KR20140121989A

KR20140121989A - 초도배양 세포로의 물질 전달용 조성물

Info

Publication number: KR20140121989A
Application number: KR20130038411A
Authority: KR
Inventors: 황을문
Original assignee: 주식회사 서린바이오사이언스; 황을문
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2014-10-17

Abstract

본 발명은 경제적이며, 효과적으로 생체 물질을 검출할 수 있는 바이오 센서를 제공하기 위하여, 표적 바이오 물질과 결합하거나 반응하는 생체분자가 결합된 카본 나노닷(carbon dot)을 제공한다.

Description

초도배양 세포로의 물질 전달용 조성물{Composition for transfering substance into primary culture cells}

본 발명은 물질 전달용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 줄기세포를 포함한 초도배양 세포로의 물질 전달용 조성물에 관한 것이다.

세포 내로의 물질전달 특히 RNA나 DNA와 같은 핵산 또는 항체와 같은 펩타이드의 전달은 세포막이라는 장벽 때문에 쉬운 일이 아니다. 이런 문제점을 극복하기 위해 lipofectamineTM과 같은 리포좀 계열의 물질을 이용한 lipofection, 염화칼슘을 이용한 침전법, 전기천공법 등이 빈번하게 사용되고 있으나, 이들 방법은 DNA의 세포내로의 전달에 특화되어 있는 방법이고, 암세포와 같이 이미 확립된 일부 계대배양 세포주에서만 제대로 작동하는 것으로 알려져 있다.

카본 나노닷(Carbon nanodot, C-Dots)은 pulse laser deposition, carbon arc discharge, microwave and hydrothermal strategy를 이용한 다양한 방법으로 제조된 탄소 기반의 형광 나노입자로서 개발되고 있으며, 광 발광(photoluminescence) 의존적으로 크기 및 발광(excitation) 파장이 변화하고, 광표백(photobleaching)에 대하여 저항성을 나타낼 뿐만 아니라 우수한 생체 적합성(biocompatibility)를 나타내는 특성을 갖고 있다고 보고된 바 있다(S. Sharbati-Tehrani, et al., J. BMC Mol. Biol., 9, 34, 2008; S. Sharbati-Tehrani, B. Kutz-Lohroff, R. Bergbauer, J. Scholven, R. Einspanier, BMC Mol. Biol., 9, 34, 2008). 그 외에도 다수의 C-Dot은 다수의 카복실산 반족(moiety)를 표면에 가지고 있어, 수용성이 우수하며, 다양한 생체분자와 기능화(functionalization)될 수 있게 한다.

그러나 이러한 종래의 세포 내로의 물질 전달방법은 배아줄기세포, 중간엽줄기세포와 같은 줄기세포나 섬유아세포와 같은 초도배양 세포에 대해서는 매우 효율이 떨어지고, 설사 효율이 다소 높은 방법의 경우라도 세포독성이 나타나는 등의 문제로 인해 제한적으로 사용되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 줄기세포를 포함한 초도배양 세포 내로의 활성물질을 효율적으로 전달할 수 있는 시약 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 아울러, 본 발명은 상기 물질 전달 방법을 이용하여 세포 내의 특정 생체분자에 대한 특이적 검출방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 활성분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 유효성분으로 함유하는 상기 활성분자의 초대배양 세포로의 전달용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 세포 내 표적분자와 결합하거나 반응하는 탐침분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 포함하는 초대배양 세포 내의 상기 표적분자의 검출용 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 상기 카본 나노닷은 탄소계 물질의 소각시 발생하는 그을음(soot)으로부터 수득될 수 있으며, 예를 들어, 양초, 타이어, 등유(kerosin), 경우(disel), 휘발유(gasoline), 목재, 나뭇잎, 글리세롤(glycerol), 가솔린(gasoline), 또는 타이어 등의 탄소계 물질의 연소에 의하여 발생하는 그을음을 이용하여 제조될 수 있으며, 이 외에도 마이크로파 보조 열분해법(microwave assisted pyrolysis method)에 의하여 발생하는 그을음을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 초대배양 세포는 미분화세포 또는 분화세포일 수 있다. 이 때, 상기 미분화세포는 줄기세포(stem cell) 또는 아세포(blast cell)일 수 있고, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있으며, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cell), 내피줄기세포(endothelial stem cell), 치수줄기세포(dental pulp stem cell) 또는 제대혈유래줄기세포(cord blood-derived stem cell)일 수 있다. 상기 아세포는 섬유아세포(fibroblast), 근아세포(myoblast), 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 각질세포, 내피세포(endothelial cell), 근아세포(myoblast), 신경아세포(neuroblast), 림프아구(lymphoblast), 멜라닌아세포(melanoblast), 혈관아세포(angioblast) 또는 골수아세포(myeloblast)일 수 있다. 상기 분화세포는 각질세포(keratinocyte), 림프구(lymphocyte), 신경세포(neuron), 연골세포(chondrocyte), 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 근세포(myocyte), 선세포(gland cell), 골세포(osteocyte) 또는 파골세포(osteoclast)일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 활성분자는 작은 화합물, DNA, RNA, PNA, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 단백질, 효소, 및 항체 또는 그의 기능성 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 카본 나노닷과 활성분자는 수소결합, 이온결합 또는 공유결합에 의해 결합될 수 있고, 상기 공유결합은 에테르 결합(eter bond), 티오에테르 결합(thioeter bond), 에스테르 결합(ester bond) 또는 아마이드 결합(amide bond)일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 표적분자는 단백질 또는 핵산분자일 수 있고, 상기 핵산분자는 miRNA를 포함하는 non-coding RNA일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 탐침분자는 항체 또는 그의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 또는 앱타머일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 저해제는 항체 또는 기의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 앱타머일 수 있다.

