KR102590485B1 - 신규 타우 단백질-매개 퇴행성 신경질환 치료제 및 그의 스크리닝 방법 - Google Patents

신규 타우 단백질-매개 퇴행성 신경질환 치료제 및 그의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타우 과인산화 또는 응집에 의해 발생하는 퇴행성 신경질환 치료제 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, i) 인산화 FcγRIIb 또는 상기 FcγRIIb의 ITIM 및 SHIP2(SH2 domain-containing phosphatidylinositol 5'-phosphatase 2) 간의 상호작용 저해제 또는 ii) 상기 SHIP2의 저해제를 유효성분으로 함유하는 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제 및 그의 다양한 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

신규 타우 단백질-매개 퇴행성 신경질환 치료제 및 그의 스크리닝 방법{Novel therapeutic agent for treating neurodegenerative disease medated by tau protein and a method for screening the same}
본 발명은 약학적 조성물 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신규 타우 단백질-매개 퇴행성 신경질환 치료제 및 그의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 미래창조과학부의 지원을 받은 기초연구사업/중견연구자지원사업의 "치매 병 아밀로이드 신경독서 조절 system과 pathway 유전자 분자기전규명" 과제(과제번호: 0409-20150059)의 성과물이다.
알츠하이머병 또는 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease, 이하, 'AD'로 약칭함)는 기억 소실 및 신경퇴화의 진행이 특징인 질환이다. AD의 병리학적 특징은 아밀로이드 베타 펩타이드 및 비정상적으로 고인산화된 tau에 의해 형성된 신경내 신경섬유 다발(neurofibrillary tangle, 이하, 'NFT'로 약칭함)로 구성된 세포외액 노인성 플라그의 존재이다. 아밀로이드 베타 종류들은 β- 및 γ- 분비제에 의해 아밀로이드 전구 단백질(APP)로부터 생성되어 세포외액에 축적된다.
상기 Tau는 N-말단 돌출 부분, 프롤린(proline) 응집 도메인, 미세소기관 결합 도메인 및 C-말단의 4부분으로 구성되어 있으며(Mandelkow et al., Acta. Neuropathol., 103: 26-35, 1996), 중추신경계의 신경세포 속에서 Tau가 비정상적으로 과인산화되거나 변형되는 경우 tauopathy와 같은 퇴행성 뇌질환을 유발한다고 알려져 있다. 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 픽병(Picks disease), 17번 염색체연관 파킨슨병 수반 전두측 두엽성 치매(FTDP-17) 등이 대표적인 Tauopathy에 속한다.
본 발명자들은 대한민국 공개특허 제10-2013-0131546호에서 타우 단백질의 인산화 또는 응집으로 인해 발생하는 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위하여 ALK(anaplastic lymphoma kinase)의 활성 또는 발현 저해물질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 개시하였고, 대한민국 공개특허 제10-2014-0103603호에서는 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 조성물을 개시하였다.
또한, 본 발명자들은 최근에 Fc γ-수용체 IIb(FcγRIIb)가 신경세포에서 발현되고 AD 발병에서 Aβ 신경독성, 시냅스 기능장애 및 기억장애를 매개하는 Aβ1-42와 직접 상호작용함을 확인한 바 있다(Kam, T. I. et al., J. Clin. Invest., 123: 2791-2802, 2013).
그러나 FcγRIIb의 하위단계에서 어떠한 분자들이 작용하여 병리현상이 나타는 지 아직까지 규명된 바 없고, 따라서, 보다 효율적인 타우 단백질-매개 퇴행성 신경질환의 치료제의 개발이 더뎌지고 있는 실정이다.
이에, 본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, FcγRIIb와 상호작용함으로써 타우 단백질-매개 퇴행성 신경질환의 병리현상과 밀접한 상관관계를 갖는 생체분자를 규명함으로써 이를 이용한 알츠하이머병의 치료제의 개발 가능성을 제시하는 것을 발명의 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 인산화 FcγRIIb 및 SHIP2(SH2 domain-containing phosphatidylinositol 5'-phosphatase 2) 간의 상호작용 저해제 또는 상기 SHIP2의 저해제를 유효성분으로 함유하는 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 FcγRIIb 및 SHIP2 간의 상호작용 저해제 또는 상기 SHIP2의 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 인산화 FcγRIIb 또는 상기 인산화 FcγRIIb의 인산화된 Tyr273을 포함하는 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) 및 SHIP2가 포함된 조성물에 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 인산화 FcγRIIb 또는 상기 인산화 FcγRIIb의 인산화된 Tyr273을 포함하는 ITIM 및 SHIP2의 상호작용을 유의하게 저해한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, SHIP2 및 상기 SHIP2의 기질을 포함하는 조성물에 피검화합물을 처리하는 단계; 및
상기 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 SHIP2의 기질의 탈인산화를 억제한 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, FcγRIIb, SHIP2, 및 tau를 발현하는 세포를 준비하는 단계;
상기 세포에 베타 아밀로이드 올리고머 및 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
상기 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 tau의 과인산화 또는 응집을 유의하게 억제한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
도 1은 Fcgr2b 결실이 3xTg 마우스에서 기억 결핍 및 신경세포에서 Aβ-유도된 tau 인산화를 방지하는 결과들로써, 도 1a는 Fcgr2b KO 신경세포가 합성Aβ-유도된 tau 인산화에 저항하여 야생형(WT) 또는 Fcgr2b KO 배아(DIV 8)의 마우스 일차배양 피질 신경세포을 합성 Aβ1-42로 24 시간 배양한 세포추출물의 웨스턴블랏 사진이고, 도 1b는 인산화된 tau의 정량(평균 ± s.e.m.; *P<0.05, **P<0.005, 한 방향 ANOVA(n=4))그래프이고, 도 1c는 WT 및 Fcgr2b KO 신경세포에서 Aβ-유도 인산화 tau에 대한 면역세포화학 분석한 사진이고, 도 1d는 천연적으로 분비되는 Aβ에 의한 일차 신경세포에서 tau 인산화의 유도를 위해서 음성대조군으로 Compound E(CompE), 로딩대조로 Aβ1-42(200ng), Aβ항체를 사용하여 Aβ1-42의 단량체(mono), 이량체(Di) 및 삼량체(Tri)의 7PA2-CHO 세포에서 세포유래 Aβ의 면역침전방법과 웨스턴블랏분석한 사진이고, 도 1e는 Fcgr2b 결실이 세포유래 Aβ-유도된 tau 과인산화를 방지하는 24시간 동안 CHO 또는 7PA2 세포로 공동배양(좌)한 WT 또는 Fcgr2b KO 배아의 마우스 일차 해마 신경세포에서 tau 인산화(우)의 웨스턴블랏 사진이고, 도 1f는 24시간 동안 Compound E를 처리하거나 처리하지 않은 CHO 또는 7PA2 세포와 공동 배양한 일차 신경세포 세포 용해물의 웨스턴블랏 사진이고, 도 1g는 3xTg-AD/Fcgr2b KO 마우스에서 기억 장애회복의 Y-미로시험 결과이고, 도 1h는 신규 사물 인지 시험 결과이고, 도 1i는 수동 회피 시험의 결과이고, 도 1j는 3xTg-AD 및 3xTg-AD/Fcgr2b KO 마우스의 해마에서 Aβ 수준의 ELISA 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 1k는 3xTg-AD/Fcgr2b KO 마우스에서 감소된 tau 과산화를 고찰한 웨스턴블랏 사진이고, 도 1l은 인산화된 tau의 수준을 정량(평균 ± s.e.m.; *P<0.05, 한쪽 t-test (n=3))한 그래프이고, 도 1m은 지시한 항체를 사용하여 11 개월령 WT, Fcgr2b KO, hAPP 및 hAPP/Fcgr2b KO (hAPP/KO)마우스의 해마 용해물의 웨스턴블랏 사진이고, 도 1n은 상기 도 1m의 블랏에서 보여준 인산화된 tau의 수준을 정량(평균 ± s.e.m.; **P<0.005, ***P<0.0005, 한방향 ANOVA(n=3))한 그래프이다.
도 2는 Aβ-유도된 tau 인산화 및 기억 장애를 억제하는 Ab1-42-FcγRIIb 상호작용의 저해를 고찰한 결과들로, 도 2a는 정제한 hFcγRIIb-ED 단백질의 추가로 Aβ1-42-유도된 tau 인산화를 저해하는 마우스 일차배양 피질 신경세포 추출물의 웨스턴블랏 사진이고, 도 2b는 인산화된 tau(PHF1, CP13, 및 AT180)의 상대적인 수준을 tau 총량으로 정규분포(평균 ± s.e.m. (n=3))한 그래프이고, 도 2c는 hFcγRIIb-HA를 안정하게 발현하는 SH-SY5Y 세포를 한 시간 동안 1 μM의 Aβ1-42를 처리하거나 또는 처리하지 않은 2.4G2 항체로 Aβ 및 FcγRIIb 간의 상호작용을 저해하는 항-HA 항체를 사용한 면역침강(IP)분석 결과 사진이고, 도 2d는 항-Aβ(Nu-1) 항체를 사용한 IP 결과를 나타내는 사진이고, 도 2e는 PHF1, CP13, TG5, 및 β-actin 항체들을 사용한 웨스턴블랏 사진이고, 도 2f는 인산화된 tau의 수준을 정량(평균 ± s.e.m.; n=3, 한쪽 t-test)한 그래프이고, 도 2g는 항-FcγRIIb 항체의 공주입으로 Aβ1-42-유도 인지장애의 억제효과를 나타낸 Y-미로 시험 결과(**P<0.005, ***P<0.0005, 한쪽 t-test)를 나타낸 그래프이고, 도 2h는 신규 사물 인지 시험 결과(**P < 0.005, 한방향 ANOVA)를 나타낸 그래프이고, 도 2i는 수동 회피 시험 결과(*P<0.02, **P<0.005, 한쪽 t-test)를 나타낸 그래프이고, 도 2j는 Aβ 단독 또는 IgG 또는 2.4G2와 함께 I.c.v. 주입한 마우스의 Y-미로 시험결과를 나타낸 그래프이고, 도 2k는 항-FcγRIIb 항체로 i.c.v. Aβ1-42-유도된 tau 인산화 저해를 나타낸 웨스턴블랏 사진이다.
