KR20140129644A

KR20140129644A - Ｄｎａ 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법 그리고 이러한 프라이머의 설계방법

Info

Publication number: KR20140129644A
Application number: KR1020130048189A
Authority: KR
Inventors: 유왕돈; 김수옥; 홍선표; 김석준; 신수경; 김재일; 최희숙
Original assignee: (주)진매트릭스
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2014-11-07
Also published as: WO2014178562A1; KR101503726B1

Abstract

본 발명은 증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않는 외부 서열과, 프라이머를 유전자 증폭 반응에 참여할 수 있는 구조로 변형시킬 수 있는 제한효소 인지서열을 포함하는 특수 프라이머, 이를 이용하여 비특이적인 반응을 억제하면서도 특이도를 획기적으로 높이고 용도에 따라 프라이머 농도, 증폭속도, 증폭시점 (프라이머가 증폭반응에 참여하는 시점) 및 증폭량을 조절할 수 있는 유전자 증폭방법 그리고 이에 사용되는 프라이머의 설계방법을 제공한다.

Description

ＤＮＡ 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법 그리고 이러한 프라이머의 설계방법 {Primer capable of controlling its activity by DNA restriction enzyme, method for amplifying a gene using the same, and method for designing the primer}

본 발명은 DNA 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법 그리고 이러한 프라이머의 설계방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않는 외부 서열과, 프라이머를 유전자 증폭 반응에 참여할 수 있는 구조로 변형시킬 수 있는 제한효소 인지서열을 포함하는 특수 프라이머, 이를 이용하여 비특이적인 반응을 억제하면서도 특이도를 획기적으로 높이고 용도에 따라 프라이머 농도, 증폭속도, 증폭시점 (프라이머가 증폭반응에 참여하는 시점) 및 증폭량을 조절할 수 있는 유전자 증폭방법 그리고 이에 사용되는 프라이머의 설계방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 낮은 온도에서 프라이머 다이머가 생성되는 현상을 억제하고, 비슷한 유전자 서열을 지닌 유전자 배경(background)에서도 타겟만을 증폭할 수 있는 특이도를 획기적으로 높인 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법 그리고 이에 사용되는 프라이머의 설계방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)은 PCR로 약칭되는 기술로서, 유전공학, 유전자 진단, 질병치료 및 바이오테크놀로지 분야 등에서 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법 중 하나이다.

현재 PCR 관련 기술들은 생물학, 의학의 연구 및 응용 분야에서 다양한 방식으로 널리 이용되고 있다. 예컨대, 표적 서열의 검출, 역전사 효소 PCR (RT-PCR), 분별 디스플레이 (Differential Display) PCR (DD-PCR), 공지 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), DNA 시퀀싱 및 PCR 관여 게놈 분석 (McPherson and Moller, 2000) 등이 이에 속한다. 핵산 증폭은 상술한 바와 같이 널리 이용되고 있기 때문에, 핵산 증폭 방법을 보다 효율적으로 개선하려는 연구들이 많이 이루어지고 있다.

PCR 증폭과정은 다음과 같다. 이중가닥 DNA 표적 서열은 변성되고, 프라이머는 변성된 표적의 단일가닥에 어닐링된 후, DNA 중합효소의 작용에 의해 연장되는데 이와 같은 과정을 반복하여 증폭이 이루어진다. 증폭의 특이성은 프라이머 혼성화의 특이성에 의해 결정된다. 프라이머는 표적 핵산 서열의 단일가닥의 3' 말단에 존재하는 서열에 상보적이 되도록 선택된다. 전형적인 PCR 증폭 반응에 사용되는 사이클에서 프라이머는 오직 의도하는 표적 서열에만 혼성화된다.

그러나, 증폭 반응 혼합물에서는 통상적으로 프라이머 혼성화의 특이성을 보장하기 위해 요구되는 온도보다 충분히 낮은 온도인 상온에서도 혼성화 반응이 일어날 수 있는데, 이때 엉성하게 혼성화된 프라이머는 부분적으로만 상보적인 핵산 서열(또는 심지어 다른 프라이머)에 비특이적으로 결합함으로써 원하지 않는 연장 생성물의 합성을 시작할 수 있게 된다. 이러한 비특이적 프라이머 결합 후 주형이 되는 서열을 따라 증폭 반응이 수행될 수 있고, 이러한 비특이적 프라이머 연장 생성물의 증폭은 목적한 표적 서열의 증폭과 경쟁하여 표적 서열의 증폭 효율을 현저히 감소시킬 수 있다. 이와 같이 만들어지는 비특이적 증폭 산물은 반응의 개시 전에 비-표적 서열에 결합한 프라이머로부터 연장되는 생성물의 생성을 감소시킴으로써 줄일 수 있다. 이하에서는 PCR 과정 중 비특이적 증폭 산물의 생성을 억제하는 방법을 설명한다.

핫 스타트(hot start) 프로토콜이라 일컬어지는 한 방법에서는 필요한 혼성화 특이성을 제공하기에 충분하도록 온도가 상승할 때까지 하나 또는 그 이상의 중요한 시약을 반응 혼합물에 첨가하지 않는다. 이 방법에서 반응 혼합물은 반응 조건이 특이적 프라이머 혼성화를 보장하지 않는 동안에는 프라이머 연장을 지속할 수 없다. 핫 스타트 방법은 초기 고온 인큐베이션 단계 후에 반응 튜브를 열고 제외된 시약을 첨가함으로써 수동식으로 수행할 수 있다.

그러나, 수동식 핫 스타트 방법은 노동 집약적이고 반응 혼합물이 오염될 위험성을 증가시킨다. 반응 성분들을 분리하거나 유리시키기 위해 왁스와 같은 열에 불안정한 물질을 사용하는 핫 스타트 방법은 미국특허 제5,411,876호에 기재되어 있다. 이러한 방법에 있어서, 고온의 반응 전 인큐베이션 과정에서는 열에 불안정한 물질을 녹여 시약이 섞이도록 한다. 반응 개시 전 비-표적 서열에 결합된 프라이머로부터 연장 생성물의 형성을 감소시키는 다른 방법은 열가역적인 방법으로 DNA 중합효소에 비공유적으로 결합하는 화합물을 사용하는 것이다.

미국특허 제5,338,671호는 DNA 중합효소 활성을 저해하기 위해 열안정성 DNA 중합효소에 특이적인 항체를 사용하는 것을 기술하고 있다. 상기 항체는 반응 혼합물을 혼합하기 전에 상온 하의 완충액 내에서 DNA 중합효소와 함께 인큐베이션되어 항체-DNA 중합효소 복합체를 형성함으로써 중합효소의 활성을 저해하게 된다. 항체에 의한 DNA 중합효소 활성 저해 효과는 반응 혼합물이 고온에서 반응하여 항체가 불활성화됨에 따라 사라지게 된다. 또한, 핵산의 비특이적 증폭 산물의 형성을 억제하는 방법으로서 수소 결합을 파괴하는 화학 물질을 사용할 수 있는데, 이는 핵산의 AT, GC의 수소 결합 등에 작용하여 DNA 이중 가닥 결합을 약하게 하고, 이차 구조를 제거하여 비특이적인 반응을 최소화한다. 수소 결합 파괴 물질 및 중합효소 항체를 같이 사용할 경우, 수소결합 파괴 물질은 DNA 구조를 약화시켜 비특이적 반응을 저해시키는 장점이 있지만, Taq DNA 중합효소와 항체의 활성화 부위의 결합까지도 약화시키는 단점이 있다.

그 밖에도 다양한 PCR 방법들이 표적 증폭산물의 특이도를 높이기 위해 사용된다. 네스티드(Nested) PCR은 한 표적서열을 만들기 위해서 두 번의 PCR을 수행하는 것을 말하는데, 1차 PCR에서 표적 서열을 포함하는 비교적 간략한 중간 표적 서열을 만든 후 2차 PCR을 진행하여 집중적으로 표적 서열을 증폭시켜 특이도와 민감도를 보장하는 방법이다. 이를 순차적으로 진행하지 아니하고 한 단계 PCR로 통합하여 수행하면 첨가되는 프라이머의 종류가 많아져 원치 않는 프라이머 조합의 결과물(비-표적 증폭 산물)이 생길 수 있고, 이는 프라이머 다이머와 마찬가지로 표적 증폭 산물과 경쟁관계가 되어 증폭 효율을 떨어뜨린다. 이러한 이유로 네스티드(Nested) PCR은 2단계로 나뉘어 PCR을 진행해야 하기 때문에 많은 시간과 노력이 소모된다는 단점을 갖는다.

상술한 것과 같은 단점은 네스티드 PCR에 국한되는 것만은 아니다. 다중(multiplex) PCR의 경우에도 사용되는 프라이머의 종류가 늘어남에 따라 같은 문제점을 갖는다. 다중 PCR이란 하나의 반응액으로부터 2가지 이상의 증폭 표적 산물을 생산하는 PCR 방법으로서 증폭 반응 용액 내에 적어도 2쌍 이상의 프라이머가 사용된다. 따라서, 반응조건과 프라이머 서열이 적당하지 않으면 프라이머 다이머 생성, 비-표적 증폭 산물 생성과 같은 문제를 초래할 수 있고, 또한 원하는 증폭 표적 산물을 얻지 못하는 경우가 많다.

