KR20140103603A

KR20140103603A - Ｐｉｍｏｚｉｄｅ를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20140103603A
Application number: KR1020130017181A
Authority: KR
Inventors: 정용근; 김영두; 유안 쥬닝
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-02-18
Filing date: 2013-02-18
Publication date: 2014-08-27

Abstract

본 발명은 신경 퇴행성 질환 치료제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 타우 단백질의 인산화 또는 응집으로 인해 발생하는 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위하여 피모자이드(pimozide)를 유효성분으로 함유하는, 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

Description

Ｐｉｍｏｚｉｄｅ를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 조성물{Composition for the treatment of neurodegenerative diseases comprising pimozide}

본 발명은 신경질환 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 Pimozide를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

치매(dementia)는 기억력 장애, 판단력 상실 등 전신기능의 전반적인 장애를 동반하는 질환이다. 50세 이전에는 증상이 거의 나타나지 않지만 60세 이후로는 발생 빈도가 점진적으로 증가하는 노인성 질환으로서, 의학기술의 발전 및 삶의 질 향상으로 인한 노인 인구의 증가에 따라 우리나라뿐만 아니라 전세계적으로 발병 인구가 급속히 증가하고 있는 질환이다. 우리나라에서 2008년 65세 이상으로 등록된 치매 환자 수는 421,000명으로 노인 전체 인구의 8.4%를 차지하고 있으며, 2030년에는 1,135,000명으로 전체 노인인구의 9.6%를 넘어설 것으로 예측된 바 있다. 보건복지부, 2008 치매 유병률 조사 결과, 치매의 발병 형태는 매우 다양한데, 국내 발병하는 치매의 약 70% 정도는 알츠하이머형 치매(dementia of Alzheimer type)이며, 약 25% 정도는 혈관성 치매(dementia of Vascular type), 기타 알코올성 치매 및 파킨슨병 치매는 5% 이하로 집계되고 있다.

치매의 가장 주요한 발병 형태인 알츠하이머병(Alzheimer disease, AD)은 두 가지 특징적인 병변을 보이게 되는데 하나는 뇌의 피질과 해마 부위의 신경세포에서 타우(tau)단백질의 과인산화 및 응집에 의해 나타나는 세포 내의 신경섬유수초(Neurofibrillary tangle) 형성이고 다른 하나는 아밀로이드 β-1/42(amyloid β-1/42)의 응집에 의해 세포 외부에 형성되는 플라그(plague)이다.

알츠하이머병의 원인은 아직 확실하게 규명되어 있지 않으나, 응집에 관여되는 두 단백질의 응집된 형태인 tangle이나 plaque, 또는 전구체들이 뇌의 기억 및 인식을 담당하는 신경세포 부위에 침적되어 신경세포의 기능 저하 및 사멸을 일으켜 알츠하이머를 일으킨다는 것이다. 또는 응집된 tau 단백질의 경우 미세소관과의 안정화를 담당하는데, 응집으로 감소된 tau 단백질이 정상적인 기능을 수행하지 못함에 따라 미세소관의 결합력이 약해지고 기능 이상이 긴 시간에 걸쳐 작용하여 개별 신경 세포의 기능저하, 나아가서 사멸에 이르게 된다는 것이다.

한편, 현재까지 치매 환자에게 사용되는 약물로 미 식약청(FDA)의 승인을 받아 시판되는 약물은 4 종류가 있으나 치매의 진행을 늦출 수 있는 약물로 치료제는 아직 존재하지 않는다. 지금까지 개발되어 임상단계에 들어간 치매 치료제 후보신약으로는 아밀로이드 베타의 생성에 관여하는 단백질절단효소의 억제제, 타우 단백질의 인산화 억제제, 그리고 두 단백질의 자가응집 억제제등이 주로 개발되었다. 그러나 이러한 신약후보물질들은 해당 단백질 이외의 다른 단백질을 억제하거나, 억제된 효소들이 원래 수행하던 정상적인 기능을 하지 않으므로 나타나는 다양한 부작용으로 인해 최종 임상단계를 넘어서지 못하였다. 따라서 기존의 새로운 개념의 신약을 필요로 하고 있다. 새롭게 부각되는 개념으로 세포내의 항상성 유지를 위한 기능 중 하나인 자가포식(autophagy) 작용이 주목받고 있다.