도 3은 AD 뇌에서 발견된 FcγRIIb Tyr293 인산화가 Aβ-유도된 tau 인산화를 매개하는 연구의 결과들로써, 도 3a는 Fcgr2b KO 신경세포에서 Aβ-유도된 GSK3β 활성저해를 PHF1, Tau5, p-GSK3b, GSK3b, p35/p25, FcγRIIb (2.4G2) 및 β-actin 항체를 사용하여 웨스턴블랏 분석한 사진이고, 도 3b는 상기 블랏에서 p-GSK3b, GSK3b 및 p25의 신호를 정량한 농도계 그래프이고, 도 3c는 SH-SY5Y 세포에서 SB-415286(SB) 노출로 FcγRIIb 매개 tau 과인산화의 저해작용을 나타낸 웨스턴블랏 사진이고, 도 3d는 roscovitine (Rosco)노출로 FcγRIIb 매개 tau 과인산화의 저해작용을 나타낸 웨스턴블랏 사진이고, 도 3e는 일차배양 피질 신경세포에서 SB-415286(SB) 노출로 FcγRIIb 매개 tau 과인산화의 저해작용을 나타낸 웨스턴블랏 사진이고, 도 3f는 일차배양 피질 신경세포에서 roscovitine(Rosco) 노출로 FcγRIIb 매개 tau 과인산화의 저해작용을 나타낸 웨스턴블랏 사진이고, 도 3g는 야생형 FCGR2B 넉다운 SH-SY5Y 세포(SH-SY5Y/shFCGR2B)의 인산-FcγRIIb 및 총 FcγRIIb 항체를 이용한 웨스턴블랏 사진(좌) 및 인산화된 FcγRIIb 수준을 정량한 농도계 그래프(우)이고, 도 3h는 일차배양 피질 신경세포에서 Ab1-42로 인산화된 FcγRIIb의 웨스턴블랏 사진이고, 도 3i는 hFcγRIIb-ED 단백질에 의해 Ab1-42-유도된 FcγRIIb의 저해를 SH-SY5Y 새포와 공동 배양한 웨스턴블랏 사진이고, 도 3j는 FcγRIIb Y273F-GFP(Y273F)는 아니지만, Tyr273에서 인산화된 FcγRIIb의 웨스턴블랏 사진이고, 도 3k는 Fcgr2b KO 신경세포(DIV 8)에서 FcγRIIb Tyr273의 인산화를 나타낸 웨스턴블랏 사진(좌) 및 블랏상 신호를 정량한 바그래프(우)이고, 도 3l은 정상, MCI(Braak III), 및 AD 환자들(Braak V/VI)의 해마 균질체의 웨스턴블랏 사진(좌) 및 인산화된 FcγRIIb 및 총 FcγRIIb 수준(우)을 정량한 그래프(우, 평균 ± s.e.m.; **P<0.01, 양쪽 t-test)이다.
도 4는 SHIP2가 Aβ에 반응하는 데에 인산화된 FcγRIIb와 결합을 고찰한 결과들로써, 도 4a는 FcγRIIb 단백질의 구조를 보여주는 개략도(좌) 및 형광 현미경으로 측정한 세포사멸을 나타낸 그래프(우, 평균 ± s.d.; n=3)이고,
[도식화한 부호 설명]
SS; 신호 서열,
EX; 세포외 도메인,
TM; 막전위 도메인,
Cyto; 세포질 도메인,
WT; FcγRIIb-GFP,
ΔITIM; FcγRIIb ITIM-삭제 형태(1-270; DITIM),
ΔCyto; FcγRIIb 세포질 도메인-삭제 형태(1-240) 및
Y273F; FcγRIIb 인산화-ITIM에서 결함 변이체(Y273F).
도 4b는 pEGFR(Mock)와 비교한 FcγRIIb Y273F 변이체의 Aβ신경독성에 의한 세포 사멸을 나타낸 바 그래프(평균 ± s.d.; n=3. # P<0.05, **, ## P<0.005, 한쪽 t-test)이고, 도 4c는 SH-SY5Y 세포에서 인산화 된 FcγRIIb 및 SHIP2간의 상호작용을 항-His를 사용한 면역침강 분석(IP)결과 사진이고, 도 4d는 항-GFP를 사용한 IP 분석결과 사진이고, 도 4e는 항-FcγRIIb 항체를 사용한 IP 분석결과 사진이고, 도 4f는 항-SHIP2 항체를 사용한 IP 분석결과 사진이고, 도 4g는 원형질막에서 FcγRIIb 및 SHIP2의 공동국소화를 유도하는 Aβ가 SH-SY5Y 세포에서 항-FcγRIIb 항체 및 항-SHIP2 항체의 IP 분석결과 사진이고, 도 4h는 세포질 분율에 마커로 사용한 α-튜불린 항체의 웨스턴블랏 사진(좌) 및 각 분율에서 SHIP2의 상대적인 발현양을 정량한 농도계 그래프(우, 평균 means ± s.d.; *P<0.05, 양쪽 t-test)이다.
도 5는 FcγRIIb-SHIP2 축이 tau 인산화에 대한 PtdIns(3,4)P2 대사를 철폐하는 연구 결과들로써, 도 5a는 일차배양 피질 신경세포에서 TAPP1-PH-결합 PtdIns(3,4)P2 수준을 증가시키는 Aβ 올리고머를 His 항체를 사용한 웨스턴블랏 사진(좌) 및 정제한 TAPP1-PH를 사용한 PLO 분석결과 사진이고, 도 5b는 Aβ-유도된 PtdIns(3,4)P2 조절장애에 FcγRIIb 및 SHIP2의 요구를 SH-SY5Y/pSuper, SH-SY5Y/shFCGR2B 및 SH-SY5Y/shSHIP2 넉다운 안정한 세포에서 PLO 분석결과 사진이고, 도 5c는 FcγRIIb를 통한 PtdIns(3,4)P2 수준을 증가시키는 Aβ 올리고머가 WT 및 Fcgr2b KO 배아의 일차배양 피질 신경세포에서 정제한 TAPP1-PH 및 GRP1-PH를 사용하여 PLO분석한 결과를 나타낸 사진이고, 도 5d는 블랏상 신호를 정량한 농도계 그래프(평균 ± s.d.; **P<0.005, ***P<0.0005, 한쪽 t-test)이고, 도 5e는 PtdIns 수준을 ELISA로 정량 분석한 그래프이고, 도 5f는 공초점 현미경으로 관찰한 GFP-PHTAPP1 형광사진(위) 및 원형질막상 GFP-PHTAPP1 형광세기를 나타낸 그래프(아래)이고, 도 5g는 SH-SY5Y/pSuper 및 SH-SY5Y/shFCGR2B 안정한 세포에서 GFP-PHTAPP1 형광사진이고, 도 5h는 담체의 유무에 따른 tau 과인산화를 유도하는 PtdIns(3,4)P2 가 세포내로 전달되는 농도를 나타내는 웨스턴블랏 사진이고, 도 5i는 포스포이오시타이드를 담체로 사용하여 tau 과인산화를 유도하는 PtdIns(3,4)P2 가 세포내로 전달되는 농도를 나타내는 웨스턴블랏 사진이다.
도 6은 렌티바이러스 또는 SHIP2의 약리학적 저해가 Aβ-매개 기억 장애 및 tau 인산화 방지 실험결과들로써, 도 6a는 SH-SY5Y 세포. SH-SY5Y/pSuper 및 SH-SY5Y/shSHIP2 안정한 세포에서 hGFP-tau 아데노바이러스의 웨스턴블랏 사진이고, 도 6b는 48시간 동안 Aβ1-42 처리하여 유도한 세포사멸을 나타낸 그래프이고, 도 6c는 36시간 동안 pFcγRIIb 주입하여 유도한 세포사멸을 나타낸 그래프이고, 도 6d는 pGFP-tau 단독 또는 pSHIP2로 형질전환한 SHIP2의 발현을 나타낸 사진이고, 도 6e는 SHIP2 WT 또는 D608A 촉매 불활성 변이체의 웨스턴블랏 사진이고, 도 6f는 SHIP2 넉다운으로 Aβ-유도된 tau 인산화의 억제가 일차배양 피질 신경세포에서 대조(LV-Con) 또는 Ship2 siRNA 함유 렌티바이러스(LV-siShip2)로 형질전환한 웨스턴블랏 사진이고, 도 6g는 SHIP2 넉다운에 의한 기억장애 및 tau 과산화의 방지 효과를 나타낸 기억실험 시간표(위) 및 Y-미로 시험결과 그래프이고, 도 6h는 신규 사물 인지 실험결과를 나타낸 그래프이고, 도 6i는 해마 용해물의 웨스턴블랏 사진이고, 도 6j는 AS1949490으로 배양한 일차배양 피질 신경세포의 웨스턴블랏 사진(위) 및 블랏상 신호를 정량한 그래프(아래)이고, 도 6k는 SHIP2 억제제가 Aβ-유도된 기억결핍을 방지하는 Y-미로 시험결과 그래프이고, 도 6l는 신규 사물 인지 실험결과를 나타낸 그래프이고, 도 6m는 수동회피시험결과를 나타낸 그래프이고, 도 6n는 SHIP2 억제제에 의한 Aβ-유도된 tau 인산화를 억제하는 해마추출물의 웨스턴블랏 사진이다.
도 7은 siRNA-수반하는 렌티바이러스로 SHIP2 발현의 넉다운 실험결과들로써 도 7a는 MOI2 또는 MOI5로 렌티바이러스(LV)-부재 또는 LV-siShip2 감염된 HT22 세포의 웨스턴블랏 사진이고, 도 7b는 렌티바이러스(LV)-부재 또는 LV-siShip2 감염된 일차배양 피질 신경세포의 웨스턴블랏 사진이다.
도 8은 SHIP2 억제제의 Aβ-유도된 신경독성을 방지하는 결과를 나타낸 그래프들로써, 도 8a는 Calcein-AM 분석으로 측정한 세포활성을 나타낸 그래프이고, 도 8b는 AS1949490-주입한 마우스의 Y-미로 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 "인산화 FcγRIIb"는 면역세포의 Fc 수용체에 아형들중 하나로 대식세포의 Fc 수용체를 통한 면역체계에서 대식세포의 바이러스 등 다양한 항원들의 세포 내흡수(탐식)가 인접 T세포에 항원 인식을 유도하는데 중요하게 관여하며, 인체 면역체계에 그 중요성을 갖고 있으며 탐식과정 자체가 아주 복잡한 과정을 거치므로 Fc수용체를 통한 신호전달연구에 많이 이용되고 있다.