상술한 바와 같이, PCR 수행 중 생성될 수 있는 비-표적 증폭산물을 억제하고 표적 증폭서열의 증폭 특이도를 높이기 위해, 각각의 프라이머 혼성화 온도를 다르게 조절하여 프라이머가 반응에 참여하는 시점을 다르게 하는 방법이 사용되고 있다. 그러나 이러한 혼성화 온도를 조절하여 특이도를 높이는 방법은 PCR 사이클이 반복될 때 특정 온도를 계속 거치게 되므로 완벽하게 프라이머의 혼성화를 조절하는 결과를 내지 못하였고, 그 결과 특이도와 민감도가 효율적으로 보장되지 못하게 되었다.

이와 같이 본 발명이 속하는 기술분야에서는 PCR 프라이머 다이머, 비표적 증폭 산물의 합성을 줄여 PCR을 효율적으로 수행하려는 많은 노력이 있었으며 그 개선의 필요성을 인식하고 있음에도 불구하고 프라이머의 반응 참여를 직접 조절할 수 있는 방법이 제한적이기 때문에 다양한 실험에 적용되지 못하는 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 PCR 수행 시 제약이나 불편함이 없고, 비특이적 산물 증폭 및 불필요한 이합체(dimer) 형성을 억제할 수 있으며 동시에 원하는 산물만을 선택적으로 정확히 증폭시킬 수 있는 더욱 개선된 PCR 조절 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 핵산의 비특이적인 증폭 산물을 감소시키는 직접적 방법으로서 프라이머의 구조를 변화시켜 PCR 과정 중 프라이머의 농도, 반응에서 사용되는 시점 등을 제한효소를 통해 조절할 수 있도록 하는 PCR 증폭방법 및 이에 사용되는 프라이머를 개발하기에 이르렀다. 특히, 본 발명의 발명자들은 여러 쌍의 프라이머를 하나의 반응액 안에서 사용 함으로써 생기는 비특이적 결합으로 인한 증폭 효율 저하를 극복하고 네스티드 PCR, 다중 PCR 등에서 프라이머의 사용 시점을 조절 가능하게 하여, 실험 노력과 시간을 줄여 분석의 경제성을 높인 PCR 증폭방법 및 이에 사용되는 프라이머를 발명하기에 이르렀다.

미국특허공보 제5,411,876호(1995.05.02) 미국특허공보 제5,338,671호(1994.08.16)

본 발명의 목적은 DNA 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법 그리고 이에 사용되는 프라이머의 설계방법을 제공하는데 있다.

구체적으로, 본 발명의 목적은 증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않는 외부 서열과, 프라이머를 유전자 증폭 반응에 참여할 수 있는 구조로 변형시킬 수 있는 제한효소 인지서열을 포함하는 특수 프라이머, 이를 이용하여 비특이적인 반응을 억제하면서도 특이도를 획기적으로 높이고 용도에 따라 프라이머 농도, 증폭속도, 증폭시점 (프라이머가 증폭반응에 참여하는 시점) 및 증폭량을 조절할 수 있는 유전자 증폭방법 그리고 이에 사용되는 프라이머의 설계방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 낮은 온도에서 프라이머 다이머가 생성되는 현상을 억제하고, 비슷한 유전자 서열을 지닌 유전자 배경(background)에서도 타겟만을 증폭할 수 있는 특이도를 획기적으로 높인 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법 그리고 이에 사용되는 프라이머의 설계방법을 제공하는데 있다.

상기한 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 본 발명은 타겟 유전자 증폭시 비특이적인 반응을 억제하면서도 특이도를 획기적으로 높이고, PCR 반응에 사용되는 프라이머의 농도, 증폭속도, 증폭시점 (프라이머가 증폭반응에 참여하는 시점) 및 증폭량을 조절할 수 있는 유전자 증폭방법과 이에 사용되는 프라이머 설계방법을 제공한다.

우선, 본 발명의 명세서에서 사용되는 용어를 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 "타겟 유전자"라는 용어는 분석대상이 되는 시료 내의 유전자들 중 유전자형 분석 대상이 되는 유전자로서, 통상 유전자형 분석에 유용한 변이를 가질 수 있다. 예를 들어 단일염기다형성 또는 유전자형 분석에 사용되는 특이적인 염기서열 부분을 갖는 유전자, 특정 질환의 진단 또는 약물 내성 분석에 사용되는 유전자, 유전학적으로 의미가 있는 돌연변이를 갖는 유전자, STR (short tandem repeat)을 갖는 유전자 및 단일염기다형성을 갖는 유전자 등을 들 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에서는 타겟 유전자로서 HBV 바이러스 유전자 또는 HCV 바이러스 유전자가 사용되었으나, HBV 바이러스 유전자 또는 HCV 바이러스 유전자는 타겟 유전자의 예시로서 이해되어야 하며, 본 발명의 DNA 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머 및 이를 이용한 유전자 증폭방법은 다양한 타겟 유전자의 증폭 및 분석에 사용될 수 있는 기반기술로서 이해되어야 할 것이다. 즉, 본 발명은 후술하는 실시예들에서 기술한 내용 뿐만 아니라 프라이머를 사용하는 PCR 응용분야에 모두 효과적으로 적용가능하다.

또한, PCR 증폭 수행 과정 중 프라이머의 비특이적 결합으로 인해 원하지 않는 연장 생성물을 증폭하여 만들어진 산물, 또는 포워드 프라이머 및/또는 리버스 프라이머가 서로 엉성하게 혼성화되어 증폭된 산물을 편의상 프라이머 다이머라고 지칭하여 사용한다. 이러한 프라이머 다이머는 PCR의 증폭 산물과 경쟁하여 표적 유전자의 증폭 효율을 현저히 감소시키며, 또한 여러 프라이머 쌍을 한 번에 사용하는 다중 PCR의 경우 의도하지 않은 조합의 증폭 산물이 생성되게 되는데 이를 비-표적 증폭산물이라고 말할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 프라이머 다이머 및 다중 PCR 수행 중 생성되는 비-표적 증폭산물을 억제하는 방안을 마련하기 위해, 제한효소에 의해 프라이머의 구조를 변화시켜 활성을 갖게 되는 증폭 프라이머 및 이를 위한 PCR 증폭 과정 중 프라이머 조절 방법을 제공한다. 이와 같은 본 발명의 프라이머를 엔클립(Encleap) 프라이머라고 명명한다.

본 발명은 하기 구조식 1을 갖고 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머를 제공한다:

구조식 1

W는 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 결합서열이고,

X는 증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제1 외부 서열이며,

Z 및 Z'은 증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제2 외부 서열로서, 상기 구조식 1의 프라이머가 스스로 혼성화하여 스템루프(stem-loop) 구조를 형성하도록 상기 구조식 1의 프라이머의 5' 말단과 3' 말단에 각각 형성되며 서로에 대해 상보적인 서열을 갖고,

Y 및 Y'은 제한효소에 의해 인지되는 제한효소 인지서열로서 서로에 대해 상보적인 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머에 있어서, Y'의 5' 말단 절단 부위는 W의 3'말단에 연이어서 형성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머에 있어서, 제한효소가 활성화된 상태에서는 Y와 Y'의 제한효소 인지서열이 제한효소에 의해 인지되어 Z, Y' 및 Z'가 프라이머로부터 절단되고, 상기 스템루프 구조가 해체되면서 단일가닥 프라이머가 형성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머에 있어서,상기 제한효소가 활성화된 상태에서 형성된 단일가닥 프라이머는 하기 구조식 2를 갖는 것을 특징으로 한다:

구조식 2

.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머에 있어서 W 영역 내의 3'말단 영역에 대해 X는 상보적일 수 있다. 예를 들어, X는 프라이머 결합서열(W) 내의 3' 말단 4~5개 염기와 상보적일 수 있다.

이와 같이 본 발명에서 제안하는 엔클립(Encleap) 프라이머는 프라이머 스스로 혼성화하여 스템루프 구조를 형성하기 위해 5' 말단과 3' 말단에 외부 서열이 존재한다. 인간 또는 바이러스의 게놈의 어디에도 결합하지 않는 염기서열을 외부 서열로 결정한 후, 이를 프라이머의 5' 말단에 삽입하고 이와 상보적인 외부 서열을 프라이머의 3' 말단에 삽입하여 프라이머 스스로 혼성화 구조를 이루게 할 수 있다. 한편, 인간 또는 바이러스 게놈에 대한 외부서열의 결합 가능성 여부는 Needleman과 Wunsch의 서열정렬 기법을 이용하여 미스매칭(mismatching) 여부를 예상함으로써 판단한다. 증폭하고자 하는 타겟 유전자 주형에 존재하지 않는 서열이면 모두 본 발명에 따른 외부 서열로 이용될 수 있다. 분석대상이 아닌 한, 식물이나 박테리아 등에서 유래하는 서열을 외부 서열로 사용하여도 무방하다.

"제한효소 인지서열"은 제한효소에 의해 인지되는 서열로서, 절단되는 서열과 일치할 수도 있고 일치하지 않을 수 있다. PCR 증폭 과정 중 제한효소가 활성을 갖는 온도에 다다르면 제한효소는 스템루프 구조 중 이중가닥 부분에 포함되어 있는 제한효소 인지서열을 인식해 프라이머를 절단하게 되고 혼성화를 이루는 외부 서열이 절단됨에 따라 스템루프 구조가 해체되어 일반 프라이머와 같은 단일가닥 프라이머(구조식 2의 프라이머에 해당)로서의 구조적 변화를 갖는다. 구조 변화 후, 구조식 2의 프라이머는 일반 프라이머와 같이 PCR 증폭에 참여하게 되는데 PCR 증폭 반응 중 프라이머가 활성을 갖는 시점을 조절함으로써 다중 PCR 등에서 프라이머가 PCR 증폭 반응에 참여하는 시점을 조절할 수 있다.