Autophagy는 스스로(auto) ‘먹는다(phagy)’는 뜻의 단어로, 세포 내부의 물질이 세포 스스로에 의해 제거되기 때문에 붙여진 이름이다. 퇴행성 단백질이나 수명이 다하거나 변성되어 기능이 저하된 세포소기관(organelle)들이 세포 안에서 이중막으로 된 자가포식체(autophagosome)라고 불리는 소포(vesicle) 내에 격리되고, 이 소포는 다시 리소좀(lysosome)과 결합하여 리소좀 안에 있는 소화 효소에 의하여 분해된다.

자가소화작용(autophagy) 작용은 세포내 단백질의 질적 유지에 필수적인 작용으로, 많은 노화와 연관된 질병들, 특히 신경퇴행성 질환에서 저하되어 있다. 헌팅턴 모델 동물을 이용한 실험에서 autophagy을 증진시키는 약물인 라파마이신(rapamycin)을 투여한 실험군에서는 대조군에 비해 증상이 완화된다는 결과가 보고된 바 있다(Ravikumar B., et al., Nat. Genet., 2004 Jun;36(6):585-95). 하지만 라파마이신은 mTOR를 억제함으로써, 면역력을 저해시킨다는 단점을 가지고 있다. 따라서 mTOR를 억제하지 않아 면역력을 저해하지 않으면서, 동시에 자가소화작용(autophagy) 작용을 증진시켜 세포내 응집된 형태의 독성 단백질을 제거하는 방법을 통해 치매를 예방, 치료할 수 있는 가능성이 열려있다.

피모자이드(pimozide)는 정신분열증(Schizophrenia)의 치료제로 1963년 얀센사에 의해 개발된 약이다. 도파민 D2 수용체에 대한 억제제로 개발되었으며, 혈뇌장벽(Blood-brain barrier)를 통과할 수 있는 화합물로 autophagy 작용을 유도할 수 있음이 밝혀진 바 있다(Zhang L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007) 104(48):19023-18928). pimozide는 다른 autophagy를 일으키는 화합물들과 달리 mTOR를 억제하지 않으므로 면역력을 억제시키지 않을 것으로 예상된다. 따라서 빠르게 뇌로 들어가 autophagy를 일으키는 화합물을 이용한 치매치료 후보물질의 절실히 요구되는 개발의 필요성에 pimozide는 가장 적합한 신약재창출(drug repositioning)을 통한 후보물질로 기능할 수 있다.

종래 신경 퇴행성 질환 치료제에 있어서 타우 단백질을 표적으로 한 뇌질환 치료제는 많이 개발되지 않고 있으며, tau 매개의 퇴행성 신경질환이 유발되는 정확한 기작 또한 밝혀지지 않고 있다. 또한, 피모자이드(pimozide)는 자가소화작용(autophagy)을 통하여 헌팅턴 질환에 치료효과가 있음이 알려져 있으나, tau 단백질 응집억제 및 tau 매개의 퇴행성 뇌질환에 대한 치료효과는 입증된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, tau 매개의 퇴행성 신경질환에 대한 피모자이드의 치료 효과를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 피모자이드(pimozide)를 유효성분으로 함유하는, 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease), 측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration), 퇴행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 픽병(Pick's disease)일 수 있다.

상기 조성물은 추가적으로 세포 내에서 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 유도하는 자가소화작용(autophagy) 유도제를 포함할 수 있다. 상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 칼슘이온 채널 작용 억제제(antagonist), ATP-민감성 칼륨 채널 오프너(opener), 도파민 작용 억제제(antagonist), 칼페인(Calpain) 억제제, 또는 Gs alpha 억제제일 수 있으며, 예를 들어, 라파마이신(rapamycin), 페르헥실린(perhexiline), 니클로사미드(niclosamide), 아미오다론(amiodarone), 로틀레린(rottlerin), 트레할로스(trehalose), 칼페스타틴(calpastatin), SMERs(small molecule inhibitors and enhancers), 베라파밀(verapamil), 로페라마이드(loperamide), 니모디핀(nimodipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 플루스피릴렌(fluspirilene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 니굴디핀(niguldipine), 미녹시딜(minoxidil), 클로니딘(clonidine), 릴메니딘(rilmenidine), 및 2’5’-디데옥시아데노신(dideoxyadenosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

이때, 본 발명의 일 실시예 따른 조성물은 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 상기 피모자이드(pimozide)를 0.1 내지 50 중량% 로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 피모자이드(pimozide)와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다. 피모자이드(pimozide)와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 자가소화작용(autophagy) 유도제는 상술한 바와 같으며, 이 외에도 공지된 화합물 또는 관련된 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제 등을 이용할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 경구용 조성물은 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.