상기 대식세포의 Fc 수용체를 통한 탐식과정은 kinase와 phosphatase의 활성을 포함하는 극히 복잡한 신호전달 과정을 거쳐 이루어지므로 어느 단일 모델을 제시하여 탐식 과정에 연관된 다양한 구조와 현상을 설명하기는 불가능하며, 그 복잡성은 일부는 Fc 수용체의 다양성, 그리고 탐식되는 물질의 다양성에 기인한다고 알려져있다. 따라서, 그동안의 많은 연구들이 Fc 수용체 자체의 연구에 집중되어 대식세포의 세포막에는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII 등의 subtypes들이 있으며, 이들 중 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIII들은 활성 수용체로 써 세포질 영역에 공통적으로 immunoreceptor tyrosine activation motif (ITAM)가 존재하여 ITAM 특정부위의 타이로신-인산화를 통해 Fc 수용체를 통한 탐식과정에 양성적으로 작용하고, FcγRIIb는 억제 수용체로써 immunoreceptor tyrosine inhibition motif (ITIM)를 갖고 있어 음성적으로 작용함이 밝혀졌다. 그러나 Fc 수용체를 통한 탐식과정에서 Fc 수용체의 이러한 특정 motif(ITAM 또는 ITIM)들이 어떠한 메커니즘을 통하여 Fc 수용체를 통한 신호전달에 양성 또는 음성으로 작용하는 지 아직 밝혀지지 않았다. 최근 연구에 의하면 SH2 domain을 갖고 있는 이노시톨-포스파테이즈(SH2-containing inositol-phosphatase, SHIP)가 세포질 영역에 ITIM을 갖고 있는 FcγRIIb 같은 억제 수용체에 결합되어 있음이 보고되었다. 따라서 SHIP가 Fc 수용체를 통한 탐식과정에서 억제 수용체인 FcγRIIb의 ITIM을 통한 음성적 작용에 중요한 매개체로 작용하리라 쉽게 예측할수 있다. 또한, SHIP에 변이가 일어난 마우스에서 폐장에 이상이 발생하며, 생존시간 단축 등 실제 변화를 일으켜 이 효소의 기능에 대한 관심이 높아지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "SHIP2(SH2 domain-containing phosphatidylinositol 5'-phosphatase 2)"는 인산 가수분해 SH2 도메인 포함 5 inositol 효소 (SHIP2) 타입을 의미하며, 주로 2 당뇨병과 암 개발에 연루된다. 상기 Ship2의 티로신 인 산화 인산 가수분해 효소 활동을 향상 시키기 위해 표시되고 IP4 기판으로 사용하여, 본 발명자들이 본 발명에서 표시 tyrosines 273, 986, 987, 그리고 1135 SHIP2 활동의 EGF 유발 자극에 대해서 중요하다. SHIP2 교란된 SH2 도메인(R47G 돌연변이)와 야생-타입 SHIP2 보다 높은 활동을 표시한다. C-말단 영역의 삭제는 마찬가지로 SHIP2 활성화 된다. 따라서, C-말단과 함께SHIP2, SH2 도메인에서 기저 활동을 유지하기 위해 억제 효과 및 신호 유도 티로신 phosphorylations SHIP2 활성화 효과 극복한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "타우 단백질"은 Tau 단백질은 안정시키는 microtubules의 기능을 능력을 발휘하는 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 신경 세포에서 풍부하 oligodendrocytes와 astrocytes에 있는 다량 적은 정도에 나타나. 적당하게 microtubules를 안정시키기 위하여 Tau 단백질이 불완전하게 실패가 될 때, 신경계의 병리는 Alzheimer의 질병과 같이 발전할 수 있다.
상기 Tau 단백질은 MAPT (microtubule 관련되는 단백질 tau)에게 불린 단 하나 유전자의 양자택일 접합을 통해 생성되는 단백질로 1975년에 프린스톤 대학에 Marc Kirschner 실험실에서 발견되었다. 또한, Tau 단백질은 microtubules를 안정시키고 뿐 아니라 융통성을 제공하는 축삭의 원심 부분에서 주로 활성화되는 단백질로써 tubulin에게 불린 공 모양 단백질과 함께 microtubules를 안정시키고 microtubules에 있는 tubulin의 집합을 원조하기 위하여 작동한다. 게다가, Tau 단백질은 isoforms와 인산화를 통해 microtubule 안정성의 통제를 달성하고, 상기 tau 단백질의 Hyperphosphorylation는 나선형과 똑바른 필라멘트가 엉키게 하는 원인이 될 수 있으며(neurofibrillary 엉킴으로 불려), 이 엉킴은 Alzheimer의 질병의 병리에 기여한다.
상기 Alzheimer의 질병에 의해 영향을 받을 두뇌가 검토될 때, tau의 모든 6개의 isoforms는 수시로 한 쌍이 된 나선형 필라멘트에서 hyperphosphorylated 있다. 또한, 다른 어떤 neurodegenerative 질병에서도 이상한 골재는 보고 되고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "베타 아밀로이드 올리고머"는 독성 아밀로이드 베타(Hypertoxic amyloid-β, Aβ) 올리고머의 형성은 특이적으로 절단되고 번역 후 변형을 통해 형성된 pEAβ로 불리는 소량의 변이형 Aβ에 의해서 촉발된다.
상기 Aβ의 pE 변형은 얽힘, 독성, 그리고 분해 저항성을 가속화시킨다는 사실이 확인된 바 있지만, 이러한 관측 결과에 대해 설명할 수 있는 메커니즘은 밝혀지지 않았고, pEAβ가 주형에 의해서 유발되는 Aβ1-42의 잘못 접힘을 촉발하며, 프리온과 유사한 메커니즘을 통해서 구조적으로 구분되는 독성 올리고머를 만든다. 또한, Tau 발현이 이러한 올리고머 생성에 필요하며, 이와 유사한 형태의 분자들이 알츠하이머 질환을 앓고 있는 환자의 뇌에서 발견되고 있다. 게다가, 아밀로이드 전구단백질인 아밀로이드 프리커서 단백질(Amyloid precursor protein, APP)은 다양한 세포의 세포막에 발현되는 단백질로 신경세포의 시냅스(synapse)에 주로 모여있다. 상기 단백질은 알파시크리테이즈와(α-secretase) 감마시크리테이즈(γ-secretase)라는 효소에 의해 정상적인 경로로 분해되면서 그 기능을 하게 되는데, 알츠하이머 환자인 경우 베타시크리테이즈(β-secretase)와 감마시크리테이즈 효소에 의해 분해되면서 베타아밀로이드라는 짧은 펩타이드를 생성하게 되며, 이들 모노머(monomer)가 서로 뭉쳐 올리고머(oligomer)를 형성하게 된다. 형성된 올리고머는 프로토피브릴(protofibril), 피브릴(fibrils)로 되는 단계를 거쳐 플라크(plaque) 형태를 이루게 된다. 이런 일련의 과정을 amyloidogenesis라고 하며, 이 과정에서 세포에 독성을 내게 된다. 또한, 베타아밀로이드의 플라크가 형성되고 나면 일정 시간이 지난 후 타우 단백질이 집적되면서 세포 내 탱글(tangle)을 이루게 되고, 이 또한 세포 독성을 갖게 되면서 알츠하이머병은 점점 더 중증으로 진행되게 된다. 그러므로, 플라크와 탱글이 함께 뇌 안에 존재하는 경우를 알츠하이머라고 진단할 수 있는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퇴행성 신경질환"은 신경계의 퇴행성질환, 또는 퇴행성신경질환으로 번역되는'neurodegenerative disease'는 현재까지 알려지지 않은 원인에 의해서 뇌와 피질의 특정 뇌세포 군이 서서히 그 기능을 잃고 뇌세포의 수가 감소하는 질환을 총칭한다.
상기 뇌와 피질의 신경세포들은 그 위치에 따라 매우 다양한 기능을 하고 있기 때문에, 어느 부위의 신경세포들이 먼저 손상되고 기능을 잃어가는 가에 따라, 또 이러한 기능장애가 어떤 형태로 진행되는 가에 따라 매우 다양한 임상 양상을 보이게 된다.
상기 퇴행성신경질환은 결국 신경세포의 기능 감소 또는 소실에 의해 우리 몸의 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능 등 우리가 느낄 수 있는 몸의 모든 기능뿐만 아니라 우리가 지각하지 못하는 상태로 스스로 조절되고 있는 자율신경 기능을 포함한 매우 다양한 기능의 이상을 나타내게 된다. 또한, 퇴행성신경질환은 현재까지 진단이 매우 어렵고, 치료, 예방은 불가능한 것으로 간주되어 왔다. 최근에 이러한 퇴행성신경질환에 관련된 이상 단백질과 이들의 특성과 기능에 대한 사실들이 밝혀지면서 이들 질환에 대한 새로운 접근 방법을 제시하고 있다.
상기 퇴행성신경질환 중에서 가장 중요하고 대표적인 질환으로는 알쯔하이머병 (Alzheimer's disease; AD), 파킨슨병 (Parkinson's disease; PD), 전두측두치매 (frontotemporal dementia; FTD), 루이치매(dementia with Lewy bodies; DLB), 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 피질기저퇴행증(corticobasal degeneration; CBD), 다 계 통 위 축 병(multiple system atrophy; MSA), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP), 헌팅톤병(Huntington's disease; HD) 등이 있다.
발명의 상세한 설명:
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 관점에 따르면, i) 인산화 FcγRIIb 또는 상기 FcγRIIb의 ITIM 및 SHIP2(SH2 domain-containing phosphatidylinositol 5'-phosphatase 2) 간의 상호작용 저해제 또는 ii) 상기 SHIP2의 저해제를 유효성분으로 함유하는 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제가 제공된다.
상기 치료제에 있어서, 상기 SHIP2의 저해제는 SHIP2에 특이적으로 결합하는 길항항체, 그의 기능성 단편, 항체 유사체, 앱타머 또는 작은 화합물 또는 SHIP2 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있다.
상기 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration), 퇴행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 픽병(Pick's disease)일 수 있다.
상기 치료제는 추가적으로 세포 내에서 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 유도하는 자가소화작용(autophagy) 유도제를 포함할 수 있다. 상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 칼슘이온 채널 작용 억제제(antagonist), ATP-민감성 칼륨 채널 오프너(opener), 도파민 작용 억제제(antagonist), 칼페인(Calpain) 억제제, 또는 Gsα 억제제일 수 있는데, 예컨대, 라파마이신(rapamycin), 페르헥실린(perhexiline), 니클로사미드(niclosamide), 아미오다론(amiodarone), 로틀레린(rottlerin), 트레할로스(trehalose), 칼페스타틴(calpastatin), SMERs(small molecule inhibitors and enhancers), 베라파밀(verapamil), 로페라마이드(loperamide), 니모디핀(nimodipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 플루스피릴렌(fluspirilene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 니굴디핀(niguldipine), 미녹시딜(minoxidil), 클로니딘(clonidine), 릴메니딘(rilmenidine), 및 2'5'-디데옥시아데노신(dideoxyadenosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 치료제는 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성성분을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.
실제 사용에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 통상적인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 (정맥내 투여를 비롯한) 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.
아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에따라 적절히 조절될 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 상기 치료제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration), 퇴행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 또는 픽병(Pick's disease)일 수 있다.