도 1에는 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머의 구조가 모식화되어 도시되어 있다. 도 1에서 확인되는 바와 같이, 엔클립(Encleap) 프라이머는 주형과 상보적인 프라이머 결합서열과 제한효소 인지서열, 외부서열로 구성되어 있다. 외부서열은 두 부분으로 나뉘어지는데 제1 외부서열(X)은 프라이머 결합서열(W) 내의 3' 말단 4~5개 염기와 상보적이다. 엔클립(Encleap) 프라이머의 제한효소 인지서열의 앞뒤로 제한효소가 작용할 충분한 공간을 마련하기 위해, 또한 스템루프 구조를 효과적으로 유지하기 위해서 제1 외부서열의 염기 개수는 2개 이상이어야 하고, 제한효소로 인해 절단된 후, 2차 구조에서 1차 구조로 구조적 변화를 갖기 위해서는 제1 외부서열 부위의 염기서열이 5개 이하인 것이 바람직하다.

제2 외부서열의 염기 개수 또한 안정적인 구조 유지를 위해 4개 이상이 바람직하다. 제1 외부서열, 제한효소 인지서열 및 제2 외부서열의 염기서열 개수는 제한효소 인지서열 및 제1, 제2 외부서열의 개수에 의해 다양하게 적용할 수 있다. 외부서열(X+Z)의 염기서열 개수가 6~35개일 때 프라이머가 스템루프 구조를 이루어 절단되기에 바람직하며 그 중 10~20개 염기서열로 외부서열을 구성하는 것이 가장 바람직하다.

제한효소에 의해 절단되기 전 엔클립(Encleap) 프라이머는 PCR 증폭과정 중 변성온도에 다다르면 스템루프 구조를 잃을 수 있는데, 프라이머 결합서열의 3' 말단이 제한효소 인지서열과 연이어 있으므로 비특이적 반응을 보이는 것을 방지할 수 있고, 변성 후 온도가 내려가면서 다시 특이적으로 프라이머가 스스로 스템루프 구조를 형성하는 것을 돕게 된다. 제한효소 인지서열의 5' 말단을 절단하는 부분과 프라이머 결합서열이 연이어 있어야 하는 두 번째 이유는 절단 후 프라이머로서의 역할을 수행하기 위해 3' 말단이 주형과 상보적이어야 하기 때문이다. 절단 후의 엔클립(Encleap) 프라이머는 꼬리가 달린 프라이머와 비슷한 성향을 갖는데 프라이머 결합서열의 15~50개의 염기 개수에 의존하여 혼성화 성질이나 정도가 변하게 된다. 이는 프라이머 결합서열 이외의 외부서열은 PCR 증폭에 영향을 끼치지 않기 때문이다.

엔클립(Encleap) 프라이머를 절단하기 위해 사용할 수 있는 제한효소로는 타겟 유전자 상에 제한효소 인지서열이 존재하지 않는 것이 선택되며, 90℃ 이상의 증폭조건에서 변성이 일어나지 않고 70℃ 이상에서 활성을 가져야 하며, 단일가닥의 프라이머를 자르지 않는 조건을 충족해야 한다. 고온에 내성이 있어 상대적으로 최적의 활성온도를 갖는 제한효소로는 PhoI, TfiI, PspGI, ApeKI, TspMI 등이 있는데 PhoI은 인지서열이 GGCC로 대단히 보편적이어서 바람직하지 않고, TfiI은 활성온도가 65℃이어서 PCR 증폭 과정 중에서 안정하지 못하다. 반면에 PspGI은 제한효소 인지서열의 양 끝을 절단하고, 단일가닥의 프라이머를 자르지 않으며, 고온에서도 저항성이 있기 때문에 본 발명에서 사용할 수 있는 제한효소이다. 그러나 본 발명을 재현하는데 있어 PspGI에 국한되지 않고 ApeKI, TspMI 등 위 조건을 충족하는 제한효소는 모두 사용가능하다. 제한효소의 양은 엔클립(Encleap) 프라이머의 양에 따라 달라지는데 1 U 이상 첨가할 수 있다. PCR 증폭 과정에 따라 사용되는 제한효소의 양이 달라지는데 이는 실험자의 의도에 따라 조절이 가능하다.

본 발명의 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법은,

(a) 전술한 바와 같이 구조식 1로 정의되는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 쌍을 준비하고 제한효소를 포함하는 PCR 증폭 반응액에 첨가하는 단계와,

(b) PCR 증폭 반응액의 온도를 상승시켜 상기 프라이머를 변성시킨 후 온도를 낮춰 상기 프라이머가 스템루프 구조를 이루게 하는 단계와,

(c) 상기 제한효소를 활성화하는 단계와,

(d) 상기 (c) 단계의 제한효소 활성화에 의해, 상기 프라이머의 Y와 Y'의 제한효소 인지서열이 제한효소에 의해 인지되어 Z, Y' 및 Z'를 상기 프라이머로부터 절단하고 스템루프 구조를 해체하면서 단일가닥의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 쌍을 형성하는 단계와,

(e) 상기 (d)에서 형성된 프라이머 쌍을 이용하여 타겟 유전자에 대한 PCR 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법에 있어서, 상기 (d) 단계에서 형성된 프라이머 쌍은 하기 구조식 2를 갖는 것을 특징으로 한다:

구조식 2

.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법에 있어서, 상기 스템루프 구조를 갖는 프라이머의 W 영역 내의 3'말단 영역에 대해 X는 상보적일 수 있다. 예를 들어, X는 프라이머 결합서열(W) 내의 3' 말단 4~5개 염기와 상보적일 수 있다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법에 있어서, 외부서열(X+Z)의 염기서열 개수는 6~35개이며, 바람직하게는 10~20개이다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법에 있어서, 상기 제한효소로는 타겟 유전자 상에 제한효소 인지서열이 존재하지 않는 것이 선택되며, 90℃ 이상의 증폭조건에서 변성이 일어나지 않고 70℃ 이상에서 활성을 가져야 하며 단일가닥의 프라이머를 자르지 않는 조건을 충족시켜야 한다. 예를 들어, 상기 제한효소는 PspGI, ApeKI 또는 TspMI일 수 있다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법에 있어서, 상기 (e) 단계의 PCR 증폭 반응은 핫 스타트(hot start) PCR 증폭 반응, 네스티드 PCR 증폭 반응, 다중 PCR 증폭 반응, RT(reverse transcription) PCR 증폭반응, 또는 RT(reverse transcription)-네스티드 PCR 증폭 반응일 수 있다.

한편, PCR 증폭 반응액의 조성은 일반 PCR 수행 조성과 유사하게 PCR 버퍼(PCR buffer)(1x), MgSO₄ 3mM, dNTP 400μM, Taq 폴리머라아제(Taq Polymerase)(TaKaRa) 1U, 엔클립 프라이머(포워드 프라이머 및 리버스 프라이머), 일반 프라이머(포워드 프라이머 및 리버스 프라이머)를 각각 0.2 μM, 게놈 DNA(genomic DNA) 100 ng을 넣고, 예를 들어 PspGI 제한효소 5U을 첨가하여 총 반응부피를 25 ㎕로 맞추어 구성할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 엔클립 프라이머의 농도는 일반적인 PCR 수행 시 사용되는 조성과 같이 25 ul당 0.1 μM 내지 1.6 μM을 사용할 수 있는데, 0.2 μM을 사용하는 것이 바람직하다. 엔클립 프라이머의 양이 많을수록 엔클립 프라이머가 반응에 참여하지 아니하고 스템루프 구조를 유지하게 되어 반응 후 생성물 확인 시 아가로오즈 젤에서 관찰되는 문제가 있으므로 과량의 엔클립 프라이머의 첨가는 적합하지 않다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 증폭방법에서는 PCR 증폭 사이클 조건 중 엔클립 프라이머가 활성화되어 반응에 참여할 수 있도록 하는 활성화 단계가 추가된다. 94℃에서 프라이머를 변성한 후 온도를 낮춰 스템루프 구조를 이루게 하고 제한 효소의 최적 활성온도에서 프라이머를 절단한다. 제한효소 최적 활성온도를 계속 유지하지 아니하고 변성온도와 제한효소 최적 활성온도를 반복하여 수행하는 경우, 이는 프라이머의 스템루프 구조 형성 및 제한효소 절단에 더 유리하게 작용한다. 따라서, 활성화 단계는 약 20분간 95℃와 80℃를 반복하는 사이클을 유지하는 것이 바람직하다. 제한효소가 변경됨에 따라 활성화 단계에서 적용되는 온도는 상이할 수 있다.

본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머 활성화 단계는 일반 PCR 사이클 20회 반복 후 삽입하고 그 후 다시 일반 PCR 사이클을 20회 내지 30회를 반복하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니고, 실험자의 의도에 따라 달라질 수 있다.