실제 사용에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 통상적인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 (정맥내 투여를 비롯한) 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.

아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물을 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 예방 및 치료 방법이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease), 측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration), 퇴행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 픽병(Pick's disease)일 수 있다.

상기 방법은 추가적으로 세포 내에서 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 유도하는 자가소화작용(autophagy) 유도제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 칼슘이온 채널 작용 억제제(antagonist), ATP-민감성 칼륨 채널 오프너(opener), 도파민 작용 억제제(antagonist), 칼페인(Calpain) 억제제, 또는 Gs alpha 억제제일 수 있으며, 예를 들어, 라파마이신(rapamycin), 페르헥실린(perhexiline), 니클로사미드(niclosamide), 아미오다론(amiodarone), 로틀레린(rottlerin), 트레할로스(trehalose), 칼페스타틴(calpastatin), SMERs(small molecule inhibitors and enhancers), 베라파밀(verapamil), 로페라마이드(loperamide), 니모디핀(nimodipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 플루스피릴렌(fluspirilene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 니굴디핀(niguldipine), 미녹시딜(minoxidil), 클로니딘(clonidine), 릴메니딘(rilmenidine), 및 2’5’-디데옥시아데노신(dideoxyadenosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 SH-SY5Y 세포주에서 pimozide에 의한 tau 단백질의 응집 저하를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스에 pimozide를 투여한 후, autophagy가 증가하는 것을 ATG5, LC3 2형 단백질의 발현 증가 및 P62 단백질의 발현 감소를 통하여 확인한 웨스턴 블랏 분석 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스에 pimozide를 투여한 후 인지 기억력이 회복된 것을 확인한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스에 pimozide를 투여한 후 공간 기억력이 회복된 것을 확인한 그래프이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 “피모자이드(pimozide)”는 정신분열증(Schizophrenia)의 치료제로 사용되었으나, 최근 자가소화작용(autophagy)을 유도할 수 있음이 밝혀진 바 있다(Zhang L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 27;104(48):19023-8, 2007). 그러나 피모자이드의 tau 단백질 응집 억제 효과 및 퇴행성 뇌질환에서 관찰되는 인지기억력 및 공간 기억력 회복 효과에 대해서는 알려진 바 없다.

본 문서에서 사용되는 “타우(tau) 단백질”은 N-말단 돌출 부분, 프롤린(proline) 응집 도메인, 미세소기관 결합 도메인 및 C-말단의 4부분으로 구성되어 있으며(Mandelkow et al., Acta. Neuropathol., 103, 26-35, 1996), 중추신경계의 신경세포 속에서 Tau가 비정상적으로 과인산화되거나 변형되는 경우 tauopathy와 같은 퇴행성 뇌질환을 유발한다고 알려져 있다. 알츠하이머 치매(Alzheimer’s disease), 픽병(Pick’s disease), 17번 염색체연관 파킨슨병 수반 전두측 두엽성 치매(FTDP-17) 등이 대표적인 Tauopathy에 속한다(Lee et al., Annu. Rev. Neurosci., 24, 1121-1159, 2001; Bergeron et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 56, 726-734, 1997; Bugiani et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 58, 667-677, 1999; Delacourte et al., Ann. Neurol., 43, 193-204, 1998; Ittner and Gotz, Nat. Rev. Neurosci., 12, 65-72, 2011).

본 문서에서 사용되는 “ATG5(Autophagy protein 5)”는 자가소화작용(autophagy) 시 그 양이 증가하는 단백질이며, E2 유비퀴틴 라이게이즈(ubiquitin ligase)로 자가포식소체(autophagosome)의 증식을 유도한다고 알려져 있다.