상기 방법은 추가적으로 세포 내에서 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 유도하는 자가소화작용(autophagy)유도제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 자가소화작용(autophagy) 유도제는 칼슘이온 채널 작용 억제제(antagonist), ATP-민감성 칼륨 채널 오프너(opener), 도파민 작용 억제제(antagonist), 칼페인(Calpain) 억제제, 또는 Gs alpha 억제제일 수 있으며, 예를 들어, 라파마이신(rapamycin), 페르헥실린(perhexiline), 니클로사미드(niclosamide), 아미오다론(amiodarone), 로틀레린(rottlerin), 트레할로스(trehalose), 칼페스타틴(calpastatin), SMERs(small molecule inhibitors and enhancers), 베라파밀(verapamil), 로페라마이드(loperamide), 니모디핀(nimodipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 플루스피릴렌(fluspirilene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 니굴디핀(niguldipine), 미녹시딜(minoxidil), 클로니딘(clonidine), 릴메니딘(rilmenidine), 및 2'5'-디데옥시아데노신(dideoxyadenosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 인산화 FcγRIIb 또는 상기 인산화 FcγRIIb의 인산화된 Tyr273을 포함하는 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) 및 SHIP2가 포함된 조성물에 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 인산화 FcγRIIb 또는 상기 인산화 FcγRIIb의 인산화된 Tyr273을 포함하는 ITIM 및 SHIP2의 상호작용을 유의하게 저해한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, SHIP2 및 상기 SHIP2의 기질을 포함하는 조성물에 피검화합물을 처리하는 단계; 및
상기 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 SHIP2의 기질의 탈인산화를 억제한 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 SHIP2의 기질은 PtdIns(3,4,5)P3일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, FcγRIIb, SHIP2, 및 tau를 발현하는 세포를 준비하는 단계;
상기 세포에 베타 아밀로이드 올리고머 및 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
상기 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 tau의 과인산화 또는 응집을 유의하게 억제한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 실시예들을 통해 보다 상세히 설명한다.
일반적 방법
실험동물
사용 시험동물로는 WT(C57BL/6), Fcgr2b KO C57BL/664, 3xTg-AD 및 hAPP(J20, The Jackson Laboratory) 마우스가 사용되었다. 동물과 관련된 모든 실험은 서울국립대학교 동물 케어 및 사용 위원회(SNU IACUC) 가이드라인에 의해 승인된 프로토콜에 따라서 수행되었다. 생화학 분석을 위해서 마우스는 마취하여 뇌는 급속히 부분영역(피질 및 해마)으로 미세절편화하여 -80℃에서 즉시 냉동하였다. 상기 뇌반구는 분해 완충액[20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 단백질 분해효소 저해제 칵테일]으로 균일화하고 4℃에서 14,000 g 로 20분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 상등액을 취하여 브래드포드 방법(GE 헬쓰케어)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
인간 뇌 샘플의 제조
AD(Braak V-VI)(평균 연령, 80.2 ± 10.6 세; 평균 사후 간격, 16.3 ± 6.7 h), MCI(Braak III)(평균 연령, 84.2 ± 2.9 세; 평균 사후 간격, 20.1 ± 8.0 h) 및 비-AD 환자들(평균 연령, 67.8 ± 16.5 세; 평균 사후 간격, 20.1 ± 5.8 h)로부터 해마 조직들은 하버드 뇌조직 자원센터(McLean 병원)가 친절하게 제공하였다. 상기 AD 환자들의 해마조직은 얼음으로 냉각한 트리스 완충식염수(TBS) 완충액[20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl 및 단백질 분해효소 저해제 칵테일]으로 균일화하였다. 상기 균질액은 4℃에서 14,000 g 로 20분 동안 원심분리함으로써 상층화 하였다. 상기 상층액은 SDS-PAGE에 주입하였다.
렌티바이러스의 뇌정위 뇌혈관내 주입
7 내지 8개월령 WT 및 3xTg-AD 마우스는 ketamine(100 mg/kg) 및 xylazine(10 mg/kg)의 혼합액으로 깊이 마취하였다. 마우스 Ship2에 대해서 shRNA(5'-GAA GGG AGG GCA CGT TAA TTT-3', 서열번호 1, Sigma)를 발현하는 렌티바이러스를 주입용으로 사영하였고 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP 비표적 바이러스는 대조군으로 사용되었다. 상기 렌티바이러스(1 x 109)는 뇌정위법으로 치상회(0.4 μl/min 유속으로 뇌반구당 2 μl)에 하기와 같은 조합으로 양측면으로 주입하였다. 전후방향 = 브레그마로부터 2.1 mm, 중외측 = ± 1.8 mm, 배복위= 2.0 mm. 주입후, 캐뉼라는 상기 바이러스의 완전한 흡수를 위해서 추가적으로 5분 더 유지하였다. 행동시험은 주입후 20 및 30일간 수행하였다. 웨스턴블랏 분석을 위해서, 뇌는 바이러스 주입 25일째에 제거하여 해마 영역을 미세절편화하여 상기 단백질 샘플들을 상술한 바대로 준비하였다. PBS 또는 Aβ1-42(시그마 알드리치)의 뇌혈관내 주입은 종래에 보고된 바대로 수행하였다(Kam, T. I. et al. J. Clin . Invest. 123: 2791-2802, 2013). 공주입 실험의 경우에 올리고머성 Aβ1-42는 단독으로 또는 사용전에 AS1949490, IgG 또는 2.4G2 항체와 함께 처리되었다.
행동시험
이중 형질전환 또는 주입 마우스에 대한 행동시험은 종래에 보고된 바대로 수행하였다(Kam, T. I. et al. J. Clin . Invest. 123: 2791-2802, 2013). 모든 장치와 사물들은 70% 에탄올로 각 시험 전후로 세척하였다. Y-미로 시험에서, 마우스는 장치의 한 팔(32.5 cm 길이 x 15 cm 높이)의 말단에 두고 7분 동안 자유롭게 움직이도록 허용하였다. 네 개의 발바닥 모두가 상기 팔로 들어갔을 때 상기 출입을계수하였다. 자발적인 양자택일의 백분율은 총 양자택일 수에 대한 성공적인 양자택일 수의 비율로 계산하였다. 신규 사물 인지시험에서, 마우스는 24시간 간격으로 7분간 챔버(22 cm 폭 x 27 cm 길이 x 30 cm 높이)에 기거하게 하였다. 훈련 시도 #1(거주 2일 후)에서, 상기 마우스는 두 개의 사물에 노출하여 7분동안 자유롭게 탐험하도록 허용하였다. 시험 시도 #2(시험 1일 후)에서, 새로운 사물을 친숙한 사물 중 하나로 대체하고 인지횟수를 7분간 계수하였다. 상기와 같은 시험이 24시간 이후에 반복되었으나 또 다른 새로운 사물을 이용하여 시험하였다(시도 #3). 상기 사물 인지는 코로 사물의 냄새를 맡거나 또는 접촉함으로써 1 cm 또는 더 가까운 거리에 있는 사물로 향한 방향 설정에 소모하는 시간으로 정의된다. 상기 수동 회피 시험은 길로틴 문으로 분리된 명암구역(각 20 x 20 x 20 cm)으로 구성되는 장치에서 행해졌다. 상기 마우스는 거주하는 동안 문을 열어두고 5분 동안 상자를 탐험하도록 허용한 다음에, 홈 케이지로 돌아오게 하였다. 24 시간 경과 후에. 마우스는 조절을 위하여 명실로 위치하게 하였다. 암실로 들어간 후에 문을 닫고 난 다음 전기 발 쇼크(0.25 mA, 2 초)를 바닥 격자로 전달하였다. 마우스가 암실로 들어가는 잠재적인 시간은 24시간 후에 5분 커톱으로 측정하였다.
합성 및 천연적으로 분비되는 Aβ 올리고머
합성 Aβ1-42 올리고머들은 동결건조한 모노머(r-펩타이드)로부터 제조하였다. 하이드록시플루오로이소프로판올(HFIP)-처리 Aβ1-42 펩타이드는 디메칠술폭사이드(DMSO)에 용해한 다음에 인산-완충 식염수(PBS)로 희석하였다. 상기 저장 용액은 4℃에서 24 시간동안 배양하여 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 사용전에 상기 용액은 12,000 g에서 10 분간 원심분리하고, 상등액을 올리고머 Aβ로 사용하였다. 상기 Aβ1-42의 올리고머 상태는 웨스턴블랏 분석 및 원자력 현미경으로 평가하였다. 7PA2-CHO 세포(하버드 의과대학의 Dr. D.J. Selkoe에 의해 친절하게 제공됨)의 조건 배지는 채취하여 분비된 Aβ 올리고머로 사용하였다.
Aβ 정량을 위한 ELISA 분석
3xTg-AD 및 3xTg-AD/Fcgr2b KO 마우스에서 Aβ 수준은 상기 제조자의 지시를 수반하는 샌드위치 효소-연계 면역흡수분석(ELISA) 키트(Invitrogen)를 이용하여 분석하였다. 간략하게, 마우스는 마취하여 뇌를 미세절편화시켰다. 해마는 조심스럽게 분리하여 얼음으로 냉각한 구아니딘 완충액(5 M guanidine-HCl/50 mM Tris-Cl, pH 8.0)의 부피 10에 균질화시키고 난 다음 상온에서 3시간동안 혼합하였다. 상기 뇌균질체는 냉각반응 완충액(단백질 분해효소 저해제 칵테일이 보충된 PBS 내에 5% BSA, 0.03% Tween-20, 및 5 mM EDTA 포함)으로 1:10으로 더 희석하고 난 다음 16,000 g로 20분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상기 희석액은 상기 분석 키트에서 표준 희석 완충액과 1:1로 혼합하였다.
세포배양, DNA 형질감염 및 처리
일차배양 피질 및 해마 신경세포는 17 배아일(E17)인 마우스로부터 배양하였다. 상기 신경세포는 poly-L-lysine(0.01%의 100 mM 붕산 완충액, pH 8.5)-코팅한 유리 커버슬립 위에 두고 2% B-27 보충액(Invitrogen) 및 0.5 mM L-glutamine(Invitrogen)을 포함하는 신경기초 배지에 유지하였다. 배지의 반은 3일마다 교환하였다. SH-SY5Y, HT22, HEK293T 및 CHO 세포는 10% 우태아혈청(FBS, HyClone), 페니실린 및 스트렙토마이신(Introgen)으로 보충한 DMEM(HyClone)에서 배양하였다. 세포는 5% CO2의 대기하 37℃에서 성장하였다. 일차배양 피질 신경세포는 Lipofectamine 2000 시약(인트로젠)을 사용하여 형질감염시킨 반면, 다른 세포는 제조자의 지시에 따른 Polyfect 시약(Qiagen)을 사용하여 형질감염시켰다. 만약 필요하다면, 세포를 제조사의 지시대로 SB-415286, roscovitine(Sigma-Aldrich) 또는 AS1949490(Tocris)으로 처리하였다.