본 발명은 하기 구조식 1을 갖고 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법을 제공한다:

구조식 1

타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 결합서열인 W를 구성하는 단계와,

증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제1 외부 서열인 X를 구성하는 단계와,

증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제2 외부 서열로서, 상기 구조식 1의 프라이머가 스스로 혼성화하여 스템루프(stem-loop) 구조를 형성하도록 상기 구조식 1의 프라이머의 5' 말단과 3' 말단에 각각 형성되며 서로에 대해 상보적인 서열을 갖는 Z 및 Z'를 구성하는 단계와,

제한효소에 의해 인지되는 제한효소 인지서열로서 서로에 대해 상보적인 서열을 갖는 Y 및 Y'를 구성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법에 있어서, Y'의 5' 말단 절단 부위는 W의 3'말단에 연이어서 형성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법에 있어서, 제한효소가 활성화된 상태에서는 Y와 Y'의 제한효소 인지서열이 제한효소에 의해 인지되어 Z, Y' 및 Z'가 프라이머로부터 절단되고, 상기 스템루프 구조가 해체되면서 단일가닥 프라이머가 형성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법에 있어서, 상기 제한효소가 활성화된 상태에서 형성된 단일가닥 프라이머는 하기 구조식 2를 갖는 것을 특징으로 한다:

구조식 2

.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법에 있어서, W 영역 내의 3'말단 영역에 대해 X는 상보적일 수 있다. 예를 들어, X는 프라이머 결합서열(W) 내의 3' 말단 4~5개 염기와 상보적일 수 있다.

본 발명의 일실시예의 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법에 있어서, 외부서열(X+Z)의 염기서열 개수는 6~35개이며, 바람직하게는 10~20개이다.

본 발명은 스템 루프 구조와 제한효소 인지서열을 이용한 엔클립(Encleap) 프라이머를 제공함으로써, 타겟 유전자 증폭시 비특이적인 반응을 억제하면서도 특이도를 획기적으로 높이고, PCR 반응에 사용되는 프라이머의 농도, 증폭속도, 증폭시점 (프라이머가 증폭반응에 참여하는 시점) 및 증폭량을 조절할 수 있는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 낮은 온도에서 프라이머 다이머가 생성되는 현상을 억제할 수 있고, 비슷한 유전자 서열을 지닌 유전자 배경(background)에서도 타겟만을 증폭할 수 있다.

특히, 본 발명은 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(Nested PCR), 다중 PCR, 역전사 (Reverse transcription) PCR 등 다양한 PCR 방법에 적용하여 증폭 특이도를 높이는데 활용할 수 있는 기반기술로서 제공될 수 있는 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머의 구조를 모식화하여 설명한 도면이다.
도 2는 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 PCR 증폭 과정과 종래의 네스티드 PCR 증폭 과정을 비교하여 설명한 도면이다.
도 3은 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 PCR 증폭 과정과 종래의 다중 PCR 증폭 과정을 비교하여 설명한 도면이다.
도 4는 RNA를 주형으로 하는 일반적인 RT-PCR 과정과 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 RT(reverse transcription)-PCR 증폭 과정을 비교하여 설명한 도면이다.
도 5는 제한효소의 양에 따른 엔클립(Encleap) 프라이머 활성화 정도를 확인해 주는 전기영동결과 사진이다.
도 6은 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 PCR 증폭 반응을 온/오프-스위칭한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 7은 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 1단계 네스티드 PCR 증폭 결과를 종래의 네스티드 PCR 증폭결과와 비교하여 나타내는 전기영동사진이다.
도 8은 인접하고 있는 여러 개의 타겟 유전자를 다중으로 증폭할 때, 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 경우 얻어지는 다중(multiplex) PCR 증폭 결과를 종래의 다중 PCR 증폭 결과와 비교하여 나타내는 전기영동사진이다.
도 9는 HCV 바이러스 유전자를 타겟으로 이용할 때, 본 발명의 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 경우 얻어지는 RT-네스티드 PCR 증폭 결과를 종래의 RT-네스티드 PCR 증폭 결과와 비교하여 나타내는 전기영동사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

실시예

하기 실시예는 주로 HBV 바이러스를 대상으로 수행하였으며 참조할 HBV 염기서열은 GeneBank No. NC003977이다.

실시예 1: 엔클립(Encleap) 프라이머 활성을 조절할 수 있는 제한효소 양의 결정

엔클립(Encleap) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭과정을 수행할 때, 제한효소의 양을 조절함으로써 PCR 증폭 정도를 조절할 수 있다. 이는 엔클립(Encleap) 프라이머가 활성화되는 정도 및 시점을 제한효소의 양으로 조절할 수 있기 때문이다. 이를 확인하기 위하여 한 쌍의 엔클립(Encleap) 프라이머에 대해 각기 다른 제한효소 양을 첨가하여 각각의 PCR을 수행하였다.

증폭 대상이 되는 HBV 바이러스 주형 DNA의 서열(5'→3')은 하기와 같다.

TCATCTGCCGTTCCGGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTAGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAGGTCTTGCCCAAGGTCTTACACAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCCCCTCTGCCTA (서열번호 1)

서열번호 1에서 밑줄 친 서열들은 엔클립(Encleap) 프라이머 1과 엔클립(Encleap) 프라이머 2의 프라이머 결합서열과 상보적인 서열이다.

엔클립 프라이머 1. 5'-CGTGT cctgg GCAG GTGCACTTCGCTTCACCTCTGC ccagg ACACG-3' (46 mer) (서열번호 2)

엔클립 프라이머 2. 5'-GGAGA cctgg GGAG ACCTAATCTCCTCCCCCAACTCC ccagg TCTCC-3' (47 mer) (서열번호 3)

상기 엔클립(Encleap) 프라이머 1은 포워드 프라이머이고, 엔클립 프라이머 2는 리버스 프라이머이다. 상술한 바와 같이 엔클립 프라이머는 각각 외부서열(이텔릭체 표시), 제한효소 인지서열(소문자로 표시) 및 프라이머 결합서열(밑줄로 표시)을 포함한다.

PCR 버퍼(PCR buffer)(1x), MgSO₄ 3 mM, dNTP 400 μM, Taq 폴리머라아제(Taq Polymerase)(TaKaRa) 1 U, 엔클립 프라이머 1 및 2(각각 0.4 μM), 게놈 DNA(genomic DNA) 100 ng을 넣고, PspGI 제한효소를 각각 0U, 1U, 2.5U, 5U, 8U, 10U을 첨가하여 총 반응부피를 25 ㎕로 맞추었다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다.

PCR 반응 조건

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (20 cycle),

80℃ 20분 (엔클립 프라이머 활성 단계),

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (20 cycle).

바이러스 DNA는 혈액으로부터 추출하며 통상적인 방법에 따라 순수 분리하였다. 예를 들어, 'SDS/단백질분해효소K' 방법(Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) 또는 QIAamp DNA Mini Kit 250(Qiagen 51106)을 사용하여 혈액으로부터 바이러스 DNA를 분리할 수 있다. PCR을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').

타겟 A:

cctgg GCAG GTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCATCARGTCCTGCCCAAGGTCTTACAAAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTAGAGGCCTACTTCAAAGACTGTGTGATAAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATAAGGT CTCC ccagg (198 bp) (서열번호 4)

상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고, 이텔릭체로 표시된 부위는 외부서열이다.

도 5에 도시된 바와 같이 제한효소인 PspGI가 첨가되지 아니하면 PCR은 진행되지 않았고, 1U 이상의 제한효소가 첨가되면 PCR이 수행되어 증폭 생성물을 확인 할 수 있었다. 2.5 U이상의 제한효소가 첨가될 시에는 제한효소 양에 따른 생성물 차이가 발견되지 않았다.

결과적으로, 1U 이상의 제한효소가 첨가되면 엔클립 프라이머가 활성화될 수 있고, 2.5 U의 제한효소 첨가 시에는 더 높은 농도의 제한효소가 첨가되었을 때와 동일한 결과를 보였다. 따라서, 엔클립 프라이머를 활성화시키기 위해서는 1U 이상의 제한효소가 필요함을 알 수 있고, 그 이상의 제한효소는 사용자의 의도에 따라 첨가량이 달라질 수 있는 것임을 알 수 있다.

실시예 2: 엔클립 프라이머를 이용한 PCR 반응 온/오프-스위칭

엔클립(Encleap) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭과정을 수행할 때, 제한효소로 활성화되기 전까지 PCR 증폭 반응을 봉쇄시킬 수 있으므로 엔클립(Encleap) 프라이머는 PCR 증폭반응의 스위치 역할을 할 수 있다. 이는 프라이머가 반응 전 비특이적으로 주형과 결합하였을 때 생성되는 프라이머 다이머 등의 문제를 해결하고 특이도를 높이는데 큰 기여를 할 수 있다. 이를 확인하기 위하여 한 쌍의 엔클립 프라이머를 이용해 PCR 증폭반응을 수행하였다.

증폭대상이 되는 HBV 바이러스 주형 DNA의 서열은 서열번호 1과 동일하였다. 또한 엔클립(Encleap) 프라이머 역시 실시예 1에서 사용된 것과 동일하였다(서열번호 2 및 서열번호 3).

PCR 버퍼의 조성은 실시예 1과 동일하되 제한효소의 양은 5U으로 고정하였다. 그리고 다음의 각각의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다.

PCR 반응 조건 1

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (40 cycle).