상기 초대배양 세포로의 전달용 조성물 또는 표적분자의 검출용 조성물은 세포 배양시 배지에 첨가하여 반응시킬 수 있고, 상기와 같이 생체외 조건에서(ex vivo)에서 세포에 처리된 후, 동물의 생체 내(in vivo)에 주입되어 생체 내의 주입 세포 및 표적분자의 추적에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 관점에 따르면, 활성분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 초대배양 세포에 처리하는 단계를 포함하는 상기 활성분자의 초대배양 세포내로의 전달방법이 제공된다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 활성분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 초대배양 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 초대배양 세포로의 상기 표적분자의 상기 활성분자를 전달하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 세포 내 표적분자와 결합하거나 반응하는 탐침분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 초대배양 세포에 처리하는 단계를 포함하는 상기 초대배양 세포 내의 상기 표적분자를 검출하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 세포 내 표적분자의 기능을 저해하는 저해제가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 초대배양 세포에 처리하는 단계를 포함하는 상기 표적분자의 기능의 저해방법이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 상기 초대배양 세포는 미분화세포 또는 분화세포일 수 있다. 이 때, 상기 미분화세포는 줄기세포(stem cell) 또는 아세포(blast cell)일 수 있고, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있으며, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 지방유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cell), 내피줄기세포(endothelial stem cell), 치수줄기세포(dental pulp stem cell) 또는 제대혈유래줄기세포(cord blood-derived stem cell)일 수 있다. 상기 아세포는 섬유아세포(fibroblast), 근아세포(myoblast), 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 각질세포, 내피세포(endothelial cell), 근아세포(myoblast), 신경아세포(neuroblast), 림프아구(lymphoblast), 멜라닌아세포(melanoblast), 혈관아세포(angioblast) 또는 골수아세포(myeloblast)일 수 있다. 상기 분화세포는 각질세포(keratinocyte), 림프구(lymphocyte), 신경세포(neuron), 연골세포(chondrocyte), 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 근세포(myocyte), 선세포(gland cell), 골세포(osteocyte) 또는 파골세포(osteoclast)일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 카본 나노닷과 활성분자는 수소결합, 이온결합 또는 공유결합에 의해 결합될 수 있고, 상기 공유결합은 에테르 결합(eter bond), 티오에테르 결합(thioeter bond), 에스테르 결합(ester bond) 또는 아마이드 결합(amide bond)일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 표적분자는 단백질 또는 핵산분자일 수 있고, 핵산분자는 miRNA를 포함하는 non-coding RNA일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 탐침분자는 항체 또는 그의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 또는 앱타머일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 저해제는 항체 또는 기의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 앱타머일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 카본 나노닷은 탄소계 물질의 소각시 발생하는 그을음(soot)으로부터 수득될 수 있으며, 예를 들어, 양초, 타이어, 등유(kerosin), 경우(disel), 휘발유(gasoline), 목재, 나뭇잎, 글리세롤(glycerol), 가솔린(gasoline), 또는 타이어 등의 탄소계 물질의 연소시 발생하는 그을음을 이용하여 제조될 수 있다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 경제적이며 효과적으로 생체물질을 검출할 수 있는 바이오 센서를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷(1a) 및 실시예 8의 분자비콘(1b)의 제조방법을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 실시예 1 내지 8에 따른 카본 나노닷의 광발광(photoluminescence) 스펙트럼을 기록한 그래프(각각 1a 내지 1h) 및 실시예 8에 따른 타이어 유래의 카본 나노닷의 근적외광 영역의 광발광 스펙트럼을 보다 상세히 기록한 일련의 형광 스펙트럼 이미지(1i) 및 그래프(좌하귀)이다.
도 3은 카보 나노닷의 형광 스펙트럼 분석 결과(3a), TEM 이미지 분석 결과(3b), FTIR 분석 결과 및 세포독성 분서 결과(도 3d)를 나타낸다.
도 4는 실시예 7의 카본 나노닷의 광학적 특성(4a) 및 실시예 9의 분자비콘의 표적 miRNA 특이성을 형광스펙트럼을 통하여 확인한 결과(4b)이다.
도 5는 실시예 9의 카본 나노닷과 이의 표적 miRNA를 CHO 세포에 처리한 후 형광 분석 결과를 나타내는 그래프(5a), 일련의 공초점 형광현미경 사진(5b), 처리시간에 따른 형광 강도의 변화를 나타내는 그래프(5c), 및 P19 세포에 실시예 7 또는 9의 카본 나노닷을 처리한 후 수득한 일련의 형광 이미지 사진(5d)이다.
도 6은 실시예 7의 카본 나노닷의 UV-스펙트럼 분석 결과(6a) 및 본 발명의 일 실시예에 다른 카본 나노닷의 다양한 pH에 따른 형광 스펙트럼을 나타내는 그래프(6b)이다.
도 7은 실시예 7의 카본 나노닷의 XPS 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 9의 카본 나노닷과 이의 표적 miRNA의 결합율을 아가로즈 젤 전기영동을 통하여 확인한 젤 사진이다.
도 9는 P19 세포에 레티노산을 처리하여 분화를 유도한 후, 신경세포 분화수준을 분화마커를 이용하여 염색한 후 수득한 일련의 형광 이미지 사진이다.
도 10은 P19 세포에 레티노산을 처리하여 분화를 유도한 후, 신경세포 분화에 따른 miRNA 9의 발현 수준을 정량적 RT-PCR 분석을 통하여 확인한 결과이다.
도 11은 실시예 10의 카본 나노닷을 이용한 siRNA의 초대배양 세포로의 전달이 리포좀에 의한 전달에 비하여 우수한 효율을 나타내는 것을 확인한 그래프이다.
도 12는 실시예 12의 카본 나노닷에 의하여 miRNA가 초대배양 세포로 효과적을 전달되는 것을 확인한 일련의 형광 이미지 사진이다.
도 13은 miRNA9 기능성 벡터(3xPT-miR9)의 개략적인 구조(13a) 및 인간 섬유아세포에 실시예 9의 카본 나노닷에 의하여 miRNA9가 효과적으로 세포로 전달되는 것을 입증한 루시퍼라아제 분석 결과 그래프 (13b)이다.
도 14는 실시예 12의 카본 나노닷에 의한 섬유아세포의 형태 변화를 관찰한 일련의 세포 사진(14a) 및 실시예 12의 카본 나노닷에 의한 섬유아세포의 분화마커인 Tuj1의 형광수준이 증가하는 것을 확인한 형광 이미지 사진(14b)이다.

용어의 정의

카본나노닷: 카본나노닷 또는 탄소나노닷은 연 구조 또는 비정형 탄소 핵과 탄소질 표면(carbonaceous surface)으로 구성된 수 나노미터에서 수십 나노미터의 크기를 갖는 발광성 카본 나노입자이다. 탄소나노튜브가 sp ³ 결합을 주로 갖고 있는 반면, 카본나노닷은 sp ² 결합을 가지고 있어, 탄소-탄소 이중결합을 내부에 보유하고 있으며, 카르보닐기(C=O) 역시 다수 보유하고 있는 것으로 알려지고 있다.

발명의 상세한 설명

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예: 카본 나노닷의 제조

본 발명자들은 카본 나노닷을 제조하기 위해, 경유, 등유, 휘발유, 나뭇잎, 글리세롤, 양초, 목재 및 타이어를 소각시키면서 발생한 화염의 상부 위로 사각형의 유리판(길이=800 mm, 폭=700 mm, 두께=10 mm)을 올려 놓은 후 유리판에 형성된 그을음을 수집하였다(표 1 참조). 수집된 각각의 그을음(200 mg)을 5 M 질산(HNO₃) 100 mL과 혼합한 후 120℃에서 10시간동안 환류시켜, 검은색의 균질한 수용성 현탁액을 제조하였다. 상기 현탁액을 4000 rpm으로 8분간 원심분리하여 검은색 탄소성 침전물과 연녹색 상등액으로 분리하였다. 카본 나노닷의 최대 회수를 위해 상기 침전물을 유기용매(아세톤:물=3:1) 100 ml과 혼합한 후, 15,000 rpm으로 12분간 원심분리하였다. 그런 다음 수집된 상등액을 pH 조정을 위해 탄산수소나트륨(NaHCO₃)로 중성화시킨 후 3 kD 투석막을 이용하여 물에 대하여 투석을 하였다.