본 문서에서 사용되는 “LC3(Light Chain 3)”은 자가소화작용시 그 양이 증가하는 단백질이며, 자가소화작용에 중요한 역할을 하는 효모 단백질 Apg8/Aut7/Cvt5에 유사하다고 알려져 있으며(Lang, T, et al., EMBO J. 17, 3597-3607, 1998), LC3은 그 합성 후 즉시 이어지는 카르복시 말단의 첫번째로 절단을 통하여 세포질성 형태 LC3-I을 생성시키고, 자가소화작용 동안 LC3-I는 Apg7 및 Apg3이 관여하는 유비퀴틴 유사 시스템으로 인하여 LC3-II로 변환되어 LC3이 자가포식소체에 연결된다. 따라서 자가포식소체에서 LC3의 존재와 LC3의 더 낮은 이동 형태인 LC3-II로의 변환은 자가소화작용의 지표로서 사용된다.

본 문서에서 사용되는 “P62“는 자가포식 특이성 기질(substrate) 중 하나인 동시에, 다유비퀴틴화 단백질에 결합하여 이를 자가포식체로 유도하는 기능을 한다고 알려져 있다(Komatsu M, et al., Cell, 131:1149-63, 2007).

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 컨스트럭트의 제조

1-1: pGFP-tau 컨스트럭트의 제조

인간의 가장 긴 형태의 Tau(2N4R)(Genebank 등록번호:NM_005910)를 발현하는 포유류 발현 pCI 벡터는 Dr. Akihiko Takashima(RIKEN, Japan)로부터 제공받았다.

상기 제공받은 벡터를 이용하여 Tau cDNA를 수득한 후, 삽입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 테트라사이클린(tetracycline)-조절 프로모터와 GFP 융합 단백질과 같은 선별 마커(selection marker)를 포함하고 있는 pGFP(Clontech) 벡터로 Tau cDNA를 서브 클로닝 하였다(Krishnamurthy et al., J. Biol. Chem., 279, 7893-7900, 2004). 그 결과, pGFP-tau 컨스트럭트를 생성하였다.

1-2: pGSK3β 컨스트럭트의 제조

GSK3β cDNA는 GATEWAY® cloning system(life technology, USA)에서 구매한 cDNA를 포유류 발현 pcDNA3.1(+) vector(invitrogen, USA)에 cloning하여 pGSK3β 컨스트럭트를 제작하였다.

실시예 2: Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스의 제조

tau 단백질은 중추신경계에서만 특이적으로 발현하는 단백질로, 6개의 isoform을 가지고 있으며 가장 긴 form은 441개의 아미노산으로 이루어져 있다. Δtau 단백질은 441개 longest form을 기준으로 할 때 단백질의 C-말단 영역에서 421번 아미노산(아스파르트산, Asp421)과 422번 아미노산 사이 부분이 절단되어 1번~421번의 아미노산으로 이루어진 것 (DMVD421-S422)을 특징으로 한다. BAI1-AP4 프로모터는 마우스의 대뇌피질과 해마 지역에서 특이적으로 발현하는 프로모터이다. BAI1-AP4 프로모터와 tau 단백질의 C-말단 영역에서 tau단백질의 3번째 isoform (NCBI NM_016834.4)에서 말단부 20번째 아미노산(아스파르트산, Asp)이 절단되어 있는 형태가 이루어진 인간 Δtau 유전자를 연결시켜 형질전환용 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 도입하여 형질전환 알츠하이머형 치매 동물을 제조하였으며, 상기 형질전환 알츠하이머형 치매 동물의 대뇌피질, 해마, 소뇌, 줄무늬체 부위에서 인간 Δtau 단백질이 발현되고, 해마 부위에서 tau 단백질의 과인산화와 응집현상이 증가하며, 인지능력 감소시기가 종래의 tau 유전자 형질전환 치매 동물에 비해 빠르게 단축됨을 확인하고 치매 마우스모델을 확립했다(한국 등록특허 제1213325호 참조).

실험예 1: 신경세포에서 pimozide에 의한 tau 단백질의 응집현상 변화 확인

본 발명에 따른 pimozide에 의한 autophagy 작용의 증진 여부를 확인하기 위하여, 신경 세포주를 이용하여 tau 단백질 응집 검출실험을 수행하였다.

본 실험에 사용한 세포주로는 사람의 신경세포로부터 유래된 SH-SY5Y 세포주를 사용하였다. pGFP-tau 컨스트럭트를 세포내로 도입하여 발현시킨 후, pimozide, pGSK3β 컨스트럭트 또는 pimozide + pGSK3β 컨스트럭트를 처리한 실험군과 용매만을 처리한 대조군을 비교하여 tau 단백질의 응집 정도를 비교하였다.