PCR 반응 조건 2

94℃ 10분,

80℃ 20분 (엔클립 프라이머 활성 단계),

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (40 cycle)

PCR 반응 조건 3

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (10 cycle),

80℃ 20분 (엔클립 프라이머 활성 단계),

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (30 cycle)

PCR 반응 조건 4

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (20 cycle),

80℃ 20분 (엔클립 프라이머 활성 단계),

94℃ 15초, 62℃ 30초, 72℃ 30초 (20 cycle)

HBV 바이러스 DNA는 실시예 1과 같은 방법으로 분리하였으며 PCR을 통해 생성되는 단편의 서열 또한 실시예 1과 같다 (서열번호 4).

엔클립 프라이머가 제한효소에 의해 절단되면 PCR 증폭 반응에 사용되어 증폭 산물이 나타나게 된다. 도 6에서 보듯이 제한효소가 첨가되었을 때에만 198 bp 밴드가 나타남으로써 증폭 산물을 확인할 수 있었다. 제한효소를 첨가하고 PCR 조건을 달리 수행하였을 경우에도 그 조건에 따라 다른 증폭효율을 보였다. 엔클립 프라이머 활성화 단계가 없는 "PCR 조건 1"을 적용하였을 경우(1번 레인)에는 그 결과물(증폭 산물)이 보이지 않았으나, 엔클립 프라이머 활성화 단계가 포함된 "PCR 조건 2, 3 및 4"를 적용하였을 경우 (2번 레인, 3번 레인, 4번 레인)에서는 그 결과물(증폭 산물)이 관찰되었다.

따라서, 제한효소에 의해 엔클립 프라이머가 활성화되고 활성화 시점을 조절함으로써 PCR 수행 시 프라이머의 참여 시기를 결정할 수 있음을 확인하였다. 즉, 엔클립 프라이머를 이용하면 PCR 반응의 시작 시점을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 증폭의 정도 또한 조절이 가능하다. 따라서, 본 발명의 엔클립 프라이머를 이용한 PCR은 프라이머 다이머를 줄이기 위한 기존의 핫 스타트 PCR과는 차이를 보인다.

실시예 3: 엔클립 프라이머를 이용한 1단계(one step) 네스티드 PCR

실시예 2에서 설명하였듯이 엔클립 프라이머를 이용하면 프라이머의 활성을 조절함으로써 프라이머가 PCR 증폭 반응에서 사용되는 시점을 조절할 수 있다. 또한, 엔클립 프라이머는 PCR 반응 시작 전에 상온에서 형성될 수 있는 프라이머의 비특이적 혼성화를 막아 이로 인해 생성되는 비특이적 증폭산물을 억제할 수 있기 때문에 핫 스타트 PCR 증폭 반응에 사용하기에 적합하다.

본 발명의 엔클립 프라이머를 이용한 증폭 방법이 일반 프라이머를 사용할 때보다 간편하고 신속하게 그리고 특이도가 높은 증폭 산물을 얻는 방법임을 확인하기 위하여 한 쌍의 일반 프라이머와 한 쌍의 엔클립 프라이머를 이용하여 한 반응액에서 PCR을 수행하였다. 이를 위해 HBV 바이러스의 유전자 염기 서열에 맞춰 프라이머를 제작하였다.

분석대상이 되는 HBV 바이러스의 주형 DNA 서열(5'→3')은 실시예 1의 서열번호 1과 같다.

프라이머 1. 5'-GTGCACTTCGCTTCACCTCTGC-3' (22 mer) (서열번호 5)

프라이머 2. 5'-ACCTTATCTCCTCCCCCAACTCCT-3' (24 mer) (서열번호 6)

프라이머 3. 5'-CTCCCCGTCTGTKCCTTCTCATC-3' (23 mer) (서열번호 7)

프라이머 4. 5'-GTGCTGGTGAACAGACCAATTTAT-3' (24 mer) (서열번호 8)

상기 프라이머 1, 프라이머 2, 프라이머 3 및 프라이머 4는 일반적인 형태의 프라이머로서 서열번호 1의 주형에 대해 상보적인 서열만으로 이루어져 있고, 주형에서의 위치는 다음과 같다.

TCATCTGCCGTTCCGGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATC(프라이머 3)TGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGC(프라이머 1)ACGTAGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAGGTCTTGCCCAAGGTCTTACACAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGT(프라이머 2)TAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCAC(프라이머 4)CATGCAACTTTTTCCCCTCTGCCTA (서열번호 1)

프라이머 1 및 프라이머 2의 서열번호 1의 주형에 대한 상보적 위치는 각각 엔클립 프라이머 1 및 엔클립 프라이머 2의 서열번호 1의 주형에 대한 상보적인 위치와 거의 동일하다.

PCR 반응은 프라이머 1과 프라이머 2, 엔클립 프라이머 1과 엔클립 프라이머2를 각각 0.2 μM을 넣어주거나, 프라이머 1, 2, 3 및 4를 각각 0.2 μM을 넣어주어 수행하였으며, 그 외 반응물 조성은 실시예 2와 동일하다. 단, PCR 반응 조건은 다음과 같다.

PCR 조건 1

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 30초 (35 cycle)

PCR 조건 2

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 30초 (50 cycle)

PCR 조건 3

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 30초 (20 cycle)

94℃ 2분, 94℃ 15초, 80℃ 5분 (4 cycle) (엔클립 프라이머 활성 단계)

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 1분 (30 cycle)

PCR 증폭 반응을 통해 생성되는 단편의 서열은 실시예 1과 동일하다. 활성화 단계에 진입하기 전 프라이머 1 및 프라이머 2가 작용하여 PCR 중간 산물을 만들고, 이를 토대로 활성화된 엔클립 프라이머 1 및 엔클립 프라이머 2가 작용해 최종 증폭 산물을 만들어 낸다(네스티드 PCR).

도 7에서 1번 레인~5번 레인은 일반 프라이머 1 및 2를 이용하여 1차 PCR(PCR 조건 1)을 진행한 후 엔클립 프라이머 1 및 2를 이용하여 2차 PCR(PCR 조건 1)을 수행하여 얻은 결과이고(2단계 네스티드 PCR), 6번~10번 레인은 일반 프라이머(프라이머 1, 2, 3 및 4)를 이용하여 1차 PCR, 2차 PCR을 한 반응액에서 동시에 수행한 결과이다(PCR 조건 2). 11번~15번 레인은 엔클립(Encleap) 프라이머와 일반적인 프라이머를 혼합하여 1차 PCR, 2차 PCR을 한 반응액에서 동시에 수행한 결과인데(PCR 조건 3), 도 7에 도시된 바와 같이 1차 PCR, 2차 PCR을 순차적으로 수행한 것(1번 레인~5번 레인)과 동일한 결과를 보였다. 이는 1차 PCR, 2차 PCR을 순차적으로 수행하는 것과 비교하여 시간과 노력이 대폭 감소하기 때문에 본 발명이 실험자의 편의를 증진하는데 획기적이라 할 수 있다.

즉, 본 발명은 2단계에 걸쳐 수행하던 네스티드 PCR을 한 단계로 축약하여 신속하게 특이도 높은 증폭 산물을 얻어낼 수 있다. 이와 관련하여 도 2의 A는 일반적인 네스티드 PCR의 진행과정을 나타내고 있다. 종래의 2단계 네스티드 PCR은 2쌍의 프라이머를 이용해 특이도와 민감도를 높이게 되는데 각 프라이머 쌍 마다 각각의 PCR 단계를 거쳐야 하기 때문에 실험자의 시간과 노력이 요구된다. 이에 비해 도 2의 B는 A에서 사용되는 2쌍의 프라이머를 한 반응액에 동시 첨가하여 PCR을 진행하는 과정을 나타내고 있다. 2쌍의 프라이머를 한 반응액에 동시에 넣으면 증폭하고자 하는 타겟 유전자 증폭 산물뿐만 아니라 의도하지 않는 프라이머 조합으로 비-표적 증폭 산물을 함께 생산하게 되어 표적 증폭 산물의 생성 효율이 떨어지게 된다. 마지막으로 도 2의 C는 본 발명의 엔클립 프라이머를 이용한 1단계 네스티드 PCR의 진행과정을 나타내고 있다. 2쌍의 프라이머가 동시에 혼합되어 한 반응액에서 PCR 증폭이 일어나지만 엔클립 프라이머를 사용함으로써 PCR 반응 내에서 프라이머의 적용순서를 부여할 수 있기 때문에 두 번의 PCR 과정을 거치지 않고 한 번의 PCR 수행만으로 특이도와 민감도를 보장할 수 있다.

결국, 본 발명의 엔클립 프라이머를 이용하면 PCR의 수행과정 중 프라이머의 농도나 종류를 조절할 수 있고, 이를 통하여 PCR의 비-표적 증폭 산물을 현저히 감소시킬 수 있으며, 종래의 PCR (예를 들어, 네스티드 PCR) 보다 경제적인 시간활용이 가능하다.

실시예 4: 엔클립(Encleap) 프라이머를 이용한 다중(multiplex) PCR

엔클립(Encleap) 프라이머의 활성 조절 특징을 이용하여 다중 PCR을 상호 간섭 없이 수행할 수 있다. 이를 증명하기 위하여 HBV 바이러스를 주형으로 하는 프라이머를 도 3의 C와 같이 포워드 엔클립 프라이머, 일반 리버스 프라이머 한 쌍, 일반 포워드 프라이머 한 쌍, 리버스 엔클립 프라이머의 구성으로 제작하여 두 쌍의 프라이머가 교차로 반응하지 아니하고 타겟 만을 증폭시키는지를 확인하였다.