실시예	원료
1	경유
2	등유
3	휘발유
4	글리세롤
5	나뭇잎
6	목재
7	양초
8	타이어

실험예 1: 카보 나노닷의 PL 특성 분석

상기 실시예에서 제조된 증류수에 용해된 카본 나노닷(1 mg/ml) 200 μl에 대하여 광발광 특성과 흡광도를 멀티웰 분광광도계(Synergy MX, Bioteck Ltd., 대한민국)를 이용하여 측정하였다. 광 방출 스펙트럼은 340 nm 부터 710 nm의 여기파장에 대하여, 500 내지 800 nm의 방출파장에 대하여 측정하였고, 흡광도는 250 nm 부터 800 nm 파장대에 대하여 기록하였다(도 3a).

그 결과 도 2a 내지 2h에 나타난 바와 같이, 전반적으로 상기 8가지 소재로부터 제조된 카본 나노닷은 전형적인 광발광 현상을 나타냈고, 여기파장이 길수록 방출되는 광의 파장도 긴쪽으로 전이되고 광도는 여기파장의 길이와 반비례의 관계가 있음을 알 수 있었다. 그러나, 원재료의 차이에 따라 PL 특성이 다른 점이 발견되었는데, 경유, 등유, 글리세롤, 나뭇잎의 경우 전형적인 청색광이 주로 나타났고, 목재, 휘발유, 양초 및 타이어의 경우에는 청록광이 주로 나타났다. 한편, 타이어의 경우에는 비록 그 강도는 상대적으로 낮았으나, 근적외광(650 nm ~ 760 nm) 영역에서의 최대 방출 파장값을 갖는 스펙트럼을 나타냈다. 이에, 본 발명자들은 다양한 탄소 기반의 물질로부터 유래한 카본 나노닷이 모두 광발광(photoluminescence) 특성을 나타내므로, 시험관 내 및 생체내 조건에서의 세포의 추적 및 특정 생체분자에 대한 표지제로서 사용이 가능할 것이라고 판단하여, 이 중 실시예 7의 양초 유래의 카본 나노닷을 이용하여 각종 이미징 분석을 수행하였다.

실시예 9: 분자 비콘의 제조

본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷을 분자 비콘(molecular beacon)으로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 7의 양초 유래의 카본 나노닷에 예시적으로 miRNA 9 센싱 올리고뉴클레오티드를 연결시켜 분자 비콘(carbon-dot based molecular beacon, CMB)을 제조하였다.

miRNA 9 분자 비콘의 부분 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 바이오닉스(Bionics, Inc, Koea)로부터 구매하였다. 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드를 DNA 올리고 쌍을 이용하여 제조하였다(도 1b 참조). 그 후, 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드(miRNA 9 센싱 올리고)를 miR9 결합 부위를 포함하고 아민 말단을 갖는 올리고뉴클레오티드(miRNA 9 결합 올리고뉴클레오티드)와 3' 말단에 BHQ1(black hole quencher 1)을 갖는 짧은 올리고뉴클레오티드(?처 올리고)를 1:1(몰비)로 혼성화하여 제조하였다. 상기 miRNA 9 센싱 올리고는 miRNA 9에 대하여 상보적인 miRNA 9 결합부위를 포함하고 있으며, 5'-NH2-ttcgctgtTCATACAGCTAGATAACCAAAGA-3'(서열번호 1)의 서열을 갖는다. 또한, BHQ1를 포함하는 상기 ?처 올리고는 5'-TATGAACAGCG-BHQ1-3'(서열번호 2)의 서열을 갖는다.

그 후, 상기 miRNA 9 센싱 올리고(80 pmol)를 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimide hydrochloride, 2 mM, Sigma) 및 NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide, 5 mM, Sigma)를 결합 용액을 이용하여 상기 실시예 9의 카본 나노닷(1 mg/ml) 20 μl과 상온에서 1시간 동안 반응시켜, 공유적으로 결합시켜 miRNA 9 분자 비콘을 제조하였다.

상기 실시예 9에서 제조한 miRNA 9 분자 비콘의 결합율을 측정하기 위하여 아가로즈 젤 전기영동을 이용하였다. 실시예 7에서 제조한 카본 나노닷(1 mg/ml) 20 μl, miRNA 9 센싱 올리고(80 pmol) 및 이들의 혼합물을 각각 2 μl 로딩 버퍼와 혼합한 후, EtBr을 포함하고 있는 2% 아가로즈 젤에 로딩하였다. 전기영동은 1×TAE 버퍼에서 100V 조건에서 40분 동안 수행하였으며, 젤 사진 이미지에 나타난 밴드의 진하기를 imageJ software(NIH, USA)를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, miRNA 9 센싱 올리고 밴드는 miRNA 9 분자 비콘에서는 현저하게 밴드의 진하기가 감소하는 것이 관찰되었다. 젤 사진을 ROI 분석 결과, 실시예 1의 카본 나노닷에 miRNA 9 센싱 올리고의 결합 효율을 약 82%로 나타났으며, 이러한 결과는 실시예 9의 miRNA 9 분자 비콘이 성공적으로 형성되었음을 의미한다(도 7 참조).

실시예 10: 카본 나노닷-siRNA의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 7의 카본 나노닷에 GFP에 특이적이고 5'-말단에 아민기를 가진 siRNA(Sense primer (서열번호 3, 5'-NH2-GCA UCA AGG UGA ACU UCA A(dTdT)-3'); Anti-sense primer(서열번호 4, 5'-UUG AAG UUC ACC UUG AUG C-3')를 상기 실시예 9와 유사하게 EDC와 NHS를 이용한 아마이드 결합을 통해 연결한 후, 3 kD 투석막 방법으로 비결합된 물질을 제거하고 분리하였다.

실시예 11: 카본 나노닷-DNA의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 7의 카본 나노닷에 5'-말단에 아민기를 갖고 3'-말단에 Cy 5.5가 표지된 DNA(Sense primer(서열번호 5) 5'-NH2-TAT TAG GAC AAG GCT GGT GGG CAC-Cy5.5-3', Antisense primer (서열번호 6, 5'-GTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATA-3')를 상시 실시예 9와 유사하게 EDC와 NHS를 이용한 아마이드 결합을 통해 연결한 후, 3 kD 투석막 방법으로 비결합된 물질을 제거하고 카본 나노닷-DNA 복합체를 분리 정제하였다.

실시예 12: 카본 나노닷-miRNA의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 7의 카본 나노닷에 antisense primer의 3'-말단에 아민기를 갖는 miRNA mimic(miR-124a Sense primer(서열번호 7, 5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3'); miR-124a antisense primer(서열번호 8, 5'-GGCUTTCUCCGCGTGCCTTU-NH2-3'); miR-9 Sense primer(서열번호 9, 5'-UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA-3'), miR-9 antisense primer(서열번호 10, 5'-TCUTUCUGCTUGUTUUCCUUUGU-NH2-3'); miR-9* Sense primer(서열번호 11, 5'-AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU-3'), miR-9* antisense primer(서열번호 12, 5'-UCTTTCGGTTUTCTUGCTTTUT-NH2-3')를 상시 실시예 9와 유사하게 EDC와 NHS를 이용한 아마이드 결합을 통해 연결한 후, 3 kD 투석막 방법으로 비결합된 물질을 제거하고 카본 나노닷-miRNA 복합체를 분리 정제하였다.