공통적으로, 6 well plate에 4×10⁴개의 SH-SY5Y 세포를 분주한 후, 24시간 경과 후 각 실험군에 따른 컨스트럭트 및 pimozide를 처리하였다. 대조군인 GFP-tau는 웰(well)당 pGFP-tau 컨스트럭트를 50 μg을 처리하였으며, GFP-tau + pimozide 군은 웰(well)당 50 μg의 pGFP-tau 컨스트럭트를 도입시키고, 6시간 후 웰(well)당 pimozide의 최종농도가 100 nM이 되도록 처리하였다. 또한, GFP-Tau + GSK-3β군은 웰(well)당 50 μg pGFP-tau 컨스트럭트와 50 μg pGSK3β 컨스트럭트를 공형질도입시켰다. 또한, GFP-Tau + GSK-3β + pimozide 군은 웰(well)당 50 μg pGFP-tau 컨스트럭트와 50 μg pGSK3β 컨스트럭트를 공형질도입시킨 후, 6시간 후 웰(well)당 pimozide의 최종농도가 100 nM이 되도록 처리하였다. 그 후, 상기 모든 군은 24시간이 경과한 후, 형광현미경을 통해서 응집된 것으로 보이는 GFP 양성 세포 수를 통하여 응집된 tau 단백질의 양의 차이를 응집된 형태의 개수를 측정하였다. 이때, 세포의 응집률은 전체 GFP 발현 세포 수준에 대하여 응집된 GFP 세포수의 비율(%)로 나타냈다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, pGFP-tau 컨스트럭트를 도입시킨 SH-SY5Y 신경세포주에서 GFP-tau 단백질은 세포내에서 30% 이상 응집현상을 나타냈으며, 이 비율은 pimozide의 처리에 의하여 5% 가량 감소하였다. 이는 잘 알려진 tau 인산화키나아제 단백질인 GSK-3β를 과발현시켜 응집현상을 증가시킨 GFP-Tau + GSK-3β 군에 비하여 응집현상이 현저하게 저하시켰다.

실험예 2: Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스에서 pimozide에 의한 autophagy 증가 분석

상기 실험예 1을 통하여 시험관 내(in vitro)에서 pimozide가 tau 단백질의 응집을 저해할 수 있음을 입증하였다. 이에, 본 발명자는 상기 실시예 2에서 제조한 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스를 이용하여 pimozide의 tau 단백질 응집 저하 및 autophagy 효과를 확인하였다.

상기 실시예 2에서 제조한 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스(1개월령, n=9)에 복강 주사(intraperitoneal injection)를 통해 매일 20 mg/kg의 pimozide를 30일 동안 투여하였으며(TG-Pimo), 이에 대한 양성 대조군으로 autophagy를 증가시키는 약물인 라파마이신(rapapmycin)을 복강으로 투여하였으며(TG-Rapa), 대조군으로 PBS를 복강으로 투여하였다. 실험에 대한 전체 대조군은 1개월령의 동일한 정상 마우스에 30일 동안 PBS를 복강으로 투여하였다. 그 후, 각 실험군에 따른 마우스를 희생시킨 후, 뇌를 추출하고 인지능력에 중요한 해마 부분을 분리한 후, 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다.

인산화 실험에 사용한 1차 항체로는 항-P62 항체(Abnova, Taiwan), ATG5 항체(Novus, USA), LC3 항체(Novus, USA)를 각각 1:3000의 비율로 희석하여 사용하였다. 2차 항체는 HRP가 결합되어 있는 항-마우스와 래빗 항체(Jackson immunoresearch, USA)를 1:10000의 희석비율로 사용하였다. 1차 항체 및 2차 항체 모두 TBST 완충액에 녹여 사용하였다. 대조 항체로는 β-액틴(actin)(Santa Cruz, USA)을 1:10,000의 비율로 희석하여 사용하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, pimozide 알츠하이머형 치매 마우스에서 PBS 투여 군에 비하여, 라파마이신(rapamycin) 또는 pimozide 투여 군의 해마 조직에서 autophagy의 증가에 따라 증가하는 것으로 알려진 ATG5 단백질 및 LC3 단백질 2형이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 상기 LC3 단백질은 autophagy 시 1형에서 2형으로의 전환된다고 알려져 있다. 또한, autophagy의 증가 시, 그 발현이 감소하는 것으로 알려져 있는 P62 단백질 역시 pimozide 알츠하이머형 치매 마우스에서 PBS 투여 군에 비하여, pimozide 투여 군의 해마 조직에서 감소하였으며, 이러한 감소는 양성 대조군인 라파마이신(rapamycin) 투여 군과 거의 유사하였다.