분석 대상이 되는 HBV 바이러스의 DNA 염기서열은 다음과 같다.

TGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGCTATCCTGCCTTGATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTAAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACGGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCGGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACTTATCGGAACCGACAACTCAGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCGTCTC (서열번호 9)

프라이머 5. 5'-GCGAGAAAGTGAAAGCCTGC-3' (20 mer) (서열번호 10)

프라이머 6. 5'-GCTCCTCTGCCGATCCATAC-3' (20 mer) (서열번호 11)

프라이머 7. 5'-GTGGGTCTTTTGGGCTTTGC-3' (20 mer) (서열번호 12)

프라이머 8. 5'-CGGGACGTAGACAAAGGACG-3' (20 mer) (서열번호 13)

엔클립 프라이머 3. 5'-GGAGA cctgg GCAA GTGGGTCTTTTGGGCTTTGC ccagg TCTCC-3' (44 mer) (서열번호 14)

엔클립 프라이머 4. 5'-CGTGT cctgg CGTC CGGGACGTAGACAAAGGACG ccagg ACACG-3' (44 mer) (서열번호 15)

상기 프라이머 5 및 프라이머 6은 일반적으로 사용되는 프라이머로서 서열번호 9의 주형과 상보적인 서열만으로 이루어져 있다. 상기 프라이머 5와 프라이머 6은 증폭하고자 하는 부분(서열번호 9의 2번째 밑줄친 부분과 1번째 굵은 글씨체 부분)에 대해 각각 리버스 프라이머 및 포워드 프라이머이다. 프라이머 5(리버스 프라이머)는 엔클립 프라이머 3(포워드 프라이머)과 작용하여 타겟 a (1번째 밑줄친 부분~2번째 밑줄친 부분)를 만들고, 프라이머 6(포워드 프라이머)은 엔클립 프라이머 4(리버스 프라이머)와 작용하여 타겟 b (1번째 굵은 글씨체 부분~2번째 굵은 글씨체 부분)를 만든다. 이때 엔클립 프라이머의 활성화를 지연시켜 엔클립 프라이머 3과 엔클립 프라이머 4가 작용하여 만들어질 수 있는 원치 않는 증폭 산물을 억제할 수 있다.

엔클립 프라이머 3 및 엔클립 프라이머 4가 활성을 갖지 않는 동안 프라이머 5 및 프라이머 6으로부터 각각 타겟 a 및 타겟 b의 한 쪽 타겟 서열만을 생성하게 되고, 엔클립 프라이머 3과 엔클립 프라이머 4가 활성화되면 미리 생성되었던 한 쪽 타겟 서열을 토대로 최종 타겟 a 및 타겟 b 두 가지만 생성할 수 있다.

한편, 프라이머 7 및 프라이머 8은 엔클립 프라이머의 효과와 비교하기 위한 대조군 프라이머로서 제작되었다. 프라이머 7은 엔클립 프라이머 3의 프라이머 결합서열과 동일한 서열을 갖고, 프라이머 8은 엔클립 프라이머 4의 프라이머 결합서열과 동일한 서열을 갖는다. 실시예 1에서 상술한 바와 같이 엔클립 프라이머는 각각 외부서열(이텔릭체 표시), 제한효소 인지서열(소문자로 표시) 및 프라이머 결합서열(밑줄로 표시)을 포함한다.

PCR 반응은 프라이머 5와 프라이머 6, 엔클립 프라이머 3과 엔클립 프라이머 4를 각각 0.2 μM을 넣어주거나, 프라이머 5, 6, 7 및 8을 각각 0.2 μM을 넣어 수행하였고, 그 외 반응물 조성은 실시예 1과 동일하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다.

PCR 반응 조건

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 30초 (20 cycle)

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 1분 (40 cycle)

생성되는 타겟 서열은 다음과 같다.

타겟 B:

cctgg GCAA GTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGCTATCCTGCCTTGATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGC (서열번호 16)

타겟 C:

GCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACTTATCGGAACCGACAACTCAGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCG GACG ccagg (서열번호 17)

타겟 B-1:

GTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGCTATCCTGCCTTGATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGC (서열번호 18)

타겟 C-1:

GCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACTTATCGGAACCGACAACTCAGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCG (서열번호 19)

비표적 타겟 A:

cctgg GCAA GTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGCTATCCTGCCTTGATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTAAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACGGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCGGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACTTATCGGAACCGACAACTCAGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCG GACG ccagg (서열번호 20)

비표적 타겟 A-1:

GTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGCTATCCTGCCTTGATGCCTTTATATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTAAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACGGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCGGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACTTATCGGAACCGACAACTCAGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCG (서열번호 21)

도 8에서 1번 레인~4번 레인은 한 서열에 존재하는 인접 타겟 a, 타겟 b를 엔클립 프라이머를 이용해 다중 PCR을 진행한 결과이고, 5번 레인~8번 레인은 이의 대조군으로서 엔클립 프라이머에 대응되는 일반적인 프라이머로 다중 PCR을 진행한 결과이다. 1번 레인은 타겟 a를 만드는 엔클립 프라이머 3과 프라이머 5를 이용한 PCR증폭 결과이고, 2번 레인은 타겟 b를 만드는 프라이머 6과 엔클립 프라이머 4를 이용한 PCR 증폭 결과이다. 3번 레인은 원치 않는 조합인 엔클립 프라이머 3과 엔클립 프라이머 4가 작용되었을 때 생성될 수 있는 PCR 증폭 결과이다. 4번 레인은 엔클립 프라이머 3 및 엔클립 프라이머 4와, 프라이머 5 및 프라이머 6을 이용하여 다중 PCR을 진행한 결과로서 3번 레인과 같은 원치 않는 조합의 결과물은 확인되지 않았고, 1번 레인과 2번 레인의 결과와 동일한 결과물만 나타나는 것을 확인하였다. 반면에 프라이머 5, 6, 7 및 8을 이용해 동시에 다중 PCR을 진행하였을 때에는 원치 않는 조합의 결과인 프라이머 7 및 프라이머 8의 PCR 결과물도 함께 나타나는 것을 8번 레인에서 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 엔클립 프라이머를 이용하여 다중 PCR을 수행하면 네스티드 PCR의 경우와 마찬가지로 프라이머에 적용 순서를 부여하여 원하는 증폭 산물만을 특이적으로 얻어낼 수 있다. 도 3의 A는 일반적인 복수 분자 내 다중 표적 PCR 과정을 모식화한 것이다. 복수 분자 내에서의 다중 표적 PCR은 프라이머의 특이도가 높을수록 표적 증폭 산물을 효과적으로 생성하게 된다. 그러나, 도 3의 B에서 확인되는 바와 같이 동일 분자내에 인접하게 표적이 있을 경우 의도치 않은 증폭 산물이 생성되어 표적 증폭 산물의 생성 효율을 저하시키는 문제가 발생할 수 있다. 이때 엔클립 프라이머를 이용하게 되면 도 3의 C와 같은 방법으로 다중 PCR을 진행할 수 있다. 즉, 엔클립 프라이머가 활성을 갖기 전에 1차적으로 표적이 되는 서열의 안쪽에 상보적으로 결합하는 일반 프라이머만을 이용해 표적 증폭 산물 중 한 가닥이 먼저 생성되게 되고, 이를 토대로 엔클립 프라이머는 반응 후반부에 활성을 지니게 되어 표적 증폭 산물을 집중적으로 생성하게 된다. 따라서, 이러한 방법을 통해 비-표적 증폭 산물을 억제하고 표적 증폭 산물만을 집중적으로 생성할 수 있게 되는 것이다.

결국, 다중 PCR을 수행할 때 인접해 있는 여러 타겟을 한 번에 증폭하고자 할 때에 본 발명의 엔클립 프라이머를 이용하면 원하는 표적 증폭 산물만을 증폭할 수 있는 장점이 있는 것이다.

실시예 5: 엔클립 프라이머를 이용한 RT(reverse transcription)-네스티드 PCR

본 발명의 엔클립 프라이머를 이용하면 DNA를 주형으로 하는 PCR 뿐만 아니라 RNA를 주형으로 하는 RT(reverse transcription) PCR도 수행할 수 있다. 엔클립 프라이머를 이용함으로써 RT(reverse transcription) PCR 과정에서도 네스티드 PCR을 수행할 수 있고 이로써 간편하고 신속하게 그리고 특이도 높은 증폭 산물을 얻을 수 있다. 이를 확인하기 위하여 한 쌍의 일반 프라이머와, 한 쌍의 엔클립 프라이머를 이용한 RT(reverse transcription)-네스티드 PCR을 수행하였다.

PCR의 주형으로는 HCV 바이러스를 선택하였고, HCV 바이러스의 RNA 유전자 염기 서열에 맞추어 프라이머를 제작하였다.

분석대상이 되는 HCV 바이러스의 주형 cDNA 서열은 다음과 같다.

CCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCC TGATAGGGTGCTTGCGAGTG CCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAG GACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGG TCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCA (서열번호 22)

프라이머 9. 5'-GTYGCGAAAGGCCTTGTG-3' (18 mer) (서열번호 23)

프라이머 10. 5'-GTAWACTCCRCCAACGATCTG-3' (21 mer) (서열번호 24)

프라이머 11. 5'-TGATAGGGTGCTTGCGAGTG-3' (20 mer) (서열번호 25)

프라이머 12. 5'-CCACCCGGGAACTTRACGTC-3' (20 mer) (서열번호 26)

엔클립 프라이머 5. 5'-CGTGT cctgg CACT TGATAGGGTGCTTGCGAGTG ccagg ACACG -3' (44 mer) (서열번호 27)

엔클립 프라이머 6. 5'-GGAGA cctgg GACG CCACCCGGGAACTTRACGTC ccagg TCTCC-3' (44 mer) (서열번호 28)

프라이머 9, 프라이머 10, 프라이머 11 및 프라이머 12는 일반적으로 사용되는 프라이머로서 서열번호 22의 주형과 상보적인 서열만으로 이루어져 있다. 프라이머 9 및 프라이머 10은 DNA로 역전사될 때, 그리고 역전사 후 네스티드 PCR의 중간 산물을 만들어 낼 때 사용된다. 그 후 엔클립 프라이머인 엔클립 프라이머 5와 엔클립 프라이머 6이 활성화되면 최종 산물이 생성된다. 프라이머 11 및 프라이머 12는 엔클립 프라이머의 효과와 비교하기 위한 대조군 프라이머로서 제작되었다. 실시예 1에서 상술한 바와 같이 엔클립 프라이머는 각각 외부서열(이텔릭체 표시), 제한효소 인지서열(소문자로 표시) 및 프라이머 결합서열(밑줄로 표시)을 포함한다.

PCR 반응은 프라이머 9 및 프라이머 10과, 엔클립 프라이머 5 및 엔클립 프라이머 6을 각각 0.2 μM을 넣어주거나, 프라이머 9, 10, 11 및 12를 각각 0.2 μM을 넣어주었으며, 역전사 반응을 추가하기 위해 역전사효소 50U (Superscript Ⅲ, Invitrogen), RNase 활성 억제제(RNase ribon, Invitrogen) 20U을 첨가하였다. 그 외 반응물 조성은 실시예 1과 동일하다. 단, PCR 반응 조건은 다음과 같다.

PCR 반응 조건 1

50℃ 45분,

94℃ 10분,

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 30초 (20 cycle)

94℃ 15초, 62.5℃ 30초, 72℃ 1분 (40 cycle)

생성되는 타겟 서열은 다음과 같다.

타겟 D:

GTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCC TGATAGGGTGCTTGCGAGTG CCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAG GACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGG TCAGATCGTTGGTGGAGTTTAC (서열번호 29)

타겟 E:

cctgg CACT TGATAGGGTGCTTGCGAGTG CCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAG GACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGG CGTC ccagg (서열번호 30)

타겟 F:

TGATAGGGTGCTTGCGAGTG CCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAG GACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGG (서열번호 31)

도 9의 1번 레인 결과는 프라이머 9 및 프라이머 10만을 이용해 PCR을 수행한 결과이고, 2번 레인 결과는 프라이머 11 및 프라이머 12를 이용해 PCR을 수행한 결과이다. 3번 레인 결과는 1번 레인 및 2 번 레인에서 사용하였던 프라이머 9, 10, 11 및 12을 혼합하여 한 반응액 안에서 한 차례의 PCR을 수행한 결과이고, 4 번 레인은 실시예 2의 PCR 반응 조건 1에 따라 각각의 프라이머 쌍(프라이머 9와 프라이머 10, 프라이머 11과 프라이머 12)을 이용해 연속적으로 PCR 반응을 수행한 결과이다. 3번 레인 결과에서 보듯이 두 쌍의 프라이머를 한 번에 수행하면 타겟 D, 타겟 F 이외의 비-표적 산물이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

반면에, 엔클립 프라이머를 사용하였을 경우에는 두 쌍의 프라이머를 혼합하여 한 반응액에서 동시에 PCR 반응을 수행하였음에도 불구하고 표적 증폭 산물 (타겟 E)만 생성된 것을 확인하였다. 이는 4번 레인과 같은 방법으로 PCR을 순차적으로 수행한 6번 레인의 결과와도 비슷한 결과를 보여주었다. 이는 엔클립 프라이머를 이용하면 타겟 D를 만든 후 타겟 E를 생성하도록 하는 과정이 한 튜브 안에서도 가능하기 때문이다.

따라서, 본 발명의 엔클립 프라이머를 이용하면, RNA에서 cDNA를 만드는 단계와, 만들어진 cDNA을 주형으로 증폭 표적 산물을 만들어내는 증폭 단계로 나뉘었던 과정을 프라이머의 활성을 조절하여 적용 순서를 부여함으로써 한 단계로 축약할 수 있고, 이는 시간적으로 매우 경제적이고 특이도와 민감도를 갖는 증폭산물을 효과적으로 얻는데 적합하다. 또한, 본 발명의 엔클립 프라이머를 이용하면, 네스티드 PCR을 RT(reverse transcription)-PCR과 함께 구현하여 RNA를 주형으로 하는 증폭과정에서도 특이도와 민감도를 갖는 증폭산물을 효과적으로 얻을 수 있고, RT(reverse transcription)-PCR과 동시에 네스티드 PCR을 수행하게 됨으로써 실험자의 시간을 효과적으로 단축시킬 수 있다.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> GENEMATRIX INC. <120> Primer capable of controlling its activity by DNA restriction enzyme, method for amplifying a gene using the same, and method for designing the primer <130> P13-0055KR <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 341 <212> DNA <213> HBV virus <400> 1 tcatctgccg ttccggccga ccacggggcg cacctctctt tacgcggtct ccccgtctgt 60 gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtag catggagacc 120 accgtgaacg cccaccaggt cttgcccaag gtcttacaca agaggactct tggactctca 180 gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac ttcaaagact gtttgtttaa agactgggag 240 gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag gaggctgtag gcataaattg 300 gtctgttcac cagcaccatg caactttttc ccctctgcct a 341 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encleap primer 1 <400> 2 cgtgtcctgg gcaggtgcac ttcgcttcac ctctgcccag gacacg 46 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encleap primer 2 <400> 3 ggagacctgg ggagacctaa tctcctcccc caactcccca ggtctcc 47 <210> 4 <211> 198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target A PCR product <400> 4 cctgggcagg tgcacttcgc ttcacctctg cacgttgcat ggagaccacc gtgaacgccc 60 atcargtcct gcccaaggtc ttacaaaaga ggactcttgg actctcagca atgtcaacga 120 ccgacctaga ggcctacttc aaagactgtg tgataaaaga ctgggaggag ttgggggagg 180 agataaggtc tccccagg 198 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 5 gtgcacttcg cttcacctct gc 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 6 accttatctc ctcccccaac tcct 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 7 ctccccgtct gtkccttctc atc 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 8 gtgctggtga acagaccaat ttat 24 <210> 9 <211> 510 <212> DNA <213> HBV virus <400> 9 tgcctgtaaa tagacctatt gattggaaag tatgtcaaag aattgtgggt cttttgggct 60 ttgctgcccc ttttacacaa tgtggctatc ctgccttgat gcctttatat gcatgtatac 120 aatctaagca ggctttcact ttctcgccaa cttacaaggc ctttctgtgt aaacaatatc 180 taaaccttta ccccgttgcc cggcaacggt caggtctctg ccaagtgttt gctgacgcaa 240 cccccacggg ttggggcttg gccataggcc atcggcgcat gcgtggaacc tttgtggctc 300 ctctgccgat ccatactgcg gaactcctag cagcttgttt tgctcgcagc cggtctggag 360 cgaaacttat cggaaccgac aactcagttg tcctctctcg gaaatacacc tcctttccat 420 ggctgctagg ctgtgctgcc aactggatcc tgcgcgggac gtcctttgtc tacgtcccgt 480 cggcgctgaa tcccgcggac gacccgtctc 510 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 10 gcgagaaagt gaaagcctgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 11 gctcctctgc cgatccatac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 <400> 12 gtgggtcttt tgggctttgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 <400> 13 cgggacgtag acaaaggacg 20 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encleap primer 3 <400> 14 ggagacctgg gcaagtgggt cttttgggct ttgcccaggt ctcc 44 <210> 15 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encleap primer 4 <400> 15 cgtgtcctgg cgtccgggac gtagacaaag gacgccagga cacg 44 <210> 16 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target B PCR product <400> 16 cctgggcaag tgggtctttt gggctttgct gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc 60 ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct aagcaggctt tcactttctc gc 112 <210> 17 <211> 192 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target C PCR product <400> 17 gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagcagctt gttttgctcg cagccggtct 60 ggagcgaaac ttatcggaac cgacaactca gttgtcctct ctcggaaata cacctccttt 120 ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt tgtctacgtc 180 ccggacgcca gg 192 <210> 18 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target B-1 PCR product <400> 18 gtgggtcttt tgggctttgc tgcccctttt acacaatgtg gctatcctgc cttgatgcct 60 ttatatgcat gtatacaatc taagcaggct ttcactttct cgc 103 <210> 19 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target C-1 PCR product <400> 19 gctcctctgc cgatccatac tgcggaactc ctagcagctt gttttgctcg cagccggtct 60 ggagcgaaac ttatcggaac cgacaactca gttgtcctct ctcggaaata cacctccttt 120 ccatggctgc taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt tgtctacgtc 180 ccg 183 <210> 20 <211> 453 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-specific Target A PCR product <400> 20 cctgggcaag tgggtctttt gggctttgct gcccctttta cacaatgtgg ctatcctgcc 60 ttgatgcctt tatatgcatg tatacaatct aagcaggctt tcactttctc gccaacttac 120 aaggcctttc tgtgtaaaca atatctaaac ctttaccccg ttgcccggca acggtcaggt 180 ctctgccaag tgtttgctga cgcaaccccc acgggttggg gcttggccat aggccatcgg 240 cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg ccgatccata ctgcggaact cctagcagct 300 tgttttgctc gcagccggtc tggagcgaaa cttatcggaa ccgacaactc agttgtcctc 360 tctcggaaat acacctcctt tccatggctg ctaggctgtg ctgccaactg gatcctgcgc 420 gggacgtcct ttgtctacgt cccggacgcc agg 453 <210> 21 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-specific Target A-1 PCR product <400> 21 gtgggtcttt tgggctttgc tgcccctttt acacaatgtg gctatcctgc cttgatgcct 60 ttatatgcat gtatacaatc taagcaggct ttcactttct cgccaactta caaggccttt 120 ctgtgtaaac aatatctaaa cctttacccc gttgcccggc aacggtcagg tctctgccaa 180 gtgtttgctg acgcaacccc cacgggttgg ggcttggcca taggccatcg gcgcatgcgt 240 ggaacctttg tggctcctct gccgatccat actgcggaac tcctagcagc ttgttttgct 300 cgcagccggt ctggagcgaa acttatcgga accgacaact cagttgtcct ctctcggaaa 360 tacacctcct ttccatggct gctaggctgt gctgccaact ggatcctgcg cgggacgtcc 420 tttgtctacg tcccg 435 <210> 22 <211> 230 <212> DNA <213> HCV virus <400> 22 ccgcgagact gctagccgag tagtgttggg tcgcgaaagg ccttgtggta ctgcctgata 60 gggtgcttgc gagtgccccg ggaggtctcg tagaccgtgc accatgagca cgaatcctaa 120 acctcaaaga aaaaccaaac gtaacaccaa ccgccgccca caggacgtca agttcccggg 180 cggtggtcag atcgttggtg gagtttacct gttgccgcgc aggggcccca 230 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 <400> 23 gtygcgaaag gccttgtg 18 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 10 <400> 24 gtawactccr ccaacgatct g 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 11 <400> 25 tgatagggtg cttgcgagtg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 12 <400> 26 ccacccggga acttracgtc 20 <210> 27 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encleap primer 5 <400> 27 cgtgtcctgg cacttgatag ggtgcttgcg agtgccagga cacg 44 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Encleap primer 6 <400> 28 ggagacctgg gacgccaccc gggaacttra cgtcccaggt ctcc 44 <210> 29 <211> 179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target D PCR product <400> 29 gtcgcgaaag gccttgtggt actgcctgat agggtgcttg cgagtgcccc gggaggtctc 60 gtagaccgtg caccatgagc acgaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa cgtaacacca 120 accgccgccc acaggacgtc aagttcccgg gcggtggtca gatcgttggt ggagtttac 179 <210> 30 <211> 149 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target E PCR product <400> 30 cctggcactt gatagggtgc ttgcgagtgc cccgggaggt ctcgtagacc gtgcaccatg 60 agcacgaatc ctaaacctca aagaaaaacc aaacgtaaca ccaaccgccg cccacaggac 120 gtcaagttcc cgggcggtgg cgtcccagg 149 <210> 31 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target F PCR product <400> 31 tgatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac cgtgcaccat gagcacgaat 60 cctaaacctc aaagaaaaac caaacgtaac accaaccgcc gcccacagga cgtcaagttc 120 ccgggcggtg g 131

