발현율을 나타내었다 (일반산소 조건에 비해 저산소 조건에서 각각, M4의 경우 P < 0.006이고, M5의 경우 P < 0.0001이다).
따라서, 디엘-알파-토코페롤 아세테이트 및 알파-토코페롤을 함께 처리한 실험군에서 Dapi수 발현율, 세포 증식 마커인 Ki67 양성을 나타내는 세포의 비율, 또는 Ki67 양성 및 신경 전구 세포 마커인 Nestin 양성을 나타내는 세포의 비율이 가장 높게 나타났다 (도 3b 내지 도 3d).
실시예 4: 면역세포화학 분석 2
태아 신경 전구 세포를 24 well 플레이트에 1 X 105 cells/well로 접종하여 7일 배양한 후 GFAP, Tuj1, 및 DAPI 마커를 이용한 면역세포화학 분석을 수행하였다.
도 4a 내지 4e는 각 배지에서 태아 신경 전구 세포를 7일 동안 배양한 후, 면역염색하여 GFAP, Tuj1, GFAP+Tuj1, 및 Dapi 마커의 발현율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 4b에서, 태아 신경 전구 세포는 일반 배양 조건인 M1 및 M2에 비해 디엘-알파-토코페롤 아세테이트(M3), 알파-토코페롤(M4), 또는 두 가지를 모두(M5) 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 GFAP 발현이 감소되었다 (Ps < 0.04). 또한, 일반 배양 조건에서 B27 보충물을 첨가한 경우(M2)는 B27 보충물을 첨가하지 않은 경우(M1)에 비해 GFAP 발현이 낮게 나타났다. (저산소조건: P < 0.006, 일반산소조건: P < 0.007).
도 4c에서, 태아 신경 전구 세포는 일반 배양 조건인 M1 및 M2에 비해 디엘-알파-토코페롤 아세테이트(M3), 알파-토코페롤(M4), 또는 두 가지를 모두(M5) 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 Tuj1 발현이 감소되었다 (Ps < 0.02). 또한, 일반 배양 조건에서 B27 보충물을 첨가한 경우(M2)는 B27 보충물을 첨가하지 않은 경우(M1)에 비해 Tuj1 발현이 낮게 나타났다. (저산소조건: P < 0.008).
도 4d에서, 태아 신경 전구 세포는 일반 배양 조건에 비해 디엘-알파-토코페롤 아세테이트, 알파-토코페롤, 또는 두 가지를 모두 첨가한 경우에 통계적으로 유의하게 GFAP와 Tuj1이 함께 발현하는 빈도가 낮게 나타났다 (Ps < 0.0001). 또한, 일반 배양 조건에서 B27 보충물을 첨가한 경우(M2)는 B27 보충물을 첨가하지 않은 경우(M1)에 비해 GFAP와 Tuj1이 함께 발현하는 빈도가 낮게 나타났다 (저산소조건: P < 0.003, 일반산소조건: P < 0.001).
도 4e에서, 태아 신경 전구 세포는 일반 배양 조건에 비해 디엘-알파-토코페롤 아세테이트, 알파-토코페롤, 또는 두 가지를 모두 첨가한 경우 통계적으로 유의하게 Dapi수 발현율이 증가되었다 (Ps < 0.0001). 또한, 일반 배양 조건에서 B27 보충물을 첨가한 경우(M2)는 B27 보충물을 첨가하지 않은 경우(M1)에 비해 Dapi가 높게 나타났다 (일반산소조건: Ps < 0.008). 태아 신경 전구 세포는 알파-토코페롤만 첨가한 경우, 저산소 조건에서 일반산소 조건에 비해 통계적으로 유의하게 Dapi 발현 세포가 높게 나타났다 (M4: P < 0.006).
따라서, 디엘-알파-토코페롤 아세테이트, 알파-토코페롤, 또는 두 가지를 모두 첨가한 경우, 일반 배양 조건에 비해 신경 교세포 마커인 GFAP 양성 세포와 뉴런 마커인 Tuj1 양성 세포 발현은 낮았고, Dapi는 높게 발현됨을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기 세포를 증식시키는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 저산소 조건 (hypoxia condition)에서 줄기 세포를 배양하는 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 신경 전구 세포인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 줄기 세포는 미분화 상태로 증식되는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 배지 중의 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물의 농도는 0.01 ㎍/ml 내지 10 ㎍/ml인 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 배지 중의 토코페롤 및 토코페롤 아세테이트의 혼합 비율은 1:5 내지 5:1인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 bFGF (basic fibroblast growth factor) 및 EGF (epidermal growth factor)를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 배지는 FGF4 (fibroblast growth factor 4)를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 2에 있어서, 저산소 조건은 대기 중 산소 농도로 0.1% 내지 10%인 것인 방법.
  10. 청구항 3의 방법으로 증식된 신경 전구 세포를 포함하는 신경 질환 치료용 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 신경 질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증, 다계통위축증, 파킨슨병성 치매, 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 질환인 것인 조성물.
  12. 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 또는 이의 혼합물을 포함하는, 신경 전구 세포의 미분화 증식용 배지 조성물.
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