상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 pimozide가 알츠하이머형 치매 마우스 모델에서 autophagy 향상을 유도하는 효과를 나타낸다는 것을 입증한 것이다.

실험예 3 : Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스에서 pimozide에 의한 인지능력 변화 분석

상기 실시예 2에서 제조한 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스를 이용하여 pimozide에 투여에 의하여 실제 인지능력 개선 효과가 나타나는지 확인하기 위하여, 인지 기억력 측정(noble object recognition test) 및 공간 기억력 측정(Y-maze test)과 같은 동물 행동 실험을 수행하였다.

3-1: 인지 기억력 측정(noble object recognition test)

인지기억(recognition memory)은 치매의 초기 증상이 경도 인지 장애(mild cognitive impairment)로, 치매와 가장 밀접한 관계를 가진 기억력이다. 기억력이 감소할수록 새로운 물체가 새로운 것이라고 인식하는 강도가 약해지며, 이에 따라 익숙한 물체와 새로운 물체에 대하여 비슷한 관심을 갖게 된다. 이러한 원리를 이용하여 마우스 케이지에 2가지 종류의 물체를 넣고, 그중 하나를 새로운 물체로 바꾸며 마우스의 인지 기억력의 변화를 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 2에서 제조한 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스를 이용하였으며, 상기 마우스에 PBS 용매 또는 pimozide를 20 mg/Kg으로 30일 동안 복강을 통해 투여하였다(n=15). 이에 대한 대조군은 상기 치매 마우스와 동일한 연령의 정상형 마우스에 PBS 용매 또는 pimozide를 동일한 조건으로 투여하였다(n=10). 그 후, 실험 1~3일차에는 마우스를 실험상자(가로 25㎝, 세로 20㎝, 높이 15㎝) 속에 7분씩 두어 상자와 기타 주변 환경에 적응시켰다. 실험 4일차부터는 상자 안에 새로운 두 가지 물체를 놓고 마우스가 물체를 인식하는 빈도를 측정하였다. 실험 5일차에는 두 번째 물체를 다른 물체로 바꾸었다. 마우스의 기억력이 정상이라면 어제와 다른 새로운 물체가 나타났기 때문에 새로 바뀐 물체를 좀 더 인식할 수 있다. 실험 6일차에 두 번째 물체를 한 번 더 바꾸었다.

인지 기억력은 6일째에서 새로운 물체에 관심을 나타내는 빈도수와 전체 물체에 대하여 관심을 가진 빈도수의 비율로 나타냈으며, 일반적으로 0.5와 0.8 사이의 값으로 나타난다. 0.5에 가까울수록 기억력이 많이 떨어져 있는 상태이며, 0.7 이상이면 정상수준의 기억력을 가지고 있다고 판단할 수 있다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, pimozide를 투여하지 않은 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스의 인지 기억력은 정상 마우스에 용매를 투여한 대조군(WT PBS)에 비하여 유의하게 감소하였으며(* p≤0.01), 이러한 치매 마우스의 인지 기억력 감소는 pimozide 투여에 의해서 회복됨으로써, pimoizde의 인지기능 회복 효과를 확인할 수 있었다.

3-2: 공간 기억력 측정(Y-maze test)

공간 기억(spatial memory)은 주위 환경 및 공간의 순서와 배치를 기억하는 능력으로, 해마에서 일어나는 장/단기 기억의 전환과 관련 있으며, 알츠하이머병과 많은 신경퇴행성 질환에서 질환의 진행에 따라 감소하는 기억이다.