DNA 컨스트럭트의 제조
인간 FCGR2B cDNA는 합성 프라이머(FCGR2B-5'-NheI, 5'-GGG CTA GCA TGG GAA TCC TGT CAT TC-3', 서열번호 2; FCGR2B-3'-KpnI, 5'-GGG GTA CCC CAA TAC GGT TCT GGT CAT C-3', 서열번호 3)을 사용하여 인간 뇌 cDNA 라이브러리로부터 PCR로 증폭하였고 pEGFP-N1 벡터로 서브클로닝하였다. FCGR2B 결실 변이체의 cDNAs, ΔCyto (FCGR2B ΔCyto-5'-NheI, 5'-GGG CTA GCA TGG GAA TCC TGT CAT TC-3', 서열번호 4; FCGR2B ΔCyto-3'-KpnI, 5'-GGG GTA CCC CAG CAA TGG CCG-3', 서열번호 5), ΔITIM(FCGR2B ΔITIM-5'-NheI, 5'-GGG CTA GCA TGG GAA TCC TGT CAT TC-3', 서열번호 6; FCGR2B ΔITIM-3'-KpnI, 5'-GGG GTA CCC CTG TGT TCT CAG CCC CAA C-3', 서열번호 7) and ΔC-term (FCGR2B ΔC-term-5'-NheI, 5'-GGG CTA GCA TGG GAA TCC TGT CAT TC-3', 서열번호 8; FCGR2B ΔC-term-3'-KpnI, 5'-GGG GTA CCC CGA GAA GTG AAT AGG TGA TTG-3', 서열번호 9)는 PCR을 이용하여 생산하고 pEGFP-N1 벡터로 서브클로닝하였다. FCGR2B 점돌이변이체(Y273F)는 합성 프라이머(FCGR2B Y273F-5', 5'-CAA TCA CCT TTT CAC TTC TC-3', 서열번호 10; FCGR2B Y273F-3', 5'-GCT TGA GAA GTG AAA AGG TG-3', 서열번호 11)를 사용하여 부위-지향성 변이발생에 의해 생산하였다. 모든 변이체들은 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 인간 FCGR2B shRNAs(#1, 5'-293GCTACAGGTTCAAGGCCAA311-3', 서열번호 12; #2, 5'-587GCACAGGAAACATAGGCTA605-3', 서열번호 13) 및 인간 SHIP2 shRNAs(#1, 5'-702GGTGTTTGACCAGCAGAGC720-3', 서열번호 14; #2, 5'-2930CCAAGAACAGCTTCAATAA2948-3', 서열번호 15)는 합성되어, 결찰시키고 pSUPER-neo 벡터로 클로닝하였다. 인간 tau(0N4R) cDNA는 pcDNA3-HA 및 pEGFP-C1 벡터로 종래에 보고된 바와 같이 서브클로닝하였다(Park, H. J. et al. Hum. Mol . Genet., 21: 2725-2737, 2013). His-태그된 마우스 Ship2 cDNA는 M.G. Tomlinson(University of Birmingham, UK)박사로부터 공여받았다. GFP-태그된 마우스 Ship2 및 D608A 변이체는 P. De Camilli(Yale University)박사가 친절하게 제공하였다.
stable cell line의 확보
SH-SY5Y 세포는 pcDNA3-HA, pFCGR2B-HA, pSuper-neo, pFCGR2B shRNAs 또는 pSHIP2 shRNAs로 36 시간 동안 형질감염시킨 다음, 1 mg/ml G418(Invitrogen)을 포함하는 조건 배지에서 적어도 2주 동안 배양하였다. 안정된 세포 군락을 형성하기 위하여 단일 세포를 부가적으로 배양하고 각 세포 라인의 발현은 웨스턴블랏으로 분석하였다.
웨스턴블랏 분석 및 항체
세포는 용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.4, 30 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1mMNaF, aprotinin, leupeptin 및 pepstatin A 각각 1 mg/ml)으로 용해시켰다. 상기 용해물은 14,000 g로 10분 동안 4℃에서 원심분리 하였고 상등액은 SDS-PAGE로 분리하여 PVDF막으로 블랏하였다. 상기 블랏은 상온에서 1 시간 동안 차단한 후 하기의 항체들과 반응시켰다: 항-phospho-FcγRIIb, 항-FcγRIIb(Epitomics), 항-Aβ(4G8, Signet), 항-phospho-tau(AT180 및 AT100, Innogenetics), 항-NSE(Zymed), 항-phospho-GSK3β, 항-p35/25(Cell signaling), 항-GSK3β(BD Biosciences), 항-SHIP2, 항-mFcγRIIb, 항-GFP, 항-His(Santa Cruz Biotechnology Inc.), 항-a-tubulin 및 항-b-actin (Sigma-Aldrich), Nu-1 (W.L. Klein 박사, Northwestern University 제공), PHF1, CP13 and TG5(P. Davies 박사, Albert Einstein College of Medicine 제공), 및 12E8 (P. Seubert 박사, Elan Pharmaceuticals 제공). 그런 다음, 막은 TBS-T(10-mM Tris-Cl, pH 7.5, 150-mM NaCl, 0.1% Tween-20)로 3회 세척하고 퍼옥시다제-결합 이차 항체들로 1 시간 동안 반응시켜 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시스템을 사용하여 시각화하였다.
면역세포화학 분석
마우스 일차 피질 또는 해마 신경세포들은 4% 파라포름알데하이드(Sigma)에서 10분 동안 고정하고, PBS로 세 번 세척한 다음 0.1 % Triton X-100이 포함된 PBS를 이용하여 투과화하였다. 5% BSA이 포함된 PBS로 차단한 후 신경세포들은 4℃에서 하기의 항체들과 밤새 반응시켰다: AT180(1:200), AT8(1:200), 항-NSE(1:200), 항-FcγRIIb(1:500) 및 항-SHIP2(1:250). 이어 PBS로 세 번 세척한 후에, 신경세포들은 FITC- 또는 TRITC-결합된 이차 항체들(Jackson Lab, Inc.)로 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 커버슬립은 탑재 용액(Sigma)로 정치하고 공촛점 레이저 스캔 현미경(Karl Zeiss, Inc.)으로 관찰하였다.
면역침강 분석
내인성 면역침강(IP) 분석을 위해서, Aβ1-42-처리한 SH-SY5Y 세포 추출물을 IP 완충액[50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 단백질 분해효소 저해제들의 혼합물] 내의 항-FcγRIIb 또는 항-SHIP2 항체들과 12 시간 동안 4℃에서 반응시킨 다음, 단백질 G-세파로스 비드(GE Healthcare)로 당겨 내렸다. 공면역침강(IP)분석을 위해서, GFP-태그된 FcγRIIb 또는 FcγRIIb Y273F 변이체 중 어느 하나와 함께 His-태그된 SHIP2를 일시적으로 과발현하는 HEK293T 세포를 용해시킨 후 항-GFP 또는 항-His 항체들과 12 시간 동안 4℃에서 반응시킨 다음, G-세파로스 비드(GE Healthcare)로 당겨 내렸다. 잠시 원심분리를 한 후, 비드는 IP 완충액으로 세 번 세척하고 웨스턴블랏 분석을 하였다.
아세포 분획
Aβ1-42-처리한 SH-SY5Y 세포를 완충액(20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM EDTA)으로 수확한 다음 26-게이지 바늘에 20회 통과시킴으로써 기계적으로 파쇄하였다. 세포용해물은 핵 또는 파괴되지 않은 세포들을 제거하기 위하여 1,000 g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상등액을 새 시험관으로 옮긴 후 다시 100,000 g로 1시간 동안 4℃에서 베크만 SW41 로터로 원심분리 하였다. 펠렛을 용해 완충액에 재현탁하여 조막분획(crude membrane fractio)으로 사용하는 반면, 상등액은 세포질분획(cytosolic fraction)으로 사용하였다. 상기 분리된 분획은 상기 막 및 세포질 마커로 각각 항-FcγRIIb 및 항-α-tubulin 항체를 사용하여 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다.
지질 추출
일차배양 피질 신경세포 또는 SH-SY5Y 세포로부터 지질 추출은 종래에 보고된 바와 같이 수행하였다(Gray, A., et al., 313: 234-245, 2003). 자극 후, 세포를 얼음으로 냉각시킨 0.5M 삼염화초산(TCA) 용액으로 수확하여 5분 동안 얼음 위에서 정치하고 200 g로 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛은 1 mM EDTA의 5% TCA 용액으로 세척하였다. 중성 지질은 메탄올과 클로르포름의 2:1 용액으로 펠렛으로부터 추출하여 상온에서 10분 동안 강력하게 교반하였다. 추출물을 200 g로 5분동안 원심분리하고 난 다음 산성 지질을 추출하였다. 메탄올, 클로르포름, 및 12 M HCl의 80:40:1용액을 펠렛에 추가하여 상온에서 15분간 교반하고 난 다음, 200 g로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액의 750 μl을 새 시험관으로 이행하고 250 μl의 클로르포름 및 450 μl의 0.1 M HCl을 추가하였다. 혼합 후, 샘플들은 유기 및 수용액상으로 분리하기 위하여 원심분리하였고 저급 유기용매상은 채취하여 진공건조하였다. 그런 다음 지질을 수조에서 적절한 완충액(PLO 분석을 위해서 클로르포름, 메탄올 및 물의 1:2:0.8 용액 또는 ELISA를 위한 PBS-T 완충액)에서 초음파로 재분산시켰다.
단백질 지질 중첩 분석 및 ELISA
재조합 단백질의 정제를 위해서, TAPP1 및 GRP1의 PH 도메인을 pET-28a 벡터로 삽입하였다. E.coli BL21 세포를 상기 플라스미드로 형질전환하여 1 mM IPTG로 유도하기 전에 OD600 = 0.6에 도달하도록 배양하였다. 세포들은 16℃에서 18 시간 동안 배양한 후, 수확하여 초음파로 용해시켰다. His-융합된 TAPP1-PH 및 GRP1-PH는 Ni-NTA 킬레이팅 아가로스 CL-6B(Peptron)을 사용하여 세포용해물로부터 정제하였다. PLO 분석은 종래 보고된 바에서 경미한 수정을 하여 수행하였다(Dowler, S. et al., Sci. STKE. 129: l6, 2002). 동결건조된 PtdIns(3,4)P2, PtdIns(4,5)P2 및 PtdIns(3,4,5)P3 diC16(Echelon)는 클로르포름, 메탄올 및 물의 1:2:0.8 용액에서 재조성하여 양성 대조군으로 사용하였다. 상기 세포로부터 유래한 지질 추출물을 순차적으로 희석한 후, 메탄올로 미리 적셔둔 PVDF 상에 점적한 후 TBS-T 완충액으로 세척하고 공기 건조하였다. 상기 막은 완전히 건조한 후 3% BSA가 포함된 TBS-T 완충액으로 1시간 동안 차단하였다. 상기 블랏은 정제된 10 mM His-TAPP1-PH 또는 His-GRP1-PH를 포함하는 신선한 차단 완충액에서 밤새 4℃의 조건으로 부드럽게 흔들면서 반응시켰다. 상기 막은 50분에 걸쳐 TBS-T 완충액에서 5회 세척하고 항-His 항체로 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 막은 퍼옥시다제-결합이차 항체들로 1 시간 동안 반응시켰고 결합된 단백질은 ECL 검출 시스템을 이용하여 시각화하였다. PtdIns(3,4)P2, PtdIns(4,5)P2 또는 PtdIns(3,4,5)P3의 농도는 제조자의 지시에 따른 ELISA 키트(Echelon)로 정량하였다.