실험예 2: 세포 배양

2-1: CHO 세포의 배양

CHO cells (chinese hamster ovary cell line) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구매하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen, Grand Island, NY) 및 1% 항생제(Invitrogen, Grand Island, NY)가 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Grand Isaland) 배지를 배양하였다. 배양기는 포화수분 및 5% 이산화탄소 조건으로 설정하였다.

2-2: P19 세포의 배양

P19 세포(mouse embryonic teratocarcinoma cell lines)는 10% FBS 및 1% 비필수아미노산 용액(100x Sigma, St Louis, MO), 0.1% 2-메르캅토에탄올(Mercaptoethanol, Gibco, Herndon, VA) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 이용하고, 0.1% 젤라틴으로 코팅한 디쉬(dish)에서 배양하였다. 배양기는 포화수분 및 5% 이산화탄소 조건으로 설정하였다.

2-3: 섬유아세포의 배양

인간 섬유아세포(human fibroblast)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구매하였으며, 15% FBS(fetal bovine serum, Invitrogen, Grand Island, NY) 및 1% 항생제(Invitrogen, Grand Island, NY)가 첨가된 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium, Grand Isaland) 배지를 배양하였다. 배양기는 포화수분 및 5% 이산화탄소 조건으로 설정하였다.

2-4: 중간엽 줄기세포의 배양

마우스 골수 유래 mesenchymal stem cells (MSC, 중간엽줄기세포)는 Lonza (Lonza Walkersville, Inc)에서 구입하였고, MSC basal medium에 50 ml MSC growth supplement, 10 ml L-glutamine, 0.5 ml GA-100 첨가하여 배양하였다. 배양기는 포화수분 및 5% 이산화탄소 조건으로 설정하였다.

실험예 3: 카본 나노닷의 광학적 특성 분석

상기 실시예 1 및 실시예 9에서 제조한 카본 나노닷의 자체 발광(self-illumination), 카복실기의 자가 개질(self-passivation of carboxyl group), 및 세포 내 독성의 특성을 분석하였다.

3-1: 실시예 7의 카본 나노닷의 광학적 특성 분석

방출 스펙트럼을 425~585 nm 범위의 여기(excitation) 파장에서 기록하였다. 흡수 스펙트럼은 300~800 nm 범위에서 기록하였다. 그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이 실시예 7의 카본 나노닷의 방출(emission)에 의존적으로 여기(excitation) 파장이 변화하는 결과가 관찰되었다.

TEM(Transmission Elctron Microscopy) 측정은 200 kV에서 JEOL JEM-2010 기기를 이용하였다. 상기 실시예 7에서 제조한 카본 나노닷 용액을 탄소 코팅된 구리 그리드(copper grid)에 몇 방을 떨어뜨린 후, 밤새 공기 건조시켰다. 방출 및 흡수 스펙트럼은 실시예 7의 카본 나노닷 200 μl을 Synergy Mx Monochromator-Based Multi-Mode Microplate Reader(Bio Teck, Seoul) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 실시예 7의 카본 나노닷의 직경이 2.4 ± 1.1 nm인 것으로 관찰되었다(도 2b 참조).

이어, FTIR(Fourier Transform Infrared Spectroscopy ) 분석을 수행하였다. 실시예 7의 카본 나노닷 용액을 샘플 홀더에 올려놓고 Perkin-Elmer Spectrum 2000 Fourier Transform Infrared Spectroscopy 기기를 이용하여 측정하였다. 기본 보정(baseline correction)은 측정 후에 적용하였다. 그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 3444 cm-1를 중심으로 OH기에 해당되는 넓고 강한 피크가 관찰되었으며, 1717 cm-1에서C=O에 해당되는 스트레칭 피크(stretching peak)가 관찰되었으며, 1402 cm-1에서 변형된 OH기에 해당하는 피크가, 1623 cm-1에서 C=C 스트레치(stretch)가 관찰되었다. 이러한 결과는 실시예 7의 카본 나노닷의 표면에 수산화(hydroxyl)기 및 카복실(carboxyl)기가 다수 존재한다는 것을 의미한다(도 3c 참조).

또한, UV-Vis 스펙트럼을 이용하여 상기 실시예 7의 카본 나노닷 용액의 광학적 특성을 분석한 결과, 425 nm에서 흡수 밴드가 관찰되었으며, 425 nm의 여기(exciation) 파장에 대하여 525 nm 근처에서 강한 황색의 방출 파장이 관찰되었다(도 6a 참조)

이어, XPS(X-ray Photoelectron Spectroscopy)를 이용하여 특성을 분석하였다. XPS 측정은 Mg Kα source (1253.6 eV)를 이용하여 Escalab 220i-XL(Thermo VG, U.K.) 기기에서 측정하였다. 스펙트럼은 10 eV pass energy 조건에서 수득하였으며, 셜리 타입 백그라운드(Shirley type background)는 각 부분에서 제거하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 7의 카본 나노닷의 탄소(C) 및 산소(O) 원자의 비율이 각각 50.32% 및 39.29%인 것으로 나타났다(도 7 참조). 또한, C-C, C-O 및 C=O이 284.6, 286.5 및 288.9 eV에서 관찰되었다(도 7 참조). 또한, 284.6 ev에서 관찰되는 피크는 흑연 탄소(sp2)를 의미한다.

3-2: 실시예 9의 분자 비콘의 광학적 특성 분석

실시예 9의 카본 나노닷(miRNA 9 분자 비콘)의 TEM 이미지 분석 결과, 직경이 3.8 ± 1.2 nm로 실시예 1의 카본 나노닷에 비하여 약간 크기가 커진 것을 확인할 수 있었다(도 3b 참조).

이어, miRNA 9 센싱 올리고와의 결합한 실시예 9의 분자 비콘의 형광변화를 관찰하였다. 실시예 9의 카본 나노닷의 농도를 고정하고, miRNA 9 센싱 올리고의 농도를 0, 40, 60 및 80 pmol로 증가시키며 마이크로튜브 내에서 반응시켰다. 그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이 실시예 7의 카본 나노닷의 방출 강도가 300~560 범위의 여기(excitation) 파장에서 ?칭(quenching)되었으며, 480 nm 여기 파장에서 스펙트럼 형광 강도가 ?칭(quenching)되는 것이 관찰되었다(도 3a 참조). 또한, 통계학적으로 유의한 miRNA 9 분자 비콘의 ?칭 효율은 480 m 및 540 nm 여기 파장에서 약 70% 달하였다(도 4a 및 8 참조.)

실험예 4: 생물학적 특성 분석

본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷이 생물학적 이미징에 적용 가능한지 판단하기 위하여, 세포 내 다양한 pH 환경 내에서 카본 나노닷의 방출 파장 특성이 변화하는지 분석하였다. 그 결과 도 6b에 나타난 바와 같이, pH 3~11의 조건에서 실시예 7의 카본 나노닷의 형광 강도가 변화하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 세포의 생리학적, 생리학적 pH 변화 범위인 4.5~9.5 조건에서 본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷을 유용하게 적용할 수 있음을 의미한다(도 6b 참조).