Claims

하기 구조식 1을 갖고 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머로서,
구조식 1

W는 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 결합서열이고,
X는 증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제1 외부 서열이며,
Z 및 Z'은 증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제2 외부 서열로서, 상기 구조식 1의 프라이머가 스스로 혼성화하여 스템루프(stem-loop) 구조를 형성하도록 상기 구조식 1의 프라이머의 5' 말단과 3' 말단에 각각 형성되며 서로에 대해 상보적인 서열을 갖고,
Y 및 Y'은 제한효소에 의해 인지되는 제한효소 인지서열로서 서로에 대해 상보적인 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머.
제1항에 있어서,
Y'의 5' 말단 절단 부위는 W의 3'말단에 연이어서 형성되는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머.
제1항 또는 제2항에 있어서,
제한효소가 활성화된 상태에서는 Y와 Y'의 제한효소 인지서열이 제한효소에 의해 인지되어 Z, Y' 및 Z'가 프라이머로부터 절단되고, 상기 스템루프 구조가 해체되면서 단일가닥 프라이머가 형성되는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머.
제3항에 있어서,
상기 제한효소가 활성화된 상태에서 형성된 단일가닥 프라이머는 하기 구조식 2를 갖는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머:
구조식 2

.
제1항 또는 제2항에 있어서,
W 영역 내의 3'말단 영역에 대해 X는 상보적인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머.
제1항 또는 제2항에 있어서,
외부서열(X+Z)의 염기서열 개수는 6~35개인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머.
(a) 청구항 제1항의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 쌍을 준비하고 제한효소를 포함하는 PCR 증폭 반응액에 첨가하는 단계와,
(b) PCR 증폭 반응액의 온도를 상승시켜 상기 프라이머를 변성시킨 후 온도를 낮춰 상기 프라이머가 스템루프 구조를 이루게 하는 단계와,
(c) 상기 제한효소를 활성화하는 단계와,
(d) 상기 (c) 단계의 제한효소 활성화에 의해, 상기 프라이머의 Y와 Y'의 제한효소 인지서열이 제한효소에 의해 인지되어 Z, Y' 및 Z'를 상기 프라이머로부터 절단하고 스템루프 구조를 해체하면서 단일가닥의 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머 쌍을 형성하는 단계와,
(e) 상기 (d)에서 형성된 프라이머 쌍을 이용하여 타겟 유전자에 대한 PCR 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
제7항에 있어서,
상기 (d) 단계에서 형성된 프라이머 쌍은 하기 구조식 2를 갖는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법:
구조식 2

.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 스템루프 구조를 갖는 프라이머에 있어서 W 영역 내의 3'말단 영역에 대해 X는 상보적인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
외부서열(X+Z)의 염기서열 개수는 6~35개인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 제한효소로는 타겟 유전자 상에 제한효소 인지서열이 존재하지 않는 것이 선택되며, 90℃ 이상의 증폭조건에서 변성이 일어나지 않고 70℃ 이상에서 활성을 가져야 하며 단일가닥의 프라이머를 자르지 않는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
제11항에 있어서,
상기 제한효소는 PspGI, ApeKI 또는 TspMI인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 (e) 단계의 PCR 증폭 반응은 핫 스타트(hot start) PCR 증폭 반응, 네스티드 PCR 증폭 반응, 다중 PCR 증폭 반응, RT(reverse transcription) PCR 증폭반응, 또는 RT(reverse transcription)-네스티드 PCR 증폭 반응인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
제7항 또는 제8항에 있어서,
상기 (b) 단계부터 상기 (d) 단계는 95℃와 80℃를 반복하는 사이클로서 수행되는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
제14항에 있어서,
상기 (b) 단계 전에 PCR 사이클을 20회 반복하고 상기 (d) 단계 후 PCR 사이클을 20회 내지 30회를 반복하는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성 조절이 가능한 프라이머를 이용한 유전자 증폭방법.
하기 구조식 1을 갖고 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법으로서,
구조식 1

타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 결합서열인 W를 구성하는 단계와,
증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제1 외부 서열인 X를 구성하는 단계와,
증폭대상이 되는 타겟 유전자에는 존재하지 않으며 타겟 유전자 서열과는 상동성이 없는 비상동성의 서열로 구성된 제2 외부 서열로서, 상기 구조식 1의 프라이머가 스스로 혼성화하여 스템루프(stem-loop) 구조를 형성하도록 상기 구조식 1의 프라이머의 5' 말단과 3' 말단에 각각 형성되며 서로에 대해 상보적인 서열을 갖는 Z 및 Z'를 구성하는 단계와,
제한효소에 의해 인지되는 제한효소 인지서열로서 서로에 대해 상보적인 서열을 갖는 Y 및 Y'를 구성하는 단계를 포함하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법.
제16항에 있어서,
Y'의 5' 말단 절단 부위는 W의 3'말단에 연이어서 형성되는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법.
제16항 또는 제17항에 있어서,
제한효소가 활성화된 상태에서는 Y와 Y'의 제한효소 인지서열이 제한효소에 의해 인지되어 Z, Y' 및 Z'가 프라이머로부터 절단되고, 상기 스템루프 구조가 해체되면서 단일가닥 프라이머가 형성되는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법.
제18항에 있어서,
상기 제한효소가 활성화된 상태에서 형성된 단일가닥 프라이머는 하기 구조식 2를 갖는 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법:
구조식 2

.
제16항 또는 제17항에 있어서,
W 영역 내의 3'말단 영역에 대해 X는 상보적인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법.
제16항 또는 제17항에 있어서,
외부서열(X+Z)의 염기서열 개수는 6~35개인 것을 특징으로 하는 제한효소에 의해 활성이 조절되는 프라이머의 설계방법.