포스포이노시타이드의 세포내 전달
합성 포스포이노시타이드 diC16은 히스톤 담체(에클론)와 0.5-3:1 몰 비율로 15분 동안 강하게 교반하면서 반응시켰다. 상기 히스톤-포스포이노시타이드 복합체는 신경기초 배지로 1:10으로 희석하여 일차배양 피질 신경세포에 첨가하였다. 담체 없는 포스포이노시타이드 및 포스포이노시타이드 없는 담체만을 음성 대조군으로 사용하였다.
통계 분석
통계분석은 GraphPad Prism 소프트웨어로 수행하였다. 두 수단 사이의 차이는 한쪽 또는 양쪽 t-test로 수행하였다. 다중 수단사이의 차이는 한 방향 ANOVA로 평가하였고, 이어서 Tukey's post-hoc 시험을 수행하였다. 에러 바는 지시한 것처럼 s.d. 또는 s.e.m.을 나타낸다.
실시예 1: FcγRcIIb와 tau 인산화와의 상관관계 규명
본 발명자들의 종래 연구결과 Aβ1-42에 대한 신경 수용체로 그리고 유전성 돌연변이 APP만을 발현하는 hAPP-J20 마우스에서 뇌독성 및 메모리 결함의 매개체로 FcγRIIb가 확인되었고(Kam, T. I. et al. J. Clin. Invest. 123: 2791-2802, 2013), AD 마우스에서 Aβ 외에도 tau 역시 기억 손상에 필수적임이 규명된 바 있기 때문에(Ramsden, M. et al., J. Neurosci. 25: 10637-10647, 2005), 본 발명자들은 우선 FcγRIIb가 배양된 신경세포 내에서 Aβ1-42에 대한 반응에서 tau 과인산화에 책임이 있는지를 주목하였다. 이에 일차배양 피질 신경세포들을 합성 Aβ1-42 올리고머와 함께 배양할 경우, Aβ1-42 올리고머가 Ser396/Ser404(PHF1), Thr231/Ser235 (AT180)를 포함하는 몇몇 병리학적 에피토프에서 tau 인산화를 증가시킴을 확인하였으나, 상기 인산화는 Fcgr2b 넉아웃(KO) 동물의 신경세포에서는 나타나지 않았다(도 1a 및 1b 참조). 면역세포화학적 분석을 통해 역시 인산화된 tau에 대한 면역반응성이 신경세포-특이성 에놀라제(NSE)-양성 피질신경세포들에서 Aβ1-42 로 처리시 증가하지만 Fcgr2b 넉아웃(KO) 동물의 신경세포에서는 증가하지 않음을 확인하였다(도 1c 참조).
본 발명자들은 더 나아가 고용량의 합성 Aβ1-42를 사용하는 대신에 세포 유래의 천연적으로 분비되는 저용량의 Aβ 올리고머를 활용하였다. 7PA2 세포의 조건 매체에서 분비된 가용성 Aβ 올리고머의 존재는 웨스턴블랏 분석으로 확인하였고, 이들의 생산은 γ-secretase 저해제인 compound E를 처리함으로써 감소하였다(도 1d 참조).
이에, 본 발명자들은 우선 tau 인산화가 7PA2 세포들로 공동 배양된 일차성 해마신경에서 증가하였으나(도 1e 참조), 화합물 E-처리한 세포들로 공동 배양한 신경들에서는 증가하지 않았는 점을 발견하였다(도 1f 참조). 더구나, 본 발명자들은 7PA2 세포들로 공동 배양된 Fcgr2b 넉아웃(KO) 마우스의 신경에서는 tau의 과인산화가 없었다는 것을 발견하였다(도 1e 참조).
상기 결과들은 배양된 신경세포들에서 tau 과인산화는 FcγRIIb를 통하여 Aβ 올리고머의 생리적으로 관련된 수준으로 유도되었다는 것을 시사한다.
3xTg-AD 마우스에서는 기억장애를 포함하는 연령 의존적인 진행성 Aβ 및 tau 병리현상이 발생된다. 따라서, tau 병리현상에서 FcγRIIb의 역할을 밝히기 위하여 본 발명자들은 이중 형질전환 마우스(3xTg-AD/Fcgr2b KO)를 만들기 위하여 3xTg-AD 마우스를 Fcgr2b 넉아웃(KO) 마우스와 교배하였다. 그런 다음 상기 이중 형질전환 마우스의 각 그룹을 대상으로 Y-미로 시험에서 공간 작업 기억을 시험하였다. 팔 진입 총횟수는 그룹간에 유의하게 다르지 않았지만 Fcgr2b 결핍은 3xTg-AD 마우스의 공간 작업 기억을 개선시켰다(도 1g 참조). 신규 사물 인지 시험에서, 3xTg-AD/Fcgr2b KO 마우스만이 두세 번 시도만에 신규 및 친숙한 사물을 구별하였으나(도 1h 참조) 3xTg-AD 마우스는 그렇지 못화였다. 이는 3xTg-AD 마우스의 인지 기억 결핍이 Fcgr2b 결핍으로 예방됨을 시사한다. 더구나, 3xTg-AD 마우스가 수동 회피 기억의 결핍을 보여주는 반면에 3xTg-AD/Fcgr2b KO 마우스는 수동 회피 시험을 잘 수행하였다(도 1i 참조).
상기 결과들은 FcγRIIb가 3xTg-AD 마우스에서 습득 및 기억장애에 요구됨을 시사한다. FcγRIIb 자체는 상기 마우스에서 Aβ 수준에 영향을 미치지 않았고(도 1j 참조) 9 개월령 3xTg-AD 마우스의 해마는 플라크가 없기 때문에(Hirata-Fukae, C. et al., 1216:92-103, 2008), 본 발명자들은 이어 마우스 뇌에서 tau 병리현상에 있어서의 FcγRIIb의 역할을 조사하였다. 종래에 보고된 것처럼(Hirata-Fukae, C. et al., 1216:92-103, 2008), CP13, PHF1, 및 AT180 항체들로 검출된 tau의 병리학적 과인산화는 기억장애를 보여주는 3xTg-AD 마우스에서 증가하였다(도 1k 및 도 1l 참조). 대조적으로, 3xTg-AD 마우스에서 Fcgr2b의 유전학적 결실은 tau의 과인산화를 방지하였다. 상기 Fcgr2b 결핍시 tau 인산화에 대한 저해효과는 유사하게도, 다른 AD 모델, hAPP-J20 마우스에서 관찰되었다(도 1m 및 1n 참조).
상기 결과들은 FcγRIIb 역시 기억 장애를 보이는 AD 모델에서 tau 과산화에 결정적인 역할을 수행함을 시사한다.
실시예 2: 길항적 FcγRIIb 항체의 tau 인산화 및 기억 장애효과
본 발명자들은 Aβ는 FcγRIIb와 직접적인 상호작용을 통해 신경세포로 독성 신호를 전달하기 때문에 상기 상호작용이 tau 과인산화에 필수적인지를 시험하였다. Aβ만 처리한 신경세포와 비교하여, 배양 배지에 hFcγRIIb(hFcγRIIb-ED)의 정제된 엑토도메인을 추가시 일차배양 피질 신경세포에서 Aβ-유도 tau 과인산화를 유의하게 저지하였다(도 2a 및 2b 참조). Aβ1-42 올리고머와 항체 복합체 둘다 FcγRIIb에서 같은 결합부위를 공유한다는 생각하에, 본 발명자들은 배양된 세포들을 항-FcγRIIb 항체(2.4G2)와 함께 배양할 경우 Aβ1-42와 HA-태그된 FcγRIIb 사이의 상호작용이 저지된다는 점을 발견하였다(도 2c 및 2d 참조). 일관성 있게, 마우스 일차배양 피질 신경세포에서 PHF1, CP13 및 AT180 항체로 검출이 되는 2.4G2 항체의 처리시 Aβ-유도 tau 과인산화가 농도 의존적인 양상으로 극적으로 감소됨이 확인되었다(도 2e 및 2f 참조). 이러한 관찰결과는 배양된 신경세포에서 Aβ1-42 및 FcγRIIb의 상호작용이 배양되는 신경세포에서의 tau 인산화의 초기단계임을 시사하는 것이다.
다음으로, 본 발명자들은 마우스에서의 Aβ-유도 급성 기억 손상에 있어서의 2.4G 항체의 효과를 주목하였다. 야생형(WT) 마우스의 뇌혈관내 영역으로 Aβ1-42를 직접 주입할 경우 상기 마우스는 장애 행동을 나타냈다(도 2g 내지 2i 참조). 흥미롭게도, Aβ1-42 및 2.4G2 항체의 공주입시 유의하게 자발적 변경 행동(도 2g 참조), 사물 인지 기억(도 2h 참조), 및 수동 회피 기억(도 2i 참조)의 결핍을 회복시켰다. 한편으로, 정상 이뮤노글로불린(IgG)의 주입은 기억 장애에대한 저해효과를 나타내지 않았다. 이들 마우스 그룹 사이에는 상기 Y-미로 시험에서 팔 진입 총 횟수로 나타내는 전체적인 운동량에 있어서는 유의한 차이가 없었다. 웨스턴블랏 분석으로부터, 본 발명자들은 tau 인산화는 Aβ1-42 주입 마우스의 해마에서 크게 증가함을 확인하였다(도 2k 참조). 대조적으로, Aβ-유도 tau 인산화는 2.4G2 항체를 공주입한 해마에서 나타나지 않았으나 IgG를 주입한 경우 유지되었다(도 2k 참조). 따라서, 본 발명자들은 Aβ1-42와 FcγRIIb 사이의 상호작용이 마우스에서 tau 과인산화 및 기억 장애에 필수적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: AD 뇌에서의 FcγRIIb ITIM 인산화의 Aβ 신경독성 및 tau 인산화와의 상관관계 분석
종래에 보고된 바와 같이(Plattner, F. et al., J. Biol. Chem. 281: 25457-25465, 2006), 본 발명자들은 GSK3β 및 Cdk5와 같은 tau 인산화효소들이 t배양된 신경세포에서 Aβ1-42의 처리에 의해 tau 인산화를 위해 활성화됨을 발견하였다(도 3a 및 3b 참조). 특히, 일차배양 피질 신경세포에서 Fcgr2b 결핍은 GSK3β의 활성화 및 Aβ1-42로 저지되는 tau 인산화를 차단하였지만 Cdk5의 경우는 그렇지 않았다. 역으로, FcγRIIb의 이소성 발현(ectopic expression)은 SH-SY5Y 세포 및 일차배양 피질 신경세포 양쪽 모두에서 PHF1, CP13, 및 AT180 항체들로 검출되는 tau 과인산화를 유도하였다(도 3c 내지 3f 참조). 일관성 있게, GSK3β 억제제인 SB-415286 처리시 현저하게 상기 에피토프에서의 FcγRIIb-유도 tau 과인산화를 현저하게 억제한 반면(도 3c 및 3e 참조), Cdk5 억제제인 로스코비틴은 tau 인산화에 영향을 미치지 않았다(도 3d 및 3f 참조). 이러한 관찰결과들은 FcγRIIb가 tau 과인산화를 위해 GSK3β를 활성화시키기 위해 신경세포로 Aβ 신호를 전달함을 시사하는 것이다.