이어, 실시예 7의 카본 나노닷의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. CHO(Chinese hamster ovary) 및 P19 세포를 각각 96-웰 플레이트에 웰당 1×104 의 농도로 심고, 그 다음날 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 20 및 50 μg/μl 농도로 실시예 1의 카본 나노닷을 세포에 처리하였다. 37℃에서 48시간 동안 세포를 배양한 후, 1 mg/ml MTT(3-(4,5-dimethythazolz-yl)-2,5-diphenyletrazolium bromide) 용액을 웰당 20 μl씩 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상층액을 제거하고, 남은 침전물에 DMSO를 200 μl 첨가하여 용해시켰다. 각 웰의 흡광도를 490 nm에서 마이크로플레이트 리더기(Tecan Spectra, Wetzlar, Germany)를 이용하여 측정하였다. 이때, 대조군으로는 DMEM 배지에서 카본 나노닷을 처리하지 않은 세포를 이용하였으며, 상대적인 세포의 생존율은 평균%±표준편차(n=3)으로 나타냈으며, 대조군의 흡광도를 기준으로 실험군의 흡광도를 퍼센트로 나타냈다.

그 결과, 도 3d에 나타난 바와 같이, CHO 및 P19 세포에 실시예 7의 카본 나노닷의 처리 농도 증가에 따른 세포 생존율의 변화가 유의한 수준에서 관찰되지 않았다(도 3d 참조). 상기 결과를 종합하면, 양초 그을음으로부터 분리된 카본 나노닷이 자가 형광 특성, 복실기의 자가 개질(self-passivation of carboxyl group) 특성을 나타내며, 세포 독성을 유발하지 않아, 세포 또는 생체 내(in vivo) 이미징 도구로 유용하게 적용될 수 있음을 시사한다.

실험예 5: 카본 나노닷의 표적 특이적 반응성 분석

본 발명자는 실시예 9의 miRNA 9 분자 비콘의 miRNA 9를 인식하는 특이성을 시험관 내(in vitro)에서 측정하였다. 이때, miRNA 9는 0, 50, 및 100 pmol을 이용하였으며, 100 pmol miRNA1(5'-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3', 서열번호 13)을 대조군으로 이용하였다. 1시간 동안 상온에서 반응시키며, Bio Tek Fluorescent Microplate Fluorometer(Synergy Mx, BioTeck Ltd, VT)를 이용하여 형광을 측정하였으며, 여기 파장은 300~560nm 범위로 설정하였다.

그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이 480 nm 여기 파장에서의 스펙트럼 형광 강도 및 300~560 nm 파장 범위의 여기 파장에서의 형광 강도가 miRNA 9의 농도 의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 4b 참조). 반면, miRNA1과 반응한 실시예 9의 분자 비콘은 형광신호의 ?칭을 유발하였다. 이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 비콘이 컨쥬게이트된 프로브 특이적으로 반응하여 형광 ?처(quencher)가 분자 비콘으로부터 분리되어 형광 신호가 가시화될 수 있음을 의미한다.

실험예 6: 세포를 이용한 표적 특이적 반응성 분석

6-1: CHO 세포를 이용한 표적 특이적 반응성 분석

CHO 세포는 신경 특이적 miRNA 9가 발현하지 않는다고 알려져 있다. 이에, 본 발명자는 CHO 세포를 이용하여 실시예 9의 miRNA 9 분자 비콘의 표적 특이적 형광 발현 여부를 확인하였다. CHO 세포를 24웰 플레이트에 웰당 1×10⁵ 농도로 심은 후, miRNA(miRNA 9 또는 miRNA1)을 리포펙타민(lipofectamine,Invitrogen, CA)을 이용하여 37℃에서 1시간 동안 세포로 형질도입하였다. 형질도입 이후, 실시예 9의 miRNA 9 분자 비콘(miR9 sensing oligo: 카본 나노닷, 80 pmol: 20 μl of 1 mg/ml)을 37℃에서 3시간 동안 세포에 처리하고 반응시켰다. 이때, miRNA 9는 0, 50, 및 100 pmol을 이용하였으며, 100 pmol miRNA1(5'-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3', 서열번호 13)을 대조군으로 이용하였다.

480 nm 여기 파장 및 550 nm 방출 파장에서 miRNA 9 처리 농도에 따른 miRNA 9 분자 비콘의 형광 강도를 상대적으로 비교하였다. 실시예 9의 miRNA 9의 ?칭 효율은 도 5a에 나타난 바와 같이 CHO 세포에 0, 50 및 100 pmole miRNA 9 처리시 각각 79, 54 및 22%으로 나타났다(도 5a 참조). 상기 ?칭 효율을 실시예 1의 카본 나노닷을 기준으로 상대적으로 계산한 결과이다.

CHO 세포를 유리 글라스를 넣은 6 웰 플레이트 위에 웰 당 1×10⁵ 농도로 심었다. 우선 miRNA 9(0, 50 및 100 pmol 농도) 또는 miR1을 리포펙타민을 이용하여 CHO 세포에 도입시킨 후, 실시예 9의 카본 나노닷인 miRNA 9 분자 비콘(80 pmole, 20 μg)을 세포에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 세포를 D-PBS(Gibco, Grand Island, NY)를 이용하여 5분 씩 2회 세척하고, 4% 포름알데하이드 500 μl를 이용하여 4℃에서 15분 동안 고정시켰다. 그 후, 다시 D-PBS(Gibco, Grand Island, NY)를 이용하여 5분 씩 2회 세척하였다. 세포 이미지는 공초점 레이저 현미경(LSM 510; Carl Zeiss, Weimer, Germany)을 이용하여 얻었으며, 이때 방출 필터는 508-580, 561-593 및 636-700 nm를 이용하였으며, 여기 파장은 488 nm였다.

그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이 실시예 7 및 실시예 9의 카본 나노닷 모두 CHO 세포 내로 쉽게 유입되어, 세포 내에서 형광이 발현하는 것을 관찰할 수 있었다(도 5b 참조). 이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷의 세포 내로의 자가 유입 촉진(self-promoted uptake) 특성을 의미한다. 또한, CHO 세포의 세포질 내에서 실시예 9의 카본 나노닷의 형광 밝기가 miRNA 9 처리량 의존적으로 증가한 반면, miR1은 원래의 ?칭 상태가 유지되며, 분자 비콘으로 유용하게 적용될 수 있음을 재확인할 수 있었다(도 5b 참조).

6-2: P19 세포를 이용한 표적 특이적 반응성 분석

이어, 본 발명자는 실시예 9의 카본 나노닷(miRNA 9 분자 비콘)을 이용하여 P19 세포 신경분화에서 발현하는 miRNA 9의 발현을 이미징할 수 있는지 확인하였다.

우선, P19 세포의 신경 분화 과정 중에 내인성 miRNA 9의 발현 수준을 확인하였다. P19 세포에 레티노산(retinoic acid, RA)를 처리하여 신경 분화를 유도하고, 신경 세포 분화 마커인 Oct4(줄기세포 마커) 및 Tuj1(신경세포 마커)를 이용하여 면역세포화학 염색을 이용하여 분석하였다.