상기 실시예 2에서 제조한 Δtau 유전자가 삽입된 형질전환 알츠하이머형 치매 마우스를 이용하였으며, 상기 마우스에 PBS 용매 또는 pimozide를 20 mg/Kg으로 30일 동안 복강을 통해 투여하였으며, 10일 및 30일이 경과한 시점의 마우스(1.3 및 2 개월 연령)를 이용하여 공간 기억력을 측정하였다. 이에 대한 대조군은 상기 치매 마우스와 동일한 연령의 정상형 마우스에 PBS 용매 (n=9)또는 pimozide(n=15)를 동일한 조건으로 투여하였다.

Y자형 미로의 한 통로의 끝에 마우스의 머리 부분이 향하도록 두고 7분 동안 자유롭게 통로를 돌아다니도록 하였다. 동물의 움직임을 기록하고, 동물의 뒷발까지 통로로 들어간 경우를 통과한 것(arm entry)으로 보았다. 동물의 움직임을 교차횟수(alternation)로 나타내는데, 교차횟수는 동물이 연속적으로 3개의 통로를 통과하였을 때(예를 들어, 각 팔을 A,B,C 라고 하면 ABC, ACB, BAC, BCA, CAB, CBA와 같이 움직였을 때)를 각각 한 번 교차한 것으로 하였으며, 매 움직임마다 이전 두 번의 통과한 것과 다를 때마다 값을 매겼다. 기억력은 실제 교차횟수와 최대 가능한 교차횟수(즉, 총 교차횟수에서 2를 뺀 값)의 백분비로 나타내며, 일반적으로 0.5와 0.8 사이의 값을 가진다. 0.5에 가까울수록 기억력이 많이 떨어져 있는 상태이며, 0.7 이상이면 정상수준의 기억력을 가지고 있다고 판단할 수 있다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, pimozide를 투여하지 않은 Δtau 유전자가 삽입된 알츠하이머형 치매 마우스는 실험이 진행되는 동안 정상 마우스에 용매를 투여한 대조군(WT PBS)에 비하여 공간 기억력이 현저하게 감소하였으며 (* p≤0.01) 그러나 pimozide를 투여한 Δtau 유전자가 삽입된 알츠하이머형 치매 마우스는 공간 기억력이 대조군과 유사한 수준으로 회복되었다.

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

피모자이드(pimozide)를 유효성분으로 함유하는, 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease), 측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration), 퇴행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 픽병(Pick's disease)인, 조성물.
제1항에 있어서,
추가적으로 세포 내에서 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 유도하는 자가소화작용(autophagy) 유도제를 포함하는, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 칼슘이온 채널 작용 억제제(antagonist), ATP-민감성 칼륨 채널 오프너(opener), 도파민 작용 억제제(antagonist), 칼페인(Calpain) 억제제, 또는 Gs alpha 억제제인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 라파마이신(rapamycin), 페르헥실린(perhexiline), 니클로사미드(niclosamide), 아미오다론(amiodarone), 로틀레린(rottlerin), 트레할로스(trehalose), 칼페스타틴(calpastatin), SMERs(small molecule inhibitors and enhancers), 베라파밀(verapamil), 로페라마이드(loperamide), 니모디핀(nimodipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 플루스피릴렌(fluspirilene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 니굴디핀(niguldipine), 미녹시딜(minoxidil), 클로니딘(clonidine), 릴메니딘(rilmenidine), 및 2’5’-디데옥시아데노신(dideoxyadenosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료 방법.
제6항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 병(Alzheimer’s disease), 측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration), 퇴행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 픽병(Pick's disease)인, 방법.
제6항에 있어서,
추가적으로 세포 내에서 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 유도하는 자가소화작용(autophagy) 유도제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 칼슘이온 채널 작용 억제제(antagonist), ATP-민감성 칼륨 채널 오프너(opener), 도파민 작용 억제제(antagonist), 칼페인(Calpain) 억제제, 또는 Gs alpha 억제제인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 라파마이신(rapamycin), 페르헥실린(perhexiline), 니클로사미드(niclosamide), 아미오다론(amiodarone), 로틀레린(rottlerin), 트레할로스(trehalose), 칼페스타틴(calpastatin), SMERs(small molecule inhibitors and enhancers), 베라파밀(verapamil), 로페라마이드(loperamide), 니모디핀(nimodipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 플루스피릴렌(fluspirilene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 니굴디핀(niguldipine), 미녹시딜(minoxidil), 클로니딘(clonidine), 릴메니딘(rilmenidine), 및 2’5’-디데옥시아데노신(dideoxyadenosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상인, 방법.