본 발명자들은 다음으로 tau 인산화를 위해서 신경세포로 Aβ 신호의 FcγRIIb 신호전달의 기전을 조사하였고 SH-SY5Y 세포에 Aβ1-42 처리시 농도 의존적으로FcγRIIb의 면역수용체 티로신-기반 저해 모티브(ITIM) 내의 Tyr273에서 인산화가 유도됨을 발견하였다(도 3g 참조). 이러한 FcγRIIb의 인산화는 Aβ 처리된 일차배양 피질 신경세포도 역시 검출되었으나 Fcgr2b KO 신경세포에서는 검출되지 않았다(도 3h 참조). 더 나아가, 정제된 hFcγRIIb-ED 단백질의 추가시 SH-SY5Y 세포에서 Aβ-유도 FcγRIIb-Tyr273의 인산화가 억제되었는데(도 3i 참조), 이는 FcγRIIb가 Aβ1-42와 상호작용한 후에 세포질 ITIM 내의 Tyr273에서 인산화됨을 시사한다.
FcγRIIb 변이체들을 사용함으로써, 본 발명자들은 더 나아가 신경세포에서 FcγRIIb 인산화의 역할을 분석하였다. 본 발명자들은 몇 몇의 ITIM(ΔITIM) 또는 세포질 영역(Δ사이토)을 결핍하고 있거나 티로신 잔기를 페닐알라닌으로 치환시킨 (Y273F) FcγRIIb 돌연변이체를 제조하여, 이들의 Aβ1-42 신경독성 및 tau 인산화에 미치는 영향을 조사하였다. FcγRIIb와는 달리, FcγRIIb-ΔITIM, FcγRIIb-Δcyto, 또는 FcγRIIb-Y273F 변이체들의 이소성 발현은 마우스 해마 HT22 세포에서 신경사멸을 유도하지 않았다(도 4a 참조). 더 나아가, 인산화 되지 않는(도 3j 참조) FcγRIIb-Y273F 변이체의 과발현 역시 SH-SY5Y 세포에서 대조군 수준으로 Aβ1-42 신경독성을 차단한 반면, FcγRIIb WT는 신경독성을 유발하였는데(도 4b 참조), 이는 FcγRIIb-Y273F 인산화가 Aβ1-42 신경독성에 필수적이라는 점을 시사한다. 다음으로 본 발명자들은 Fcgr2b KO 신경세포에서의 재구성분석을 사용하여 tau 인산화에서의 FcγRIIb 인산화의 역할을 조사하였다. Fcgr2b-결실 신경세포에서와는 달리, FcγRIIb WT를 가진 Fcgr2b KO 일차배양 피질 신경세포의 재구성시 WT 신경세포에서 관찰된 것처럼 PHF1, CP13, AT180, 및 12E8 항체들로 검출되는 tau의 Aβ-유도 과인산화가 회복되었다(도 3k 참조). 한편, 세포질 영역이 결핍된 돌연변이체(Δ사이토), 또는 FcγRIIb 인산기-결핍 돌연변이체(Y273F)로 재구성시 Aβ1-42와의 반응에서 상기 에피토프에서의 tau 인산화를 나타내는데 실패하였다(도 3k 참조). 이러한 결과들은 Aβ1-42에 의한 FcγRIIb-Tyr273의 인산화가 tau 인산화에 결정적이라는 점을 시사한다.
더 흥미롭게도, 본 발명자들은 AD 환자들의 뇌에서 FcγRIIb의 인산화 상태를 분석하였을 때, 정상 및 경미한 인지 장애(MCI) 환자들(단계 III)은 아니지만 6명의 AD 환자들 중에서 5명의 해마 조직에서(단계 V 및 VI) Try273에서의 FcγRIIb 인산화를 발견하였다(도 3l 참조). 더구나, PHF에서 tau 인산화가 FcγRIIb-Tyr273의 인산화-양성인 뇌를 가진 5명의 AD 환자들 중 4명에서 관찰되었다. 본 발명자들이 종래에 보고한 바와 같이, FcγRIIb의 발현수준이 AD 뇌에서 증가하였다(도 3l 참조). FcγRIIb 인산화가 tau 인산화 및 Aβ1-42 신경독성에 요구된다는 것을 주목하여, AD 뇌에서 발견된 FcγRIIb의 인산화가 AD 발병과정 동안 tau 인산화 및 신경세포 소실과 연관이 있을 것으로 추측된다.
실시예 4: 신경세포에서 Aβ 1-42 에 의한 인산화된 FcγRIIb로의 SHIP2의 징집
B 세포에서, SHIP(SHIP1 및 2)은 FcγRIIb의 인산화된 ITIM 영역에 결합하는 것으로 알려져 면역 수용체에 의해 촉발되는 하류 반응을 억제한다. SHIP2는 뇌에서 고도로 발현되고 SHIP1은 조혈모 세포에서 우세하게 발현된다는 점에서, 본 발명자들은 본 발명자들은 SHIP2에 초점을 두고 이들의 신경세포에서 인산화된 FcγRIIb에 결합하는 능력을 시험하였다. 면역침강분석 결과 SH-SY5Y 세포에서 과발현된 FcγRIIb-GFP가 FcSHIP2-His에 결합하는 반면에 인산화-결핍 FcγRIIb(Y273F) 변이체는 결합에 실패함을 확인하였다(도 4c 참조). 유사한 결과들이 GFP 항체를 이용한 역면역침강분석법에서 관찰되었다(도 4d 참조). 흥미롭게도, 처리되지 않은 대조군 세포에서 결핍되거나 약한 상호작용과 비교하여, 본 발명자들은 Aβ1-42에 노출된 후에 SH-SY5Y 세포에서 내인성 SHIP2와 FcγRIIb 사이의 결합의 극적인 증가를 확인하였고(도 4e 및 4f 참조), 이는 Aβ1-42에 반응하는 신경세포에서 SHIP2가 FcγRIIb에 결합한다는 것을 시사한다. 더구나, SHIP2는 세포질에 위치하지만 자극시 세포막으로 전위하는 것으로 알려져 있어, 본 발명자들은 Aβ1-42에 노출된 신경세포 세포에서 SHIP2의 세포내 국소화를 추가적으로 분석하였다. 그 결과 Aβ1-42를 SH-SY5Y 세포에 처리시 세포막으로의 SHIP2의 세포내 국소화 및 SHIP2 및 FcγRIIb의 공국소화가 촉진되었다(도 4g 참조). 덧붙여, 세포내 분획 분석 결과 SHIP2는 Aβ1-42 처리후 세포막 분획에 풍부하게 존재한 반면 미처리 대조군 세포에서는 세포질 분획 및 막 분획 모두에서 검출되는 등 유사한 결과를 나타냈다(도 4h 참조). 전체적으로, 본 발명자들의 데이터는 SHIP2이 Aβ1-42 처리를 수반하는 신경세포에서 FcγRIIb와 상호작용하기 위해 막으로 징집됨을 시사한다.
실시예 5: Aβ저지 tau 인산화에 FcγRIIb-SHIP2 축에 의한 포스포이노시타이드 대사의 영향
SHIP2는 PtdIns(3,4)P2를 생산하기 위해 PtdIns(3,4,5)P3를 탈인산화하는 이노시톨 탈인산화효소(phosphatase)이기 때문에, 본 발명자들은 Aβ1-42가 FcγRIIb 및 SHIP2를 통해 포스포이노시타이드 대사에 영향을 미치는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 프로브로 반복(tandem) PH 도메인-함유 단백질-1(TAPP1)의 정제된 His-태그 플렉스트린 상동영역 (PH) 도메인을 사용한 단백질 지질 중첩(PLO) 분석으로 PtdIns(3,4)P2의 수준을 측정하였다. 추출된 총지질을 사용한 PLO 분석으로부터, 본 발명자들은 TAPP1-PH-상호작용 PtdIns(3,4)P2의 양이 Aβ1-42에 노출을 수반하는 SH-SY5Y 세포에서 증가한다는 것을 발견하였다(도 5a 및 5b 참조). 대조적으로, SH-SY5Y/FCGR2B 또는 SH-SY5Y/SHIP2 넉다운 세포에서는 상기와 같은 그러한 증가가 없었다(도 5b 참조). 역으로, SH-SY5Y 세포에서 주로 PtdIns(3,4,5)P3인 포스포이노시타이드-1(GRP1)-PH-상호작용 지질에 대한 일반적인 수용체의 양은 Aβ1-42에 의해 감소하였으나(도 5b 참조), SH-SY5Y/FCGR2B 또는 SH-SY5Y/SHIP2 넉다운 세포에서는 감소하지 않았다(도 5b 참조). TAPP1-PH-상호작용 또는 GRP1-PH-상호작용 지질의 수준에서 유사한 양상의 변화 역시 Aβ1-42로 처리한 후에 야생형(WT) 일차배양 피질 신경세포에서 관찰되었다(도 5c 및 5d 참조). 일관성 있게, 상기 변화들은 Fcgr2b KO 신경세포에서는 관찰되지 않았다. 상기 결과들은 포스포이노시타이드 대사가 FcγRIIb-SHIP2 축에 의해 영향을 받음을 시사한다.