구체적으로, P19 세포의 신경분화를 유도하기 위하여, 0.1% N2 supplement (100x, Gibco) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM/F12(1:1, Gibco, Grand Island, NY) 배지를 이용하여 배양하며, 0.5 mM 레티노산(all-trans-retinoic acid, RA; Sigma, St. Louis, MO)을 2일 동안 처리하였다. 그 후, 레테노산이 포함되지 않은 배지로 교환하여 세포를 48 시간동안 더 배양하였다. P19 세포는 레티노산을 첨가하기 전(0일) 및 첨가후 4일 이후, 4% 포름알데하이드(formaldehyde)를 이용하여 15분 동안 고정시키고, PBS를 이용하여 5분씩 2회 세척하였으며, 반응 중에는 조심스럽게 웰 플레이트를 교반하였다. 블로킹(blocking) 및 투과(permeabilization) 과정은 20% 정상 염소 혈청 반응 혼합물과 0.1% Triton X-100을 동시에 세포에 첨가하여 60분 동안 반응시키며 수행하였다. Oct-4 또는 Tuj1 단백질은 1:1,000 항-Oct-4 항체(Chemicon, Millipore, Watford, UK) 또는 항-Tuj1 항체(Chemicon, Millipore, Watford, UK)를 4℃에서 밤새 반응시켜 검출하였다. 상기 항체와 반응한 이후, 5분 씩 3회 PBS를 이용하여 세포를 세척하고, Alexa-488 및 Alexa?594 Fluor 2차 항체 컨쥬게이트를 각각 첨가하고 90분 동안 반응을 수행하였다. 그 후, 상기 P19 세포를 커버 슬립(cover slip) 위에 놓고 DAPI (Vector Laboratories, Inc., CA)를 포함하는 용액을 그 위에 첨가하였다. 세포의 형광 신호는 공초점 레이저 현미경(LSM 510; Carl Zeiss, Weimer, Germany)을 이용하여 수득하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 레티노산 처리 4일 후, 신경세포 분화 마커가 강하게 발현되며, P19 세포의 신경 분화를 확인할 수 있었다. 또한, 염색된 세포의 사진으로부터 확인할 수 있듯이 세포 신경돌기가 성장하는 형상을 보이며, 분화를 확인할 수 있었다(도 9 참조).

또한, P19 세포 분화 진행에 따라 miRNA 9의 발현의 증가는 실시간 PCR 수행 결과에서도 관찰되었다(도 10 참조). P19 세포 내 miRNA 9의 발현을 정량화하기 위하여, qRT-PCR(quantified reverse polymerase chain reaction)을 수행하였다. P19 세포에 레티노산을 0.5 mM 농도로 처리 0, 2, 및 4일이 경과한 시점에서 전체 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen, Grand Island, NY)을 이용하여 추출하였다. 그 후, 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하기 위하여 역전사 반응을 SuperscriptTM III first-stransd synthesis system (Invitrogen, Grand Island, NY)을 이용하여 수행했다. 그 후, 하기 사이클 조건에 따라 SYBR Premix Ex Taq(Takara)을 이용하여 LightCycler 480 II (Roche, Rochester, NY)에서 PCR 반응을 수행하였다: 95℃ 3분, 95℃ 15 초, 62℃ 30초, 40회 반복. 5S rRNA을 대조군으로 이용하였다.

이어, 본 발명자는 실시예 9의 분자 비콘이 P19 세포에서 miRNA 9의 발현을 이미징할 수 있는지 확인하였다. P19 세포의 신경분화 전 miRNA 9가 발현되지 않는 상태에서는 실시예 9의 분자 비콘(miRNA 9 CMB)을 구성하는 ?처 올리고(quencher oligo)와 형광 카본 나노닷이 근접한 위치에 존재하여 BHQ1에 의하여 방출되는 형광을 흡수하고, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 원리에 의하여 형광이 ?칭(quenching)될 것으로 예상되었다. 반면, P19 세포의 신경분화 후 miRNA 9가 존재할 때에는, miRNA 9가 miRNA 9 CMB를 구성하는 miRNA 9 결합 올리고와 결합하여 ?처(quencher) 올리고가 miRNA 9 CMB로부터 분리되어 형광이 관찰될 것으로 예상되었다.

그 결과, 도 5c에 나타난 바와 같이 480 nm 여기 및 540 nm 방출 파장 조건에서, P19 세포에 레티노산을 처리한지 2일이 경과한 후 방출 파장이 레티노산 미처리 시에 비하여 각각 7.5배 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 5c 참조). 이러한 결과는 레티노산 처리에 의한 P19 세포의 분화 과정에서 세포 miR124amiRNA 9의 발현이 증가하기 때문인 것으로 사료되었다.

이어, 본 발명자는 공초점 현미경 영상법을 이용하여 실제 P19 세포의 신경분화 과정에서 실시예 9의 분자 비콘의 형광 신호를 확인하였다.

P19 세포는 유리 글라스를 넣은 6 웰 플레이트 위에 웰 당 1×10⁵ 농도로 심었다. 그 후, P19 세포에 레티노산을 처리한지 0일 2일이 경과한 후 실시예 9의 분자 비콘(miRNA 9 분자비콘, 80 pmole, 20 μg)을 세포에 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 세포를 D-PBS(Gibco, Grand Island, NY)를 이용하여 5분 씩 2회 세척하고, 4% 포름알데하이드 500 μl를 이용하여 4℃에서 15분 동안 고정시켰다. 그 후, 다시 D-PBS(Gibco, Grand Island, NY)를 이용하여 5분 씩 2회 세척하였다. 세포 이미지는 공초점 레이저 현미경(LSM 510; Carl Zeiss, Weimer, Germany)을 이용하여 얻었으며, 이때 방출 필터는 508-580, 561-593 및 636-700 nm를 이용하였으며, 여기 파장은 488 nm였다. 이때, 형광 수준을 비교하기 위하여 실시예 7의 카본 나노닷을 세포에 처리한 샘플을 대조군으로 이용하였다.

그 결과, 도 5d에 나타난 바와 같이, 실시예 7의 카본 나노닷을 처리한 488 nm 여기 파장에서 실시예 7 및 실시예 9의 분자 비콘이 세포 내로의 자가 유입 촉진(self-promoted uptake)되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 9의 분자 비콘의 경우 P19 세포의 분화가 0일에서 2일로 증가함에 따라 내인성 발현이 증가하는 miRNA 9에 의하여 형광 신호가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 실시예 9의 분자 비콘을 구성하는 ?처 올리고(quencher oligo)가 miRNA 9의 존재하에 분리되어 카본 나노닷의 형광이 회복됨에 따라 발생하는 것으로 생각되었다. 반면 분화되지 않은 P19 세포에서는 miRNA 9가 거의 발현되지 않기 때문에, 형광 신호가 거의 확인되지 않았다(도 5d 참조).

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷은 세포 내로 쉽게 유입되어, 상기 카본 나노닷에 다양한 분자 비콘을 적용함으로써, 시험관 내(in vitro) 뿐만 아니라, 생체 내(in vivo)의 다양한 신호 검출에 유용하게 적용될 수 있음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예에 이용한 miRNA 9 이외에도 다양한 표적에 적용할 수 있으며, miRNA에 한정되지 않고 DNA, RNA, 펩타이드 및 단백질을 프로브로 적용할 수 있음을 시사한다.

실험예 7: 초대배양 세포로의 활성물질 전달 분석

상기 실험예 4 내지 6에서 사용한 세포들은 모두 확립된 계대배양 세포들로서 암세포 기원의 세포들로서 종래의 세포내 물질전달 수단으로 세로내로의 물질 전달이 원활하게 되는 편이다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷이 추가적인 표면 개질 없이도, 줄기세포를 포함한 초도배양 세포 내로의 활성물질을 효율적으로 전달할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.

7-1: 초대배양 세포로의 siRNA 전달 분석

본 발명자들은 상기 실시예 10에서 제조된 카본 나노닷-siRNA 복합체를 GFP를 발현하는 마우스 중간엽 줄기세포 (6 웰 플레이트 위에 웰 당 1×10⁵ 농도)에 (GFP siRNA:카본 나노닷, 25 또는 50 pmol:20 μl of 1 mg/ml)로 첨가한 후, 24시 후에 형광의 양상을 정량 및 정성적인 공초점 형광현미경으로 관찰하였다. 이 때, 양성대조군으로 리포좀으로 제형화된 GFP siRNA (50 pmol)를 상기 세포에 처리하였다.

그 결과 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷-siRNA는 상기 세포 내로 침투하여 GFP의 발현을 유의하게 저해하였으며, 처리 농도에 비례하는 GFP 발현 억제능을 보였으며, 이는 리포좀을 이용하여 동량의 siRNA를 처리한 경우보다 매우 현저한 효과임을 알 수 있다(도 11 참조). 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 카본 나노닷은 벡터의 제조나 형질감염 없이 유용하게 siRNA를 세포내로 전달하여 세포 내의 특정 유전자의 발현 억제를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

7-2: 초대배양 세포로의 DNA 전달 분석

본 발명자들은 상기 실시예 11에서 제조된, 카본 나노닷-DNA 복합체(Cy5.5-DNA:카본 나노닷, 50 pmol:10 μl of 1 mg/ml)를 초대배양세포인 피부조직에서 유래한 인간 섬유아세포(6 웰 플레이트 위에 웰 당 1×10⁵ 농도)에 처리한 후, 형광 양상을 공초점 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과 도 12에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 카본 나노닷만 처리한 세포에서 카본 나노닷의 고유의 형광신호가 검출되는 것을 확인하였기에 초대배양 세포인 인간 섬유아세포에 카본 나노닷이 효율적으로 침투하였음을 알 수 있다. 이때 방출 필터는 508-580, 561-593 및 636-700 nm를 이용하였으며, 여기 파장은 488 nm였다. 하지만 Cy5.5 형광신호 (방출필터 636-700 nm, 여기 파장 633 nm)에서는 형광신호가 검출되지 않았다(도 12 참조). 카본 나노닷-DNA 복합체가 처리된 섬유아세포에서 동일한 세포에서 카본 나노닷의 형광 신호와 아울러 DNA에 표지된 Cy5.5 신호가 동시에 검출 되었기에 초대배양 세포인 인간 섬유아세포에 효율적으로 카본 나노닷이 DNA를 전달 할 수 있음을 확인하였다.

7-3: 초대배양 세포로의 miRNA 전달 분석

본 발명자들은 상기 실시예 12에서 제조된, 카본 나노닷-miRNA 복합체 (miRNA:카본 나노닷, 60 pmol:10 μl of 1 mg/ml)를 초대 배양세포인 피부조직에서 유래한 인간 섬유아세포(6 웰 플레이트 위에 웰 당 1×10⁵ 농도)에 처리한 후 세포의 형태의 변화를 관찰하였다.

먼저 카본 나노닷-miRNA 복합체에 의해 전달된 miRNA9의 기능성 유무 확인을 위하여 miRNA9 기능성 벡터(3xPT-miR9)를 제작하였다(도 13a). CMV 프로모터에 의해 조절 받는 Luciferase 리포터 유전자 벡터의 3' 비번역부위(untranslated region)에 miRNA9와 상보적인 염기서열을 3 copy를 포함하는 핵산(miRNA9 target sequence)을 클로닝하였다. 이 경우 miRNA9가 발현이 되지 않을 때는 CMV 프로모터에 의해 세포내에서 luciferase 신호가 강하게 검출되나, miRNA9의 발현시 벡터내 존재하는 miRNA9 표적 서열(target sequence)에 결합되어 miRNA9의 기능에 의해 루시퍼라아제(luciferase) 신호가 감소하게 된다. 이때, 대조군으로는 miRNA124a의 기능을 확인 할 수 있는 3xPT-miR124a를 동일한 방법으로 제작하여 함께 사용하였다. 그 결과, 리포좀에 의해 3xPT-miR9벡터가 이입된 섬유아세포에서 카본 나노닷 만 처리한 대조군보다 카본 나노닷-miRNA9 복합체가 처리된 실험군에서 통계적으로 유의한 luciferase의 신호감소가 확인되었다(도 13b). 하지만 리포좀에 의해 3xPT-miR124a벡터가 이입된 섬유아세포에서는 카본 나노닷-miRNA9 복합체에 의한 luciferase 신호 감소가 확인 되지 않았다. 이를 통해 카본 나노닷을 통해 초대배양세포에 miRNA를 성공적으로 전달 할 수 있음을 확인하였다.

또한, 신경세포 특이적으로 발현하는 miRNA124a, miRNA9 및 miRNA9*를 이용하여 카본 나노닷-miRNA 복합체(miRNA:카본 나노닷, 80 pmol:20 μl of 1 mg/ml)를 제작 한 후 초대 배양세포인 피부조직에서 유래한 인간 섬유아세포(4 웰 플레이트 위에 웰 당 2×10⁵ 농도)에 처리하여 세포의 형태의 변화를 관찰하였다. 처리 5일 후 현미경관찰을 통해 카본 나노닷 또는 3개의 miRNA만 처리된 실험군에서는 아무것도 처리하지 않은 섬유아세포와 동일하게 세포증식 및 형태를 유지하였다(도 14a). 하지만 miRNA124a, miRNA9 및 miRNA9*를 이용한 카본 나노닷-miRNA 복합체가 처리된 섬유아세포에서는 세포의 증식이 현저하게 줄어들면서 세포형태학적으로 신경돌기가 보이는 신경세포로의 변화가 관찰할 수 있었다.

카본 나노닷-miRNA 복합체가 처리된 5일 후 섬유아세포의 분자특성을 확인하기 위하여 4% 포름알데하이드(formaldehyde)를 이용하여 15분 동안 고정시키고, PBS를 이용하여 5분씩 2회 세척하였으며, 반응 중에는 조심스럽게 웰 플레이트를 교반하였다. 블로킹(blocking) 및 투과(permeabilization) 과정은 20% 정상 염소 혈청 반응 혼합물과 0.1% Triton X-100을 동시에 세포에 첨가하여 60분 동안 반응시키며 수행하였다. Tuj1 단백질은 1:1,000 항-Tuj1 항체(Chemicon, Millipore, Watford, UK)를 4℃에서 밤새 반응시켜 검출하였다. 상기 항체와 반응한 이후, 5분 씩 3회 PBS를 이용하여 세포를 세척하고, Alexa?594 Fluor 2차 항체 컨쥬게이트를 각각 첨가하고 90분 동안 반응을 수행하였다. 그 후, 섬유아세포를 커버 슬립(cover slip) 위에 놓고 DAPI (Vector Laboratories, Inc., CA)를 포함하는 용액을 그 위에 첨가하였다. 세포의 형광 신호는 공초점 레이저 현미경(LSM 510; Carl Zeiss, Weimer, Germany)을 이용하여 수득하였다.