본 발명자들이 ELISA 분석으로 포스포이노시타이드의 수준을 직접 측정하였을 때 PtdIns(3,4)P2의 수준이 Aβ1-42에 노출된 후에 일차배양 피질 신경세포에서 30% 증가한 반면에 PtdIns(3,4,5)P3는 17% 감소하였다(도 5e 참조). 그러나, Fcgr2b 결손의 경우 PtdIns(3,4)P2 및 PtdIns(3,4,5)P3 수준에서 상기 변화들을 나타나지 않았다. 다른 한편으로는, 종래에 보고된 바와 일치하게 PtdIns(3,4)P2의 수준은 야생형(WT) 신경세포에서 Aβ1-42로 낮추어 지고, Fcgr2b KO 신경세포에서도 마찬가지였다(도 5e 참조). 본 발명자들은 더 나아가 형광 현미경하에서 GFP-태그 TAPP1-PH를 사용하여 PtdIns(3,4)P2에서 변화를 추적하였다. Aβ1-42가 미처리된 SH-SY5Y 세포에서는 TAPP1-PH-GFP의 형광이 세포질 내에서 분산된 양상으로 나타난 반면에, Aβ1-42로 처리된 경우에는 TAPP1-PH-GFP의 형광이 강화되었고 세포막에서 농축되었다(도 5f 참조). 대조적으로, 세포막에서 Aβ-유도된 TAPP1-PH-GFP의 축적은 SH-SY5Y/FCGR2B 넉다운 세포에서 방지되었다(도 5f 참조). 종래에 보고된 바대로, 과산화수소 역시 SH-SY5Y 세포에서 TAPP1-PH-GFP의 막 국소화를 유도하였다. 그러나, 상기 막 국소화는 Fcgr2b 결손으로 영향을 받지 않았다(도 5g 참조). 이러한 관찰결과들은 더 나아가 Aβ1-42가 FcγRIIb를 통해 선택적으로 PtdIns(3,4)P2 및 PtdIns(3,4,5)P3 수준을 이상조절(dysregulation)한다는 아이디어를 지지하는 것이다.
Aβ1-42에 의한 PtdIns(3,4)P2에서 증가가 tau 인산화에 영향을 미치는 지에 대한 중요한 질문에 주목하여, 본 발명자들은 포스포이노시타이드를 담체를 이용하여 직접 살아있는 신경세포로 전달하였다. 처리하지 않은 대조 세포와 비교하여, PtdIns(3,4)P2로 처리시 농도 의존 방식으로 일차배양 피질 신경세포에서 tau 인산화(AT180, CP13, PHF1)를 증가시켰다(도 5h 참조). 흥미롭게도, tau 과인산화의 증가는 PtdIns(3,4)P2에 특이적이었고; PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,5)P2, 및, PtdIns(3,4,5)P3 와 같은 다른 포스포이노시타이드에는 특이적이지 않았다(도 5i 참조). Aβ1-42에 의한 GSK3β의 활성화와 일치하게, PtdIns(3,4)P2 처리시 신경세포에서 GSK3β의 Ser9에서의 저해적 인산화 역시 감소시켰다억. 이러한 결과들은 Aβ1-42에 의한 PtdIns(3,4)P2 수준의 증가가 신경세포에서 tau 과인산화에 결정적이라는 점을 시사한다.
실시예 6: Aβ-유도된 tau 인산화 및 기억 장애에 있어서의 SHIP2의 영향
본 발명자들은 FcγRIIb의 하류 신호 중개인자인 SHIP2가 tau 인산화에 필수적인지를 SHIP2 넉다운의 효과를 시험함으로써 조사하였다. 대조군 세포에서 Aβ1-42에 의한 강화된 tau 인산화와는 달리, SH-SY5Y 세포에서 SHIP2 넉다운의 발현은 Aβ1-42에 의한 tau 인산화(PHF1 and CP13)를 방지하였다(도 6a 참조). 역으로, SHIP2 단독의 과발현은 SH-SY5Y 세포에서 tau 과인산화를 증가시키기에 충분하였다(도 6d 참조). 다른 한편으로는, 상기 효과들은 Ala로 대체된 Asp608로 비활성화 SHIP2 돌연변이체를 사용시 관찰되지 않았다(도 6e 참조). 덧붙여, Aβ1-42 처리 또는 FcγRIIb의 과발현에 의해 촉발된 신경세포의 세포사멸은 SH-SY5Y 세포에서 SHIP2 넉다운의 발현에 의해 크게 감소되었다(도6b 및 6c 참조). 이와 함께, 상기 결과들은 SHIP2이 Aβ-유도 tau 과인산화 및 신경독성에서 주요한 FcγRIIb의 신호 중개인자임을 시사하는 것이다.
이어, 본 발명자들은 siRNA-발현 렌티바이러스(lenti-siShip2)를 사용하여 생체 내 기억장애에서의 SHIP2의 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 lenti-siShip2 로 감염시 HT22 세포 및 일차배양 피질 신경세포 양쪽에서 모두 SHIP2 수준을 감소시킴을 확인하였다(도 7a 및 7b 참조). 일관성 있게, 본 발명자들은 lenti-siShip2 로 감염시 일차배양 피질 신경세포에서 Aβ-유도 tau 인산화(PHF1, CP13)를 방지됨을 확인하였다(도 6f 참조). 본 발명자들은 lenti-siShip2를 뇌정위법으로 야생형(WT) 및 3xTg-AD 마우스의 정치회로 주입한 경우, 대조 3xTg-AD 마우스에 비교하여, lenti-siShip2를 주입한 3xTg-AD 마우스가 바이러스 주입 20일 후에 Y-미로 및 신규 사물 인지 에서 유의한 기억 결핍을 보이지 않음을 확인하였다(도 6g 및 6h 참조). 또한, 본 발명자들은 웨스턴블랏 분석으로 뇌에 있는 tau 인산화 및 SHIP2 수준을 조사한 결과, tau 인산화 및 SHIP2 수준이 lenti-siShip2를 주입한 3xTg-AD 마우스의 해마에서 감소됨을 발견하였다(도 6i 참조). lenti-siShip2에 의한 기억 장애 개선은 주입후 30일 동안 유지되었다(데이타는 주어지지 않음). 상기 결과들은 SHIP2가 3xTg-AD 마우스에서 기억 장애 및 tau 과인산화에 결정적임을 시사한다.
덧붙여, 본 발명자들은 SHIP1 보다 SHIP2에 대하여 30배 정도 더 강력한 SHIP2-선택적 저해제인 AS1949490를 사용하여, Aβ-유도 tau 인산화의 저해에 및 및 기억 손상에 대한 약리학적 SHIP2 저해의 영향을 평가하였다. AS1949490로 처리된 일차배양 피질 신경세포는 Aβ-유도 tau 인산화(PHF1, CP13, AT180) 및 신경세포의 세포사멸을 억제하였다(도 6j 및 도 8a 참조). 본 발명자들은 마우스에 i.c.v.-주입된 Aβ1-42에 의해 촉발된 기억 손상이 관한 AS1949490의 효과를 조사하였는데, AS1949490의 경우 생체이용율이 낮기 때문에 마우스 뇌로 직접 전달하였다. 치사량 미만의 Aβ1-42 및 AS1949490의 I.c.v. 주입후 행동시험 결과 AS1949490가 Aβ1-42-유도 공간 작업 기억(도 6k 참조), 사물 인지 기억(도 6l 참조), 및 수동 회피 기억(도 6m 참조)의 손상을 유의하게 회복시키는 것으로 나타났다. Y-미로 시험에서 폴로의 총출입 횟수 결정되는 총 운동량은 마우스 그룹들 간에서 유의하게 다르지 않았다(도 8b 참조). 아울러, 마우스 해마 조직의 웨스턴블랏 분석으로부터, 본 발명자들은 AS1949490가 Aβ1-42-유도 tau 인산화(PHF1, CP13, AT180)를 억제함을 확인하였다(도 6n 참조). 종합적으로, 상기 관찰결과들은 SHIP2의 약리학적 조절이 Aβ1-42-유도 tau 인산화 및 기억 손상을 표적으로 하는 AD 치료제의 개발을 가능하게 한다는 관점을 지지한다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Novel therapeutic agent for treating Alzheimer's disease and a method for screening the same <130> PD15-5309 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against mouse SHIP2 <400> 1 gaagggaggg cacgttaatt t 21 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B-5'-NheI <400> 2 gggctagcat gggaatcctg tcattc 26 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B-3'-KpnI <400> 3 ggggtacccc aatacggttc tggtcatc 28 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B deltaCyto-5'-NheI <400> 4 gggctagcat gggaatcctg tcattc 26 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B deltaCyto-3'-KpnI <400> 5 ggggtacccc agcaatggcc g 21 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B deltaITIM-5'-NheI <400> 6 gggctagcat gggaatcctg tcattc 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B deltaITIM-3'-KpnI <400> 7 ggggtacccc tgtgttctca gccccaac 28 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B deltaC-term-5'-NheI <400> 8 gggctagcat gggaatcctg tcattc 26 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B deltaC-term-3'-KpnI <400> 9 ggggtacccc gagaagtgaa taggtgattg 30 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B Y273F-5' <400> 10 caatcacctt ttcacttctc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FCGR2B Y273F-3' <400> 11 gcttgagaag tgaaaaggtg 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against humang FCGR2B #1 <400> 12 gctacaggtt caaggccaa 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against humang FCGR2B #2 <400> 13 gcacaggaaa cataggcta 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against humang SHIP2 #1 <400> 14 ggtgtttgac cagcagagc 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA against humang SHIP2 #2 <400> 15 ccaagaacag cttcaataa 19

Claims (10)

  1. 항-FcγRIIb 항체를 유효성분으로 함유하는 측두엽 변성증(Frontotemporal lobar degeneration), 피질기조퇴행(Corticobasal degeneration), 퇴행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy) 및 픽병(Pick's disease)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 타우(tau) 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    추가적으로 라파마이신(rapamycin), 페르헥실린(perhexiline), 니클로사미드(niclosamide), 아미오다론(amiodarone), 로틀레린(rottlerin), 트레할로스(trehalose), 칼페스타틴(calpastatin), SMERs(small molecule inhibitors and enhancers), 베라파밀(verapamil), 로페라마이드(loperamide), 니모디핀(nimodipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 플루스피릴렌(fluspirilene), 트리플루오페라진(trifluoperazine), 니굴디핀(niguldipine), 미녹시딜(minoxidil), 클로니딘(clonidine), 릴메니딘(rilmenidine), 및 2'5'-디데옥시아데노신(dideoxyadenosine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 자가소화작용(autophagy) 유도제를 포함하는, 치료제.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 인산화 FcγRIIb 또는 상기 인산화 FcγRIIb의 인산화된 Tyr273을 포함하는 ITIM(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) 및 SHIP2가 포함된 조성물에 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
    피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 인산화 FcγRIIb 또는 상기 인산화 FcγRIIb의 인산화된 Tyr273을 포함하는 ITIM 및 SHIP2의 상호작용을 유의하게 저해한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법.
  8. SHIP2 및 상기 SHIP2의 기질을 포함하는 조성물에 피검화합물을 처리하는 단계; 및
    상기 피검화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 SHIP2의 기질의 탈인산화를 억제한 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 SHIP2의 기질은 포스파티딜이노시톨(3,4,5)삼인산(PtdIns(3,4,5)P3인, 방법.
  10. FcγRIIb, SHIP2, 및 tau를 발현하는 세포를 준비하는 단계;
    상기 세포에 베타 아밀로이드 올리고머 및 피검 화합물을 처리하는 단계; 및
    상기 피검 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 tau의 과인산화 또는 응집을 유의하게 억제한 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 타우 단백질 매개의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법.
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