그 결과, 도 14b에 나타난 바와 같이, 카본 나노닷-miRNA 복합체가 처리 5일 후, Tuj1 신경세포 분화 마커가 강하게 발현되며, 섬유아세포의 신경 분화를 확인할 수 있었다. 또한, 염색된 세포의 사진으로부터 확인할 수 있듯이 세포 신경돌기가 성장하는 형상을 보이며, 분화를 확인할 수 있었다(도 14b 참조).

상기 결과는 매우 희박한 확률로 가능한 교차분화(transdifferentiation)가 본 발명의 카본 나노닷에 의해 매우 효율적으로 달성될 수 있음을 보여주는 매우 획기적인 결과이다.

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> SEOULIN BIO SCIENCE CO., LTD. <120> Composition for transfering substance into primary culture cells <130> PD13-0728 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA 9 sensing olig <400> 1 ttcgctgttc atacagctag ataaccaaag a 31 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> quencher olig <400> 2 tatgaacagc g 11 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP siRNA sense primer <400> 3 gcaucaaggu gaacuucaa 19 <210> 4 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP siRNA anti-sense primer <400> 4 uugaaguuca ccuugaug 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cy5.5 labeled DNA sense primer <400> 5 tattaggaca aggctggtgg gcac 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cy5.5 labeled DNA anti-sense primer <400> 6 gtgcccacca gccttgtcct aata 24 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-124a Sense primer <400> 7 uaaggcacgc ggugaaugcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-124a anti-sense primer <400> 8 ggcuttcucc gcgtgccttu 20 <210> 9 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-9 Sense primer <400> 9 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 10 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-9 antisense primer <400> 10 tcutucugct ugutuuccuu ugu 23 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-9* Sense primer <400> 11 auaaagcuag auaaccgaaa gu 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-9* antisense primer <400> 12 uctttcggtt utctugcttt ut 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA1 <400> 13 uggaauguaa agaaguaugu au 22

Claims

활성분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 유효성분으로 함유하는, 상기 활성분자의 초대배양 세포로의 전달용 조성물.
세포 내 표적분자와 결합하거나 반응하는 탐침분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 포함하는, 초대배양 세포 내의 상기 표적분자의 검출용 조성물.
세포 내 표적분자의 기능을 저해하는 저해제가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 유효성분으로 함유하는, 초대배양 세포 내에서의 상기 표적분자의 기능저해용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 카본 나노닷은 탄소계 물질의 소각시 발생하는 그을음(soot)으로부터 수득된, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 탄소계 물질은 양초, 타이어, 등유(kerosin), 경우(disel), 휘발유(gasoline), 목재, 나뭇잎, 글리세롤(glycerol), 가솔린(gasoline), 및 타이어로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 초대배양 세포는 미분화세포 또는 분화세포인, 조성물.
제6항에 있어서,
상기 미분화 세포는 줄기세포(stem cell) 또는 아세포(blast cell)인, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 줄기세포(stem cell)는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인, 조성물.
제7항에 있어서,
상기 아세포(blast cell)는 섬유아세포(fibroblast), 근아세포(myoblast), 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 각질세포, 내피세포(endothelial cell), 근아세포(myoblast), 신경아세포(neuroblast), 림프아구(lymphoblast), 멜라닌아세포(melanoblast), 혈관아세포(angioblast) 또는 골수아세포(myeloblast)인 조성물.
제6항에 있어서,
상기 분화세포는 각질세포(keratinocyte), 림프구(lymphocyte), 신경세포(neuron), 연골세포(chondrocyte), 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 근세포(myocyte), 선세포(gland cell), 골세포(osteocyte) 및 파골세포(osteoclast)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 활성분자는 작은 화합물, DNA, RNA, PNA, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 단백질, 효소, 항체 또는 그의 기능성 단편 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 카본 나노닷과 활성분자는 수소결합, 이온결합 또는 공유결합에 의해 결합되는, 조성물.
제12항에 있어서,
상기 공유결합은 에테르 결합(eter bond), 티오에테르 결합(thioeter bond), 에스테르 결합(ester bond) 또는 아마이드 결합(amide bond)인, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 표적분자는 단백질 또는 핵산분자인, 조성물.
제14항에 있어서,
상기 핵산분자는 miRNA인, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 탐침분자는 항체 또는 그의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 저해제는 항체 또는 기의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 앱타머인, 조성물.
활성분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 초대배양 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 초대배양 세포로의 상기 표적분자의 상기 활성분자를 전달하는 방법.
세포 내 표적분자와 결합하거나 반응하는 탐침분자가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 초대배양 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 초대배양 세포 내의 상기 표적분자를 검출하는 방법.
세포 내 표적분자의 기능을 저해하는 저해제가 결합된 카본 나노닷(carbon nanodot)을 초대배양 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 표적분자의 기능을 저해하는 방법.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 카본 나노닷은 탄소계 물질의 소각시 발생하는 그을음(soot)으로부터 수득된, 방법.
제21항에 있어서,
상기 탄소계 물질은 양초, 타이어, 등유(kerosin), 경우(disel), 휘발유(gasoline), 목재, 나뭇잎, 글리세롤(glycerol), 가솔린(gasoline), 및 타이어로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
초대배양 세포는 미분화세포 또는 분화세포인, 방법.
제23항에 있어서,
상기 미분화 세포는 줄기세포(stem cell) 또는 아세포(blast cell)인, 방법.
제24항에 있어서,
상기 줄기세포(stem cell)는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인, 방법.
제24항에 있어서,
상기 아세포(blast cell)는 섬유아세포(fibroblast), 근아세포(myoblast), 골아세포(osteoblast), 연골아세포(chondroblast), 각질세포, 내피세포(endothelial cell), 근아세포(myoblast), 신경아세포(neuroblast), 림프아구(lymphoblast), 멜라닌아세포(melanoblast), 혈관아세포(angioblast) 또는 골수아세포(myeloblast)일 수 있다. 상기 분화세포는 각질세포(keratinocyte), 림프구(lymphocyte), 신경세포(neuron), 연골세포(chondrocyte), 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 근세포(myocyte), 선세포(gland cell), 골세포(osteocyte) 및 파골세포(osteoclast)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 활성분자는 작은 화합물, DNA, RNA, PNA, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 단백질, 효소, 항체 또는 그의 기능성 단편 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
제18항에 있어서,
상기 카본 나노닷과 활성분자는 수소결합, 이온결합 또는 공유결합에 의해 결합되는, 방법.
제28항에 있어서,
상기 공유결합은 에테르 결합(eter bond), 티오에테르 결합(thioeter bond), 에스테르 결합(ester bond) 또는 아마이드 결합(amide bond)인, 방법.
제19항에 있어서,
상기 표적분자는 단백질 또는 핵산분자인, 방법.
제30항에 있어서,
상기 핵산분자는 miRNA인, 방법.
제19항에 있어서,
상기 탐침분자는 항체 또는 그의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 및 앱타머로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
제20항에 있어서,
상기 저해제는 항체 또는 기의 기능성 단편, 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 앱타머인, 방법.